DE10018787A1

DE10018787A1 - Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure-sterylestern

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Publication number: DE10018787A1
Application number: DE2000118787
Authority: DE
Inventors: Nikolaus Weber; Kumar D Mukheriee
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-04-15
Filing date: 2000-04-15
Publication date: 2001-05-03

Abstract

Die Erfindung beschreibt ein enzymatisches Verfahren zur Synthese von Carbonsäure-sterylestern in hoher Ausbeute durch Umsetzung von Carbonsäuren oder Carbonsäureestern mit Sterinen und anderen Steroiden oder deren kurzkettigen Estern, wobei die Reaktionspartner ohne Lösungsmittel in Gegenwart von Lipasen im Vakuum reagieren. Carbonsäure-sterylester können als Nahrungsergänzungen und Pharmazeutika, als Flüssigkristalle in der Technik sowie als Bestandteile von Kosmetika Verwendung finden.

Description

Die Erfindung ist charakterisiert durch die lösungsmittelfreie Umsetzung von organischen Carbonsäuren oder Carbonsäureestern mit Sterinen und anderen Steroiden oder deren kurzkettigen Estern, wobei die Reaktionspartner ohne Lösungsmittel in Gegenwart von Lipasen im Vakuum zu Sterylestern reagieren.

Als Sterine (Sterole, Steroide) werden im folgenden natürlich vorkommende und synthetische Alkohole mit einem hydrierten oder partiell hydrierten Cyclopenta[a]phenanthren-Gerüst bezeichnet, die noch weitere funktionelle Gruppen als Substituenten besitzen können wie z. B. Alkyl-Reste, Keto-, Hydroxy- und Carboxy-Gruppen. Die Verbindungen besitzen üblicherweise 18-30 Kohlenstoffatome. Der Begriff Sterine wird im folgenden sinngemäß auch für Verbindungen verwendet, die oft als Steroide oder Steroid-Hormone bezeichnet werden, beispielsweise Androstan- und Pregnan-Derivate.

Sterinester finden vielseitige Anwendung als Parmazeutika und Bestandteile von Kosmetika sowie als flüssigkristalline Verbindungen in der Technik (Koshiro, A., 1987. Cholesterol ester and its manufacture using microbial lipase. Japan. Kokai Tokkyo Koho 62 296 894 [Chemical Abstracts 110: 210969p, 1989]). In jüngster Zeit werden Fettsäureester der Phytosterine auch als Nahrungsergänzungen in Diätmargarinen verwendet, da sie den Plasmacholesterin-Spiegel senken können (Miettinen, T., Vanhagen, H. und Wester, I., 1996. Use of stanol fatty acid ester for reducing serum cholesterol level. U.S. Patent 5 502 045; von Hellens, S., 1999. Benecol margarine enriched with stanol esters. Lipid Technology 11: 29-31; Wester, I., 2000. Cholesterol-lowering effect of plant sterols. European Journal of Lipid Science and Technology, 37-44).

Es ist bekannt, daß Carbonsäure-sterylester durch Übertragung eines Acyl-Rests auf Hydroxy- Gruppen von Sterinen auf unterschiedliche Weise hergestellt werden können. Chemische Verfahren beruhen vor allem auf der Umesterung von Carbonsäureestern mit Sterinen oder Reaktionen von Carbonsäurehalogeniden oder -anhydriden mit Hydroxy-Gruppen von Sterinen (Pinter, K. G., hamilton, J. G. und Muldrey, J. E., 1964. A method for rapid microsynthesis of radioactive cholesterol esters. Journal of Lipid Research 5: 273-274; Piretti, M. V. und Pagliuca, G., 1996. Synthesis of highly pure dolichyl and cholesteryl esters. Italian Journal of Biochemistry 45: 67-69).

Enzymatische Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure-sterylestern gehen von Carbonsäuren und Sterinen (Veresterung) bzw. Carbonsäureestern und Sterinen (Umesterung) aus, die in Gegenwart von Lipasen als Biokatalysatoren umgesetzt werden.

Bisherige Verfahren (Koshiro, A., 1987. Cholesterol ester and its manufacture using microbial lipase. Japan. Kokai Tokkyo Koho 62 296 894 [Chemical Abstracts 110: 210969p, 1989]; Kosugi, Y., Tanaka, H., Tomizuka, N., Akeboshi, K., Matsufune, Y. und Yoshikawa, S., 1989. Enzymic manufacture of sterol fatty acid esters. Japan. Kokai Tokkyo Koho 1 218 593 [Chemical Abstracts 113, 4707k, 1990]) beschreiben die lipase-katalysierte Veresterung von organischen Carbonsäuren mit Hydroxy-Gruppen von Sterinen, z. B. Cholesterin, in organischen Lösungsmitteln wie zum Beispiel Heptan, Methyl-tert.-butylether, Aceton und anderen, zum Teil in Gegenwart geringer Mengen Wasser. So ist die lipase-katalysierte Synthese von Cholesteryl docosahexaenoat bekannt, die in Gegenwart von etwa 30% Wasser zu einem Umsatz von 90% nach einer Reaktionszeit von 24 Stunden führt (Shimada, Y., Hirota, Y., Baba, T., Sugihara, A., Moriyama, S., Tominaga, Y. und Terai, T., 1999. Enzymatic synthesis of steryl esters of polyunsaturated fatty acids. Journal of the American Oil Chemists' Society 76: 713-716).

In einer Reihe weiterer Veröffentlichungen wird die Synthese von kurzkettigen Carbonsäure- steroidestern sowie von langkettigen Sterylestern in organischen Lösungsmitteln, zum Teil unter Verwendung von Molekularsieb im Reaktionsansatz zur Entfernung des gebildeten Wassers oder Alkohols beschrieben (Haraldsson, G. G., 1992. The application of lipases in organic synthesis. In: Supplement B: The chemistry of acid derivatives, Vol. 2 [Patai, S., Ed.] S. 1395-1473, John Wiley, Chichester; Kazlauskas, R. J. und Bornscheuer, U. T., 1998. Biotransformations with lipases, in: Biotechnology [Rehm, H.-J. und Reed, G., Eds) 2^nd edition, Vol. 8a: Biotransformations, S. 37-191, Wiley-VCH, Weinheim; Riva, S. und Klibanov, A. M., 1988. Enzymochemical regioselective oxidation of steroids without oxidoreductases, Journal of the American Chemical Society 110: 3291; Riva, S., Bovara, R., Ottolina, G., Secundo, F. und Carrea, G., 1989. Regioselective acylation of bile acid derivatives with Candida cylindracea lipase in anhydrous benzene. Journal of Organic Chemistry 54: 3161-3164; Faber, K. und Riva, S., 1992. Enzyme-catalyzed irreversible acyl transfer. Synthesis, 895-910).

Lipase-katalysierte Veresterungs- und Umesterungsreaktionen im Vakuum zur Entfernung der flüchtigen Reaktionsprodukte sind zur Herstellung von verschiedenen Esterverbindungen bereits eingesetzt worden. Auf diese Weise wurden zum Beispiel folgende Verbindungen hergestellt: Alkylester von Fettsäuren (Miller, C., Austin, H., Posorske, L. und Gonzalez, J., 1988. Characteristics of an immobilized lipase for the commercial synthesis of esters. Journal of the American Oil Chemists' Society 65: 927-931), 1,3-Diglyceride (Rosu, R., Yasui, M., Iwasaki, Y. und Yamane, T., 1999. Enzymatic synthesis of symmetrical 1,3-diacylglycerols by direct esterification of glycerol in solvent-free system. Journal of the American Oil Chemists' Society 76: 839-843), strukturierte Triglyceride (Han, J. J. und Yamane, T., 1999. Enhancement of both reaction yield and rate of synthesis of structured triacylglycerol containing eicosapentaenoic acid under vacuum with water activity control. Lipids 34: 989-995) und Thioester von Fettsäuren (Weber, N., Klein, E. und Mukherjee, K. D., 1999. Enzymatisches Verfahren zur Herstellung von Carbonsäure-thioestern. Ger. Patent Application 199 05 962 A1; Weber, N., Klein, E., Mukherjee, K. D. und Vosmann, K., 1999. Enzymatisches Verfahren zur Herstellung sterisch einheitlicher ungesättigter Carbonsäure-thioester und isomerer gesättigter S-Alkylcarbonsäure- thioester. Ger. Patent Application 199 36 549 A1).

Im Unterschied zu den bekannten, oben erwähnten Verfahren werden die im folgenden ausführlich beschriebenen enzymatischen Synthesen ohne Lösungsmittel und ohne Molekularsieb oder andere Trockenmittel im Reaktionsgemisch durchgeführt. Vielmehr werden die Gemische der Reaktionspartner, d. s. Carbonsäuren oder Carbonsäureester und Sterine oder deren kurzkettige Ester, enzymkatalytisch in Gegenwart von Lipasen umgesetzt und das entstandene Wasser bzw. entstandene kurzkettige Alkohole, Säuren oder Ester im Vakuum aus dem Reaktionsgemisch entfernt. Über diese lipase-katalysierten Veresterungs- und Umesterungsreaktionen unter Vakuum zur Herstellung von Carbonsäure-sterylestern ist bisher nichts bekannt.

Veresterung: R₁-CO-OH + R₂-OH ⇄ R₁-CO-OR₂ + H₂O

Umesterung:
R₁-CO-OR₃ + R₂-OH ⇄ R₁-CO-OR₂ + R₃OH
R₁-CO-OH + R₂O-CO-R₄ ⇄ R₁-CO-OR₂ + R₄-CO-OH
R₁-CO-OR₃ + R₂O-CO-R₄ ⇄ R₁-CO-OR₂ + R₄-CO-OR₃
wobei R₁ beispielsweise Alkylreste mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen und R₂ Steryl-Reste darstellen, während es sich bei R₃ vorzugsweise um kurzkettige Alkylreste und bei R₄ um kurzkettige Acylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen handelt

Zur Herstellung von Carbonsäure-sterylestern werden vor allem gesättigte und ungesättigte Sterine, wie z. B. Sitostanol (Stigmastanol), α-Cholestan-3β-ol (Dihyrocholesterin), Sitosterin (β- Sitosterin), Cholesterin, Ergosterin und 7-Dehydrocholesterin sowie Sterine mit weiteren Alkyl- Gruppen, wie z. B. Lanosterin und Dihydrolanosterin, oder Sterine mit weiteren Hydroxy- Gruppen oder anderen funktionellen Gruppen, wie z. B. 5α-Androstan-3β,17β-diol, 5α-Pregnan- 3β-ol-20-on, 5-Pregnen-3β-ol-20-on sowie Cholsäure, Desoxycholsäure und andere Gallensäuren, eingesetzt.

Das Verfahren ist anwendbar auf eine große Anzahl von Carbonsäuren sowie Di- und Polycarbonsäuren mit linearer, verzweigtkettiger und cyclischer Struktur der Kettenlängen C₂ bis C₃₀. Als Carbonsäuren werden zum Beispiel langkettige gesättigte und ungesättigte aliphatische Carbonsäuren wie Laurinsäure, Palmitinsäure, Ölsäure und Linolsäure oder auch solche mit aromatischen Resten wie Zimtsäure und Dihydrozimtsäure verwendet. Auch verzweigtkettige und cyclische aliphatische Carbonsäuren, beispielsweise Isostearinsäure und Cyclopentenylfettsäuren, werden als Reaktionspartner eingesetzt. Ferner werden aliphatische Di- und Polycarbonsäuren, wie z. B. Glutar-, Kork- und 1,12-Dodecandisäure oder Tricarballylsäure, mit Sterinen in Gegenwart von Lipasen in Di- und Polycarbonsäure-sterylester bzw. deren Partialester umgewandelt.

Als Carbonsäureester, die für die Synthese von Carbonsäure-sterylestern Verwendung finden, dienen vor allem Ester der oben genannten linearen, verzweigtkettigen oder cyclischen gesättigten und ungesättigten aliphatischen Carbonsäuren oder Di- und Polycarbonsäuren, wie z. B. Ester von Myristinsäure, Stearinsäure, Ölsäure, Linolsäure, Isostearinsäure, Dihydrozimtsäure, 1,8-Octandisäure (Korksäure) oder Tricarballylsäure, mit einem kurzkettigen linearen oder verzweigtkettigen Alkohol der Kettenlänge C₁ bis C₆. Auch andere Carbonsäureester, vor allem Triacylglycerine (Triglyceride) wie z. B. Triacetin, Tripropanoin, Tricaproin und Triolein, aber auch Kohlensäureester wie z. B. Dimethyl- und Diethyl-carbonat sowie kurzkettige Alkylcholesteryl-carbonate werden als Acyldonoren bei der Umesterung eingesetzt. Natürliche Triglyceride von Fetten und Ölen, z. B. Rindertalg oder Rapsöl, Sonnenblumenöl und Sojaöl, können ebenfalls für die Umesterung mit Sterinen eingesetzt werden. Insbesondere eignen sich kurzkettige Triglyceride wie z. B. Triacetin und Tripropanoin zur Herstellung von Carbonsäure-sterylestern (Carbonsäure-steroidestern) mit kurzen (C₂ bis C₈) Acyl-Resten, die zum Beispiel für pharmazeutische Zwecke von Interesse sind:

wobei R₁ beispielsweise Alkylreste mit 1 bis 30 Kohlenstoffatomen, R₂ Steryl-Reste und R₃ Wasserstoffatome oder kurzkettige Acylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen darstellen

Die Umesterung (Alkoholyse) von Triglyceriden mit Hydroxy-Gruppen von Sterinen benötigt im Gegensatz zur oben beschriebenen Veresterung von Carbonsäuren oder Umesterung von Carbonsäureestern grundsätzlich kein Vakuum, da kein Wasser bzw. kurzkettiger Alkohol gebildet wird. Dennoch erhöht sich auch hier die Ausbeute, wenn die Reaktion im Vakuum durchgeführt wird.

Für die Herstellung der Carbonsäure-sterylester können alle bekannten Lipasen als Enzym katalysatoren verwendet werden, vor allem Lipasen aus Mikroorganismen, wie z. B. aus Rhizopus arrhizus, Candida antarctica, Candida rugosa (= C. cylindracea), Rhizomucor miehei und Geotrichum candidum, Pankreaslipase aus verschiedenen Tierspezies sowie Lipasen aus Pflanzen, wie z. B. Papaya, Raps, Rizinus, Reis, Vernonia und Ananas.

Die lipase-katalysierten Synthesen von Carbonsäure-sterylestern können bei unterschiedlichen Reaktionsbedingungen durchgeführt werden, die insbesondere von den ausgewählten Lipasen abhängen. Im allgemeinen werden Temperaturen zwischen 10 und 100°C angewendet, bevorzugt solche zwischen 30 und 80°C. Die molaren Verhältnisse zwischen den Reaktionspartnern, d. s. Carbonsäuren oder Carbonsäureester und Sterine oder deren kurzkettige Ester, sowie die Anteile der zugesetzten Lipasen unterliegen keinen Einschränkungen. Die Reaktionszeit ist ebenfalls nicht beschränkt. Rühren des Reaktionsgemisches und Erhöhung der Lipasemenge im Versuchsansatz steigern die Reaktionsgeschwindigkeit und beschleunigen die Bildung der Carbonsäure-sterylester. Wiederholte Verwendung der in einem Reaktionsansatz benutzten Lipase in einem neuen Ansatz ist ohne nennenswerten Leistungsverlust des Biokatalysators möglich.

Unterdrücke zwischen 900 mbar und 0,1 mbar können für die Reaktion verwendet werden; üblicherweise werden Drücke zwischen 200 mbar und 10 mbar eingehalten.

Die Reinigung der Carbonsäure-sterylester kann auf unterschiedliche Weise erfolgen. Nach der Umsetzung wird der Enzymkatalysator durch Zentrifugation, Filtration oder Extraktion mit einem organischen, vorzugsweise apolaren Lösungsmittel vom Reaktionsgemisch abgetrennt. Das Reaktionsgemisch wird entweder direkt verwendet oder an einer kurzen Säule gepackt mit einem Sorbens, vorzugsweise Kieselgel, adsorbiert. Durch Elution mit Gemischen apolarer und wenig polarer, aprotischer organischer Lösungsmittel, z. B. iso-Hexan/Diethylether-Gemischen, werden die Carbonsäure-sterylester anschließend von nicht umgesetzten Carbonsäuren bzw. Carbonsäureestern sowie Sterinen abgetrennt.

Durch Umsetzung stöchiometrischer Mengen von Carbonsäuren oder Carbonsäureestern und Sterinen lassen sich bei hohen Umsätzen Carbonsäure-sterylester hoher Reinheit (< 90%) auch ohne aufwendige Reinigung der Reaktionsprodukte gewinnen.

Im folgenden werden verschiedene Ausführungsbeispiele gegeben für die Herstellung von Carbonsäure-sterylestern, die in beheizbaren Rührgefäßen unter Vakuum durchgeführt wird:

Beispiel 1

Sterin: Sitostanol 41,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäure: Ölsäure 84,7 mg (0,3 mmol)
Lipase: Candida rugosa-Lipase, immobilisiert, 50 mg
Temperatur: 40°C
Druck: 50 mbar
Dauer: 4 Std.
Aufarbeitung: Nach der Umsetzung wird der Enzymkatalysator vom Reaktionsgemisch durch zweimalige Extraktion mit je 3 mL Diethylether und anschließende Zentrifugation abgetrennt. Das Lösungsmittel wird verdampft, das Reaktionsgemisch in 1 mL iso-Hexan/Diethylether (9 : 1, v/v) gelöst und an einer kurzen Säule (20 × 1 cm i. D.) gepackt mit Kieselgel in iso-Hexan adsorbiert. Die Elution mit 20 mL iso-Hexan/Diethylether (95 : 5, v/v) ergibt 60,5 mg Ölsäure-sitostanylester. Durch anschließende Elution mit 20 mL iso-Hexan/Diethylether (1 : 1, v/v) werden überschüssige Ölsäure und nicht umgesetztes Sitostanol zurückgewonnen.
Analyse: Die Analyse des Produktes erfolgt durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 95% Ölsäure-sitostanylester (bezogen auf Sitostanol)
Reinheit (GC): < 95%
Schmelzbereich: 44-45°C

Beispiel 2 Analyse der Carbonsäure-sterylester Dünnschichtchromatographie an Kieselgelschichten

Anteile der Reaktionsgemische, gelöst in iso-Hexan/Diethylether, werden auf Kieselgel- Dünnschichtplatten (0,3 mm Schichtdicke) punkt- oder strichförmig aufgetragen. Die Platten werden in einem Gemisch von iso-Hexan/Diethylether (95 : 5, v/v) entwickelt und die verschiedenen Verbindungen des Reaktionsansatzes getrennt. Durch Besprühen der Platten mit einer wässrigen Schwefelsäure-Lösung und anschließendes Erhitzen oder durch Bedampfen mit Jod werden die unterschiedlichen Verbindungen dann sichtbar gemacht. Die Identifizierung der einzelnen Verbindungsklassen erfolgt durch Vergleich mit bekannten Standards. Die folgenden Rf-Werte werden für die verschiedenen Verbindungsklassen im Reaktionsgemisch unter Verwendung des obigen Laufmittels gefunden: Carbonsäure-sterylester 0,6-0,7; Fettsäure- methylester 0,4-0,5; Triglyceride 0,3-0,35; Sterine 0,1-0,15; freie Fettsäuren und andere Carbonsäuren < 0,1. Kieselgel-Dünnschichtplatten, auf denen Reaktionsgemische mit 5a- Pregnan-3β-ol-20-on- und 5-Pregnen-3β-ol-20-on-propionaten sowie mit Dicarbonsäure- sterylestern oder Kohlensäure-sterylestern getrennt werden, entwickelt man in einem Gemisch von iso-Hexan/Diethylether (80 : 20, v/v); Rf-Werte: 5α-Pregnan-3β-ol-20-on- und 5-Pregnen- 3β-ol-20-on-propionate 0,20-0,25; Tripropionin 0,15-0,20; Dicarbonsäure-methylcholesterylester 0,45-0,55; Dicarbonsäure-dicholesterylester 0,70-0,80; Dicarbonsäure-dimethylester 0,30-0,40; Dicarbonsäuren < 0,1; Ethylcholesteryl-carbonat 0,60-0,65; Oleylcholesteryl-carbonat 0,75-0,80.

Gaschromatographie

Anteile der Reaktionsgemische werden in Diethylether suspendiert und die Lipasekatalysatoren durch Zentrifugation und anschließende Filtration durch ein Spritzenfilter (Porengröße 0,35 µm) abgetrennt. Freie Carbonsäuren im Reaktionsgemisch werden durch Derivatisierung mit Diazomethan in die entsprechenden Methylester überführt. Das resultierende Gemisch aus Carbonsäure-methylestern, nicht umgesetzten Sterinen und Carbonsäure- sterylestern wird gaschromatographisch analysiert. Die Trennung an einer 15 m × 0,25 mm i. D. Quadrex 400-1HT Kapillarsäule (Wasserstoff als Trägergas mit einer linearen Strömungs geschwindigkeit von 25-35 cm/sec; Temperaturprogramm: 160°C [2 min isotherm] gefolgt von einem linearen Temperaturanstieg von 160 bis 180°C mit 5°C/min, anschließend mit 20°C/min auf 410°C [10 min isotherm]) liefert für die verschiedenen Verbindungen der Reaktionsgemische beispielsweise folgende Retentionszeiten (Rt): Laurinsäure-methylester (0,8 min); Myristinsäure- methylester (0,9 min); Dihydrozimtsäure-ethylester (1,0 min); Stearinsäure-methylester (1,9 min); Ölsäure-methylester (1,8 min), Linolsäure-methylester (1,7 min); Korksäure-dimethylester (1,8-Octandicarbonsäure-dimethylester, 0,9 min); 1,12-Dodecandicarbonsäure-dimethylester (1,0 min); 9-Octadecendicarbonsäure-dimethylester (3,1 min); Tripropanoin (0,8 min); Tributyrin (1,1 min); Cholesterin (8,9 min); Sitosterin (9,7 min); Stigmasterin (9,2 min); Ergosterin (8,9 min); 7-Dehydrocholesterin (8,8 min); Lanosterin (9,5 min); Dihydrolanosterin (9,3 min); α-Cholestan-3β-ol (Dihydrocholesterin) (8,8 min); Sitostanol (9,6 min); Epicoprostanol (8,6 min); 5α-Pregnan-3β-ol-20-on (5,6 min); 5-Pregnen-3β-ol-20-on (5,7 min); Buttersäure- cholesterylester (10,0 min); Laurinsäure-cholesterylester (12,5 min); Myristinsäure- cholesterylester (12,9 min); Stearinsäure-cholesterylester (13,8 min); Ölsäure-cholesterylester (13,9 min); Ölsäure-cholestanylester (14,0 min); Ölsäure-sitostanylester (14,3 min); Linolsäure- sitostanylester (14,3 min); Ölsäure-ergosterylester (14,0 min); Ölsäure-7-dehydrocholesterylester (13,9 min); Ölsäure-lanosterylester (14,2 min); Ölsäure-dihydrolanosterylester (14,1 min); 5α-Pregnan-3β-ol-20-on-propionat (7,7 min); 5-Pregnen-3β-ol-20-on-propionat (7,7 min); Ethylcholesteryl-carbonat (10,0 min); Korksäure-methylcholesteryldiester (1,8- Octandicarbonsäure-methylcholesteryldiester, 12,0 min); 1,12-Dodecandicarbonsäure- methylcholesteryldiester (12,8 min); 9-Octadecen-1,18-dicarbonsäure-methylcholesteryldiester (14,1 min).

Reversed-Phase High Performance Liquid Chromatography (RP-HPLC)

Der Umsatz der lipase-katalysierten Umesterung von Ethylcholesteryl-carbonat mit Oleylalkohol wird durch RP-HPLC bestimmt. Anteile des Reaktionsgemisches werden in Aceton suspendiert und der Lipasekatalysator durch Zentrifugation und anschließende Filtration durch ein Spritzenfilter (Porengröße 0,35 µm) abgetrennt. Die resultierende Lösung, bestehend aus Ethylcholesteryl-carbonat, Oleylalkohol und Oleyl-cholesterylcarbonat wird mit Hilfe von HPLC an einer C₁₈-Umkehrphasensäule analysiert. Zur Probenaufgabe wird ein Rheodyne Injector mit 20 µL Probenschleife verwendet. Die Trennung erfolgt an einer 250 × 4 mm Hibar RP-18 Säule, gepackt mit 10 µm LiChrospher 100 (Merck AG, Darmstadt), mit Acetonitril/Aceton (25 : 75, v/v) als Eluent bei einer Flussrate von 1 mL/min. Die Detektion erfolgt mit einem Lichtstreuungsdetektor. Folgende Retentionszeiten werden unter diesen Bedingungen gemessen: Oleylalkohol (3,8 min); Ethylcholesteryl-carbonat (7,3 min); Oleyl-cholesterylcarbonat (22,1 min).

In gleicher Weise wird der Umsatz der lipase-katalysierten Umesterung von 1,8- Octandicarbonsäure-dimethylester mit Cholesterin durch RP-HPLC bestimmt. Die Trennung erfolgt an einer 250 × 4 mm Hibar RP-18 Säule, gepackt mit 10 µm LiChrospher 100 (Merck AG, Darmstadt), bei einer Flussrate von 1 mL/min. Die Elution beginnt mit Acetonitril/Aceton (25 : 75, v/v) für 15 min, danach erfolgt ein linearer Anstieg der Aceton-Konzentration innerhalb von 5 min bis zu einem Verhältnis Acetonitril/Aceton (1 : 9, v/v), das für weitere 30 min beibehalten wird. Die Detektion erfolgt mit einem Lichtstreuungsdetektor. Folgende Retentionszeiten werden unter diesen Bedingungen gemessen: 1,8-Octandicarbonsäure- dimethylester (2,1 min); Cholesterin (13,1 min); 1,8-Octandicarbonsäure- methylcholesteryldiester (7,1 min); 1,8-Octandicarbonsäure-dicholesteryldiester (36,1 min).

Beispiel 3

Sterin: Cholesterin 38,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäureester: Stearinsäure-methylester 89,6 mg (0,3 mmol)
Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyme®) 50 mg
Temperatur: 80°C
Druck: 30 mbar
Dauer: 48 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 78% Stearinsäure-cholesterylester (bezogen auf Cholesterin)
Reinheit (GC): 98%
Schmelzbereich: 83-84°C

Beispiel 4

Sterin: Ergosterin 39,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäure: Ölsäure 84,7 mg (0,3 mmol)
Lipase: Candida rugosa-Lipase, immobilisiert, 50 mg
Temperatur: 40°C
Druck: 30 mbar
Dauer: 24 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie unter Beispiel 1, Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 88% Ölsäure-ergosterylester (bezogen auf Ergosterin)
Reinheit (GC): 95%
Schmelzbereich: 76-77°C

Beispiel 5

Sterin: 7-Dehydrocholesterin 38,5 mg (0,1 mmol)
Carbonsäure: Ölsäure 84,7 mg (0,3 mmol)
Lipase: Candida rugosa-Lipase, immobilisiert, 50 mg
Temperatur: 40°C
Druck: 30 mbar
Dauer: 24 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 85% Ölsäure-7-dehydrocholesterylester (bezogen auf 7-Dehydrocholesterin)
Reinheit (GC): 94%
Schmelzbereich: 69-70°C

Beispiel 6

Sterin: Lanosterin^a)

42,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäureester: Ölsäure-methylester 178,0 mg (0,6 mmol)
Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyme®) 100 mg
Temperatur: 80°C
Druck: 20 mbar
Dauer: 120 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 17% Ölsäure-lanosterylester + Ölsäure-dihydrolanosterylester (bezogen auf Lanosterin^a))
Reinheit (GC): 90% Ölsäure-lanosterylester + Ölsäure-dihydrolanosterylester ^a)

^a) Der Anteil an Dihydrolanosterin bzw. Dihydrolanosterylester beträgt etwa 30%.

Beispiel 7

Sterin: Sitostanol 41,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäureester: Ölsäure-methylester 89,0 mg (0,3 mmol)
Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyme®) 50 mg
Temperatur: 80°C
Druck: 40 mbar
Dauer: 24 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 95% Ölsäure-sitostanylester (bezogen auf Sitostanol)

Beispiel 8

Sterin: Sitostanol 41,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäureester: Trioleoylglycerin (Triolein) 132,8 mg (0,3 mequival bezogen auf sn-1,3 veresterte Ölsäure-Reste; 0,15 mmol)
Lipase: Candida rugosa-Lipase, immobilisiert, 50 mg
Temperatur: 40°C
Druck: 20 mbar
Dauer: 8 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 89% Ölsäure-sitostanylester (bezogen auf Sitostanol)

Beispiel 9

Sterin: Sitostanol 41,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäureester: Trioleoylglycerin (Triolein) 132,8 mg (0,3 mequival bezogen auf sn-1,3 veresterte Ölsäure-Reste; 0,15 mmol)
Lipase: Papaya-Latex-Lipase 50 mg
Temperatur: 80°C
Druck: 20 mbar
Dauer: 48 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 60% Ölsäure-sitostanylester (bezogen auf Sitostanol)

Beispiel 10

Sterin: 5-Pregnen-3β-ol-20-on 31,6 mg (0,1 mmol)
Carbonsäureester: Tripropionin 651 mg (2,5 mmol)
Lipase: Candida rugosa-Lipase, immobilisiert, 100 mg
Temperatur: 40°C
Druck: 20 mbar
Dauer: 24 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt durch Extraktion des Reaktionsgemisches als iso-Hexan- Lösung mit einem Methanol/Wasser-Gemisch und anschließender Säulenchromatographie:

Reinigung der 5-Pregnen-3β-ol-20-on-propionate

Das Reaktionsgemisch der lipase-katalysierten Synthese von 5-Pregnen-3β-ol-20-on- propionat wird zweimal mit Diethylether extrahiert und der Lipasekatalysator durch Zentrifugation abgetrennt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, der Rückstand in 5 mL iso- Hexan gelöst und der überwiegende Teil des Tripropanoins durch dreimalige Extraktion mit je 3 mL Methanol/Wasser (95 : 5, v/v) entfernt. Die iso-Hexan-Phasen werden anschließend über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das so vorgereinigte Produktgemisch wird an einer Kieselgelsäule (20 × 1 cm) wie in Beispiel 1 beschrieben getrennt.

Die Analyse erfolgt durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 78% 5-Pregnen-3β-ol-20-on-propionat (bezogen auf 5-Pregnen-3β-ol-20- on)
Reinheit (GC): 93%
Schmelzbereich: 122-123°C

Beispiel 11

Sterin: Cholesterin 386,7 mg (1 mmol)
Carbonsäure: Ölsäure 282,5 mg (1 mmol)
Lipase: Candida rugosa-Lipase, immobilisiert, 500 mg
Temperatur: 40°C
Druck: 50 mbar
Dauer: 48 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt durch Filtration oder Zentrifugation in der Wärme ohne weitere Reinigungsschritte, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 93% Ölsäure-cholesterylester (bezogen auf Cholesterin)
Reinheit (GC): 93%
Schmelzbereich: 48-50°C

Beispiel 12

Sterin: Sitostanol 41,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäureester: Sonnenblumenöl^b)

132,8 mg (0,15 mmol; 0,3 mequival bezogen auf sn-1,3 veresterte Fettsäure-Reste)
Lipase: Candida rugosa-Lipase, immobilisiert, 50 mg
Temperatur: 40°C
Druck: 30 mbar
Dauer: 24 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 99% Fettsäure-sitostanylester^b) (bezogen auf Sitostanol)
Reinheit (GC): < 95%

^b) veresterte Fettsäure-Reste des Sonnenblumenöls: 8,5% Palmitinsäure-, 3,9% Stearinsäure-, 24,0% Ölsäure- und 63,4% Linolsäure-Reste

Beispiel 13

Sterin: Ethylcholesterylcarbonat 45,9 mg (0,1 mmol)
Alkohol: Oleylalkohol 80,6 mg (0,3 mmol)
Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyme®) 50 mg
Temperatur: 80°C
Druck: 40 mbar
Dauer: 48 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse durch RP-HPLC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (RP-HPLC): 19% Oleyl-cholesterylcarbonat (bezogen auf Ethylcholesterylcarbonat)
Reinheit (RP-HPLC): < 95%
Schmelzbereich: 32-33°C

Beispiel 14

Sterin: Cholesterin 38,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäureester: Dihydrozimtsäure-ethylester 178,2 mg (1,0 mmol)
Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyme®) 100 mg
Temperatur: 80°C
Druck: 50 mbar
Dauer: 96 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1, die Analyse durch GC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 70% Dihydrozimtsäure-cholesterylester (bezogen auf Cholesterin)
Reinheit (GC): 90%
Schmelzbereich: 111-113°C

Beispiel 15

Sterin: Sitostanol 41,7 mg (0,1 mmol)
Carbonsäure: Ölsäure 84,7 mg (0,3 mmol)
Lipase: Candida rugosa-Lipase, immobilisiert, 50 mg
Temperatur: 40°C
Druck: 50 mbar
Dauer: 4 Std.

Reinigung durch Entsäuerung

Die Reinigung des Produktes erfolgt durch Abtrennung der freien Fettsäure aus dem Reaktionsgemisch ("Entsäuern"): Anteile überschüssiger freier Ölsäure werden aus dem Reaktionsgemisch durch Entsäuern mit verdünnter wässriger Natriumcarbonat-Lösung entfernt. Dazu wird das Reaktionsgemisch der lipase-katalysierten Synthese von Ölsäure-sitostanylester zweimal mit Diethylether extrahiert und der Lipasekatalysator durch Zentrifugation abgetrennt. Freie Ölsäure wird aus der Etherlösung durch dreimalige Extraktion mit je 3 mL 2%iger Natriumcarbonat-Lösung und anschließendes Waschen mit Wasser entfernt. Die Etherphase wird über Natriumsulfat getrocknet und ein Aliquot gaschromatographisch analysiert wie in Beispiel 2 beschrieben.
Umsatz (GC): 95% Ölsäure-sitostanylester (bezogen auf Sitostanol)
Reinheit (GC): 94% Ölsäure-sitostanylester (enthält 5% Sitostanol und < 1% Ölsäure)

Beispiel 16

Sterin: Cholesterin 77,3 mg (0,2 mmol)
Carbonsäureester: 1,8-Octandisäure-dimethylester 1214 mg (1,2 mmol)
Lipase: Rhizomucor miehei-Lipase, immobilisiert (Lipozyme®) 200 mg
Temperatur: 80°C
Druck: 50 mbar
Dauer: 72 Std.

Die Aufarbeitung des Produktes erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben, jedoch wird der 1,8- Octandisäure-dicholesteryldiester mit 20 ml iso-Hexan/Diethylether (9 : 1, v/v) und der 1,8- Octandisäure-methylcholesteryldiester mit 20 ml iso-Hexan/Diethylether (4 : 1, v/v) eluiert. Die Analyse erfolgt durch GC und RP-HPLC wie in Beispiel 2 beschrieben.
Ausbeute (isoliert): 60% 1,8-Octandisäure-methylcholesteryldiester + 5% 1,8-Octandisäure-dicholesteryldiester (bezogen auf Cholesterin)
Reinheit (GC, RP-HPLC): < 95% 1,8-Octandisäure-methylcholesteryldiester < 95% 1,8-Octandisäure-dicholesteryldiester)
Schmelzbereich: 83-84°C 1,8-Octandisäure-methylcholesteryldiester 188-191°C 1,8-Octandisäure-dicholesteryldiester

Claims

1. Enzymatisches Verfahren zur Synthese von organischen Carbonsäure-sterylestern ausgehend von organischen Carbonsäuren oder Carbonsäureestern und Sterinen unter Rühren in Gegenwart von Lipasen, wobei entstehende flüchtige Nebenprodukte im Vakuum entfernt werden.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Carbonsäure durch eine Di- oder Polycarbonsäure ersetzt ist.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Carbonsäureester durch einen Di- oder Polycarbonsäureester ersetzt ist.

4. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem der Carbonsäureester ein Triacylglycerin (Triglycerid) oder der Carbonsäure-Polyester eines anderen Polyols ist.

5. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem die Sterine weitere funktionelle Gruppen besitzen.

6. Verfahren gemäß Ansprüchen 1 bis 5, bei denen Sterylester kurzkettiger Carbonsäuren anstatt von Sterinen eingesetzt werden.