DE10025809A1

DE10025809A1 - Verfahren und Vorrichtung zum Steuern des Stoffaustauschs zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre

Info

Publication number: DE10025809A1
Application number: DE2000125809
Authority: DE
Inventors: Ralph Mueller; Matthias Hinger
Original assignee: BASF Lynx Bioscience AG
Current assignee: Sygnis Pharma AG
Priority date: 2000-05-24
Filing date: 2000-05-24
Publication date: 2001-11-29
Also published as: AU2001283821A1; WO2001090721A1

Abstract

Das Verfahren kann bei allen offenen Proben bzw. Reaktionsräumen eingesetzt werden. Insbesondere dient es zum Konditionieren von Mikrotiterplatten mit einer Vielzahl an kleinen Wells beim Aufbau von DNA-Arrays. Die Atmosphäre um die Mikrotiterplatte enthält Wasserdampf, und die Wells enthalten wässrige Lösungen. Zwischen Atmosphäre und Lösungen kommt es zu einem ständigen Austausch von Wasser durch Kondensation und Verdunstung. Um keinen dieser Prozesse Überhand gewinnen zu lassen, wird der Taupunkt des Wasserdampfs für die umgebende Atmosphäre bestimmt. Anschließend wird die Temperatur der Probe auf den Taupunkt geregelt. Dadurch ergibt sich ein verschwindender Nettoaustausch von Wasser zwischen den Lösungen in den Wells und der umgebenden Atmosphäre. Die Mikrotiterplatte mit den Lösungen in den Wells kann so mehrere Tage an der offenen Atmosphäre gehalten werden, ohne daß sich die Konzentrationen der Stoffe in den Wells ändern.

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Steuern des Stoffaustauschs zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre, wo bei die Atmosphäre einen Dampf eines Stoffs enthält und die Probe diesen Stoff enthält oder ihn aufnehmen kann. Ferner betrifft die Erfindung eine Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens.

Zur Aufklärung der molekularen Wirkung von potentiellen Medika menten werden sogenannte Genomexpressionsprofilanalysen durchge führt. Dabei wird versucht, die tatsächlich in einer Zelle exprimierten Gene zu bestimmen, da die zugehörigen Proteine Einfluß auf die Entwicklung der Zelle nehmen. Eine Möglichkeit, die tatsächlich vorhandenen Proteine zu bestimmen, besteht darin, die in der Zelle synthetisieden m-RNA zu be stimmen, da aus ihnen die Proteine gebildet werden. Dazu werden isolier te Zellen aufgeschlossen. Durch geeignete Aufreinigungsschritte wird die m-RNA aus den Zellen isoliert. Danach wird sie idR mittels der Reversen Transkriptase in c-DNA übersetzt. Diese wird mit idR linearer PCR amplifi ziert. Dabei wird sie idR radioaktiv oder mit Farbstoffen markiert. Die so gewonnene c-DNA wird anschließend z. B. mit Hilfe von geeigneten DNA- Arrays qualitativ bzw. quantitativ analysiert. Bei der Analyse wird die Bin dung bzw. Hybridisierung der gewonnenen DNA-Moleküle an geeignete, auf dem Array immobilisierte DNA-Fragmente detektiert.

Hierzu bedarf es der Herstellung geeigneter DNA-Arrays. Diese wer den idR ausgehend von Mikrotiterplatten hergestellt, die Lösungen mit geeigneten DNA-Fragmenten in den Wells enthalten. Die Wells sind kleine Vertiefungen mit einem Volumen pro Well von beispielsweise 20 µl. Jedes Well enthält ein bekanntes, speziell synthetisiertes DNA-Fragment. Zum Aufbau eines DNA-Arrays werden jeweils z. B. 220 pl Lösung aus einem Well auf eine genau definierte Position auf z. B. einem Objektträger (Slide) pipet tiert. Dies wird von Robotern durchgeführt, sog. Spotting-Robotern. Der Aufbau eines kompletten DNA-Arrays dauert einige Stunden bis einige Ta ge und wird idR in einer abgeschlossenen Kammer durchgeführt.

Die pipettierten DNA-Fragmente werden anschließend auf dem Slide immobilisiert, sei es durch eine kovalente Crosslinking-Reaktion oder durch einfache Adsorption.

Anschließend wird die zu untersuchende Probe auf das Slide bzw. das DNA-Array gegeben. Die Probe enthält radioaktiv oder mit Farbstoffen markierte DNA- oder RNA-Moleküle. In einer speziellen Hybridisierungs kammer wird bei geeigneter Temperatur die Hybridisierung abgewartet. Nicht hybridisierte DNA oder RNA aus der zu untersuchenden Probe wird durch Spülen entfernt. Hybridisierte DNA- oder RNA-Moleküle werden in einem Reader detektiert.

Schwierigkeiten bereitet dabei die schnelle Verdunstung der Lö sungsmittel aus den kleinen Volumina der Wells, wodurch es zu einer Kon zentrationsverschiebung und damit zur Änderung von Reaktionsbedin gungen kommt. Es kann während der Dauer des Pipettierens teilweise zu einer vollständigen Verdunstung des Lösungsmittels kommen. DNA-Arrays mit wohldefinierten Eigenschaften können so nicht aufgebaut werden.

Der Verdunstung kann prinzipiell durch Kühlen der Mikrotiterplatte entgegengewirkt werden. Bei hoher Luftfeuchtigkeit führt eine niedrige Temperatur der Mikrotiterplatte jedoch zu Kondensation auf der Mikroti terplatte. Dadurch kommt es zu einem Flüssigkeitseintrag in die Wells, und die Konzentration der Lösungen in den Wells ändert sich. Die Reaktionsbe dingungen für den Aufbau der DNA-Arrays ändern sich dadurch in unkon trollierter Weise. Bei stärkerer Kondensation kann es sogar zu einem über laufen der Wells kommen, wodurch sich die Lösungen in den einzelnen Wells teilweise mischen. Ein DNA-Array kann unter diesen Bedingungen nicht mehr zuverlässig aufgebaut werden.

Zur Lösung dieser Probleme werden die Mikrotiterplatten derzeit auf verschiedene Art verschlossen, z. B. mit Heißkleber versiegelt oder durch ein Laminierverfahren oder ein Folien-Verschweißungsverfahren verschlos sen. Häufig wird die gesamte Mikrotiterplatte durch einen Deckel ver schlossen, der für jeden Pipettiervorgang wieder entfernt werden muß (sog. Lidding-Delidding). Alle diese Möglichkeiten verlangen einen hohen technischen und zeitlichen Aufwand. Sie erfordern zusätzliche Arbeits schritte.

Aufgabe der Erfindung ist es, den Stoffaustausch zwischen einer Pro be und der die Probe umgebenden Atmosphäre zu steuern.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren mit den Merkmalen des Anspruchs 1 sowie durch eine Vorrichtung mit den Merk malen des Anspruchs 7 gelöst.

Die Probe kann eine Lösung sein, z. B. DNA-Moleküle in einer wässri gen Pufferlösung. Es kann auch jede andere Lösung sein. Ferner kann die Probe ein Festkörper sein, z. B. Eis, der Stoff mit der Umgebung über Subli mation austauschen kann.

Der Stoff ist üblicherweise ein Lösungsmittel, wie Wasser, wässrige Pufferlösung, Alkohol oder ähnliches, mit dem zugehörigen Dampfdruck. Der Stoff kann aber auch ein Festkörper mit seinem zugehörigen Dampf druck sein, beispielsweise Eis oder PVC. Auch kann der Dampfdruck durch z. B. Ultraschallvernebler gezielt erhöht werden, da der Dampfdruck über den stark gekrümmten Oberflächen kleiner Tröpfchen erhöht ist.

Zwischen der Probe und dem Stoff bzw. seinem Dampf findet ein kontinuierlicher Austausch mittels Verdampfen und Kondensation statt. Diese Prozesse sind von thermodynamischer, statistischer Natur. Auch bei höheren Temperaturen treten einzelne Moleküle aus dem Dampf in die Probe ein (Kondensation); allerdings überwiegt bei höheren Temperaturen der Austritt von Molekülen aus der Probe in die umgebende Atmosphäre (Verdunstung).

Die Konzentration des Dampfs in der umgebenden Atmosphäre, d. h. der Partialdruck des Dampfs, kann maximal gleich dem Sättigungs dampfdruck bei der jeweiligen Temperatur sein. Übersteigt der Par tialdruck den Sättigungsdampfdruck, so wird der Überschuß durch Kon densation abgeschieden. Dies kann beispielsweise an der Probe eintreten, wenn die Temperatur der Probe so niedrig ist, daß der zur niedrigen Pro bentemperatur gehörige Sättigungsdampfdruck unter dem momentanen Partialdruck des Dampfs in der die Probe umgebenden wärmeren Atmosphäre liegt. In einer solchen Situation kommt es zu Kondensation auf der Probe.

Im umgekehrten Fall, in dem die Probe hinreichend warm ist und der Partialdruck des Dampfs noch nicht den Sättigungsdruck erreicht hat, kommt es zu Verdunstung.

Entscheidend für die Frage, ob es zu Verdunstung oder Kondensation auf der Probe kommt, sind somit die Temperatur der Probe und der Par tialdruck des Dampfs über der Probe. Die Temperatur der Probe muß sich dabei am Taupunkt des Dampfs in der die Probe umgebenden Atmo sphäre orientieren. Der Taupunkt des Dampfs ist diejenige Temperatur, bei der der Partialdruck des Dampfs gleich dem Sättigungsdampfdruck ist. Liegt die Temperatur der Probe über dem Taupunkt, kommt es zu einer effektiven Verdunstung; liegt sie darunter, kommt es zu Kondensation.

Daher wird zur Steuerung des Stoffaustauschs zunächst der Taupunkt bestimmt. Dies kann z. B. mit einem Taupunkt-Hygrometer geschehen.

Zur Einstellung eines minimalen Stoffaustauschs mit der Umgebung kann dann z. B. die Temperatur der Probe um den Taupunkt herum gere gelt werden. Dadurch ergibt sich abwechselnd eine minimale Verdun stung und eine minimale Kondensation, die sich in der Summe gegenseitig aufheben.

Selbst eine kleine Probe von z. B. 20 µl in einem Well kann mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens mindestens drei bis vier Tage an der offe nen Atmosphäre gehalten werden; während dieser Zeit bleiben die Kon zentrationen der Stoffe in der Probe konstant. Man erhält konstante und reproduzierbare Bedingungen der Lösungen in den Wells über einen lan gen Zeitraum. Daraus ergeben sich ebenso genau definierte Mengen z. B. der DNA-Fragmente auf einem DNA-Array. Es kann somit auch ein großes DNA-Array über mehrere Tage hinweg unter genau definierten Bedingun gen aufgebaut werden.

Diese Vorteile werden mit einfachsten technischen Mitteln erreicht. Auch können Störungen der Umgebungsbedingungen, z. B. durch Öffnen der Reaktionskammer oder des gesamten Automationssystems, schnell ausgeglichen werden.

In der Regel wird die Kammer, in der sich die Mikrotiterplatte befin det durch einen Lüfter belüftet. Dieser stört das Gleichgewicht des Austau sches zwischen Probe und Umgebung dahingehend, daß er aus der Pro be verdunstetes Lösungsmittel wegträgt. Dies muß durch Kondensation wieder ausgeglichen werden. Daher wird die Temperatur der Probe idR nicht genau auf den Taupunkt eingestellt bzw. um den Taupunkt herum geregelt. Vielmehr wird die Temperatur der Probe leicht unter den Tau punkt eingestellt, so daß es zu einer leichten Kondensation kommt, die die Verdunstungsverluste aufgrund des Lüfters ausgleicht.

In einer anderen Variante kann ein gezieltes leichtes Verdunsten der Probe eingestellt werden. Dazu wird die Temperatur der Probe leicht über dem Taupunkt eingestellt. Zusätzlich sollte der Partialdruck des Dampfs un ter dem Sättigungsdruck sein, da es sonst zu keiner Verdunstung kommt, da die umgebende Atmosphäre keinen weiteren Dampf mehr aufneh men könnte.

Ebensogut kann durch Einstellen der Temperatur der Probe unterhalb des Taupunkts ein gezieltes Kondensieren herbeigeführt werden.

Statt die Temperatur der Probe zu regeln, kann auch die Temperatur der Atmosphäre bezogen auf den Taupunkt des Dampfs des Stoffs oder der Dampfdruck des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre bezogen auf den Sättigungsdampfdruck eingestellt werden. Der Dampfdruck über der Probe läßt sich auf einfache Weise über einen Verdampfer einstellen. Im einfachsten Fall ist dies eine Heizplatte unter einem offenen Lösungsmit telbehälter.

Es können auch sowohl die Atmosphäre als auch die Temperatur der Probe gleichzeitig in geeigneter Weise eingestellt werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann auch dazu verwendet wer den, einen genau definierten Eintrag verschiedener Lösungsmitteln her beizuführen, indem über der Probe die zugehörigen Dampfdrücke aufge baut werden.

Auf diese Weise können minimale Mengen von Stoffen in die Probe eintragen werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist damit auch in der Lage, Pumpen, z. B. Mikropumpen oder piezoelektrischen Pipettierköpfen auf der technischen Basis von Tintenstrahlköpfen, zu ersetzen. Letztere können etwa 100 pl dosieren. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Kondensa tionskontrolle können über das Einstellen von geringen Partialdrücken, kleinen Oberflächen und kurzen Wechselwirkungszeiten nahezu beliebig kleine Mengen Lösungsmittel eingetragen bzw. auf festen Oberflächen abgeschieden werden. Es können so Wells gezielt mit geringen Mengen an Lösungsmitteln gefüllt werden, Konzentrationen geändert werden und Mischungen erstellt werden.

Bei Einstellung der Temperatur der Probe leicht oberhalb des Tau punkts können auch gezielt Mischdämpfen mit jeweils definierten Par tialdrücken hergestellt werden. Dazu können verschiedene Lösungsmittel z. B. in verschiedenen Wells einer Mikrotiterplatte vorgesehen werden, oder es werden zeitlich nacheinander verschiedene Lösungsmittel verdampft.

Auch ein zuverlässiges vorübergehendes Aufbewahren von Proben, insbesondere Flüssigkeitsproben bzw. Lösungen, in offenen Gefäßen, etwa nach Abschluß einer Reaktion oder einer Reaktionsfolge wie der PCR- Reaktion, kann mit dem erfindungsgemäßen Verfahren erreicht werden.

Schließlich kann das erfindungsgemäße Verfahren auch zum Be schichten von Substraten verwendet werden.

Der Taupunkt des Dampfs kann auch durch Messen der Temperatur der umgebenden Atmosphäre und des Dampfdrucks des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre bestimmt werden. Aus diesen beiden Größen läßt sich der Taupunkt berechnen. Der Dampfdruck kann dabei auch als relativer Dampfdruck, etwa als relative Luftfeuchtigkeit, gemessen wer den, d. h. als prozentualer Anteil am Sättigungsdampfdrucks. Die relative Luftfeuchtigkeit kann beispielsweise mit einem Hygrometer oder sonstigen relativen oder absoluten Feuchtesensoren bestimmt werden. Aus der Temperatur ergibt sich der (absolute) Sättigungsdampfdruck des Stoffs in der Atmosphäre. Aus dem Sättigungsdampfdruck des Stoffs und dem re lativen Dampfdruck ergibt sich der Partialdruck des Stoffdampfs. Aus die sem wiederum erhält man über geeignete Referenzwerte den Taupunkt. Dieser kann unter nicht ungewöhnlichen Bedingungen z. B. bei 8°C liegen.

Eine weitere Möglichkeit, den Taupunkt zu bestimmen erhält man, wenn man das Gewicht der Probe kontinuierlich mißt. Wird beispielsweise die Temperatur der Probe geregelt, so erhöht Kondensat das Gewicht der Probe, sobald die Temperatur der Probe unter dem Taupunkt liegt. Liegt die Temperatur der Probe über dem Taupunkt, so verringert Verdunstung das Gewicht der Probe. Es läßt sich somit der Taupunkt als diejenige Tem peratur bestimmen, bei der sich das Gewicht nicht ändert. Auf diese Wei se ist eine Regelung um den Taupunkt und eine Stoffaustauschkontrolle einfach möglich.

Die verschiedenen Möglichkeiten der Taupunkt-Bestimmung können kombiniert werden.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung zum Ausführen des erfindungs gemäßen Verfahrens wird dann ein Mittel zum Messen der Temperatur der Probe aufweisen, wenn die Temperatur der Probe geregelt werden soll, was bevorzugterweise geschieht.

Zur schnellen und genauen Steuerung der Temperatur einer Mikro titerplatte wird die Mikrotiterplatte vorzugsweise in eine Negativform mit Vertiefungen für die Wells gesetzt. Diese Form kann z. B. aus Aluminium oder Kupfer gefertigt werden. Die Form selbst wird dann über eine Tem peratur-Regeleinrichtung temperiert. Sie kann etwa von temperiertem, zweifach destilliertem Wasser aus einem Kryostat durchspült werden, oder sie wird von einem Peltierelement oder einer Kombination aus beidem gekühlt. Durch den engen Kontakt zwischen den Wells und der Negativ form kann die Temperatur der Probe schnell und genau geregelt werden.

Weitere vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindung sind in den Un teransprüchen gekennzeichnet.

Im folgenden wird die Erfindung anhand eines Ausführungsbeispiels näher erläutert, das in der Figur schematisch dargestellt ist. Im einzelnen zeigt:

Fig. 1 eine schematische Darstellung einer Vorrichtung zum Steuern des Stoffaustauschs zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre.

Fig. 1 zeigt eine Mikrotiterplatte 10 mit Wells 12, die auf einer kupfer nen Negativform 14 mit Vertiefungen 15 für die Wells 12 angeordnet ist. Über der Mikrotiterplatte 10 befindet sich ein Pipettier-Roboter 16, der Lö sungen aus den Wells 12 der Mikrotiterplatte 10 auf einen Objektträger 18 aufträgt. Auf dem Objektträger 18 wird auf diese Weise ein DNA-Array aufgebaut.

In der Atmosphäre über der Mikrotiterplatte 10 befindet sich ein Feuchte- und Temperatursensor 20, der mit einem Mikrocontroller 22 ver bunden ist. Der Mikrocontroller 22 berechnet aus den Feuchte- und Tem peraturdaten den Taupunkt.

Der Mikrocontroller 22 regelt auch die Temperatur der Mikrotiterplat te 10 über einen Kryostaten 24, mit dem er über eine Leitung 26 kommuni ziert. Der Kryostat 24 temperiert die Negativform 14 mit gekühltem Wasser. Das Wasser wird über einen Zulauf 28 und einen Rückfluß 30 zwischen Kryostat 24 und Negativform 14 transportiert.

Außer den Temperatur- und Feuchtewerten der Atmosphäre wird noch von einem Sensor 32 die Temperatur der Mikrotiterplatte 10 gemes sen. Das Messsignal wird dem Mikrocontroller 22 über eine Leitung 34 zu geführt.

Im einfachsten Fall prüft der Mikrocontroller 22 ob die Temperatur der Mikrotiterplatte 10 über dem Taupunkt liegt. Ist dies der Fall, sendet der Mikrocontroller 22 ein geeignetes Regelsignal über die Leitung 26 an den Kryostaten 24, der daraufhin die Temperatur des Wassers entspre chend senkt, um die Mikrotiterplatte 10 an den Taupunkt heran zu führen.

Im Rahmen der Erfindung sind zahlreiche Abwandlungen und Weiterbildungen der beschriebenen Ausführungsbeispiele verwirklichbar.

So ist es beispielsweise möglich, ganze Stapel von Mikrotiterplatten gleichzeitig zu temperieren und damit diese im Stoffaustausch zu kontrollieren. Dazu kann jede einzelne Probe, hier also jede Mikrotiterplatte, auf einer Kälteplatte ruhen. Denkbar ist aber auch, daß der Raum, in dem die Proben lagern, insgesamt temperiert wird. Durch ein Kühlen des Raums werden auch die Proben gekühlt. Wird anschließend Dampf in den Raum eingeleitet, so kondensiert er u. a. auf der Probe.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist auch nicht auf die Anwendung auf Mikrotiterplatten beschränkt. Es kann für beliebig geformte Proben eingesetzt werden.

Bezugszeichenliste

10

Mikrotiterplatte

12

Well

14

kupferne Negativform

15

Vertiefungen

16

Pipettier-Roboter

18

Objektträger

20

Feuchte- und Temperatursensor

22

Mikrocontroller

24

Kryostat

26

Kommunikationsleitung

28

Zulauf

30

Rückfluß

32

Temperatursensor

34

Kommunikationsleitung

Claims

1. Verfahren zum Steuern des Stoffaustauschs zwischen einer Probe und der die Probe umgebenden Atmosphäre,
wobei die umgebende Atmosphäre einen Dampf eines Stoffs enthält und die Probe diesen Stoff enthält oder ihn aufnehmen kann,
dadurch gekennzeichnet
daß der Taupunkt des Dampfs des Stoffs in der umgebenden Atmo sphäre bestimmt wird; und
daß die physikalischen Eigenschaften der Probe und/oder der um gebenden Atmosphäre derart bezogen auf den Taupunkt des Dampfs des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre eingestellt werden, daß sich eine gewünschte Kondensation des Dampfs in oder auf die Probe bzw. Verdunstung bzw. Sublimation des Stoffs aus der Probe ergibt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Taupunkt des Dampfs durch Bestimmen der Temperatur der umgebenden Atmosphäre und des Dampfdrucks des Stoffs in der umgebenden Atmo sphäre bestimmt wird.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß der Taupunkt des Dampfs durch Bestimmen der Temperatur der umge benden Atmosphäre und der relativen Feuchte des Stoffs in der umge benden Atmosphäre bestimmt wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekenn zeichnet, daß der Taupunkt des Dampfs durch Bestimmen des Gewichts der Probe bestimmt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekenn zeichnet, daß die Temperatur der Probe bezogen auf den Taupunkt des Dampfs des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre eingestellt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekenn zeichnet, daß die Temperatur der umgebenden Atmosphäre bezogen awf den Taupunkt des Dampfs des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre oder der Dampfdruck des Stoffs in der umgebenden Atmosphäre bezo gen auf den Sättigungsdampfdruck eingestellt werden.

7. Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens nach einem der An sprüche 1 bis 6 mit
einer Probe, die mit einer Atmosphäre in Kontakt ist, wobei die Atmo sphäre einen Dampf eines Stoffs enthält und die Probe diesen Stoff enthält oder ihn aufnehmen kann,
gekennzeichnet durch
Mittel (20, 22) zum Bestimmen des Taupunkts des Dampfs des Stoffs in der Atmosphäre, und durch
Mittel (32, 24) zum Einstellen der physikalischen Eigenschaften der Probe und/oder der Atmosphäre bezogen auf den Taupunkt des Dampfs des Stoffs in der Atmosphäre derart, daß sich eine gewünschte Kondensa tion des Dampfs in oder auf die Probe bzw. Verdunstung bzw. Sublimation des Stoffs aus der Probe ergibt.

8. Vorrichtung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe eine Mikrotiterplatte (10) ist, und daß die Mittel zum Einstellen der physikalischen Eigenschaften der Probe eine Temperatur-Regeleinrichtung (22, 24) für die Probe mit einer Negativform (14) der Mikrotiterplatte (10) mit Vertiefungen (15) für Wells (12) enthalten.