DE10026453A1 - Production of beads, especially magnetic and non-magnetic calcium alginate beads useful in biochemistry, medicine and active and passive drug targeting, involves dispersing droplets solution in different liquid phase - Google Patents
Production of beads, especially magnetic and non-magnetic calcium alginate beads useful in biochemistry, medicine and active and passive drug targeting, involves dispersing droplets solution in different liquid phaseInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft magnetische und nicht magnetische sphärische Partikel sowie ein Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Matrix der sphärischen Partikel besteht aus einem formbeständigen Alginatgel, das durch Salzbrücken zwischen den Carboxylgruppen des Alginates vernetzt wird. Die sphärischen Partikel können erfindungsgemäss inkorporiertes magnetisches Material enthalten.The invention relates to magnetic and non-magnetic spherical particles and a Process for their production. The matrix of the spherical particles consists of a dimensionally stable alginate gel, which is formed by salt bridges between the carboxyl groups of the alginate is networked. According to the invention, the spherical particles can incorporated magnetic material included.
Das vorzugsweise verwendete Matrixmaterial Alginat ist ein Copolymer, bestehend aus den zwei 1,4-verknüpften Monomeren, β-D-Mannuron- und α-L-Guluronsäure, wobei die beiden Monomere im Polymer nicht statistisch, sondern blockweise angeordnet sind. Neben rein homopolymeren Blöcken (Mannuron- oder Guluronblöcke) treten im Polymer auch Blöcke auf, die beide Monomere abwechselnd enthalten (Mannuron/Guluronblöcke). Alginate werden aufgrund ihrer hohen Biokompatibilität vielfach verwendet und sind im Handel in hoher Reinheit erhältlich. Je nach Quelle können sie stark in ihrer Zusammensetzung variieren, angefangen von reiner Mannuronsäure bis hin zu Polymeren mit einem über 80%igen Guluronsäureanteil. Die physikalischen Eigenschaften des Alginates hängen in weitem Masse von seinem Mannuron-Guluronsäure-Verhältnis ab.The preferably used matrix material alginate is a copolymer consisting of the two 1,4-linked monomers, β-D-mannuronic and α-L-guluronic acid, where the two monomers in the polymer are not arranged statistically, but in blocks are. In addition to purely homopolymeric blocks (Mannuron or Guluron blocks) occur in Polymer also blocks that alternately contain both monomers (Mannuron / Guluron blocks). Alginates are due to their high biocompatibility widely used and are commercially available in high purity. Depending on the source they can vary widely in their composition, starting from pure Mannuronic acid up to polymers with over 80% guluronic acid. The physical properties of the alginate depend to a large extent on its Mannuron-guluronic acid ratio.
Verfahren zur Herstellung von sphärischen Calciumalginat-Partikeln sind in der Literatur seit langem beschrieben. Häufig angewendet wird die sogenannte Eintropfmethode. Hierbei wird eine Lösung aus Natriumalginat über eine Hohlnadel oder Kanüle in eine Lösung eines Vernetzers, z. B. eine Calciumsalzlösung ("ionogener Crosslinker"), getropft. Auch andere zweiwertige Kationen wie Sr2+, Ba2+, Pb2+, Cu2+, Cd2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ und Mn2+ sind als ionogene Vernetzer geeignet. Ihr Einsatz ist jedoch, bedingt durch ihre Toxizität, limitiert. Einwertige Kationen oder Mg2+-Ionen sind als Vernetzer ungeeignet. Das rein ionogene Vernetzen und das damit verbundene Gelieren der Alginatlösung wird hauptsächlich durch den Austausch der Na+-Ionen des Guluronates im Polymeren durch z. B. Ca2+ bewirkt. Die dadurch hervorgerufene besondere räumliche Anordnung der Guluronsäuresequenzen um das zweiwertige Ca2+- Ion, in der Literatur unter dem Begriff "Egg-Box-Model" bekannt, ist für den Aufbau des resultierenden Gel-Netzwerkes verantwortlich. Dieses verleiht dem sich bildenden sphärischen Partikel ("Bead") die Festigkeit. Sphärische Partikel aus Alginat, hergestellt durch Eintropfen einer Alginatlösung in ein Reservoir eines ionogenen Crosslinkers, werden in der Literatur vielfach zum Einkapseln der verschiedensten Substanzen, z. B. Pflanzenzellen [K. Redenbaugh et al. Bio/Technology, 4, 797-801, 1986], Säugetierzellen [DE 30 12 233], Hefezellen [T. Shiotani et al. Eur. J. Appl. Microbial Biotechnol, 13(2), 1981], Bakterien [H. Provost et al. Biotechnology Letters, 7(4), 247-252, 1985], Therapeutika [US 485,471] sowie zur Herstellung künstlichen Kaviars [JP 60 83,570] verwendet. Zu Inkorporationszwecken wird das einzukapselnde Material der Alginatlösung vor Kontakt mit dem Vernetzungsmedium zugesetzt.Methods for producing spherical calcium alginate particles have long been described in the literature. The so-called dropping method is often used. Here, a solution of sodium alginate via a hollow needle or cannula in a solution of a crosslinking agent, e.g. B. a calcium salt solution ("ionic crosslinker"). Other divalent cations such as Sr 2+ , Ba 2+ , Pb 2+ , Cu 2+ , Cd 2+ , Co 2+ , Ni 2+ , Zn 2+ and Mn 2+ are also suitable as ionogenic crosslinkers. However, their use is limited due to their toxicity. Monovalent cations or Mg 2+ ions are unsuitable as crosslinkers. The purely ionic crosslinking and the associated gelation of the alginate solution is mainly achieved by the exchange of the Na + ions of the guluronate in the polymer by e.g. B. Ca 2+ causes. The resulting spatial arrangement of the guluronic acid sequences around the divalent Ca 2+ ion, known in the literature under the term "egg box model", is responsible for the structure of the resulting gel network. This gives the spherical particle ("bead") the strength. Spherical particles of alginate, produced by dropping an alginate solution into a reservoir of an ionogenic crosslinker, are widely used in the literature to encapsulate a wide variety of substances, e.g. B. Plant cells [K. Redenbaugh et al. Bio / Technology, 4, 797-801, 1986], mammalian cells [DE 30 12 233], yeast cells [T. Shiotani et al. Eur. J. Appl. Microbial Biotechnol, 13 (2), 1981], bacteria [H. Provost et al. Biotechnology Letters, 7 (4), 247-252, 1985], therapeutic agents [US 485,471] and for the production of artificial caviar [JP 60 83,570]. For incorporation purposes, the material to be encapsulated is added to the alginate solution before contact with the crosslinking medium.
Die Verwendung von Alginatbeads zur Einkapselung von Magnetit ("Eintropfmethode") und deren Einsatz in der Chromatographie ist in WO 86/03136 beschrieben. Pope et al [3. Biomedical Materials Research, Vol 28, 449-457, 1994] verwendet über ein "Eintropfverfahren" hergestellte und anschließend modifizierte magnetithaltige Alginatbeads zur Separation von CD34+ (KG1a)-Zellen.The use of alginate beads to encapsulate magnetite ("Dropping method") and their use in chromatography is in WO 86/03136 described. Pope et al [3rd Biomedical Materials Research, Vol 28, 449-457, 1994] used by a "dropping process" and then modified Alginate beads containing magnetite for the separation of CD34 + (KG1a) cells.
Die Anmeldung EP 0313008 beschäftigt sich mit Membrankapseln aus Polysacchariden sowie Polysäuren/Polybasen, die magnetische Partikel enthalten. The application EP 0313008 deals with membrane capsules Polysaccharides and polyacids / polybases that contain magnetic particles.
US 5,427,935 beschreibt ein Verfahren zur Einkapselung u. a. von magnetischen Partikeln in gelbildende Polymere. WO 81/00575 offenbart einen Katalysator, der aus Mikroorganismen, die zusammen mit magnetischem Material in einem Trägermaterial aus Alginat inmobilisiert vorliegen, besteht. Bei allen drei Anmeldungen wird zur Herstellung der magnetischen Partikel eine Eintropfmethode beschrieben.US 5,427,935 describes a method for encapsulation and. a. of magnetic Particles in gel-forming polymers. WO 81/00575 discloses a catalyst consisting of Microorganisms together with magnetic material in a carrier material immobilized from alginate. For all three registrations, the Production of the magnetic particles described a dropping method.
Das als Eintropfmethode bezeichnete Verfahren hat mehrere Nachteile. Eine Reduktion der Beadgröße, die z. B. für Fermentationsprozesse oder für das sogenannte "Drug Delivery" genau definiert sein muß, ist durch die Dimensionen der verwendeten Nadel/Kanüle nur begrenzt möglich. Sphärische Partikel <0,5 m sind so nur schwer herstellbar. Eine weitere Reduzierung der Beadgröße kann durch den mehr oder weniger aufwendigen Einsatz technischer Hilfsmittel wie z. B. elektrostatischer Pulssysteme [Canadian Patent, 1241598], rotierender oder vibrierender Nadeln bzw. weiterentwickelter Eintropftechniken erfolgen. Letztere Techniken sind oftmals, durch ihre Komplexität und geringe Produktivität, für ein industrielles "Scale-up" nur bedingt geeignet.The method known as the dropping method has several disadvantages. A reduction the bead size, e.g. B. for fermentation processes or for the so-called "drug Delivery "must be precisely defined by the dimensions used Needle / cannula only possible to a limited extent. This makes spherical particles <0.5 m difficult producible. A further reduction in the bead size can be achieved by the more or less expensive use of technical aids such. B. electrostatic Pulse systems [Canadian Patent, 1241598], rotating or vibrating needles or further developed dropping techniques take place. The latter techniques are often through their complexity and low productivity, for an industrial "scale-up" only to a limited extent suitable.
Neben den oben beschriebenen Techniken gibt es eine weitere grundlegende Methode zur Herstellung von sphärischen Alginat-Partikeln. Diese Methode wird weniger häufig verwendet und basiert auf einem Emulsionsverfahren. Die bisher bekannten Emulsionsverfahren können grob in zwei Gruppen eingeteilt werden.In addition to the techniques described above, there is another basic method for the production of spherical alginate particles. This method becomes less common used and based on an emulsion process. The previously known Emulsion processes can be roughly divided into two groups.
Zum einen diejenigen Emulsionsverfahren, bei denen sphärische Partikel dadurch gebildet werden, daß der in der organischen bzw. lipophilen Phase, die mit der Alginatlösung nicht mischbar ist, emulgierten Alginatlösung eine Lösung eines ionogenen Vernetzers (z. B. eine Ca2+-Lösung) zugesetzt wird [L. W. Chan er al. J. Microencapsulation, 15(4), 409-420, 1998; N.-H. Cho et al. J. Controlled Release, 53, 215-224, 1998; G. Fundueanu et al. Biomaterials, 20, 1427-1435, 1999]. Die dort beschriebenen Verfahren beziehen sich jedoch ausschließlich auf unmagnetische sphärische Partikel. Nicht magnetische sphärische Partikel sind für das gezielte, ein äußeres magnetisches Feld nutzende "active drug targeting" nicht verwendbar.On the one hand those emulsion processes in which spherical particles are formed in that the alginate solution emulsified in the organic or lipophilic phase, which is immiscible with the alginate solution, is a solution of an ionogenic crosslinking agent (e.g. a Ca 2+ solution) is added [LW Chan er al. J. Microencapsulation, 15 (4), 409-420, 1998; N.-H. Cho et al. J. Controlled Release, 53, 215-224, 1998; G. Fundueanu et al. Biomaterials, 20, 1427-1435, 1999]. However, the methods described there relate exclusively to non-magnetic spherical particles. Non-magnetic spherical particles cannot be used for the targeted "active drug targeting" using an external magnetic field.
Zum anderen diejenigen Emulsionstechniken, die als sogenannte interne Vernetzungverfahren bezeichnet werden. Hierbei ist in den in der lipophilen Phase emulgierten Alginattropfen der ionogene Vernetzer bereits enthalten. Dieser liegt aber chemisch in einer derartigen Form in der Alginatlösung vor, dass erst entweder nach Zusatz einer Säure oder durch Einstellung eines chemischen Gleichgewichtes das eigentliche, die Bildung der sphärischen Partikel auslösende bivalente Kation freigesetzt wird [US 4 822 534; D. Poncelet et al. Appl. Microbiol Biotechnol, 43, 644- 650, 1995; M. Monshipouri et al. J. Microencapsulation, 12(3), 255-262, 1995].On the other hand, those emulsion techniques that are known as internal Networking procedures. This is in the lipophilic phase emulsified alginate drops already contain the ionogenic crosslinker. But this is chemically in such a form in the alginate solution that only after either Adding an acid or by adjusting a chemical balance that actual bivalent cation which triggers the formation of the spherical particles is released [US 4,822,534; D. Poncelet et al. Appl. Microbiol Biotechnol, 43, 644- 650, 1995; M. Monshipouri et al. J. Microencapsulation, 12 (3), 255-262, 1995].
Es lag der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein neues, für das industrielle "Scale-up" geeignete Dispersionsverfahren zur Herstellung von sphärischen Calciumalginat- Partikeln, speziell zur Herstellung von sphärischen magnetischen Calciumalginat- Partikeln, zu entwickeln.It was the object of the invention to develop a new, industrial "scale-up" suitable dispersion processes for the production of spherical calcium alginate Particles, especially for the production of spherical magnetic calcium alginate Particles to develop.
Der Einsatz magnetischer Partikel aus den verschiedensten Matrixmaterialien [EP 0087786, EP 0016552] erfolgt in den letzten Jahren vor allem in der Biochemie und Medizin, vornehmlich zur Abtrennung von Zellen, Proteinen und Nukleinsäuren. Aufgrund ihrer magnetischen Eigenschaften lassen sich derartige sphärischen Partikel auch als Transportsysteme für inkorporierte Pharmaka in bestimmte Körperareale nutzen (sogenanntes active drug targeting). Deshalb war ein weiteres Ziel der Erfindung, sphärische magnetische Partikel einer mittleren Größe von kleiner 10 µm zu entwickeln, die für eine spätere in vivo Applikation genutzt werden können. Nicht magnetische sphärische Partikel können im Bereich des sogenannten passive drug targeting zum Einsatz kommen.The use of magnetic particles from a wide variety of matrix materials [EP 0087786, EP 0016552] has taken place in recent years, especially in biochemistry and Medicine, primarily for the separation of cells, proteins and nucleic acids. Due to their magnetic properties, such spherical particles can be also as transport systems for incorporated pharmaceuticals in certain areas of the body use (so-called active drug targeting). Therefore another goal was the Invention, spherical magnetic particles of an average size of less than 10 microns develop that can be used for a later in vivo application. Not Magnetic spherical particles can be found in the area of the so-called passive drug targeting are used.
Die PCT-Anmeldung WO 99/31167 beschreibt die Herstellung kovalent vernetzter Polymerpartikel, die erfindungsgemäß u. a. aus kovalent vernetztem Alginat bestehen. Das hier offengelegte Verfahren ist zur Herstellung von Polymer-Partikeln mit einem mittleren Durchmesser von 10-250 µm geeignet. Die Patente DE 196 44 343 und DE 31 44 683 beschreiben die Herstellung u. a. von alginathaltigen Mikrokapseln zur Inkorporation von Lebensmittel, Lebensmittelersatzstoffen und Arzneimittel bzw. von Ölen und öllöslichen Substanzen. Während bei ersterem die Herstellung auf einer Ultraschallsynthese bzw. anschließender "Cross-Flow-Filtration" beruht, wird bei letzterem wieder auf eine Eintropftechnik zurückgegriffen. EP 0480729 legt ein Verfahren zur Einkapselung eines sich in einem Öltropfen befindenden Therapeutikums in eine Polysaccharidmatrix offen. Ausgangspunkt ist hierbei eine Öl/Wasser-Emulsion, bei der das aus einem Polysaccharid bestehende Matrixmaterial in einer Konzentration von 20-100% (w/w) in der wässrigen Phase gelöst vorliegt. EP 0213303 beschreibt ein Emulsionssystem, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass zwei gegenseitig unmischbare wässrige Phasen die Emulsionsgrundlage bilden. Erfindungsgemäß kann die Verfestigung der emulgierten Polymertropfen, die inkorporiertes Material enthalten, in Abhängigkeit von der chemischen Natur des eingesetzten Polymeren auf vielfältige Weise erfolgen. Die so hergestellten Polymerpartikel sind größtenteils amorph. Definierte perl- bzw. kugelförmige Partikel lassen sich mit dem genannten Verfahren nicht herstellen. Die PCT-Anmeldung WO 93/19115 bezieht sich auf ein Emulsionsverfahren zur Herstellung eines porösen Polysaccharidmaterials, bei dem es sich u. a. auch um Alginat handelt. Das Polysaccharidmaterial ist durch zwei unterschiedliche Porengrößen (Klassen von Poren, die sich in ihrer Größe unterscheiden) charakterisiert. Die Anmeldung EP 0222718 beschreibt ebenfalls ein Verfahren zur Herstellung makroporöser Partikel, die u. a. aus einem Polysaccharid bestehen und die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie eine Partikelgröße von 10-500 µm und eine große Zahl von Hohlräumen mit einem Durchmesser von 1-50 µm aufweisen. DE 22 64 074 beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von Mikrokapseln, das auf dem Prinzip der Phasentrennung beruht. Hierbei führt man eine Phasentrennung zwischen den drei Ausgangssubstanzen, Polymer, Lösungsmittel und Nichtlösungsmittel in einem vierten Grundstoff (Träger) durch. Die so gebildeten Mikrokapseln sind kugelförmig bzw. annähernd kugelförmig, wobei keinerlei Größenangaben gemacht werden. Alexakis et al [Applied Biochemistry and Biotechnology, 50, 93-106, 1995.] nutzt ein von Poncelet et al (s.o.) entwickeltes Emulsionsverfahren zur Inkorporation von DNA und Carbonyl-Eisen-Pulver in sphärischen Alginat-Partikeln. Die so hergestellten sphärischen DNA-Alginat Partikel werden mit einer mit Glutaraldehyd vernetzten Chitosanschutzhülle umgeben. Die mittleren Durchmesser der erhaltenen magnetischen sphärischen DNA-Alginat- Partikel liegen in einem Bereich von 20-500 µm, was eine in vivo Applikation innerhalb des Gefäßsystems nicht zuläßt. Die Anmeldung WO 83/03426 beschreibt mit einer Hülle eines Kohlenhydrates (u. a. Alginat) umgebene magnetische Partikel und daran gebundene Antikörper mit einem Durchmesser von max. 1 µm und deren Verwendung zur Zellseparation. Ein Nachteil dieses Verfahrens liegt darin, dass eine rasche Zellseparation mittels eines Handmagneten aufgrund der Feinheit der Partikel nicht ohne weiteres möglich ist. PCT application WO 99/31167 describes the production of covalently cross-linked Polymer particles that u. a. consist of covalently cross-linked alginate. The method disclosed here is for the production of polymer particles with a average diameter of 10-250 µm suitable. The patents DE 196 44 343 and DE 31 44 683 describe the manufacture u. a. of alginate-containing microcapsules for Incorporation of food, food substitutes and pharmaceuticals or of Oils and oil-soluble substances. While in the former the production on one Ultrasound synthesis or subsequent "cross-flow filtration" is based on the latter again used a dripping technique. EP 0480729 inserts Process for encapsulating an oil droplet Therapeutic in a polysaccharide matrix open. The starting point is one Oil / water emulsion in which the matrix material consists of a polysaccharide is present in a concentration of 20-100% (w / w) dissolved in the aqueous phase. EP 0213303 describes an emulsion system which is characterized in that two mutually immiscible aqueous phases form the emulsion basis. According to the invention, the solidification of the emulsified polymer drops incorporated material depending on the chemical nature of the polymers used take place in a variety of ways. The so produced Polymer particles are mostly amorphous. Defined pearly or spherical particles cannot be produced using the process mentioned. The PCT application WHERE 93/19115 refers to an emulsion process for making a porous Polysaccharide material, which is u. a. also deals with alginate. The Polysaccharide material is characterized by two different pore sizes (classes of Pores that differ in size). The application EP 0222718 also describes a process for producing macroporous particles, the u. a. consist of a polysaccharide and are characterized in that they a particle size of 10-500 µm and a large number of cavities with one Have diameters of 1-50 µm. DE 22 64 074 describes a method for Manufacture of microcapsules based on the principle of phase separation. Here one carries out a phase separation between the three starting substances, polymer, Solvent and non-solvent in a fourth base material (carrier). The microcapsules so formed are spherical or approximately spherical, wherein no size information is given. Alexakis et al [Applied Biochemistry and Biotechnology, 50, 93-106, 1995.] uses one developed by Poncelet et al (see above) Emulsion process for incorporation of DNA and carbonyl iron powder in spherical alginate particles. The spherical DNA alginate particles produced in this way are surrounded with a chitosan protective cover cross-linked with glutaraldehyde. The average diameter of the magnetic spherical DNA alginate obtained Particles are in a range of 20-500 µm, which is an in vivo application within the vascular system. The application WO 83/03426 describes with magnetic particles surrounding a shell of a carbohydrate (including alginate) and Antibodies bound to it with a diameter of max. 1 µm and their Use for cell separation. A disadvantage of this method is that a rapid cell separation using a hand magnet due to the fineness of the particles is not easily possible.
Die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe, also die Entwicklung eines für das industrielle "scale-up" geeignete Dispersionsverfahrens zur Herstellung sphärischer magnetischer Alginat-Partikel mit einem mittleren Durchmesser unter 20 µm, wurde wie folgt gelöst:The object underlying the present invention, that is the development of a dispersion process suitable for industrial "scale-up" spherical magnetic alginate particles with an average diameter of less than 20 µm, was solved as follows:
Eine wässrige Alginatlösung bzw. eine Mischung aus Alginatlösung und einem magnetischen Kolloid wird in einem eine Kombination von mindestens zwei Emulgatoren enthaltenden mineralischen Öl, vorzugsweise ein hochviskoses Silikonöl, eingebracht und in eine Wasser/Öl-Dispersion überführt.An aqueous alginate solution or a mixture of alginate solution and one magnetic colloid is a combination of at least two in one Mineral oil containing emulsifiers, preferably a highly viscous silicone oil, introduced and transferred into a water / oil dispersion.
Im Hinblick auf einheitliche, perlförmige Partikel mit geforderten Größen kleiner als 20 µm hat sich überraschenderweise gezeigt, dass für die Ölphase nur eine Mischung aus zwei, vorzugsweise drei Emulgatoren zu den geforderten Partikelspezifikationen führt. Die Gesamtemulgatorkonzentration beträgt in der Regel 5-50% (v/v) bezogen auf die Ölphase. Die eingesetzten Emulgatoren stammen bevorzugt aus der Klasse der höheren Alkohole, der Fettalkyltetraglykolether-Phosphorsäureester und der Ethylenoxid-Propylenoxid-Copolymere. Emulgatoren aus der Klasse der höheren Alkohole werden bevorzugt im Konzentrationsbereich von 2-14% (v/v), aus der Klasse der Fettalkyltetraglykolether-Phosphorsäureester im Konzentrationsbereich von 2-14% (v/v) und der Ethylenoxid-Propylenoxid-Copolymere im Konzentrationsbereich von 5- 28% (v/v) eingesetzt. Weiterhin wurde gefunden, dass sphärische Partikel der gewünschten Spezifität nur bei Verwendung von Silikonöl mit einer bevorzugten kinematischen Viskosität im Bereich zwischen 10-1000 cSt als Dispersionsmedium, erhalten werden.With regard to uniform, pearl-shaped particles with required sizes smaller than 20 µm has surprisingly been found to be only one mixture for the oil phase from two, preferably three emulsifiers for the required particle specifications leads. The total emulsifier concentration is usually 5-50% (v / v) related on the oil phase. The emulsifiers used preferably come from the class of higher alcohols, the fatty alkyl tetraglycol ether phosphoric acid ester and Ethylene oxide-propylene oxide copolymers. Emulsifiers from the class of the higher Alcohols are preferred in the concentration range of 2-14% (v / v) from the class the fatty alkyl tetraglycol ether phosphoric acid ester in the concentration range of 2-14% (v / v) and the ethylene oxide-propylene oxide copolymers in the concentration range of 5- 28% (v / v) used. It was also found that spherical particles of desired specificity only when using silicone oil with a preferred kinematic viscosity in the range between 10-1000 cSt as a dispersion medium, be preserved.
Zum Dispergieren des Zweiphasensystems eignen sich Homogenisier geräte/Emulgiervorrichtungen oder andere Mischvorrichtungen, die zu einer ausreichenden Scherwirkung führen. Bei Einsatz eines herkömmlichen Zweiblatt- Glasflügelrührers wurde gefunden, dass eine Erhöhung der Rührgeschwindigkeit um ca. 1000 U/min den mittleren Mikrokugeldurchmesser von 6 µm (bei ca. 455 U/min) auf 3 µm (bei 1420 U/min) reduziert. Einhergehend mit der Größenreduktion wurde bei steigender Rührgeschwindigkeit eine Verringerung der Polydispersität beobachtet.Homogenizers are suitable for dispersing the two-phase system equipment / emulsifying devices or other mixing devices which form one lead to sufficient shear. When using a conventional two-sheet Glass paddle stirrer was found to increase the stirring speed by approx. 1000 rpm the average microspherical diameter of 6 µm (at approx. 455 rpm) reduced to 3 µm (at 1420 rpm). Along with the size reduction was at increasing stirring speed a reduction in polydispersity was observed.
Die Alginatlösung wird vorzugsweise in einem Konzentrationsbereich von 0,1-4,0% (w/w) eingesetzt. Durch Wan et al (s. o.) ist bekannt, dass die Alginatkonzentration ein wichtiges Mittel ist, die Morphologie sowie den mittleren Durchmesser der erhaltenen sphärischen Partikel zu beeinflussen. Es wurde gefunden, dass mit steigender Alginatkonzentration, was gleichbedeutend mit einer Viskositätzunahme der Alginatlösung ist, der mittlere Beaddurchmesser deutlich ansteigt.The alginate solution is preferably in a concentration range of 0.1-4.0% (f / w) used. It is known from Wan et al (see above) that the alginate concentration is a important means is the morphology as well as the average diameter of the obtained to influence spherical particles. It was found that with increasing Alginate concentration, which is synonymous with an increase in viscosity Alginate solution is, the mean bead diameter increases significantly.
Als der Alginatlösung zuzusetzendes magnetisches Material kommen vorzugsweise Magnetitkolloide mit Partikelgrößen von 5 nm-1000 nm in Frage, wobei das Verfahren nicht auf diese Verbindungsklasse beschränkt ist. Solche Substanzen sind z. B. unter der Handelsbezeichnung Bayferrox® oder Ferrofluidics® erhältlich. Unter Ferrofluiden (magnetische Flüssigkeiten) versteht man stabile kolloidale Suspensionen ferromagnetischer Teilchen mit den makroskopischen Eigenschaften einer Flüssigkeit. Da die Herstellung derartiger Kolloide Stand der Technik ist, können die Magnetteilchen auch nach bekannten Verfahren, wie z. B. in US 3843540 beschrieben, hergestellt werden. Voraussetzung für den Einsatz der Magnetpartikel ist ihre Dispergierbarkeit in der Polymerphase. Es wurde gefunden, dass nur solche magnetischen Kolloide verwendet werden können, die mit der Alginatlösung kompatibel sind, d. h. bei denen die Alginatlösung keine Aggregation der Magnetpartikel auslöst. Ungeeignet sind daher solche magnetischen Kolloide, bei denen die Magnetpartikel durch kationische Verbindungen wie z. B. Polyethylenimin stabilisiert sind. Hier führt die ionogene Wechselwirkung zwischen der negativ geladenen Carboxylgruppe des Alginates und dem kationischen Stabilisator der magnetischen Partikel zu einer mehr oder weniger starken Aggregation der letzteren. Die Konzentration der magnetischen Flüssigkeit in der Polymerphase liegt, bezogen auf die Polymerphase, in der Regel zwischen 2,5-25% (v/v). Für die Herstellung werden die magnetischen Kolloide der Polymerphase direkt zugemischt. Um eine feindisperse, gleichmäßige Verteilung der Partikel zu gewährleisten ist ein hochtouriges Dispergierwerkzeug (Ultra-Turrax) förderlich.The magnetic material to be added to the alginate solution is preferably Magnetite colloids with particle sizes of 5 nm-1000 nm in question, the process is not limited to this connection class. Such substances are e.g. B. under the Trade name Bayferrox® or Ferrofluidics® available. Among ferrofluids (Magnetic liquids) are stable colloidal suspensions ferromagnetic particles with the macroscopic properties of a liquid. Since the production of such colloids is state of the art, the Magnetic particles also by known methods, such as. B. described in US 3843540 getting produced. The prerequisite for the use of the magnetic particles is theirs Dispersibility in the polymer phase. It was found that only such Magnetic colloids can be used with the alginate solution are compatible, d. H. where the alginate solution does not aggregate Triggers magnetic particles. Such magnetic colloids are therefore unsuitable for which the magnetic particles by cationic compounds such. B. polyethyleneimine are stabilized. Here the ionogenic interaction between the negative leads charged carboxyl group of the alginate and the cationic stabilizer of the magnetic particles to a more or less strong aggregation of the latter. The concentration of the magnetic liquid in the polymer phase is based on the polymer phase, usually between 2.5-25% (v / v). For manufacturing the magnetic colloids are mixed directly into the polymer phase. To be finely dispersed, Ensuring even distribution of the particles is a high-speed Dispersing tool (Ultra-Turrax) beneficial.
Der oben dargelegten erfindungsgemäßen Wasser/Öl-Dispersion wird nach ausreichender Homogenisierung eine wässrige Lösung eines ionogenen bivalenten Vernetzers zugesetzt. Eingesetzt werden bevorzugt Calciumionen, da sie preiswert und nicht toxisch sind. Die Konzentration des Vernetzers ist derart gewählt, dass die erhaltenen sphärischen Partikel eine ausreichende mechanische Stabilität besitzen, wodurch sie eine mehrminütige Ultraschallbehandlung unbeschadet überstehen. Die sich bildenden sphärischen magnetischen Calciumalginat Partikel werden durch Zentrifugation von den übrigen Dispersionsbestandteilen abgetrennt und in mehreren sich anschließenden Waschschritten mit einer Kombination aus hydrophilen und hydrophoben organischen Lösungsmitteln weiter gereinigt. Hierzu wird bevorzugt eine Mischung aus Aceton-Methanol, gefolgt von Hexan, verwendet. Die erhaltenen sphärischen Partikel werden als weißes (nicht magnetische Partikel) bzw. braunes (magnetische Partikel) Pulver nach Trocknung an der Luft erhalten. Sie sind als trockenes Pulver über eine längeren Zeitraum lagerbar.The water / oil dispersion according to the invention set out above is after sufficient homogenization an aqueous solution of an ionogenic bivalent Crosslinker added. Calcium ions are preferred because they are inexpensive and are not toxic. The concentration of the crosslinking agent is chosen such that the spherical particles obtained have sufficient mechanical stability, which means that they will survive an ultrasound treatment lasting several minutes without damage. The Spherical magnetic calcium alginate particles are formed by Centrifugation separated from the other dispersion components and in several subsequent washing steps with a combination of hydrophilic and hydrophobic organic solvents further cleaned. For this purpose, one is preferred Mixture of acetone-methanol followed by hexane was used. The received spherical particles are called white (non-magnetic particles) or brown (magnetic particles) Obtain powder after air drying. You are as dry powder can be stored for a longer period.
Dis lichtmikroskopische Evaluation einer wässrigen Suspension der so hergestellten sphärischen Partikel ergibt, dass der mittlere Partikeldurchmesser im Bereich zwischen 0,5-20 µm liegt. Durch eine geeignete Wahl der Parameter Konzentration/Viskosität der Alginatlösung, Viskosität des Silikonöls, Rührgeschwindigkeit und Art der Emulgiereinrichtung kann auf die durchschnittliche Größe der sphärischen Partikel Einfluss genommen werden.The light microscopic evaluation of an aqueous suspension of the thus produced spherical particles shows that the mean particle diameter in the range between 0.5-20 µm. By a suitable choice of the parameters concentration / viscosity the alginate solution, viscosity of the silicone oil, stirring speed and type of Emulsifier can be based on the average size of the spherical particles Be influenced.
Die so hergestellten sphärischen Partikel können gemäß der Erfindung zu Separationszwecken eingesetzt werden. Hierzu werden die sphärischen magnetischen Partikel in Anlehnung an zahlreiche in der Literatur bekannte Verfahren [S. Binbaum et al. Biotechnol. Lett., 3, 393-400, 1981; I. A. Veliky et al. Biotechnol. Lett., 3, 275-280, 1981; DE 31 33 123] durch Beschichten mit einem kationischen Polymeren, vorzugsweise Polyethylenimin, modifiziert. Diese äußere Hülle verleiht den Mikropartikeln aufgrund der im pH-Bereich von 5-7 vorliegenden protonierten Aminogruppen des Polyethylenimins eine positive Oberflächenladung. Diese kann zur Separation von entgegengesetzt geladenen Substanzen aus einem Gemisch durch Einwirkung eines Magnetfeldes ausgenützt werden.The spherical particles thus produced can according to the invention Separation purposes are used. For this the spherical magnetic Particles based on numerous methods known in the literature [p. Binbaum et al. Biotechnol. Lett., 3, 393-400, 1981; I. A. Veliky et al. Biotechnol. Lett., 3, 275-280, 1981; DE 31 33 123] by coating with a cationic polymer, preferably modified polyethyleneimine. This outer shell gives the Microparticles due to the protonation in the pH range of 5-7 Amino groups of the polyethyleneimine have a positive surface charge. This can be used Separation of oppositely charged substances from a mixture Exposure to a magnetic field can be exploited.
Die Erfindung wird anhand nachfolgender Ausführungsbeispiele, deren Angaben nicht einschränkend sind, erläutert.The invention is based on the following exemplary embodiments, the details of which are not are restrictive explained.
In einem Becherglas werden 1000 ml eines hochviskosen Silikonöls (Silikonöl AK 350; Wacker) vorgelegt und unter Rühren (zweiblättriger Metallflügelrührer) werden jeweils 66,7 ml der Emulgatoren Hostaphat KL 340 N® (Hoechst, Frankfurt) und Isofol 16® (CONDEA, Brunsbüttel) sowie 133,3 ml des Emulgators Synperonic PE L62® (C. H. Erbslöh, Krefeld) zugegeben. Diese Mischung wird zur Homogenisierung einige Minuten gerührt. Man setzt nun unter Rühren 20,0 ml einer frisch bereiteten 1,5% igen Alginatlösung zu. Man läßt 5 Minuten rühren und tropft unter Rühren 66,7 ml einer wäßrigen 0.1 M CaCl2-Lösung zu. Diese Mischung wird weitere 15 Minuten gerührt und anschließend zentrifugiert. Der Überstand wird abdekantiert und der Rückstand mehrfach, zunächst mit einer ausreichenden Menge einer 1 : 1-Mischung aus Aceton und Methanol und anschließend mit Hexan gewaschen. Die erhaltenen sphärischen Calciumalginat-Partikel liegen nach Trocknen an der Luft als weißes Pulver vor.1000 ml of a highly viscous silicone oil (AK 350 silicone oil; Wacker) are placed in a beaker and 66.7 ml of the Hostaphat KL 340 N® (Hoechst, Frankfurt) and Isofol 16® (CONDEA, Brunsbüttel) emulsifiers are added with stirring (two-bladed metal paddle stirrer) ) and 133.3 ml of the emulsifier Synperonic PE L62® (CH Erbslöh, Krefeld) added. This mixture is stirred for a few minutes for homogenization. 20.0 ml of a freshly prepared 1.5% alginate solution are now added with stirring. The mixture is stirred for 5 minutes and 66.7 ml of an aqueous 0.1 M CaCl 2 solution are added dropwise with stirring. This mixture is stirred for a further 15 minutes and then centrifuged. The supernatant is decanted off and the residue is washed several times, first with a sufficient amount of a 1: 1 mixture of acetone and methanol and then with hexane. The spherical calcium alginate particles obtained are in the form of a white powder after drying in air.
Die Durchführung erfolgt analog der Herstellung für nicht-magnetische Partikel aus Beispiel 1 mit dem Unterschied, dass eine magnetithaltige Alginatlösung eingesetzt wird. Diese wird durch Mischen von 100 ml einer frisch breiteten 1,5%igen Alginatlösung mit 10 ml eines Ferrofluids (stärkestabilisiert, mittlerer Partikeldurchmesser: 10-200 nm) hergestellt. 20 ml dieser magnetithaltigen Alginatlösung werden zu Herstellung der sphärischen Partikel eingesetzt. Die magnetithaltigen sphärischen Partikel werden nach Trocknen an der Luft als braunes Pulver erhalten.The procedure is analogous to the production for non-magnetic particles Example 1 with the difference that a magnetite-containing alginate solution was used becomes. This is made by mixing 100 ml of a freshly spread 1.5% Alginate solution with 10 ml of a ferrofluid (starch stabilized, medium Particle diameter: 10-200 nm). 20 ml of this magnetite Alginate solutions are used to produce the spherical particles. The magnetite-containing spherical particles are after drying in air as get brown powder.
4,5 g einer 50%igen wässrigen Polyethyleniminlösung (MW 50000-100000) werden in 300 ml dest. Wasser gelöst. Mit ca. 9 ml 3M HCl wird ein pH-Wert von 5,5 eingestellt. Die Lösung wird einige Tage stehen gelassen und dann durch einen 0,8 µm Sterilfilter filtriert. 300 ml des erhaltenen trüben Filtrates werden für die weitere Reaktion benötigt.4.5 g of a 50% aqueous polyethyleneimine solution (MW 50000-100000) in 300 ml dist. Water dissolved. With approx. 9 ml of 3M HCl a pH value of 5.5 set. The solution is left to stand for a few days and then through a 0.8 µm Filtered sterile filter. 300 ml of the cloudy filtrate obtained are used for the further Response needed.
24 mg magnetithaltige Alginat-Partikel werden in ca. 10 ml dest. Wasser suspendiert und zur Homogenisierung durch eine Glasfritte (deren Porengrösse abhängig ist vom mittleren Durchmesser der Partikel) filtriert. Das Filtrat wird mit dest. Wasser auf 250 ml aufgefüllt. Die so erhaltene Partikel-Suspension wird gerührt und dabei über einige Stunden in eine Vorlage aus 300 ml der obigen Polyethyleniminlösung getropft.24 mg magnetite-containing alginate particles are dissolved in approx. 10 ml. Water suspended and for homogenization through a glass frit (whose pore size depends on the average diameter of the particles) filtered. The filtrate is distilled. Water to 250 ml filled up. The particle suspension obtained in this way is stirred and in the course of some Dripped into a template from 300 ml of the above polyethyleneimine solution for hours.
Die Separation der sphärischen Partikel erfolgt durch einen am Gefäßboden befindlichen Handmagneten. Die Separationsdauer ist abhängig von der Stärke des eingesetzten Magneten und kann einige Tage in Anspruch nehmen. Nach erfolgter Separation wird die überstehende Lösung abdekantiert und die Partikel werden portionsweise mit insgesamt ca. 400 ml dest. Wasser gewaschen, wobei die Separation der Kapseln nach jedem Waschvorgang jeweils über einen am Gefäßboden plazierten Handmagneten erfolgt. Die sphärischen Partikel liegen nach beendeter Aufarbeitung stark aggregiert vor. Zur Separation der sphärischen Partikel werden die Kapseln in wenigen ml dest. Wassers resuspendiert und einige Minuten mit Ultraschall (z. B. durch einen Ultraschallprozessor mit geeigneter Sonotrode) behandelt.The spherical particles are separated by a on the bottom of the vessel hand magnets. The separation time depends on the strength of the used magnets and can take a few days. After done Separation, the supernatant solution is decanted off and the particles become in portions with a total of approx. 400 ml of dist. Washed water, separating of the capsules after each washing process, each placed on the bottom of the container Hand magnet is done. The spherical particles lie after processing strongly aggregated before. To separate the spherical particles, the capsules are placed in a few ml of dist. Resuspended water and a few minutes with ultrasound (e.g. by treated with an ultrasonic processor with a suitable sonotrode).
Claims (18)
- a) zur Herstellung von zwei Flüssigkeitsphasen ausgegangen wird,
- b) die eine Flüssigkeitsphase eine gelöste Substanz enthält und in Form von Tropfen in der anderen Phase dispergiert ist.
- a) it is assumed that two liquid phases are produced,
- b) a liquid phase contains a dissolved substance and is dispersed in the form of drops in the other phase.
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