DE10019868A1 - Verfahren zur Gewinnung von Hyaluronsäure - Google Patents
Verfahren zur Gewinnung von HyaluronsäureInfo
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Hyaluronsäure durch Ausfällen als Polyelektrolytkomplex, bei dem eine hyaluronsäurehaltige Lösung oder Brühe oder ein hyaluronsäurehaltiger Extrakt und eine Hydrochlorid-Lösung eines ethoxylierten Fettamins in mindestens äquimolarem Verhältnis miteinander versetzt werden. Der ausfallende Hyaluronsäurekomplex wird danach separiert, mit einem Alkohol aufgeschlämmt und anschließend eine im Verhältnis zur Konzentration des zugesetzten Aminhydrochlorides mindestens stöchiometrische Menge alkoholische Alkalilauge zugegeben und danach die freigesetzte Hyaluronsäure aus dem Gemisch abgetrennt, mit Alkohol gewaschen und getrocknet. DOLLAR A Als ethoxyliertes Fettamin wird ein ethoxyliertes tertiäres Amin der Formel DOLLAR F1 wobei R - linear oder verzweigt ist mit einer Alkylkettenlänge von 6 bis 24 C-Atomen, vorzugsweise von 8 bis 18 C-Atomen und DOLLAR A x, y - ein Ethoxylierungsgrad von 2 bis 6 ist, DOLLAR A eingesetzt. DOLLAR A Die Erfindung zeichnet sich insbesondere durch eine hohe Produktivität und die Gewinnung von Hyaluronsäure in hoher Reinheit und ohne Verringerung des durchschnittlichen Molekulargewichtes aus.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung
von Hyaluronsäure über deren Ausbildung als Polyelek
trolytkomplex und ihre Freisetzung aus Lösungen und
Brühen, insbesondere solchen aus Fermentationsprozes
sen sowie aus Extrakten.
Hyaluronsäure, die aufgrund ihrer physiologischen
Vorzüge für medizinische und pharmazeutische Zwecke
sowie für kosmetische Anwendung zunehmende Bedeutung
erlangt hat, ist eine hochviskose, wässrige Lösung
bildendes, hochmolekulares Aminodisaccharid mit Mole
kulargewichten zwischen 50000 und mehreren Millionen.
Sie wird zunehmend biotechnisch hergestellt, aber
auch noch aus tierischem Gewebe, wie beispielsweise
dem Hahnenkamm, gewonnen. Das aus Glucuronsäure- und
Acetylglucosaminobausteinen in β 1,3-glykosidischer
Bindung bestehende Aminodisaccharid ist mit der
nächsten Einheit β 1,4-glykosidisch verbunden.
Verfahren zur Herstellung von Hyaluronsäure aus
Fermentationslösungen und -brühen sind bereits be
kannt und in der Patent- und Fachliteratur beschrie
ben [Methods in Enzymol. 28 (1972) 73, . . .].
Ein verbreitetes Verfahren der Gewinnung von Hyaluron
säure aus Fermentationsbrühen und -lösungen sieht
vor, Hyaluronsäure zunächst mit kationischen Detergen
zien, vorzugsweise Cetylpyridiniumsalze oder Cetyltri
methylammoniumchlord, als wasserunlöslichen Komplex
auszufällen, aus der Stammlösung abzutrennen und
anschließend mit Wasser zu waschen. Der ausgefällte
und abgetrennte wasserunlösliche Komplex wird danach
mittels eines gelösten organischen Salzes oder warmen
Ethanols aufgelöst und die Hyaluronsäure anschließend
mit Ethanol oder einer Salz-Lösung gefällt (J. E.
Scott Methods in Carbohydrate Chemistry, Vol. V,
Academic Press, New York-San Francisco-London, 1965;
EP 0 455 263).
Die wesentlichsten Nachteile dieses Verfahrens werden
in dem mit merklichen Verlusten an Hyaluronsäure
verbundenen langwierigen und aufwendigen Prozeß des
Auswaschens des Hyaluronsäure-Kationtensid-Komplexes
sowie in einer nicht ausreichenden Produktqualität
gesehen. Außerdem ist dieser Prozeß nachteilig mit
dem Abbau des mittleren Molekulargewichtes verbunden.
Darüber hinaus ist der Wasch- und Ausfällprozeß mit
einer Belastung des Abwassers mit Kationtensiden und
Salzen verbunden.
Die DE 197 12 931 A1 offenbart ein Verfahren, bei dem
Hyaluronsäure enthaltende Fermentationsbrühen oder
-lösungen mit der wässrigen Lösung eines Chitosansal
zes versetzt werden und der ausfallende Hyaluronsäu
re-Chitosan-Komplex anschließend abgetrennt wird.
Dieser wird danach mit verdünnter wässriger Alkalilau
ge behandelt. Das unlösliche Chitosan wird abgetrennt
und das Alkalisalz der Hyaluronsäure dann aus der
alkalischen und neutralisierten Lösung in bekannter
Weise ausgefüllt, gewaschen und getrocknet.
Mit diesem Verfahren verbindet sich insgesondere der
Nachteil, daß der Chitosan-Hyaluronsäure-Komplex über
längere Zeit mit 1 N Natronlauge behandelt werden muß
und dadurch die temporär freigesetzte Hyaluronsäure
partiell aufgespalten bzw. hydrolysiert wird. Als
Folge davon tritt eine deutliche Reduzierung des
mittleren Molekulargewichtes ein. Die mit dem in der
DE 197 12 931 A1 beschriebenen Verfahren verbundene
hohe Salzbelastung macht des weiteren langwierige
Reinigungsschritte erforderlich.
Aufgabe der Erfindung ist es daher, ein verbessertes
Verfahren zur kostengünstigen Gewinnung von Hyaluron
säure durch Ausfällen als Polyelektrolytkomplex be
reitzustellen, das eine hohe Ausbeute an Hyaluronsäu
re von hoher Reinheit und Qualität sowie ohne merkli
chen Abbau des mittleren Molekulargewichtes der Hyalu
ronsäure ermöglicht.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe durch ein Verfahren
gelöst, bei dem eine hyaloronsäurehaltige Lösung oder
Brühe oder eine hyaloronsäurehaltiger Extrakt und
eine Hydrochlorid-Lösung eines ethoxylierten Fet
tamins in mindestens äquimolarem Verhältnis miteinan
der versetzt werden. Der ausfallende Hyaluronsäurekom
plex wird danach separiert, mit einem Alkohol aufge
schlämmt. Anschließend wird eine im Verhältnis zur
Konzentration des zugesetzten Aminhydrochlorides min
destens stöchiometrische Menge alkoholische Alkalilau
ge zugegeben und danach die freigesetzte Hyaluronsäu
re aus dem Gemisch abgetrennt, mit Alkohol gewaschen
und getrocknet.
Vorteilhafte Ausgestaltungen des Verfahrens ergeben
sich aus den Merkmalen der Unteransprüche 2 bis 9.
Das erfindungsgemäße Verfahren zeichnet sich insbeson
dere durch eine hohe Produktivität und die Gewinnung
von Hyaluronsäure in hoher Reinheit und ohne Verringe
rung des durchschnittlichen Molekulargewichtes aus.
Im Unterschied zum Stand der Technik ist die Verwen
dung des teuren Ethanols und Propanols nicht erforder
lich.
Im folgenden soll das erfindungsgemäße Verfahren an
Ausführungsbeispielen näher erläutert werden.
In einem 4 l Rührreaktor wurden 2 l Fermentationslö
sung mit einem Gehalt von 4 g Hyaluronsäure pro Liter
vorgelegt. Als Komplexierungsmittel wurde das Hydro
chlorid von ethoxyliertem Talgamin (Atlas G 3762)
vorgegeben. Von diesem Amintensid-HCl-Salz wurden
7,02 g in 1,5 l Wasser gelöst und innerhalb von 3
Stunden unter Verwendung eines Ankerrührers bei
300 U/min und unter Raumtemperaturbedingungen der Fermen
tationslösung zugegeben. Nach beendeter Zugabe der
wässrigen Lösung des Amintensid-HCl-Salzes wurde noch
ca. 1 h gerührt und anschließend der flockige Nieder
schlag durch Zentrifugieren abgetrennt. Die auf diese
Weise erhaltene schwach bräunlich gefärbte gelartige
Masse wurde in 1,5 l Methanol aufgenommen und mittels
eines Propellerrührers bei ca. 1500 U/min im Lösungs
mittel weitestgehend homogenisiert.
Die Aufschlämmung wurde in einem Rührreaktor vorge
legt und unter Rühren bei ca. 300 U/min eine zur
Aminhydrochlorid-Lösung äquimolare Menge methanoli
scher Natronlauge innerhalb von 2 Stunden zugegeben.
Nachdem weitere 2 Stunden gerührt wurde, ist der
Niederschlag über eine G4-Fritte abgetrennt und
anschließend noch zweimal mit je 500 ml Methanol
gewaschen und danach getrocknet worden. Nach der
Trocknung im Vakuumtrockenschrank wurden 3,85 g
Hyaluronsäure erhalten und damit eine Ausbeute von
48% erzielt.
In einem zweiten Ausführungsbeispiel wurde bei glei
chen Ausgangsbedingungen (4 g Hyaluronsäure je 1
Liter Fermentationslösung) die doppelte molare Menge
an wässriger Hydrochloridlösung des ethoxylierten
Talgamin (Atlas G 3762), (15,84 g in 1,5 l Wasser),
der Fermentationslösung zugegeben. Bei ansonsten
gleichen Verfahrensbedingungen wurden 8 g Hyaluronsäu
re gewonnen und damit eine 100%ige Ausbeute erzielt.
Für die jeweils gewonnene Hyaluronsäure wurden nahezu
identische Grenzviskositätswerte ermittelt. Bei der
nach dem ersten Ausführungsbeispiel gewonnenen Hyalu
ronsäure betrug dieser 931,3 cm3/g, während er bei
dem zweiten Ausführungsbeispiel bei 973,5 cm3/g lag.
Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnene
Hyaluronsäure wurde bezüglich ihrer Polymermorpholo
gie mittels Lichtmikroskopie im Dunkelverfahren ver
gleichenden Untersuchungen zu durch Gefriertocknung
isolierter Hyaluronsäure unterzogen.
Sowohl bei 125-facher als auch bei 500-facher Vergrö
ßerung zeigten die erhaltenen Bilder hinsichtlich der
Morphologie der Hyaluronsäure keine Unterschiede in
Abhängigkeit von den zugrunde liegenden Verfahren.
Auch gaben die Bilder keine Hinweise auf irgendwelche
Verunreinigungen.
Erfindungsgemäß wird die gestellte Aufgabe des weite
ren durch ein Verfahren mit den Merkmalen des An
spruchs 10 gelöst. Vorteilhafte Ausgestaltungen
dieses Verfahrens ergeben sich aus den Merkmalen der
Ansprüche 11 bis 13.
Die Anwendung dieses erfindungsgemäßen Verfahrens hat
überraschend in vorteilhafter Weise gezeigt, daß mit
den ausgewählten Polykationen im Unterschied zu
klassischen Flockungsmitteln, wie hochmolekulare
kationische Acrylamidpolymere oder hochmolekulare
Reincationics, keine Einschlußflockung von polymeren
oder niedermolekularen Nebenprodukten zu verzeichnen
war. Die genannten Vorzüge wiegen den erforderlichen
Einsatz eines größeren Volumens an vorentionisiertem
Wasser bei weitem auf.
Claims (13)
1. Verfahren zur Gewinnung von Hyaluronsäure durch
Ausfällen als Polyelektrolytkomplex, dadurch
gekennzeichnet, daß eine hyaluronsäurehaltige
Lösung oder Brühe oder ein hyaluronsäurehalti
ger Extrakt und eine Hydrochlorid-Lösung eines
ethoxylierten Fettamins in mindestens äquimola
rem Verhältnis miteinander versetzt werden,
danach der ausfallende Hyaluronsäurekomplex
separiert, mit einem Alkohol aufgeschlämmt und
anschließend eine im Verhältnis zur Konzentra
tion des zugesetzten Aminhydrochlorides minde
stens stöchiometrische Menge alkoholische Alka
lilauge zugegeben und danach die freigesetzte
Hyaluronsäure aus dem Gemisch abgetrennt, mit
Alkohol gewaschen und getrocknet wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeich
net, daß als ethoxyliertes Fettamin ein schwach
basisch ethoxyliertes tertiäres Amin verwendet
wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge
kennzeichnet, daß als schwach basisch ethoxy
liertes tertiäres Amin ein Fettamin der Formel
eingesetzt wird, wobei
R - linear oder verzweigt ist mit einer Alkyl kettenlänge von 6 bis 24 C-Atomen, vor zugsweise von 8 bis 18 C-Atomen und
x,y - ein Ethoxylierungsgrad von 2 bis 6 ist.
eingesetzt wird, wobei
R - linear oder verzweigt ist mit einer Alkyl kettenlänge von 6 bis 24 C-Atomen, vor zugsweise von 8 bis 18 C-Atomen und
x,y - ein Ethoxylierungsgrad von 2 bis 6 ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrochlorid-Lö
sung des ethoxylierten Fettamins vorgelegt
wird.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet, daß als Hydrochloridlö
sung des ethoxylierten Fettamins eine wässrige
Hydrochloridlösung von ethoxyliertem Talgamin,
vorzugsweise in einer 1%igen Konzentration,
verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet, daß die Hydrochloridlö
sung des ethoxylierten Fettamins der Fermentati
onslösung oder -brühe unter schonendem Rühren
zugegeben wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet, daß der ausfallende
Hyaluronsäurekomplex mit Methanol aufgeschlämmt
wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7,
dadurch gekennzeichnet, daß die alkoholische
Alkalilauge methanolisches Natriumhydroxid ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß die freigesetzte
Hyaluronsäure mit Methanol gewaschen und ge
trocknet wird.
10. Verfahren zur Gewinnung von Hyaluronsäure durch
Ausfällen als Polyelektrolytkomplex mittels
eines Polykations, das einer hyaluronsäurehalti
gen Lösung oder Brühe oder einem hyaluronsäure
haltigen Extrakt in mindestens äquimolarer
Menge zugegeben wird, dadurch gekennzeichnet,
daß als Polykation
- - Poly-methylen-bis-acrylamid-co-benzylamin,
- - Poly-methylen-bis-acrylamid-co-hexylamin,
- - Poly-diallyl-dimethylammoniumchlorid,
- - Poly-diallyl-methylaminhydrochlorid,
- - Poly-ethyleniminhydrochlorid,
- - Poly-dimethylamin-ethylacrylathydrochlorid
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeich
net, daß die Lösung oder Brühe eine Hyaluronsäu
rekonzentration von 0,3 g/l bis 0,6 g/l, vor
zugsweise von 0,4 g/l, aufweist.
12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch ge
kennzeichnet, daß als Polysäure Natrium-Po
lyvinylsulfonat oder Natrium-Polystyrensulfonat
verwendet wird.
13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12,
dadurch gekennzeichnet, daß der ausfallende Hya
luronsäurekomplex mittels Zentrifugieren abge
trennt wird.
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| DE2000119868 DE10019868A1 (de) | 2000-04-18 | 2000-04-18 | Verfahren zur Gewinnung von Hyaluronsäure |
Publications (1)
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|---|---|
| DE10019868A1 true DE10019868A1 (de) | 2001-10-25 |
Family
ID=7639628
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DE2000119868 Withdrawn DE10019868A1 (de) | 2000-04-18 | 2000-04-18 | Verfahren zur Gewinnung von Hyaluronsäure |
Country Status (1)
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-
2000
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