DE10019864A1 - Nucleic acid sequences from alkane metabolizing Candida yeast, encoding cytochrome b5 and used for the oxidation of long chain alkyl compounds and for the production of long chain dicarbonic acids - Google Patents
Nucleic acid sequences from alkane metabolizing Candida yeast, encoding cytochrome b5 and used for the oxidation of long chain alkyl compounds and for the production of long chain dicarbonic acidsInfo
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Abstract
Description
Die Erfindung betrifft Nukleinsäure-Sequenzen aus Candida Hefen vorzugsweise aus Candida maltosa, die Cytochrom b5-Polypeptide kodieren sowie die entsprechenden Cytochrom b5-Polypeptide und ihre Verwendung zur Erhöhung der Aktivität von Cytochrom P450 Systemen, insbesondere zur Stimulierung der Aktivität Alkan- und Fettsäure hydroxylierender Cytochrom P450 Systeme bei der Produktion langkettiger Dicarbonsäuren (≧ C10)The invention preferably relates to nucleic acid sequences from Candida yeasts Candida maltosa, which encode cytochrome b5 polypeptides and the corresponding ones Cytochrome b5 polypeptides and their use to increase the activity of cytochrome P450 systems, especially to stimulate the activity of alkane and fatty acids hydroxylating cytochrome P450 systems in the production of long-chain dicarboxylic acids (≧ C10)
Cytochrome b5 sind Hämoproteine, die an verschiedenen Elektronentransfer-Prozessen in eukaryontischen Zellen beteiligt sind [Übersichten bei: Oshino, N., Pharmac. Ther. A. 2, (1978) 477-515 und Vergeres and Waskell Biochemie 77 (1995) 604-620]. Die Übertragung von Elektronen auf Cytochrom b5 erfolgt durch NADH- bzw. auch NADPH-abhängige Reduktasen. Das reduzierte Cytochrom b5 kann dann das aufgenommene Elektron auf verschiedene andere Proteine übertragen. Zu diesen Elektronenakzeptoren gehören Cytochrome P450, Fettsäure-Desaturasen, Methämoglobin und Methionin-Synthase.Cytochrome b5 are hemoproteins that participate in various electron transfer processes eukaryotic cells are involved [reviews by: Oshino, N., Pharmac. Ther. A. 2, (1978) 477-515 and Vergeres and Waskell Biochemie 77 (1995) 604-620]. The transfer of electrons on cytochrome b5 occurs through NADH- or also NADPH-dependent Reductases. The reduced cytochrome b5 can then take up the electron transfer various other proteins. These include electron acceptors Cytochrome P450, fatty acid desaturases, methemoglobin and methionine synthase.
Nach ihrer intrazellulären Lokalisierung können drei verschiedene Cytochrom b5 Formen
unterschieden werden:
After their intracellular localization, three different cytochrome b5 forms can be distinguished:
- a) eine membrangebundene Form, die im Endoplasmatischen Retikulum lokalisiert ist (mikrosomale Form) und dort mit Fettsäure-Desaturasen und Cytochromen P450 wechselwirkta) a membrane-bound form located in the endoplasmic reticulum (microsomal form) and there with fatty acid desaturases and cytochrome P450 interacts
- b) eine weitere membrangebundene Form, die aber spezifisch in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert ist undb) another membrane-bound form, but which is specific in the outer Mitochondrial membrane is localized and
- c) eine lösliche Form des Cytochrom b5, wie sie in Erythrocyten (Reduktion von Methämoglobin) und nach neueren Untersuchungen auch in Leberzellen (reduktive Aktivierung der Methionin-Synthase [Chen and Banerjee, J. Biol. Chem. 273 (1998) 26248- 26255] vorkommt.c) a soluble form of cytochrome b5, as found in erythrocytes (reduction of Methaemoglobin) and, according to recent studies, also in liver cells (reductive Activation of methionine synthase [Chen and Banerjee, J. Biol. Chem. 273 (1998) 26248- 26255] occurs.
Die membranständigen Formen des Cytochrom b5 bestehen aus einer cytoplasmatischen Domäne (Länge ca. 90 bis 100 Aminosäurereste), einem membranspannenden Segment (ca. 20 überwiegend hydrophobe Aminosäurereste) und einem C-terminalen Teil (ca. 10 hydrophile Aminosäurereste), der nach neueren Untersuchungen luminal orientiert ist [Vergeres et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 3414-3422]. Die cytoplasmatische Domäne enthält die prosthetische Hämgruppe und ist direkt an der Elektronentransfer-Funktion des Cytochrom b5 beteiligt. Die dreidimensionale Struktur der cytoplasmatischen Domäne des mikrosomalen Cytochrom b5 vom Rind ist bekannt [Argos and Mathews J. Biol. Chem. 250 (1975) 747-751]. Danach fungieren zwei Histidinreste als axiale Liganden des Hämeisens. Cytochrome b5 gehören zur Klasse der "tail-anchored" Proteine. Das membranspannende Segment und der sich C-terminal anschließende luminale Teil enthalten alle Determinanten für seine intrazelluläre Lokalisierung. Unterschiede im Vorliegen einzelner geladener Aminosäuren im luminalen Teil bestimmen darüber, ob die jeweilige Cytochrom b5 Form im Endoplasmatischen Retikulum oder in der äußeren Mitochondrienmembran lokalisiert wird [Kuroda et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 31097-31102]. Bei den Cytochrom b5 Proteinen des Endoplasmatischen Retikulums ist darüberhinaus bekannt, daß die Länge des membranspannenden Segments entscheidend für ihre permanente Lokalisierung (Retention) in diesem Zellkompartiment ist [Pedrazzini et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 4207- 4212]. Bei der löslichen Form in Erythrozyten handelt es sich um ein C-terminal verkürztes Cytochrom b5, welches dementsprechend über keinen Membrananker verfügt [VanDerMark and Steggles, Biochem. Biophys. Res. Commun. 240 (1997) 80-83].The membrane-bound forms of the cytochrome b5 consist of a cytoplasmic Domain (length approx. 90 to 100 amino acid residues), a membrane spanning segment (approx. 20 predominantly hydrophobic amino acid residues) and a C-terminal part (approx. 10 hydrophilic amino acid residues), which is luminally oriented according to recent studies [Vergeres et al., J. Biol. Chem. 270 (1995) 3414-3422]. Contains the cytoplasmic domain the prosthetic heme group and is directly connected to the electron transfer function of the Cytochrome b5 involved. The three - dimensional structure of the cytoplasmic domain of the bovine microsomal cytochrome b5 is known [Argos and Mathews J. Biol. Chem. 250 (1975) 747-751]. Thereafter, two histidine residues act as axial ligands of the hemis. Cytochrome b5 belong to the class of "tail-anchored" proteins. The membrane spanning The segment and the luminal part adjoining the C-terminal contain all determinants for its intracellular localization. Differences in the presence of individual loaded Amino acids in the luminal part determine whether the respective cytochrome b5 form in the Endoplasmic reticulum or localized in the outer mitochondrial membrane [Kuroda et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 31097-31102]. With the cytochrome b5 proteins of the Endoplasmic reticulum is also known that the length of the membrane-spanning segment crucial for their permanent localization (retention) in this cell compartment [Pedrazzini et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93 (1996) 4207- 4212]. The soluble form in erythrocytes is a shortened C-terminal Cytochrome b5, which accordingly has no membrane anchor [VanDerMark and Steggles, Biochem. Biophys. Res. Commun. 240 (1997) 80-83].
Die ersten vollständigen Aminosäuresequenzen mikrosomaler Cytochrom b5 Proteine wurden vor etwa 10 Jahren aufgeklärt (vom Menschen und vom Huhn, [Ozols, J. Biochim. Biophys. Acta 997 (1989) 121-130]. Inzwischen sind die cDNAs bzw. Gene für Cytochrome b5 aus mindestens 20 unterschiedlichen Organismen kloniert worden. Die entsprechenden DNA- und abgeleiteten Aminosäuresequenzen sind in verschiedenen Datenbanken über Internet zugänglich. Eine spezielle Zusammenstellung als Zugang zu den publizierten Cytochrom b5 Sequenzen und den entsprechenden Literaturstellen findet sich unter: http://www.icgeb.trieste.it/p450/cytb5.html. Die Sequenz eines menschlichen Cytochrom b5 ist in WO-A-98/36071 beschrieben. Die Sequenz eines Cytochrom b5 aus alkanverwertenden Hefen war bisher unbekannt.The first complete amino acid sequences of microsomal cytochrome b5 proteins were Enlightened about 10 years ago (from humans and from chickens, [Ozols, J. Biochim. Biophys. Acta 997 (1989) 121-130]. In the meantime, the cDNAs or genes for cytochrome b5 are out at least 20 different organisms have been cloned. The corresponding DNA and Derived amino acid sequences are in various databases on the Internet accessible. A special compilation to access the published cytochrome b5 Sequences and the corresponding literature can be found at: http://www.icgeb.trieste.it/p450/cytb5.html. The sequence of a human cytochrome b5 is described in WO-A-98/36071. The sequence of a cytochrome b5 from alkane-utilizing Yeast was previously unknown.
Cytochrome b5 spielen eine komplexe Rolle bei der Regulation der enzymatischen Aktivität von mikrosomalen Cytochrom P450 Systemen [Perret and Pompon, Biochemistry 37 (1998) 11412-11424 und darin zitierte Literatur]. Je nach untersuchter Cytochrom P450 Form, dem gewählten Substrat und den Reaktionsbedingungen, kann Cytochrom b5 eine Hemmung bzw. beträchtliche Stimulierung der P450-katalysierten Substratumsetzungen bewirken. Die stimulierende Wirkung beruht im allgemeinen auf einer Verbesserung der Kopplung von Elektronentransfer und Substrathydroxylierung im Reaktionszyklus der Cytochrom P450 Systeme. Dabei kann Cytochrom b5 sowohl als Redox-Partner fungieren (Übertragung des zweiten Elektrons im Reaktionszyklus) als auch Konformationsveränderungen am Cytochrom P450 bewirken, die zu einer Erhöhung der Substrataffinität führen. Die Bindungsstellen von Cytochrom b5 und NADPH-P450 Reduktase am Cytochrom P450 sind wahrscheinlich nicht identisch aber möglicherweise partiell überlappend [Bridges et al. J. Biol. Chem. 273 (1998) 17036-17049]. Einige Autoren beschreiben, daß bereits Apo-Cytochrom b5 die Aktivität von einzelnen Cytochrom P450 Systemen stimulieren kann [Yamazaki et al. J. Biol. Chem. 271 (1996) 27438-27444]. Die tatsächlichen Effekte von Cytochrom b5 auf ein konkretes Cytochrom P450 System sind bisher nicht voraussagbar.Cytochrome b5 play a complex role in the regulation of enzymatic activity of microsomal cytochrome P450 systems [Perret and Pompon, Biochemistry 37 (1998) 11412-11424 and literature cited therein]. Depending on the examined cytochrome P450 form, the selected substrate and the reaction conditions, cytochrome b5 can inhibit or cause significant stimulation of the P450-catalyzed substrate reactions. The stimulating effect is generally based on an improvement in the coupling of Electron transfer and substrate hydroxylation in the reaction cycle of the cytochrome P450 Systems. Cytochrome b5 can act as a redox partner (transfer of the second electron in the reaction cycle) as well as conformational changes on the cytochrome P450 cause an increase in substrate affinity. The binding sites of Cytochrome b5 and NADPH-P450 reductase on cytochrome P450 are probably not identical but possibly partially overlapping [Bridges et al. J. Biol. Chem. 273 (1998) 17036-17049]. Some authors describe that apo-cytochrome b5 already has the activity of can stimulate individual cytochrome P450 systems [Yamazaki et al. J. Biol. Chem. 271 (1996) 27438-27444]. The actual effects of cytochrome b5 on a concrete one Cytochrome P450 systems have so far not been predictable.
Die Anwendung des menschlichen Cytochrom b5 zur Stimulierung der Aktivität menschlicher Cytochrom P450 Systeme nach heterologer Expression in S. cerevisiae ist aus einer Reihe von Publikationen [Übersicht bei Pompon et al., Toxicol. Lett. 82/83 (1995) 815- 822] und aus WO-A 97/10344 und US 5,635,369 bekannt. Die Frage, ob zur Stimulierung der Aktivität ausgewählter Cytochrom P450 Systeme auch Cytochrome b5 aus anderen Organismen eingesetzt werden können, ist bisher nicht systematisch untersucht. Aufgrund der zum Teil geringen Sequenzhomologien erscheint dies jedoch eher als unwahrscheinlich.The use of human cytochrome b5 to stimulate activity human cytochrome P450 systems after heterologous expression in S. cerevisiae is out a number of publications [Review by Pompon et al., Toxicol. Lett. 82/83 (1995) 815- 822] and from WO-A 97/10344 and US 5,635,369. The question of whether to stimulate the Activity of selected cytochrome P450 systems including cytochrome b5 from others So far, organisms can not be used systematically. Due to the however, in some cases with low sequence homologies, this seems rather unlikely.
Die Fähigkeit von Cytochrom P450 Systemen zur regio- und z. T. auch stereospezifischen Hydroxylierung verschiedenster chemischer Verbindungen ist von erheblichem biotechnologischen Interesse. Ein Anwendungsgebiet ist beispielsweise die Produktion von langkettigen Dicarbonsäuren mit Hilfe Alkan- und Fettsäurehydroxylierender Cytochrom P450 Systeme. Hierzu patentierte Verfahren beinhalten bisher zwar bereits eine Überexpression der unmittelbaren Komponenten dieser Cytochrom P450 Systeme (P450 und NADPH-P450 Reduktase) in alkanverwertenden Hefen (Candida tropicalis, WO-A 91/14781) bzw. in Saccharomyces cerevisiae (DE 195 07 546 A1). Zum Einsatz von Cytochrom b5 in derartigen Verfahren liegen aber weder publizierte Ergebnisse noch Patente vor.The ability of cytochrome P450 systems for regional and z. T. also stereospecific The hydroxylation of a wide variety of chemical compounds is significant biotechnological interest. One area of application is the production of long chain dicarboxylic acids using alkane and fatty acid hydroxylating cytochrome P450 systems. To date, patented processes already include one Overexpression of the immediate components of these cytochrome P450 systems (P450 and NADPH-P450 reductase) in alkane-utilizing yeasts (Candida tropicalis, WO-A 91/14781) or in Saccharomyces cerevisiae (DE 195 07 546 A1). For the use of However, cytochrome b5 in such procedures are neither published results nor patents in front.
Der Erfindung lag deshalb die Aufgabe zugrunde, Nukleinsäuresequenzen zu finden, die die Produktion von Cytochrom b5-Polypeptiden ermöglichen, welche die Aktivität von Alkan- und Fettsäure-hydroxylierenden P450-Enzymen stimulieren und damit die Rate und Effizienz der Produktion von Dicarbonsäuren erhöhen. The invention was therefore based on the object of finding nucleic acid sequences which Enable production of cytochrome b5 polypeptides that inhibit the activity of alkane and fatty acid hydroxylating P450 stimulate rate and efficiency increase the production of dicarboxylic acids.
Die Aufgabe konnte durch Nukleinsäure-Sequenzen aus Candida Hefen, vorzugsweise aus Candida maltosa, die Cytochrom b5-Polypeptide kodieren, sowie deren Fragmente, Varianten und Mutationen gelöst werden.The task could be characterized by nucleic acid sequences from Candida yeasts, preferably Candida maltosa, which encode cytochrome b5 polypeptides, and their fragments, variants and mutations are resolved.
Erfindungsgemäß wurde C. maltosa Cytochrom b5 gereinigt, seine vollständige cDNA wurde kloniert und die Bildung eines funktionsfähigen Cytochrom b5 durch heterologe Expression der klonierten cDNA nachgewiesen.According to the invention, C. maltosa cytochrome b5 was purified, its complete cDNA was cloned and the formation of a functional cytochrome b5 by heterologous expression of the cloned cDNA detected.
Überraschend konnte ein spezifischer Vorteil des Cytochrom b5 aus C. maltosa mit seiner erfindungsgemäßen Sequenz erreicht werden, da es zur Stimulierung der Aktivität von Cytochrom P450 Systemen aus dem gleichen Organismus bzw. aus verwandten alkanverwertenden Hefen eingesetzt werden kann.Surprisingly, a specific advantage of cytochrome b5 from C. maltosa with its Sequence according to the invention can be achieved because it is used to stimulate the activity of Cytochrome P450 systems from the same organism or from related ones alkane-utilizing yeasts can be used.
Gegenstand der Erfindung sind somit Nukleinsäure-Sequenzen aus alkanverwertenden Candida Hefen, die ein Cytochrom b5-Polypeptid kodieren sowie ihre Fragmente, Varianten und Mutationen, insbesondere die entsprechende cDNA.The invention thus relates to nucleic acid sequences from alkane-utilizing Candida yeasts that encode a cytochrome b5 polypeptide and their fragments, variants and mutations, especially the corresponding cDNA.
Vorzugsweise handelt es sich um die Nukleinsäure-Sequenzen mit der SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 2 oder deren Varianten.These are preferably the nucleic acid sequences with SEQ ID No. 1 and SEQ ID No. 2 or their variants.
Des weiteren betrifft die Erfindung Cytochrom b5-Polypeptide, die von den Nukleinsäure- Sequenzen kodiert werden, vorzugsweise ein Cytochrom b5-Polypeptid der SEQ ID No. 3 sowie Varianten davon, die Deletionen oder Modifikationen aufweisen und Cytochrom b5- Aktivitäten aufweisen.The invention further relates to cytochrome b5 polypeptides derived from the nucleic acid Sequences are encoded, preferably a cytochrome b5 polypeptide of SEQ ID No. 3rd and variants thereof which have deletions or modifications and cytochrome b5- Have activities.
Außerdem betrifft die Erfindung Plasmide und Vektoren, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure-Sequenz enthalten sowie Wirtszellen, die einen Vektor aufweisen und Antikörper, die spezifisch an die Polypeptide binden.In addition, the invention relates to plasmids and vectors that an inventive Contain nucleic acid sequence and host cells that have a vector and Antibodies that specifically bind to the polypeptides.
Erfindungsgemäß werden die Nukleinsäuresequenzen oder Polypeptide zur Stimulierung der Aktivität von Cytochrom P50-Enzymen bei der biotechnologischen Herstellung von Fettsäuren und Dicarbonsäuren durch Oxidation von langkettigen n-Alkanen (≧ C10) verwendet. According to the invention, the nucleic acid sequences or polypeptides for stimulating the Activity of cytochrome P50 enzymes in the biotechnological production of Fatty acids and dicarboxylic acids due to the oxidation of long-chain n-alkanes (≧ C10) used.
Mit der Erfindung wird u. a. bei der Oxidation von Dodekan unter Verwendung von P450 Cml aus Candida maltosa eine mehr als 4fache Stimulierung erreicht, bei der Oxidation von Laurinsäure unter Verwendung von P450 Cm2 aus Candida maltosa eine mehr als 7fache Stimulierung.With the invention u. a. in the oxidation of dodecane using P450 Cml from Candida maltosa achieved more than 4-fold stimulation in the oxidation of Lauric acid using P450 Cm2 from Candida maltosa more than 7 times Stimulation.
Anschließend wird die Erfindung an Beispielen näher erläutert, auf die sie jedoch nicht beschränkt sein soll.The invention is then explained in more detail by means of examples, but it is not so should be limited.
Wie nachfolgend im Einzelnen beschrieben wurde das mikrosomale Cytochrom b5 der alkanverwertenden Hefe C. maltosa gereinigt, tryptisch gespalten und hinsichtlich seiner Aminosäuresequenz partiell charakterisiert. Die Sequenz eines der tryptischen Peptide bildete die Grundlage für die Ableitung von degenerierten Oligonucleotiden zur Amplifikation von Teilsequenzen der Cytochrom b5 cDNA mit Hilfe der Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Ausgehend von den erhaltenen Sequenzen erfolgte dann die Amplifikation und Klonierung der vollständigen codierenden Region. Das aus den DNA-Sequenzen abgeleitete Protein besteht aus 126 Aminosäuren, beinhaltet die Teilsequenzen wie sie für das aus C. maltosa gereinigte Cytochrom b5 ermittelt wurden und weist eine Homologie von etwa 30% zu Cytochromen b5 aus anderen Organismen auf. Als weiterer Beweis für die Identität der klonierten cDNA wurde gezeigt, daß die heterologe Expression in S. cerevisiae zur Bildung eines spektral intakten, mikrosomalen Cytochrom b5 führt.As described in detail below, the microsomal cytochrome b5 was alkane-utilizing yeast C. maltosa purified, tryptically split and with regard to its Partially characterized amino acid sequence. The sequence formed one of the tryptic peptides the basis for the derivation of degenerate oligonucleotides for the amplification of Partial sequences of the cytochrome b5 cDNA using the polymerase chain reaction (PCR). The amplification and cloning then took place on the basis of the sequences obtained the complete coding region. The protein derived from the DNA sequences consists of 126 amino acids, contains the partial sequences as for the C. maltosa purified cytochrome b5 were determined and assigns a homology of about 30% Cytochrome b5 from other organisms. As further proof of the identity of the cloned cDNA was shown to produce heterologous expression in S. cerevisiae of a spectrally intact, microsomal cytochrome b5.
Der Hefestamm C. maltosa ATCC 28140 wurde in einem 5 l Bioreaktor auf Hexadekan als Kohlenstoffquelle kultiviert. Die Medienzusammensetzung und die allgemeinen Wachstumsbedingungen waren wie bei Huth et al., J. Basic Microbiol. 30 (1990) 481-488, beschrieben. Die Hefezellen wurden kurz vor Eintritt in die stationäre Wachstumsphase geerntet. Der mechanische Zellaufschluß und die Gewinnung der mikrosomalen Membranfraktion erfolgten wie früher beschrieben [Riege et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 98 (1981) 527-534]. Der mikrosomale Cytochrom b5 Gehalt lag bei ca. 0.5 nmol/mg Protein. Die Reinigung des Cytochrom b5 erfolgte in Anlehnung an Methoden wie sie für Cytochrome b5 aus anderen Organismen publiziert wurden [Guzov et al. J. Biol. Chem. 271 (1996) 26637-26645; Strittmatter et al., Meth. Enzymol. 52 (1978) 97-101].The yeast strain C. maltosa ATCC 28140 was in a 5 l bioreactor on hexadecane as Carbon source cultivated. The media composition and the general Growth conditions were as in Huth et al., J. Basic Microbiol. 30 (1990) 481-488, described. The yeast cells were shortly before entering the stationary growth phase harvested. The mechanical cell disruption and the extraction of the microsomal Membrane fractions were carried out as previously described [Riege et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 98 (1981) 527-534]. The microsomal cytochrome b5 content was approx. 0.5 nmol / mg protein. The cytochrome b5 was purified using methods such as they have been published for cytochrome b5 from other organisms [Guzov et al. J. Biol. Chem. 271 (1996) 26637-26645; Strittmatter et al., Meth. Enzymol. 52 (1978) 97-101].
Im Ergebnis wurde ein Cytochrom b5 Präparat mit einer Reinheit von ca. 60% erhalten (das Verhältnis der Absorptionen bei 412 und 280 nm lag bei ca. 1.4). Das gereinigte Cytochrom b5 zeichnet sich durch folgende spektrale Eigenschaften aus: Absorptionsmaxima bei 412 (Sortebande), 525 und 527 nm im oxidierten Zustand; Verschiebung des Soretmaximums auf 424 nm nach Reduktion mit Dithionit.As a result, a cytochrome b5 preparation with a purity of about 60% was obtained (the Ratio of the absorptions at 412 and 280 nm was approx. 1.4). The purified cytochrome b5 is characterized by the following spectral properties: absorption maxima at 412 (Variety band), 525 and 527 nm in the oxidized state; Shift of the Soret maximum to 424 nm after reduction with dithionite.
Das unter 1.1. erhaltene Präparat wurde in einem 15%-igen SDS-Polyacrylamidgel aufgetrennt. Die erhaltenen Hauptbanden mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 17.5 und 20 kDa wurden dann auf eine Polyvinylidendifluorid-Membran geblottet (Pro Blott, Applied Biosystems, USA) und in situ mit Trypsin gespalten [Methode nach: Fernandez et al. Anal. Biochem. 218 (1994) 112-117]. Die tryptischen Peptide wurden eluiert und über eine Reverse-phase-HPLC an einer Mikrosäule (RPC C2/C18 SC; 100 × 2.1 mm) aufgetrennt (Smart system, Pharmacia, Sweden). Ausgewählte Fraktionen wurden dann auf Polybren haltige Glasfaser-Filter aufgetragen und sequenziert (Gasphasen-Sequenator, Procise, Applied Biosystems).That under 1.1. The preparation obtained was in a 15% SDS polyacrylamide gel separated. The main bands obtained with an apparent molecular weight of 17.5 and 20 kDa were then blotted onto a polyvinylidene difluoride membrane (Pro Blott, Applied Biosystems, USA) and cleaved in situ with trypsin [method according to: Fernandez et al. Anal. Biochem. 218 (1994) 112-117]. The tryptic peptides were eluted and over a Reverse phase HPLC separated on a micro column (RPC C2 / C18 SC; 100 × 2.1 mm) (Smart system, Pharmacia, Sweden). Selected fractions were then on polybrene containing glass fiber filters applied and sequenced (gas phase sequenator, procise, applied Biosystems).
Im Ergebnis wurden folgende Peptidsequenzen erhalten:
T27 (abgeleitet von der 20 kDa-Bande): LYIGNLK
T53 (abgeleitet von der 20 kDa-Bande): VYDITSYIDEHPGGE
T54 (abgeleitet von der 17.5 kDa-Bande): VYDITSYIDEAs a result, the following peptide sequences were obtained:
T27 (derived from the 20 kDa band): LYIGNLK
T53 (derived from the 20 kDa band): VYDITSYIDEHPGGE
T54 (derived from the 17.5 kDa band): VYDITSYIDE
Die Peptide T53 und T54 stimmen in der Sequenz von 10 Aminosäuren überein. Dieses Ergebnis zeigt an, daß es sich bei der 17.5 kDa-Bande wahrscheinlich um ein proteolytisches Fragment der 20 kDa-Bande handelt. The peptides T53 and T54 match in the sequence of 10 amino acids. This The result indicates that the 17.5 kDa band is probably a proteolytic Fragment of the 20 kDa band is.
Als Template für die PCR-Amplifikation von Cytochrom b5 cDNA-Fragmenten
diente zunächst der Plasmidpool aus einer bereits früher hergestellten C. maltosa EH15
cDNA-Bank [Schunck et al., Biochem Biophys. Res. Commun. 181 (1989) 843-850]. Die in
dieser Bank enthaltenen cDNAs sind in den Hind II-Ort des Plasmids pUC 119 inseriert.
Cytochrom b5-spezifische Primer wurden aus der Sequenz des Peptids T53 abgeleitet und in
Kombination mit Plasmid-abgeleiteten Primern für die PCR eingesetzt. Folgende Primer
wurden für die nachstehenden Experimente erfolgreich verwendet:
T53-1-4: 5'- GAT/C ATT/C ACT/C AGT/C TAT/C ATT/C GAT/C GAA C -3'
T53-2-2: 5'- ATT/C GAT GAA CAT/C CCA/T GGT/A GG -3'
pUC 119-2CR: 5'- ACG GCC AGT GAA TTC GAG -3'The plasmid pool from a previously produced C. maltosa EH15 cDNA library [Schunck et al., Biochem Biophys] was initially used as the template for the PCR amplification of cytochrome b5 cDNA fragments. Res. Commun. 181: 843-850 (1989)]. The cDNAs contained in this library are inserted into the Hind II site of the plasmid pUC 119. Cytochrome b5-specific primers were derived from the sequence of the peptide T53 and used in combination with plasmid-derived primers for the PCR. The following primers were successfully used for the following experiments:
T53-1-4: 5'- GAT / C ATT / C ACT / C AGT / C TAT / C ATT / C GAT / C GAA C -3 '
T53-2-2: 5'- ATT / C GAT GAA CAT / C CCA / T GGT / A GG -3 '
pUC 119-2CR: 5'- ACG GCC AGT GAA TTC GAG -3 '
Die Kombination von T53-1-4 mit pUC119-2CR führte zur Amplifikation eines etwa 380 bp großen DNA-Fragments. Die dazu durchgeführte PCR (Ready-To-Go PCR Kit, Amersham Pharmacia Biotech) verlief über 35 Zyklen bestehend aus den Schritten: 95°C, 45 sec / 53°C, 45 sec/72°C, 45 sec (+ 1 sec pro Zyklus). Zur Erhöhung der Spezifität wurde das erhaltene DNA-Fragment einer zweiten PCR mit der Primerkombination T53-2-2 (3' versetzt gegenüber T53-1-4)/pUC119-2CR unterworfen (25 Zyklen, gleiches Temperaturregime). Das so amplifizierte Fragment wurde sequenziert.The combination of T53-1-4 with pUC119-2CR resulted in the amplification of approximately 380 bp large DNA fragment. The PCR carried out for this purpose (Ready-To-Go PCR Kit, Amersham Pharmacia Biotech) ran over 35 cycles consisting of the steps: 95 ° C, 45 sec / 53 ° C, 45 sec / 72 ° C, 45 sec (+ 1 sec per cycle). The obtained was used to increase the specificity DNA fragment of a second PCR with the primer combination T53-2-2 (3 'added subjected to T53-1-4) / pUC119-2CR (25 cycles, same temperature regime). The fragment amplified in this way was sequenced.
Für die anschließende Amplifikation des fehlenden 5'-Bereichs der Cytochrom b5 cDNA
wurde folgendes Primerpaar eingesetzt:
T53-4CR: 5'- GTT TTA TTT CTA AGG GTT TTG GAG -3'
pUC1 19-1: 5'- ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG -3'The following primer pair was used for the subsequent amplification of the missing 5 'region of the cytochrome b5 cDNA:
T53-4CR: 5'- GTT TTA TTT CTA AGG GTT TTG GAG -3 '
pUC1 19-1: 5'- ACA GCT ATG ACC ATG ATT ACG -3 '
T53-4CR würde aus der Sequenz des zuerst amplifizierten Fragments abgeleitet und setzt am 3'-Ende der vermuteten Cytochrom b5 cDNA an. Die PCR verlief über 30 Zyklen bestehend aus den Schritten: 95°C, 45 sec/55°C, 45 sec/72°C, 45 sec. Das erhaltene Produkt mit einer Länge von ca. 400 bp wurde sequenziert. Die Sequenz zeigte eine offenen Leserahmen für ein Polypeptid mit 126 Aminosäuren.T53-4CR would be derived from the sequence of the first amplified fragment and starts on 3 'end of the suspected cytochrome b5 cDNA. The PCR consisted of 30 cycles from the steps: 95 ° C, 45 sec / 55 ° C, 45 sec / 72 ° C, 45 sec. The product obtained with a length of approximately 400 bp was sequenced. The sequence showed an open reading frame for a polypeptide with 126 amino acids.
Im letzten Schritt erfolgte die Gewinnung der vollständigen Cytochrom b5 cDNA mit Hilfe
des folgenden Primerpaars:
T53-7Sal: 5'- GAA GTC GAC GTC ATG TCT GAT ACT ACA -3'
T53-8BamCR: 5'- CGC GGA TCC ATT ATG TTT TAT TTC TAA G -3'In the last step, the complete cytochrome b5 cDNA was obtained using the following primer pair:
T53-7Sal: 5'- GAA GTC GAC GTC ATG TCT GAT ACT ACA -3 '
T53-8BamCR: 5'- CGC GGA TCC ATT ATG TTT TAT TTC TAA G -3 '
Diese Primer setzen am 5'- bzw. 3'-Ende der Sequenz des oben beschriebenen 400 bp Fragments an. Die unterstrichenen Sequenzbereiche sind hinzugefügte Restriktionsorte für Sal I bzw. Bam HI zur anschließenden Umklonierung in den Hefe-Expressionsvektor YEp51 (siehe Punkt 1.5).These primers set at the 5 'or 3' end of the sequence of the 400 bp described above Fragments. The underlined sequence areas are added restriction sites for Sal I or Bam HI for subsequent cloning into the yeast expression vector YEp51 (see point 1.5).
Als Template diente die Poly(A)RNA aus Zellen des C. maltosa Stammes ATCC 28140 nach Wachstum auf Hexadekan. Die Isolierung der RNA erfolgte nach mechanischem Zellaufschluß mit Hilfe des Oligotex Direct mRNA Mini Kits (QIAGEN). Für die Umschreibung in einzelsträngige cDNA und die anschließende Amplifikation der Cytochrom b5 cDNA wurde der Ready To Go RT-PCR Kit von Amersham Pharmacia Biotech verwendet. Zur reversen Transkription (30 min. 42°C) wurden 100 ng Poly(A)RNA und ein Oligo(dT) Primer eingesetzt. Nach einer Inaktivierung für 5 min bei 95°C erfolgte bei 65°C die Zugabe der Cytochrom b5-spezifischen Primer (T53-75a1 und T53-8Bam). Die anschließende PCR-Amplifikation verlief über 35 Zyklen bestehend aus den Schritten: 95°C, 45 sec/53°C, 45 sec/72°C, 45 sec (+ 1 sec pro Zyklus).The poly (A) RNA from cells of the C. maltosa strain ATCC 28140 was used as a template Growth on hexadecane. The RNA was isolated mechanically Cell disruption using the Oligotex Direct mRNA Mini Kit (QIAGEN). For the Description in single-stranded cDNA and the subsequent amplification of the cytochrome b5 cDNA became the Ready To Go RT-PCR Kit from Amersham Pharmacia Biotech used. For reverse transcription (30 min. 42 ° C) 100 ng of poly (A) RNA and a Oligo (dT) primer used. After inactivation for 5 min at 95 ° C, it was carried out at 65 ° C the addition of the cytochrome b5-specific primers (T53-75a1 and T53-8Bam). The subsequent PCR amplification was carried out over 35 cycles consisting of the steps: 95 ° C., 45 sec / 53 ° C, 45 sec / 72 ° C, 45 sec (+ 1 sec per cycle).
Für die nachfolgende Klonierung des erhaltenen RT-PCR Produkts wurde der TOPO T-A Cloning Kit der Firma INVITROGEN verwendet. Entsprechend den Instruktionen des Herstellers erfolgte eine Ligation des RT-PCR Produkts in das Plasmid pCR 2.1™ und eine anschließende Transformation in E. coli TOP10.For the subsequent cloning of the RT-PCR product obtained, the TOPO T-A Cloning kit from INVITROGEN is used. According to the instructions of the A ligation of the RT-PCR product into the plasmid pCR 2.1 ™ and a subsequent transformation into E. coli TOP10.
Zur Sequenzierung wurden insgesamt 21 Klone zufällig ausgewählt, die Plasmide mit einem RT-PCR Insert trugen. Alle sequenzierten Inserts enthielten einen offenen Leserahmen von 378 bp. Signifikante Unterschiede in den analysierten Sequenzen traten an zwei Positionen (147 und 156 gerechnet vom Start-ATG) auf: T(147)-C(156) bei 8 Klonen im Gegensatz zu C(147)-T(156) bei den übrigen. Dieses Ergebnis deutet auf das Vorliegen von zwei allelen Varianten des Cytochrom b5 Gens in C. maltosa hin. Die unterschiedlichen Basen an den Positionen 147 und 156 haben jedoch keinen Einfluß auf die Aminosäuresequenz des kodierten Proteins.A total of 21 clones were selected at random, the plasmids with one RT-PCR insert. All sequenced inserts contained an open reading frame from 378 bp. Significant differences in the analyzed sequences occurred at two positions (147 and 156 calculated from the start ATG) on: T (147) -C (156) with 8 clones as opposed to C (147) -T (156) for the rest. This result indicates the presence of two alleles Variants of the cytochrome b5 gene in C. maltosa. The different bases on the Positions 147 and 156 have no influence on the amino acid sequence of the encoded protein.
Die klonierten cDNAs (SEQ ID No. 1 und 2) kodieren für ein Polypeptid (SEQ ID No. 3) mit einer Länge von 126 Aminosäuren (Abb. 1). Die für das gereinigte Cytochrom b5 aus C. maltosa ermittelten Peptidsequenzen (vgl. Punkt 2) stimmen exakt mit den Regionen 31 bis 45 (T53 Peptid) bzw. 76 bis 82 (T27 Peptid) in der abgeleiteten Aminosäuresequenz überein (Abb. 1).The cloned cDNAs (SEQ ID No. 1 and 2) code for a polypeptide (SEQ ID No. 3) with a length of 126 amino acids ( Fig. 1). The peptide sequences determined for the purified cytochrome b5 from C. maltosa (see point 2) correspond exactly to regions 31 to 45 (T53 peptide) and 76 to 82 (T27 peptide) in the derived amino acid sequence ( Fig. 1).
Die ermittelte Aminosäuresequenz des C. maltosa Cytochrom b5 zeigt eine mäßige aber signifikante Homologie zu der von Cytochromen b5 aus anderen Organismen. Die Sequenzidentitäten betragen beispielsweise 33% beim Vergleich mit dem menschlichen Protein und überraschenderweise auch nicht mehr als 37% beim Vergleich mit dem bisher einzigen bekannten Cytochrom b5 aus einer anderen Hefeart (S. cerevisiae). Die entsprechenden Alignments sind in Abb. 2 dargestellt.The determined amino acid sequence of C. maltosa cytochrome b5 shows a moderate but significant homology to that of cytochrome b5 from other organisms. The sequence identities are, for example, 33% when compared with the human protein and surprisingly not more than 37% when compared with the only known cytochrome b5 from another type of yeast (S. cerevisiae). The corresponding alignments are shown in Fig. 2.
Die Cytochrom b5 cDNA wurde aus einem der sequenzierten Klone SEQ ID No. 2 durch Restriktionsspaltung mit Sal I und Bam HI isoliert und in den Hefeexpressionsvektor YEp51 [Broach et al., In: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inoye, ed. Academic Press, N. Y, 1983, pp. 83-117] umkloniert. Das so konstruierte Plasmid enthielt die Cytochrom b5 cDNA unter Kontrolle des Galaktose-induzierbaren GAL 10-Promotors. und wurde dann zur Transformation des S. cerevisiae Stammes GRF18 (α, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can') eingesetzt. Die Kultivierung der Transformanden (GRF18/YEp51-b5) in einem Raffinose-haltigen Medium und die Induktion der Expression der Cytochrom b5 cDNA durch Zugabe von Galaktose erfolgte analog zu früheren Arbeiten zur Expression von Cytochromen P450 in diesem Wirts/Vektor-System [Menzel et al., Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 97-109]. Als Kontrolle dienten parallel durchgeführte Kulturen des gleichen Hefestammes nach Transformation mit dem Ausgangsplasmid (GRF18/YEp51).The cytochrome b5 cDNA was obtained from one of the sequenced clones SEQ ID No. 2 through Restriction cleavage with Sal I and Bam HI isolated and into the yeast expression vector YEp51 [Broach et al., In: Experimental Manipulation of Gene Expression, M. Inoye, ed. Academic Press, N.Y., 1983, pp. 83-117]. The plasmid thus constructed contained the Cytochrome b5 cDNA under control of the galactose-inducible GAL 10 promoter. and was then used to transform the S. cerevisiae strain GRF18 (α, his 3-11, his 3-15, leu 2-3, leu 2-112, can ') used. Cultivation of the transformants (GRF18 / YEp51-b5) in a raffinose-containing medium and the induction of expression of the cytochrome b5 cDNA by adding galactose was carried out analogously to previous work on the expression of P450 cytochrome in this host / vector system [Menzel et al., Arch. Biochem. Biophys. 330 (1996) 97-109]. Cultures of the same carried out in parallel served as controls Yeast strain after transformation with the starting plasmid (GRF18 / YEp51).
Die Zellen wurden 24 h nach Zugabe der Galaktose geerntet und mechanisch mit Glaskugeln aufgeschlossen (in 100 mM Tris/HCl-Puffer pH 7.7 mit 5 mM EDTA und einem Protease- Inhibitor-Cocktail, Boehringer-Mannheim). Die anschließende differentielle Zentrifugation beinhaltete folgende Schritte: 15 min. 3000 g; 15 min. 10 000 g; 90 min. 100 000 g. Das 100 000 g Sediment (Mikrosomen) wurde in dem oben angegebenen Tris-Puffer resuspendiert.The cells were harvested 24 hours after the galactose was added and mechanically with glass balls digested (in 100 mM Tris / HCl buffer pH 7.7 with 5 mM EDTA and a protease Inhibitor cocktail, Boehringer-Mannheim). The subsequent differential centrifugation included the following steps: 15 min. 3000 g; 15 minutes. 10,000 g; 90 min. 100,000 g. The 100,000 g of sediment (microsomes) was resuspended in the above-mentioned Tris buffer.
Der Cytochrom b5 Gehalt wurde in den einzelnen Zellfraktionen spektral bestimmt: Dazu wurden die Differenzspektren zwischen der Dithionit-reduzierten und der mit H2O2 (Endkonzentration: 0.003%)-oxidierten Probe aufgenommen. Zur Berechnung diente der für Cytochrom b5 Proteine übliche Extinktionskoeffizient von 185 mM-1xcm-1 für die Differenz der Absorptionen bei 424 und 409 nm [Estabrook and Werringloer, Meth. Enzymol. 52 (1978) 212-221].The cytochrome b5 content was determined spectrally in the individual cell fractions: For this purpose, the difference spectra between the dithionite-reduced and the sample oxidized with H 2 O 2 (final concentration: 0.003%) were recorded. The extinction coefficient of 185 mM -1 xcm -1, which is customary for cytochrome b5 proteins, was used for the calculation of the difference in the absorptions at 424 and 409 nm [Estabrook and Werringloer, Meth. Enzymol. 52 (1978) 212-221].
Die erhaltenen Ergebnisse (Abb. 3) belegen, daß die unter Kontrolle des GAL 10-Promotors exprimierte cDNA tatsächlich für ein mikrosomales Cytochrom b5 kodiert. Aus den Differenzspektren der Homogenate kann eine Expressionshöhe von ca. 300 bis 400 nmol Cytochrom b5 pro 1 Kultur abgeschätzt werden. Die aus dem Stamm GRF18/YEp51-b5 isolierten Mikrosomen hatten einen Cytochrom b5 Gehalt von ca. 0.5 nmol/mg Protein. Der Gehalt an wirtseigenem Cytochrom b5 war unter den gewählten Versuchsbedingungen wesentlich geringer und lag an der Nachweisgrenze wie die Differenzspektren mit den entsprechenden Zellfraktionen des Kontrollstammes GRF18/YEp51 zeigen (Abb. 3).The results obtained ( Fig. 3) show that the cDNA expressed under the control of the GAL 10 promoter actually codes for a microsomal cytochrome b5. An expression level of approx. 300 to 400 nmol cytochrome b5 per 1 culture can be estimated from the difference spectra of the homogenates. The microsomes isolated from the strain GRF18 / YEp51-b5 had a cytochrome b5 content of approx. 0.5 nmol / mg protein. The content of the host's own cytochrome b5 was significantly lower under the chosen test conditions and was at the detection limit, as shown by the difference spectra with the corresponding cell fractions of the control strain GRF18 / YEp51 ( Fig. 3).
Das heterolog exprimierte mikrosomale Cytochrom b5 (vgl. 1.5.) wurde mit Hilfe von
Detergentien solubilisiert und durch Chromatographie an DEAE-Sepharose, Hydroxyapatit
und DEAE-Toyoperl gereinigt. Das gereinigte Protein zeigte ein scheinbares
Molekulargewicht von etwa 20 kDa. Bei der Bestimmung der N-terminalen
Aminosäuresequenz wurden folgende zwei Sequenzen ermittelt:
Met-Ser-Asp-Thr-Thr-Thr-Thr-Val-Tyr-Asp-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ser- . . .
Ser-Asp-Thr-Thr-Thr-Thr-Val-Tyr-Asp-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ser-Lys- . . .
The heterologously expressed microsomal cytochrome b5 (cf. 1.5.) Was solubilized with the aid of detergents and purified by chromatography on DEAE-Sepharose, hydroxyapatite and DEAE-Toyoperl. The purified protein showed an apparent molecular weight of about 20 kDa. The following two sequences were determined when determining the N-terminal amino acid sequence:
Met-Ser-Asp-Thr-Thr-Thr-Thr-Val-Tyr-Asp-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ser-. , ,
Ser-Asp-Thr-Thr-Thr-Thr-Val-Tyr-Asp-Tyr-Glu-Glu-Ile-Ser-Lys-. , ,
Diese unterscheiden sich lediglich durch die An- bzw. Abwesenheit des Start-Methionins, und stimmen exakt mit der aus der cDNA-Sequenz abgeleiteten Aminosäuresequenz des C. maltosa Cytochrom b5 überein. Dieses Ergebnis bestätigt eindeutig die Identität des heterolog exprimierten Proteins.These differ only in the presence or absence of the starting methionine, and agree exactly with the amino acid sequence of C. derived from the cDNA sequence maltosa cytochrome b5. This result clearly confirms the identity of the heterologous expressed protein.
Wie nachfolgend im Einzelnen beschrieben wurde der Einfluß des C. maltosa Cytochrom b5 auf die Aktivität von zwei C. maltosa Cytochrom P450 Formen untersucht. Diese werden als P450 Cm1 und P450 Cm2 bezeichnet (Schunck et al., Eur. J. Cell Biol. 55 (1991) 336-345). Sie bilden bei Rekonstitution mit der ebenfalls aus C. maltosa klonierten NADPH-P450 Reduktase enzymatisch aktive Monooxygenase-Systeme, welche die Oxidation verschiedener n-Alkane und Fettsäuren katalysieren (Scheller, U., Zimmer, T., Kärgel, E. and Schunck, W.- H. Arch: Biochem. Biophys. 328 (1996) 245-254). Sowohl P450 Cm1 als auch P450 Cm2 können nicht nur die primäre terminale Hydroxylierung von Alkanen und Fettsäuren katalysieren, sondern auch alle weiteren Oxidationsschritte bis zur Bildung der entsprechenden Dicarbonsäuren (Scheuer, U., Zimmer, T., Becher, D., Schauer, F., Schunck, W.-H., J. Biol. Chem. 273 (1998) 32528-32534).As described in detail below, the influence of C. maltosa cytochrome b5 for the activity of two C. maltosa cytochrome P450 forms. These are called P450 Cm1 and P450 Cm2 (Schunck et al., Eur. J. Cell Biol. 55 (1991) 336-345). When reconstituted with NADPH-P450, which is also cloned from C. maltosa, they form Reductase enzymatically active monooxygenase systems that control the oxidation of various Catalyze n-alkanes and fatty acids (Scheller, U., Zimmer, T., Kärgel, E. and Schunck, W.- H. Arch: Biochem. Biophys. 328 (1996) 245-254). Both P450 Cm1 and P450 Cm2 can not only do the primary terminal hydroxylation of alkanes and fatty acids catalyze, but also all further oxidation steps until the formation of corresponding dicarboxylic acids (Scheuer, U., Zimmer, T., Becher, D., Schauer, F., Schunck, W.-H., J. Biol. Chem. 273 (1998) 32528-32534).
Um Enzymsysteme bestehend aus P450 Cm1 bzw. P450 Cm2 und NADPH-P450 Reduktase zu rekonstituieren und den Einfluß von Cytochrom b5 zu testen, wurden diese drei Komponenten in S. cerevisiae coexprimiert. Das dazu entwickelte System ist unter 2.1. erläutert. Als Kontrollen dienten S. cerevisiae Zellen, in denen P450 und Reduktase ohne Cytochrom b5 exprimiert wurden. Anschließend erfolgte eine Bestimmung der resultierenden Enzymaktivitäten auf der Ebene der isolierten Mikrosomen und intakten Hefezellen (2.2.). Als Substrat wurde jeweils ein Vertreter der Klasse der n-Alkane (Dodekan) und der Fettsäuren (Laurinsäure) eingesetzt. Die erhaltenen Ergebnisse (Tab. 1-3) zeigen eindeutig, daß Cytochrom b5 einen starken stimulierenden Effekt auf die Aktivität der untersuchten Alkan- und Fettsäure-oxidierenden P450 Formen ausübt. Enzyme systems consisting of P450 Cm1 or P450 Cm2 and NADPH-P450 reductase to reconstitute and test the influence of cytochrome b5 were these three Components coexpressed in S. cerevisiae. The system developed for this is under 2.1. explained. S. cerevisiae cells, in which P450 and reductase without Cytochrome b5 were expressed. The resultant was then determined Enzyme activities at the level of the isolated microsomes and intact yeast cells (2.2.). A representative of the class of the n-alkanes (dodecane) and the Fatty acids (lauric acid) are used. The results obtained (Tab. 1-3) clearly show that cytochrome b5 has a strong stimulating effect on the activity of the examined Alkane and fatty acid oxidizing P450 forms.
Als erster Schritt wurde durch integrative Transformation ein S. cerevisiae Stamm konstruiert, der in seinem Genom eine Kassette für die Expression des C. maltosa Cytochrom b5 trägt. Wie in Abb. 4 dargestellt, bestand die integrative Expressionskassette aus folgenden Elementen: flankierenden Teilsequenzen des TRP1-Gens für die Integration ins Hefe-Genom, einem URA3-Markergen sowie dem GAL 10-Promotor, der Cytochrom b5 cDNA und dem ADH1-Terminator.As a first step, an S. cerevisiae strain was constructed by integrative transformation, which carries in its genome a cassette for the expression of the C. maltosa cytochrome b5. As shown in Fig. 4, the integrative expression cassette consisted of the following elements: flanking partial sequences of the TRP1 gene for integration into the yeast genome, a URA3 marker gene and the GAL 10 promoter, the cytochrome b5 cDNA and the ADH1 terminator.
Zur Gewinnung und Klonierung dieser einzelnen Elemente wurde wie folgt vorgegangen:
Die Teilsequenzen des TRP1-Gens wurden durch PCR aus genomischer DNA amplifiziert.
Als Primerpaare dienten:
TRP-A1: 5'-TCTAGCCATGGTGACTATTGAGCACG-3' /
TRP-A3CR: 5'-ACAGGTACCGATATCAATGCCGTAATC-3'
und
TRP-B4: 5'-TATTGCGGCCGCTTAGATTAAATGG-3'/
TRP-B2CR: 5'-CTAGGAATTCGGCACACAGTGG-3'The procedure for obtaining and cloning these individual elements was as follows:
The partial sequences of the TRP1 gene were amplified by PCR from genomic DNA. The following were used as primer pairs:
TRP-A1: 5'-TCTAGCCATGGTGACTATTGAGCACG-3 '/
TRP-A3CR: 5'-ACAGGTACCGATATCAATGCCGTAATC-3 '
and
TRP-B4: 5'-TATTGCGGCCGCTTAGATTAAATGG-3 '/
TRP-B2CR: 5'-CTAGGAATTCGGCACACAGTGG-3 '
Die amplifizierten Fragmente entsprechen den Regionen 49-390 bzw. 670-1425 innerhalb der Sequenz TRP1 Gens (zugrundeliegende Sequenz: V01341, Gene Bank). Diese Fragmente wurden in das bereits beschriebene Plasmid "pBM21-Ex2" (Zimmer, T., Kaminski, K., Scheuer, U., Vogel, F., and Schunck, W.-H. DNA and Cell Biology 14 (1995) 619-628) unter Verwendung der Restriktionsorte PmaCI/EcoRV (TRP-A) bzw. NotI/EcoRI (TRP-B) eingeführt (resultierendes Plasmid: "Ex2-TRAB").The amplified fragments correspond to regions 49-390 and 670-1425 within the Sequence TRP1 gene (underlying sequence: V01341, Gene Bank). These fragments were into the plasmid "pBM21-Ex2" (Zimmer, T., Kaminski, K., Scheuer, U., Vogel, F., and Schunck, W.-H. DNA and Cell Biology 14 (1995) 619-628) at Use of the restriction sites PmaCI / EcoRV (TRP-A) or NotI / EcoRI (TRP-B) introduced (resulting plasmid: "Ex2-TRAB").
Das URA3-Markergen wurde durch Restriktion mit Pvu I/Nru I aus dem Plasmid pSEY304 (Bankaitis, V. A., Johnson, L. M., and Emr, S. D. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83 (1986) 9075- 9079) isoliert und in den Eco RV-Ort des Plasmids Ex2-TRAB einkloniert (resultierendes Plasmid: Ex2-TRAB/URA).The URA3 marker gene was isolated from the plasmid pSEY304 by restriction with Pvu I / Nru I (Bankaitis, V.A., Johnson, L.M., and Emr, S.D. Proc.Natl.Acad.Sci. USA 83 (1986) 9075- 9079) isolated and cloned into the Eco RV site of the plasmid Ex2-TRAB (resulting Plasmid: Ex2-TRAB / URA).
Die Cytochrom b5 cDNA wurde aus dem Plasmid pCR 2.1™ (vgl. 1.3.) durch Restriktion mit Sal I und Bam HI isoliert und in das mit den gleichen Restriktasen geöffnete Plasmid Ex2-TRAB/URA umkloniert (resultierendes Plasmid: pEx2/Cmb5, siehe Abb. 4). Die verwendete Cytochrom b5 cDNA entspricht der SEQ ID No: 2.The cytochrome b5 cDNA was isolated from the plasmid pCR 2.1 ™ (cf. 1.3.) By restriction with Sal I and Bam HI and recloned into the plasmid Ex2-TRAB / URA opened with the same restrictases (resulting plasmid: pEx2 / Cmb5, see Fig. 4). The cytochrome b5 cDNA used corresponds to SEQ ID No: 2.
Die so konstruierte integrative Expressionskassette wurde dann aus dem Plasmid pEx2/Cmb5 durch Restriktion mit Pma CI und Nhe I isoliert und in den S. cerevisiae Stamm YS 18 (isogen zu GRF18 aber ura3; Sengstag and Hinnen, Gene 67 (1988) 223-228) transformiert. Dabei wurden sowohl Transformanten erhalten, bei denen die Expressionskassette durch homologe Rekombination in das TRP1-Gen der Wirtzelle eingebaut wurde (TRP-, URA+, im weiteren als YSCmb5C1 bezeichnet), als auch solche, die aus einem zufälligen Einbau an einem anderen, nicht näher charakterisierten Ort des Hefe-Genoms resultierten (TRP+, URA+, im weiteren als YSCmb5C10 bezeichnet).The integrative expression cassette thus constructed was then isolated from the plasmid pEx2 / Cmb5 by restriction with Pma CI and Nhe I and into the S. cerevisiae strain YS 18 (isogenic to GRF18 but ura3; Sengstag and Hinnen, Gene 67 (1988) 223-228 ) transformed. Both transformants were obtained in which the expression cassette was incorporated into the TRP1 gene of the host cell by homologous recombination (TRP - , URA + , hereinafter referred to as YSCmb5C1), and those which resulted from an accidental incorporation into another were not Characterized location of the yeast genome resulted (TRP + , URA + , hereinafter referred to as YSCmb5C10).
Die so konstruierten und für die weiteren Versuche ausgewählten Stämme YSCmb5CI und YSCmb5C10 tragen jeweils eine stabil in das Hefegenom integrierte Expressionskassette, die eine Galaktose-induzierbare Expression des C. maltosa Cytochrom b5 gestattet. Dabei zeichnet sich der Stamm YSCmb5C10 durch eine etwa 2.5-fach höhere Cytochrom b5 Expression im Vergleich zu YSCmb5C1 aus.The strains YSCmb5CI and YSCmb5C10 each carry an expression cassette that is stably integrated into the yeast genome a galactose-inducible expression of the C. maltosa cytochrome b5 is permitted. there the YSCmb5C10 strain is characterized by an approximately 2.5-fold higher cytochrome b5 Expression compared to YSCmb5C1.
Ausgehend von YSCmb5C1 und YSCmb5C10 wurden dann Hefe-Stämme erzeugt, die eine gleichzeitige Expression von Cytochrom P450, NADPH-P450 Reduktase und Cytochrom b5 ermöglichen. Dazu erfolgte eine Transformation der YSCmb5-Stämme mit den autonom replizierenden Plasmiden YEp51Cm1-R bzw. YEp51Cm2-R. Diese Plasmide wurden bereits früher beschrieben: Zimmer, T., Kaminski, K., Scheuer, U., Vogel, F., and Schunck, W.-H. (DNA and Cell Biology 14 (1995) 619-628 und DE 195 07 546 A1). Sie tragen zwei Expressionskassetten, die jeweils unter Kontrolle des GAL10 Promotors zur Expression der gewünschten P450-Komponente (P450 Cm1 bzw. P450 Cm2 aus C. maltosa) und der NADPH-P450 Reduktase aus C. maltosa genutzt werden.Yeast strains were then produced from YSCmb5C1 and YSCmb5C10, the one simultaneous expression of cytochrome P450, NADPH-P450 reductase and cytochrome b5 enable. For this purpose, the YSCmb5 strains were transformed with the autonomous ones replicating plasmids YEp51Cm1-R and YEp51Cm2-R. These plasmids have already been created previously described: Zimmer, T., Kaminski, K., Scheuer, U., Vogel, F., and Schunck, W.-H. (DNA and Cell Biology 14 (1995) 619-628 and DE 195 07 546 A1). You wear two Expression cassettes, each under control of the GAL10 promoter to express the desired P450 component (P450 Cm1 or P450 Cm2 from C. maltosa) and the NADPH-P450 reductase from C. maltosa can be used.
Letztlich wurden für die Untersuchung des stimulierenden Effekts von Cytochrom b5 auf die
Aktivität Alkan- und Fettsäure-oxidierender P450 Enzyme folgende S. cerevisiae-Stämme
erhalten:
YSCmb5C1/Cm1R und YSCmb5vC10/Cm1R - zur Coexpression von Cytochrom b5, P450
Cm1 und NADPH-P450 Reduktase;
YSCmb5C1/Cm2R und YSCmb5C10/Cm2R - zur Coexpression von Cytochrom b5, P450
Cm2 und NADPH-P450 Reduktase;
YS18/Cm1R - Kontrollstamm zur Expression von P450 Cm1 und NADPH-P450 Reduktase
ohne Cytochrom b5
YS18/Cm2R - Kontrollstamm zur Expression von P450 Cm2 und NADPH-P450 Reduktase
ohne Cytochrom b5Ultimately, the following S. cerevisiae strains were obtained for the investigation of the stimulating effect of cytochrome b5 on the activity of alkane and fatty acid oxidizing P450 enzymes:
YSCmb5C1 / Cm1R and YSCmb5vC10 / Cm1R - for coexpression of cytochrome b5, P450 Cm1 and NADPH-P450 reductase;
YSCmb5C1 / Cm2R and YSCmb5C10 / Cm2R - for coexpression of cytochrome b5, P450 Cm2 and NADPH-P450 reductase;
YS18 / Cm1R - control strain for the expression of P450 Cm1 and NADPH-P450 reductase without cytochrome b5
YS18 / Cm2R - control strain for the expression of P450 Cm2 and NADPH-P450 reductase without cytochrome b5
Für diese Untersuchungen wurden die oben genannten S. cerevisiae Stämme (vgl. 2.1.) wie unter 1.5. beschrieben kultiviert und die Expression der jeweiligen Komponenten (P450, Reduktase und Cytochrom b5) durch Zugabe von Galaktose induziert. Die Zellen wurden 24 h nach Galaktose-Zugabe geerntet, mechanisch aufgeschlossen und die Gewinnung der Mikrosomen erfolgte durch differentielle Zentrifugation (siehe 1.5).The S. cerevisiae strains mentioned above (cf. 2.1.) Were used for these studies under 1.5. cultivated and the expression of the respective components (P450, Reductase and cytochrome b5) induced by the addition of galactose. The cells were Harvested 24 hours after the addition of galactose, mechanically digested and the extraction of Microsomes were done by differential centrifugation (see 1.5).
Die Reaktionsansätze (1 ml) enthielten in 100 mM K-K-Phosphatpufer pH 7.25, 10 mM KCl, 5 mM MgCl2, ca. 0.2 mg mikrosomales Protein, 100 nmol NADPH, ein NADPH regenerierendes System bestehend aus 3.1 µMol Glucose-6-Phosphat und 1 U Glucose-6- Phosphat-Dehydrogenase sowie als Substrat entweder [1-14C] Dodekan (1000 nMol, 1 × 106 dpm) oder [1-14C] Laurinsäure (250 nMol, 5 × 105 dpm). Die Reaktionen wurden durch Zugabe von NADPH gestartet, bei einigen Experimenten wurde gleichzeitig NADH (500 nmol) zugesetzt. Die Inkubation erfolgte 30 min bei 30°C. Die weitere Aufarbeitung (Chloroform/Methanol-Extraktion und Dünnschicht-Chromatographie) sowie die Quantifizierung der Reaktionsprodukte mit einem TLC-Radio-Scanner erfolgte wie früher beschrieben (Scheller, U., Zimmer, T., Kärgel, E. and Schunck, W.-H. Arch. Biochem. Biophys. 328 (1996) 245-254).The reaction mixtures (1 ml) contained in 100 mM KK phosphate buffer pH 7.25, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2 , approx. 0.2 mg microsomal protein, 100 nmol NADPH, a NADPH regenerating system consisting of 3.1 µmol glucose-6-phosphate and 1 U glucose-6-phosphate dehydrogenase and as substrate either [1- 14 C] dodecane (1000 nmol, 1 × 10 6 dpm) or [1- 14 C] lauric acid (250 nmol, 5 × 10 5 dpm). The reactions were started by adding NADPH; in some experiments NADH (500 nmol) was added at the same time. Incubation took place at 30 ° C for 30 min. Further processing (chloroform / methanol extraction and thin-layer chromatography) and quantification of the reaction products using a TLC radio scanner were carried out as previously described (Scheller, U., Zimmer, T., Kärgel, E. and Schunck, W. -H. Arch. Biochem. Biophys. 328 (1996) 245-254).
Die Ergebnisse sind in Tab. 1 und Tab. 2 zusammengefaßt. Sie zeigen, daß Cytochrome b5 einen starken stimulierenden Effekt auf die Aktivität der untersuchten P450 Enzyme hat.The results are summarized in Tab. 1 and Tab. 2. They show that cytochrome b5 has a strong stimulating effect on the activity of the investigated P450 enzymes.
Beispielsweise wurde die Geschwindigkeit der NADPH-abhängigen, P450 Cm2 katalysierten Oxidation von Laurinsäure durch die Anwesenheit von Cytochrom b5 etwa 4-fach gesteigert (siehe Tab. 1). Bei Einsatz eines Gemisches von NADPH und NADH erfolgte eine weitere Erhöhung, so daß durch Cytochrom b5 eine insgesamt mehr als 7-fache Stimulierung erreicht wurde. Der synergistische Effekt von NADPH und NADH trat nur in Anwesenheit von Cytochrom b5 auf (siehe Tab. 1). Die Aktivität von P450 Cm1, das im Gegensatz zum P450 Cm2 bevorzugt n-Alkane oxidiert, wurde ebenfalls deutlich durch Cytochrom b5 stimuliert. Das coexprimierte Cytochrom b5 bewirkte eine mehr als 4-fache Steigerung der P450 Cm1 katalysierten Oxidation von Dodekan (Tab. 2). Zusätzlich wurde gezeigt, daß eine Stimulierung der P450-Aktivität auch durch Zusatz von gereinigtem Cytochrom b5 zu Mikrosomen erreicht werden kann, die nur P450 und NADPH-P450 Reduktase enthielten (Tab. 2). Unter den gewählten Reaktionsbedingungen waren 1-Dodekanol und 12- Hydroxylaurinsäure die Hauptprodukte der P450-abhängigen Dodekan bzw. Laurinsäure- Oxidationen. Eine signifikante Weiteroxidation bis zur entsprechenden Dikarbonsäure trat vor allem bei hohen Enzymaktivitäten auf (vgl. Tab. 1).For example, the speed of the NADPH-dependent, P450 Cm2 was catalyzed Oxidation of lauric acid increased approximately 4-fold due to the presence of cytochrome b5 (see Tab. 1). Another was used when using a mixture of NADPH and NADH Increase so that a total of more than 7-fold stimulation is achieved by cytochrome b5 has been. The synergistic effect of NADPH and NADH only occurred in the presence of Cytochrome b5 (see Table 1). The activity of P450 Cm1, which is in contrast to P450 Cm2 preferentially oxidized n-alkanes, was also clearly stimulated by cytochrome b5. The coexpressed cytochrome b5 caused a more than 4-fold increase in P450 Cm1 catalyzed oxidation of dodecane (Tab. 2). In addition, it was shown that a P450 activity also stimulated by adding purified cytochrome b5 to it Microsomes can be reached that contained only P450 and NADPH-P450 reductase (Tab. 2). Under the chosen reaction conditions, 1-dodecanol and 12- Hydroxylauric acid the main products of the P450-dependent dodecane or lauric acid Oxidations. Significant further oxidation to the corresponding dicarboxylic acid occurred especially with high enzyme activities (see Table 1).
In einer weiteren Versuchsreihe wurde die Fähigkeit intakter Hefezellen zur Oxidation von Laurinsäure untersucht. Dazu wurden je 2 ml Aliquote Galaktose-induzierter Kulturen der oben genannten Hefestämme eingesetzt. Diese wurden mit [1-14C] Laurinsäure (500 nMol, 1 × 106 dpm; gelöst in 10 µl Ethanol) versetzt und unter Schütteln für 30 min bei 30°C inkubiert. Die Extraktion und Quantifizierung der Reaktionsprodukte erfolgte wie oben für die mikrosomalen Ansätze beschrieben.The ability of intact yeast cells to oxidize lauric acid was investigated in a further series of experiments. For this purpose, 2 ml aliquots of galactose-induced cultures of the above-mentioned yeast strains were used. These were labeled with [1- 14 C] lauric acid (500 nmol, 1 x 10 6 dpm dissolved in 10 ul ethanol) and incubated for 30 min with shaking at 30 ° C. The reaction products were extracted and quantified as described above for the microsomal approaches.
Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tab. 3 zusammengefaßt. Sie zeigen, daß bereits auf der Ebene der intakten Zellen ein stimulierender Effekt des Cytochrom b5 klar nachweisbar ist. Dieser war im Fall von P450 Cm2 besonders stark ausgeprägt. So wies der Stamm mit der höchsten Cytochrom b5 Coexpression (YSCmb5C10/Cm2R) eine etwa 4-fach höhere Aktivität auf, als der entsprechende Stamm, der nur P450 Cm2 und die NADPH-P450 Reduktase exprimiert (YS18/Cm2R). Dabei wurde nicht nur eine verstärkte Bildung der 12- Hydroxylaurinsäure sondern auch der Dodekandisäure beobachtet (Tab. 3). Dieses Ergebnis zeigt, daß Cytochrom b5 sowohl die primäre Hydroxylierungsreaktion, als auch die nachfolgenden Oxidationsschritte bis zur entsprechenden Dikarbonsäure stimuliert. The results obtained are summarized in Tab. 3. They show that already on the Level of intact cells a stimulating effect of cytochrome b5 is clearly detectable. This was particularly pronounced in the case of P450 Cm2. So the tribe pointed with the highest cytochrome b5 coexpression (YSCmb5C10 / Cm2R) an approximately 4 times higher Activity on as the corresponding strain, the only P450 Cm2 and the NADPH-P450 Reductase expressed (YS18 / Cm2R). Not only was an increased education of the 12- Hydroxylauric acid but also dodecanedioic acid were observed (Table 3). This result shows that cytochrome b5 is the primary hydroxylation reaction as well as the subsequent oxidation steps stimulated to the corresponding dicarboxylic acid.
Legende zu den Abbildungen:
Abb. 1: Nucleinsäuresequenz und abgeleitete Aminosäuresequenz für das Cytochrom b5 der
alkanverwertenden Hefe Candida maltosa.
Abb. 2: Vergleich der Aminosäuresequenz des Cytochrom b5 aus Candida maltosa mit der
bekannter Cytochrom b5 Proteine. (A)- Alignment mit der Sequenz des Cytochrom b5 aus
Saccharomyces cerevisiae (Swiss Prot Accession number: P40312); (B)- Alignment mit der
Sequenz des menschlichen Cytochrom b5 (mikrosomale Form, Swiss Prot Accession number:
P00167).
Abb. 3: Heterologe Expression der Candida maltosa Cytochrom b5 cDNA in Saccharomyces
cerevisiae. Dargestellt sind die Differenzspektren (reduzierte gegen oxidierte Probe) zum
Nachweis von Cytochrom b5 in verschiedenen Zellfraktionen: A: Homogenat; B: 10 000 g
Überstand; C: 100 000 g Überstand; D: 100 000 g Sediment (Mikrosomen). #1-
Zellfraktionen des Stammes GRF18/YEp51-b5 (Expression des C. maltosa Cytochrom b5);
#2- Zellfraktionen des Kontrollstammes GRF18/YEp51; #0- Grundlinie zu #1.
Abb. 4: Karte des Plasmids pEx2/Cmb5. Dieses Plasmid enthält die konstuierte
Expressionskassette zur heterologen Expression des Cytrochrom b5 aus Candida maltosa in
Saccharomyces cerevisiae.Legend for the pictures:
Fig. 1: Nucleic acid sequence and derived amino acid sequence for the cytochrome b5 of the alkane-utilizing yeast Candida maltosa.
Fig. 2: Comparison of the amino acid sequence of the cytochrome b5 from Candida maltosa with the known cytochrome b5 proteins. (A) - Alignment with the sequence of the cytochrome b5 from Saccharomyces cerevisiae (Swiss Prot Accession number: P40312); (B) - Alignment with the sequence of the human cytochrome b5 (microsomal form, Swiss Prot Accession number: P00167).
Fig. 3: Heterologous expression of the Candida maltosa cytochrome b5 cDNA in Saccharomyces cerevisiae. The difference spectra (reduced versus oxidized sample) for the detection of cytochrome b5 in different cell fractions are shown: A: homogenate; B: 10,000 g of supernatant; C: 100,000 g of supernatant; D: 100,000 g sediment (microsomes). # 1 cell fractions of strain GRF18 / YEp51-b5 (expression of the C. maltosa cytochrome b5); # 2- cell fractions of the control strain GRF18 / YEp51; # 0- baseline to # 1.
Fig. 4: Map of the plasmid pEx2 / Cmb5. This plasmid contains the constructed expression cassette for the heterologous expression of the cytrochrome b5 from Candida maltosa in Saccharomyces cerevisiae.
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Legal Events
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