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Biologische Proben (Zellen, körpereigenen Flüssigkeiten,...)
enthalten oft eine sehr große
Zahl verschiedener Biomoleküle
(u.a. RNA, DNA, Proteine,...) mit äußerst selektiven Bindungeigenschaften, die
häufig
durch die Anzahl von Wasserstoffbrückenbindungen bestimmt sind.
Zur Analyse solcher biologischer Proben gibt es viele Verfahren,
z.B. die Hochdruck Flüssigkeits
Chromatograpie (HPLC) oder die Kapillarelektrophorese (CE) in verschiedensten
Varianten. Für
die Untersuchung einer großen
Zahl verschiedener biochemischer Reaktionen in kurzer Zeit werden
heute zunehmend auch Biochips eingesetzt. Das „high throughput screening
(HTS) wird unter anderem für
die Suche nach neuen Wirkstoffen eingesetzt. Die hier vorgeschlagene
Anordnung beruht auf der Nutzung solcher Biochips und kann einerseits
zur detaillierten Analyse der Zusammensetzung biologischer Proben
oder zum HTS genutzt werden.
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Dieses Ziel wird dadurch erreicht,
daß nach der
Hybridisierung und dem Waschen eines Biochips die an einem Dot gebundenen
Testsubstanzen von den auf dem Biochip präparierten Substanzen abgelöst werden
(z.B. durch Erhöhung
der Temperatur) und die abgelösten
Substanzen örtlich
von den gebundenen Präparaten
getrennt (z.B. in der den Biochip umgebenden wässerigen Lösung) nachgewiesen werden,
indem sie durch UV- Licht zum Leuchten angeregt werden und das Leuchten
nachgewiesen wird.
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Im Folgenden wird kurz beschrieben,
wie die Analyse einer biologischen Probe auf einem Biochip erfolgt,
um daran den Stand der Technik zu erklären und zu präzisieren,
was im Sinne dieser Schrift unter einem Biochip verstanden werden
soll.
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Zunächst wird die Herstellung eines
Biochips und dann seine Nutzung zur Analyse biologischer Proben
diskutiert. Diese Patentschrift beschäftigt sich nicht mit der Herstellung
von Biochips, sondern mit einer speziellen Nutzung dieser Biochips
zur Analyse der Zusammensetzung biologischer Proben oder zur Charakterisierung
biochemischer Reaktionen. Dabei basiert die Analyse der Zusammensetzung
biologischer Proben auf der Erkennung von biochemischen Reaktionen
zwischen den Substanzen in der biologischen Probe und den Substanzen,
die sich auf dem Biochip befinden.
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Bei der Herstellung von Biochips
wird zunächst
die Oberfläche
eines Substrates (z.B. Glas, Polymere, Silizium,...) so aufbereitet,
daß sie
bestimmte biologische Substanzen (z.B. Nukleotide, Oligomere) spezifisch
binden kann. Dann werden verschiedene biologische Substanzen (im
Folgenden als Präparate
bezeichnet) räumlich
getrennt aufgebracht. Dabei können
viele verschiedene Verfahren verwendet werden (z.B. Lithographie
oder Aufspritzen von Flüssigkeiten
mit Mikrodosiermaschinen). Als Resultat ergibt sich meist eine Matrix
mit N Zeilen (n = 1,...,N) und M Spalten (m = 1,...,M) mit verschiedenen
biologischen Substanzen. Ein Ortsbereich mit einer bestimmten biologischen
Substanz läßt sich durch
die Angabe von n und m charakterisieren. Ein solcher Ortsbereich
wird im Folgenden „dot" genannt und die
biologische Substanz auf einem dot wird als Präparat bezeichnet. Eine solche
Anordnung wird hier als Biochip bezeichnet. Ein typischer, schon
relativ eng gepackter, Biochip enthält heute z.B. etwa 100 × 100 Dots
von jeweils 50μm
Durchmesser bei einem Abstand von 50μm zwischen den Dots. So kann
ein 1cm2 großen Biochip etwa 104 verschiedene Präparate enthalten kann. Es besteht
eine starke Tendenz zur weiteren Miniatusierung der Biochips, so
daß zukünftig höhere Packungsdichten
zu erwarten sind. Wie bereits erwähnt, beschäftigt sich diese Patentschrift
nicht mit der geschilderten Herstellung von Biochips, sondern mit
einer speziellen Nutzung von derart hergestellten Biochips.
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Eine nach dem Stand der Technik typische Nutzung
eines Biochips dient dazu, festzustellen, welche Substanz mit welchem
der Präparate
auf dem Biochip eine feste biochemische Bindung eingeht. Dieses
wird im Folgenden kurz beschrieben.
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Zur Erkennung dieser biochemischen
Reaktionen wird dem Biochip unter wässerigen Bedingungen eine mit
Farbstoffmarkierte „Testsubstanz" zugegeben. Nach
hinreichend langer Wartezeit geht die Testsubstanz mit einigen der
vielen Präparate
auf dem Biochip dann eine feste Bindung ein. Dieser Vorgang wird
als „Hybridisierung" bezeichnet. Nach
der Hybridisierung erfolgt ein Waschschritt, bei dem die in Lösung verbliebenen
Testsubstanzen, die an keines der Präparate fest gebunden haben,
entfernt werden.
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Am Ende des Waschschrittes befindet
sich der Biochip in einer wässerigen
Lösung,
die keine mit Farbstoff markierten Testsubstanzen mehr enthält. An den
verschiedenen Dots befinden sich dann, je nachdem ob eine biochemische
Reaktion zwischen der Testsubstanz und dem Präparat auf dem Dot stattgefunden
hat oder nicht, mehr oder weniger Moleküle der (mit Farbstoff markierten!)
Testsubstanz. Der Nachweis der Testsubstanz erfolgt über den
mit der Testsubstanz verbundenen Farbstoff Durch Bestrahlung des
Biochips mit z.B. sichtbarem Licht, wird der Farbstoff zum Leuchten
gebracht und das Leuchten mit einem lichtempfindlichen Detektor
(z.B. eine Kamera) örtlich
aufgelöst
nachgewiesen. Hat eine mit Farbstoff markierte Testsubstanz an ein
bestimmtes Präparat
gebunden so ergibt sich an dem – dem Präparat entsprechenden – Dot ein
verstärktes
Aufleuchten. Aus der Intensität
des Aufleuchtens wird meist auch auf die Menge der an einem Dot
gebundenen Testsubstanz geschlossen. Diese Prozedur wird als „Auslesen" des Biochips bezeichnet.
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Bei der Analyse der Zusammensetzung
biologischer Proben ergeben sich aus dem beschriebenen Vorgehen
große
Probleme.
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- 1 Das größte Problem
ergibt sich aus der für
die Anwendung notwendige Markierung der Testsubstanzen mit Farbstoffen.
Diese Markierung ist insbesondere in natürlichen biologischen Proben,
die meist eine große
Vielzahl verschiedenster biologischer Moleküle enthalten, praktisch unmöglich. Zunächst stellt
sich die Frage welche der (sehr vielen) Substanzen überhaupt
angefärbt
und nachgewiesen werden sollen. Dann stellt sich die Frage mit welchem
chemischen Verfahren die Anfärbung
erfolgen soll und ob dieses Verfahren hinreichend spezifisch ist
für die
ausgewählte
Substanz oder ob es zur Anfärbung
anderer in der Probe vorhandener Substanzen führt. Selbst wenn die Anfärbung für eine Reihe
verschiedener Moleküle
erfolgreich ist, kann nur eine kleine Anzahl von Molekülen gezielt
angefärbt
und anhand des Aufleuchtens unterschieden werden. So können nur
wenige der vielen in der Probe vorhandenen Substanzen gleichzeitig
nachgewiesen werden.
- 2 Bei dem Auslesen des Biochips muß dieser direkt mit Licht bestrahlt
werden, da die mit Farbstoff markierten Testsubstanzen fest mit
dem Biochip verbunden sind. Diese direkte Bestrahlung hat den Nachteil,
daß die
auf dem Biochip aufgebrachten Präparate
durch zu hohe Lichtbelastung zerstört werden können. Zum anderen können bei der
direkten Bestrahlung der Oberfläche
des Biochips andere Substanzen stark aufleuchten (z.B. Laserstreulicht
an Oberflächen,
Fluoreszenz von Molekülen,
die an der Grenzfläche
zum Binden der Präparate
angebracht werden,...) und als Untergrund die quantitative Auswertung
stören
- 3 Der Nachweis einer nicht markierten Testsubstanz, die an ein
Präparat
auf dem Biochip gebunden hat, ist mit sehr großen Schwierigkeiten verbunden.
Die Verwendung sichtbaren Lichtes zum Nachweis der Testsubstanz
durch Licht induziertes Aufleuchten ist nur in ganz wenigen Fällen möglich, weil
verschwindend wenige biologische Substanzen mit sichtbarem Licht
zum Aufleuchten gebracht werden können. Obwohl eine recht große Zahl
von biologischen Substanzen durch UV- Licht zum Aufleuchten gebracht
werden kann (die meisten biologischen Moleküle erst unterhalb einer Wellenlänge von
unter 300nm), ergeben sich durch die direkte Bestrahlung des Biochips
mit UV- Licht andere Probleme. So können die auf dem Biochip befindlichen
Substanzen durch längere
UV- Bestrahlung zerstört
werden und damit der Biochip später
nicht wieder verwendet werden. Zum anderen ist eine sichere Unterscheidung
des Aufleuchtens der gebundenen Testsubstanz von dem Aufleuchten
anderer Substanzen auf dem Biochip kaum möglich. So können neben den Testsubstanzen
das Substrat, die zum Binden der Präparate an das Substrat verwendeten
Substanzen und die Präparate
selbst durch UV- Licht zum Leuchten gebracht werden. Erst durch
die Markierung der Testsubstanz mit einem Farbstoff wird der Nachweis
bei direkter Bestrahlung des Biochips hinreichend selektiv.
- 4 In den meisten Fällen
wird der Biochip nach dem Waschen zunächst getrocknet und dann erst „ausgelesen". Dadurch befinden
sich die Moleküle
nicht mehr in ihrer natürlichen
biologischen Umgebung. Außerdem
ist das Aufleuchten von vielen Molekülen bei der Bestrahlung mit
UV- Licht (s.u.) oft von der Umgebung (z.B. dem pH-Wert) abhängig. Bei
einem Nachweis der Moleküle
in wässeriger
Lösung
können
der Lösung
Substanzen zugegeben werden, die zu einem verstärkten Aufleuchten führen.
- 5 Fehlhybridisierungen, die mit einer anderen Bindungsstärke erfolgen,
können
die Signale verfälschen.
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In der hier vorgeschlagenen Anordnung
soll (a) der Biochip bereits nach dem Waschen, d.h. in wässeriger
Lösung
ausgelesen werden (b) die direkte Bestrahlung des Biochips vermieden
werden und (c) mit natürlichen
Testsubstanzen, die nicht mit Farbstoff markiert sind, gearbeitet
werden.
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Die Lösung der in 1-4 geschilderten
Probleme ergibt sich aus der hier vorgeschlagenen Anordnung. Der
Biochip befinde sich nach der Hybridisierung und dem Waschen in
wässeriger
Lösung.
Es können
vor der im nachfolgenden beschriebenen Ausleseprozedur der wässerigen
Lösung
zusätzlich andere
Stoffe, (z.B. zur Erhöhung
der Fluoreszenzausbeute) zugegeben werden. Die gesamte Anordnung
befindet sich in einem Wärmebad
mit einstellbarer Temperatur.
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Zunächst werden die bei der Hybridisierung gebundenen
Testsubstanzen von dem Biochip (z.B. durch Erwärmen) abgelöst. Dann werden die abgelösten Substanzen örtlich von
dem Biochip (z.B. durch ein elektrisches Feld senkrecht zur Oberfläche des
Biochips) getrennt. Dann werden die abgelösten Testsubstanzen örtlich getrennt
von den Präparaten
( z.B. in der Flüssigkeit
vor dem Biochip) durch UV- Licht zum Aufleuchten gebracht und die
Stärke
des Aufleuchtens mit einem Lichtdetektor nachgewiesen. Dabei soll
das UV-Licht die Oberfläche
des Biochips möglichst
wenig belasten.
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Die Prozedur wird an Hand des folgenden Beispiels
beschrieben. Nach der Hybridisierung, am Ende des Waschschrittes,
unter wässerigen
Bedingungen, wird z.B. die Temperatur des Biochips auf einen Weit
T erhöht,
so daß sich
einige der gebundenen Testsubstanzen wieder von den Präparaten
lösen.
Zunächst
werden sich die am schwächsten
gebundenen Testsubstanzen von den Präparaten lösen. Die bei der Temperatur
T abgelösten
Testsubstanzen werden dann, z.B. über ein elektrisches Feld senkrecht
zum Chip, von der Oberfläche
abgezogen und in die Flüssigkeit über dem
Biochip gebracht. Dazu kann sich auf der gegenüber liegenden Seite des Biochips
ein metallisches Netz befinden um ein entsprechendes elektrisches
Feld zu erzeugen. Auf diese Weise wandern zumindest die Biomoleküle, die eine
Ladung tragen, von den Dots in die Lösung. Die Wahl eines geeigneten
Puffers ermöglicht
es auch neutrale Moleküle
durch Anlegen eines elektrischen Feldes zu bewegen. Damit sich die
von verschiedenen Dots abgelösten
Substanzen nicht miteinander vermischen, können die elektrischen Felder
speziell ausgelegt werden.
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Wesentlich für das Patent ist, daß nun der Nachweis
der Testsubstanzen örtlich
getrennt von den Präparaten
(z.B. in der Flüssigkeit über dem
Biochip) und nicht, wie üblich,
auf dem Biochip selbst erfolgt. So wird eine Zerstörung der
Substanzen auf dem Biochip vermieden und eine Unterscheidung des
Aufleuchtens der Testsubstanz von dem Aufleuchten der anderen Substanzen
auf dem Biochip vermieden.
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Wesentlich ist auch, daß in der
hier vorgesehenen Anordnung kein sichtbares Licht, sondern UV-Laserlicht
zur Erzeugung des Aufleuchtens verwendet wird. Durch UV- Licht können wesentlich mehrbiologische
Substanzen zum Aufleuchten gebracht werden als mit sichtbarem Licht.
Aus diesem Grunde sollen die abgelösten, von dem Biochip getrennten
Testsubstanzen durch UV-Licht in der Flüssigkeit zum Leuchten gebracht
werden. Das UV sollte den Biochip selbst nicht treffen. Günstig wird
es sein, daß UV
parallel und sehr dicht an der Oberfläche entlang einzukoppeln, um
zu vermeiden, daß sich
die von benachbarten Dots abgelösten
Testsubstanzen nicht miteinander vermischen. Durch das Aufleuchten
werden die bei der Temperatur T abgelösten Testsubstanzen nachgewiesen.
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Im Folgenden wird die Temperatur
des Thermostaten zeitlich nacheinander schrittweise erhöht. Dabei
lösen sich
zunächst
die schwächer
und dann die stärker
gebundenen Testsubstanzen ab und werden in der Lösung durch UV-Licht zum Aufleuchten gebracht
und damit nachgewiesen. Von einem Dot lösen sich so bei verschiedenen
Temperaturen die verschieden stark gebundenen Testsubstanzen ab
und werden getrennt nachgewiesen. Daß die Testsubstanzen getrennt
nach ihrer Bindungsstärke
nachgewiesen werden können,
ist ein wesentlicher Vorteil, weil sich die Bindung vieler biologischer
Moleküle
an die Präparate
durch die Zahl der Wasserstoffbrückenbindungen
unterscheiden.
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Die für das Patent wesentlichen Vorteile
der Anordnung mit dem UV-Nachweis in der Lösung statt, wie sonst üblich, direkt
auf dem Biochip ist, daß
(1)
die Testsubstanzen getrennt nach ihrer Bidungsstärke nachgewiesen werden und
(2) daß das
bei einer direkten Bestrahlung der Dots vom Substrat resultierende
Streu- oder Fluoreszenzlicht nicht vorhanden ist und so ein Signal
ohne Untergrund nachgewiesen wird (3) die Eigenschaften der Lösung (pH-Wert,
Substanz) je nach Anwendungsfall variiert werden kann. (4) Durch
das UV- Licht können
viel mehr biologische Substanzen nachgewiesen werden als durch sichtbares
Licht: eine Anfärbung
mit Farbstoffen ist nicht nowendig. Es sei erwähnt, daß die Anfärbung oft zeitlich und chemisch
aufwendig ist und insbesondere bei komplexeren Gemischen von biologischen
Substanzen oft auch unmöglich
ist. Daher kann man mit der vorgestellten Anordnung auch nicht mit
Farbstoff markierte biologische Testsubstanzen (z.B. körpereigene
Flüssigkeiten)
auf dem Biochip verwenden und untersuchen, ob und wie stark sie
an die auf einem Dot präparierten
Biosubstanzen binden und (5) der Biochip selbst nicht zerstört wird. Eine
direkte Bestrahlung der auf einem Dot präparierten Biosubstanzen würde, neben
deren Zerstörung durch
UV, schwierig zu deutende Fluoreszenzsignale ergeben.
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Die Anregung der abgelösten Moleküle kann z.B. über ein
flächiges
Lichtband oder auf einer Linie erfolgen. Dazu kann z.B. ein Laser
verwendet werden. Bei der Anregung mit einem Lichtband wird die induzierte
Fluoreszenz über
ein Objektiv auf eine Kamera gelenkt und nachgewiesen. Je nach Anwendungsfall
können
verschiedene Filter in den Strahlengang gebracht werden um Streulicht
oder unerwünschtes
Fluoreszenzlicht zu unterdrücken.
Bei der Anregung auf einer Linie wird die induzierte Fluoreszenz
auf den Eintrittsspalt eines Spektrometers abgebildet, spektral
zerlegt mit einer Kamera in der Bildebene des Spektrometers nachgewiesen.
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Mit der beschriebenen Anordnung kann
die Zusammensetzung biologischer Proben sehr detailliert untersucht
werden, da mit der oben beschriebenen Prozedur Informationen über die
Bindung eines Testmoleküls,
und die Stärke
der Bindung, an viele verschiedene Präparate simultan untersucht
wird.
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Hinter Anspruch 5 steht die Idee,
daß eine wässerige
Lösung
den natürlichen
biologischen Bedingungen nahe kommt und so die abgelösten Substanzen
sich in natürlicher
Umgebung befinden. Hinter Anspruch 7 steht die Idee, daß die Helligkeit
des Aufleuchtens oft von der Umgebung, z.B. vom pH-Wert, abhängig ist.