DE10004858A1

DE10004858A1 - Verwendung von Proteinkinase-Inhibitor-alpha

Info

Publication number: DE10004858A1
Application number: DE10004858A
Authority: DE
Inventors: Ralph Knoell
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 2000-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2001-08-16
Also published as: JP2003531114A; WO2001056590A2; WO2001056590A3; AU2001233723A1; EP1253931A2

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft in einem Aspekt die Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivate zur Blutdrucksenkung, als beta-Antagonisten und zur Herstellung eines Medikaments für die Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, bei denen ein beta-Antagonist verwendet werden kann. DOLLAR A In einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines Inhibitors von PKI-alpha oder eines Derivates davon zur Bluckdruckerhöhung, als beta-Agonist und zur Herstellung eines Medikaments für die Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Agonist verwendet werden kann.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Proteinkinase-Inhibitor-alpha (PKI- alpha), die Verwendung von Inhibitoren von Proteinkinase-Inhibitor-alpha und Verfahren zum Screenen auf beta-Agonisten und beta-Antagonisten.

Im Jahre 1975 wurde erstmals das Phänomen des "myocardial stunning" beschrieben. Darun ter versteht man die Eigenschaft des Myokards, nach kurzzeitiger Ischämie infolge koronarer Okklusionen eine lang anhaltende, reversible myokardiale Dysfunktion zu zeigen, d. h. der Herzmuskel zeigt nicht die erwartete Kontraktilität. Dieser reversible Zustand hält für mehre re Stunden an und widersprach der bis dahin in der Fachwelt verbreiteten Auffassung, daß ein ischämischer Zustand von mehr als 45 Minuten unwiderruflich mit einem Absterben der My ozyten einhergeht.

Als Pathogenitätsmechanismus für das "myocardial stunning" wurde die Bildung von Sauer stoffradikalen, Kalziumüberladung, Dysfunktion des sarkoplasmatischen Reticulums und Troponin-Proteolyse diskutiert (Bolli; Mechanism of myocardial "stunning". Circulation 1990: 723-38; und Wijns, Vatner, Camici. Hibernating myocardium. New England Journal of medicine. 1998. 173-81). Jeder dieser Mechanismen ist jedoch nicht geeignet, das Phäno men vollständig zu beschreiben (Duncker et al.; Myocardial stunning remainig questions. Cardiovasc Res 1998; 38: 549-558).

Die im Herz vorhandene Proteinkinase A (fortan auch als PKA bezeichnet), die die myokar diale Kontraktilität vermittels Phospholamban und Phosphorylierung von Troponin I reguliert, wird durch Rezeptoren gesteuert, die an die Adenylatcyclase gekoppelt sind, die wiederum durch Katecholamine reguliert wird. Die Enzymaktivität wird sowohl durch Proteinkinase- Inhibitoren (hierin im folgenden als PKI bezeichnet) als auch durch cAMP reguliert. Im Herz finden sich zwei Formen von Proteinkinase-Inhibitoren: Die alpha- und die beta-Form (PKI- alpha und PKI-beta). Beide wirken als kompetitive Inhibitoren, indem die Cα- und Cβ- Untereinheiten der aktiven Proteinkinase A blockiert werden. Dabei ist die α-Form sechsmal wirksamer als die β-Form.

Ein im Stand der Technik bekannter Proteinkinase-Inhibitor ist der Proteinkinase-Inhibitor alpha (hierin auch als PKI-alpha bezeichnet). PKI-alpha weist eine Länge von 76 Aminosäure auf, wobei der für die inhibitorische Wirkung wesentliche Teil der Primärsequenz auf den Bereich der Aminosäuren 14 bis 22 beschränkt zu sein scheint. Diese Sequenz ist beim Men schen, Schwein, Hühnchen, Ratte und Maus zu 100% identisch. Auf der Eben der mRNA zeigt das 5'-Ende der gesamten mRNA vom Schwein eine Sequenzhomologie von etwa 90% verglichen mit derjenigen des Genoms vom Menschen, der Maus, der Ratte und dem Hühn chen. Ein rekombinanter PKI-alpha umfassend nur die Aminosäuren 14 bis 22 der vollständi gen PKI-alpha-Aminosäuresequenz ist zellpermeabel und von Calbiochem erhältlich (Pro duktnummer # 476485).

Die für PKI-alpha codierende cDNA vom Schwein weist an seinem 5'-Ende einen zweiten offenen Leserahmen, der für ein Polypeptid mit 9 Aminosäuren codiert, und mehrere ver schiedene poly(A)-Signalsequenzen an seinem 3'-Ende auf (GenBank #ban kit256111AF132737)

Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, neue Verwendungen für PKI-alpha und für einen Inhibitor von PKI-alpha bereitzustellen.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivaten zur Blutdrucksenkung.

In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe erfindungsgemäß gelöst durch die Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivaten als beta-Antagonist.

In einem noch weiteren Aspekt der Erfindung wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivate zur Herstellung eines Medikamentes für die Präven tion und/oder Behandlung von Krankheiten, bei denen ein beta-Antagonist verwendet werden kann.

Bei den erfindungsgemäßen Verwendung kann vorgesehen sein, daß der PKI-alpha eine in SEQ ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt.

In einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendungen wird der PKI-alpha codiert von einer Nukleinsäure, die der codierenden Sequenz der in SEQ ID No. 1 dargestellten Se quenz oder einer sich daraus infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes ergebenden oder einer daran hybridisierenden Nukleinsäure entspricht.

Bei den erfindungsgemäßen Verwendungen kann auch vorgesehen sein, daß der PKI-alpha in einer verkürzten Form verwendet wird.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendungen kann vorge sehen sein, daß der PKI-alpha die Aminosäuren 14 bis 22 der PKI-alpha-Sequenz, insbeson dere der Sequenz von PKI-alpha nach SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 2 umfaßt.

In besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendungen ist vorgesehen, daß der PKI-alpha oder dessen Derivat zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten verwendet, wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Herzrhythmusstörun gen, hyperkinetisches Herzsyndrom, Angina pectoris, Myokardinfarkt, akuter Myokardin farkt, Herzinsuffizienz, arterieller Hypertonus, essentielle und renale Hypertonie, Pfortader hochdruck, Blutungen aus Oesophagusvarizen, Phäochromozytom, Überdosierung von beta- Sympathomimetika und Cholinrezeptoren-Blockern, Glaucoma simplex, Hyperthyreose, Thy reotoxikose, Migräne, essentieller Tremor, Erregungstremor und Alkohol-Entzugssyndrom umfaßt.

In weiteren besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendun gen ist vorgesehen, daß der PKI-alpha oder dessen Derivat zur Postinfarkt-Medikation, Pro phylaxe der Reinfarktes und/oder als Beruhigungsmittel verwendet wird.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe auch dadurch gelöst, durch die Verwendung eines Inhi bitors von PKI-alpha oder eines Derivates davon zur Blutdruckerhöhung.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines Inhibitors des PKI-alpha oder eines Derivates davon als beta-Agonist.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch die Verwendung eines Inhibi tors des PKI-alpha oder eines Derivates davon zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Agonist verwendet werden kann.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendungen ist dabei vor gesehen, daß der Inhibitor die Transkription des PKI-alpha beeinflußt.

Bei den erfindungsgemäßen Verwendung kann weiter vorgesehen sein, daß der PKI-alpha ein PKI-alpha ist, wie er hierin beschrieben ist.

In einer weiteren Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verwendungen ist vorgesehen, daß der Inhibitor des PKI-alpha eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Sequenzen mit der SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4 umfaßt.

Bei besonders bevorzugten Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Verwendungen ist vorgesehen, daß der Inhibitor des PKI-alpha zur Behandlung und/oder Prävention von Krank heiten verwendet wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Herzinsuffizienz, Herzinfarkt, chronische und akute Herzinsuffizienz und Hypotonie umfaßt.

In einem weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein erfindungsgemäßes Verfahren zum Screenen auf Mittel zur Blutdrucksenkung, beta-Antagonisten und/oder Mitteln zur Be handlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Antagonist verwendet werden kann, wobei vorgesehen ist, daß

- eine Mischung aus einem beta-Rezeptor, einem beta-Agonisten des beta- Rezeptors und einem Kandidaten-beta-Antagonisten bereitgestellt wird, und
- bestimmt wird, inwieweit sich durch den Kandidaten-beta-Antagonisten das Bindungsverhalten des beta-Agonisten an den beta-Rezeptor ändert.

In einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß die unter dem Einfluß des Kandidaten-beta-Antagonisten beobachtete Änderung des Bindungsverhal tens des beta-Agonisten an den beta-Rezeptor verglichen wird mit der unter dem Einfluß des beta-Antagonisten, wie er hierin beschrieben ist, beobachteten Änderung des Bindungsver haltens des beta-Agonisten an den beta-Rezeptor.

In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß der beta-Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe, die beta1- und beta2-Rezeptoren um faßt.

In einer noch weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß der beta-Agonist ein Sympathomimetikum ist, insbesondere ein solches, das ausgewählte ist aus der Gruppe, die Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin und Dobutamin umfaßt.

Schließlich kann bei dem erfindungsgemäßen Verfahren vorgesehen sein, daß der beta- Agonist ein beta-Agonist ist, wie er hierin beschrieben ist.

In einem noch weiteren Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zum Screenen auf Mittel zur Blutdrucksenkung, beta-Agonisten und/oder Mittel zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Agonist verwendet werden kann, wobei

- ein Transkriptionssystem für einen beta-Antagonisten bereitgestellt wird,
- ein Kandidaten-beta-Agonist dem Transkriptionssystem zugesetzt wird und
- bestimmt wird, inwieweit sich durch den beta-Agonisten die Transkription für den beta-Antagonisten ändert.

In einer bevorzugten Ausführungsform der erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß die unter dem Einfluß des Kandidaten-beta-Agonisten beobachtete Änderung der Transkription des beta-Antagonisten verglichen wird mit der unter dem Einfluß des beta- Agonisten, wie er hierin beschrieben ist, beobachteten Änderung der Transkription des beta- Antagonisten.

In einer weiteren Ausführungsform des Verfahrens ist vorgesehen, daß der beta-Antagonist ein solcher ist, wie er hierin beschrieben ist.

In einer noch weiteren Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist vorgesehen, daß der beta-Antagonist erhältlich ist nach einem der erfindungsgemäßen Verfahren.

Der vorliegenden Erfindung liegt die überraschende Erkenntnis zugrunde, daß PKI-alpha eine negative inotrope, d. h. eine die Myocardfunktion verschlechternde Wirkung aufweist. Diese Wirkung kommt über eine Hemmung der Proteinkinase A zustande, die für die Phosphorylie rung von Phospholamban und Troponin verantwortlich ist (sog. beta-adrenerge Signaltrans duktion). Infolge der negativen inotropen Wirkung von PKI-alpha wird umgekehrt durch Hemmung des PKI-alpha die Myokardfunktion, insbesondere bei Herzinsuffizienz, verbes sert.

Die erfindungsgemäßen Verwendungen beruhen alle auf der vorstehend beschriebenen Er kenntnis, daß PKI-alpha eine konzentrationsabhängige, negative inotrope Wirkung aufweist, und an der beta-adrenergen Signaltransduktion beteiligt ist. Daraus ergibt sich in einem Aspekt, daß PKI-alpha zur Blutdrucksenkung bzw. zur Herstellung eines Medikamentes hier zu verwendet werden kann. In einem anderen Aspekt ergibt sich daraus, daß PKI-alpha als beta-Antagonist verwendet werden kann. Letzteres liegt darin begründet, daß die Wirkung der Katecholamine bindenden beta-Rezeptoren an der die Kontraktilität regulierenden Proteinki nase A durch die Proteinkinase-Inhibitoren gegengesteuert werden kann, diese somit eine beta-antagonistische Wirkung zeigen.

Infolge der beta-antagonistischen Wirkung des PKI-alpha eignet sich dieser auch zur Her stellung von Medikamenten für die Behandlung von Krankheiten, bei denen allgemein ein beta-Antagonist verwendet wird. Mit anderen Worten: Aufgrund der beta-adrenergen Wirkung von PKI-alpha kann dieser bzw. Derivate hiervon an der Stelle von bzw. in Ergänzung zu dem bzw. den bisher verwendeten beta-Antagonisten in Medikamenten verwendet werden. Grundsätzlich bestehen dabei keinerlei Einschränkungen, so daß mit PKI-alpha bzw. mit ei nem diesen enthaltenden Medikament nun ein Ersatz für ein jegliches, einen beta- Antagonisten als pharmazeutischen Wirkstoff enthaltendes Medikament bereitgestellt wird.

Da der PKI-alpha nicht nur im Muskelgewebe, sondern auch in Nervengewebe, insbesondere im Gehirn, exprimiert wird, sind auch insbesondere neurophysiologische Indikationsfelder für den PKI-alpha und Inhibitoren desselben im Rahmen der vorliegenden Erfindung. Beispiel haft sei hier auf Migräne verwiesen, zu deren Therapie beta-Antagonisten verwendet werden, die erfindungsgemäß durch PKI-alpha ersetzt werden können. Es ergibt sich für den Fach mann, daß ein jegliches Gewebe, das PKI-alpha exprimiert und pathologische oder geänderte Zustände ausbildet, erfindungsgemäß mit PKI-alpha und Inhibitoren desselben therapeutisch oder präventiv behandelt werden kann.

Mit den erfindungsgemäßen Verwendungen ergeben sich eine Reihe von Vorteilen. So wird mit der Verwendung des PKI-alpha und eines Inhibitors desselben die Gruppe der pharma zeutisch wirksamen Verbindungen erheblich erweitert, insbesondere insoweit, als daß eine vollständig neue Klasse von Verbindungen in diesen therapeutisch sehr wichtigen Indikati onsgebiet eingeführt wird. Darüber hinaus ist die Verwendung von PKI-alpha und Inhibitoren davon auch insoweit von Vorteil, als daß sie sehr früh in der Kaskade der beta-adrenergen Signaltransduktion ansetzen und somit nicht der unerwünschten und mit vielfältigen Nachtei len verbundenen Down-Regulation der beta-Rezeptoren unterliegen. Diese Vorteile werden im folgenden anhand der Herzinsuffizienz weiter erläutert werden.

Die Herzinsuffizienz gehört in den westlichen Industriestaaten durch seine hohe Prävalenz (1-1,5%) und Morbidität der erwachsenen Bevölkerung sowie seine entsprechend hohen Kosten zu den wichtigsten Erkrankungen (Sharpe N. et al.; Lancet 352 (suppl I), 3-7 (1998)). Zu ihrer Therapie werden eine Reihe von Medikamenten eingesetzt, von denen jedoch nur weni ge wirklich, d. h. auch auf viele Jahre hinaus, effektiv sind. Hierzu zählen vor allem β- blockierende Substanzen und ACE-Hemmer (Cleland, J; Lancet 352 (suppl I), 1-2 (1998)). Im Gegensatz hierzu sind die weiterhin gebräuchlichen Kalziumantagonisten (z. B. Adalat- Nifedipin) in Verruf geraten (Prescrire Int 7(35), 90-91 (1998); und Ishibashi, Y. et al.; Clin Exp Pharmacol Physiol 26 (5-6), 404-10 (1999)). Vor allem ihre akuten Effekte, die die Mortalität der behandelten Patienten zu erhöhen scheinen, mahnen zur Vorsicht bei Verwen dung dieser Medikamente. Im Gegensatz hierzu scheinen β-Blocker erhebliche Vorteile, ins besondere bezüglich der Mortalität, für die betroffenen Patienten zu haben. Leider wirken diese Medikamente über die β1- und β2-Rezeptoren, die der sogenannten down-Regulation unterliegen und deshalb ihren Wirkort verfehlen können (Massie, B.; Lancet 352 (suppl I), 29-33 (1998). Es werden deshalb zunehmend Substanzklassen gesucht, die ihren Wirkort wei ter oberhalb der β-adrenergen Signaltransduktionskaskade haben. Durch die Hemmung der Proteinkinase A, vor allem durch intracoronare Applikation, scheint der PKI-alpha, insbeson dere die Aminosäuren 14-22 davon, in die gewünschte Substanzklasse zu gehören.

In diesem Zusammenhang besonders interessant erscheint daher ein Inhibitor des PKI-alpha, insbesondere der vom zweiten offenen Leserahmen des PKI-alpha codierte Inhibitor des PKI- alpha (PKI-alpha-I). Es können somit, wie jeweils gewünscht, sowohl die beta- antagonistischen als auch die beta-agonistischen Wirkungen durch die Verwendung von PKI- alpha bzw. eines Inhibitors desselben zur Geltung gebracht werden.

Die Aminosäuresequenz von PKI-alpha ist in SEQ ID No. 1 zusammen mit der sie codieren den Nukleinsäuresequenz dargestellt und als Aminosäuresequenz als solches in SEQ ID No. 2. Es ergibt sich für den Fachmann, daß der PKI-alpha nicht auf denjenigen PKI-alpha be schränkt ist, der die als Sequenzen SEQ ID No. 1 und SEQ ID No. 2 dargestellten Sequenzen aufweist. Vielmehr wird unter einem PKI-alpha hierin ein jeglicher die Aktivität der Protein kinase A beeinflussender Proteinkinase-Inhibitor verstanden. Insoweit wird dem Begriff des Proteinkinase-Inhibitors hierin eine funktionelle Definition zugrunde gelegt.

Infolge der hierin verwendeten funktionellen Definition des Begriffes des Proteinkinase- Inhibitors ist auch die in SEQ ID No. 1 dargestellt Nukleinsäuresequenz lediglich ein Beispiel für eine einen Proteinkinase-Inhibitor codierende Sequenz. Andere Sequenzen ergeben sich aus der Degeneriertheit des genetischen Codes.

Der Proteinkinase-Inhibitor-alpha weist in seiner nativen Form eine Länge von 76 Aminosäu ren auf. Tatsächlich erstreckt sich der für die inhibitorische Wirkung relevante Bereich der Primärsequenz von Aminosäure 14 bis 22, so daß auch verkürzte ("trunkierte") Formen von Proteinkinase-Inhibitoren, insbesondere von PKI-alpha, erfindungsgemäß verwendet werden können. Von besonderem Vorteil erscheint dabei die Verwendung von PKI-alpha, dessen Se quenz auf die Aminosäuren 14 bis 22 der vollständigen Aminosäuresequenz beschränkt ist. Dieser verkürzte PKI-alpha ist membrangängig oder membranpermeabel, d. h. er kann über eine cytoplasmatische Membran in den intrazellulären Raum gelangen und dort die intrazel lulären Kompartimente, insbesondere das sarkoplasmatische Retikulum und die Proteinkinase A, erreichen. Somit kann PKI-alpha und insbesondere eine verkürzte Form und ganz beson ders die die Aminosäuren 14 bis 22 der vollständigen Primärsequenz des PKI-alpha, wie dar gestellt in SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 2, umfassende verkürzte Form intrakoronar, intra peritoneal oder auch intravenös gegeben werden.

Dabei ist es im Rahmen der Fähigkeiten des Fachmannes, daß PKI-alpha ebenso wie dessen Inhibitor in modifizierter Form vorliegen kann. Eine derartige Modifizierung kann bspw. im Zusammenhang mit den Erfordernissen der Galenik erfolgen. Andere Modifizierungen kön nen die pharmakologischen und toxikologischen Eigenschaften betreffen.

Formulierungen, die PKI-alpha oder einen Inhibitor desselben umfassen, können die üblichen galenischen Hilfsstoffe und Bestandteile umfassen, wie pharmazeutisch akzeptable Träger und Puffer.

Beta-Blocker, d. h. beta-Antagonisten, und damit erfindungsgemäß PKI-alpha und dessen Derivate finden bspw. Anwendungen als bzw. zur bzw. bei

1. Antiarrhythmika (Herzrhythmusstörungen)
2. Hyperkinetisches Herzsyndrom
3. Antianginöse Medikamente (Angina pectoris)
4. Verbesserung der Prognose bei Patienten mit Myokardinfarkt (Postinfarkt- Medikation), akuter Myokardinfarkt und Prophylaxe des Reinfarktes
5. Therapie bei Herzinsuffizienz
6. Antihypertensiva (arterieller Hypertonus, essentielle und renale Hypertonie)
7. Pfortaderhochdruck, Blutungen aus Oesophagusvarizen
8. Phäochromozytom (erst nach vorausgegangener Alpha-Blockade anwendbar)
9. Überdosierung von β-Sympathomimetika und m cholinozeptorenzeptoren-Blockern
10. Glaukom am Auge (Glaucoma simplex)
11. Hyperthyreose und Thyreotoxikose
12. Therapie zentralnervöser Erkrankungen wie bspw. Migräne und als Beruhigungsmittel (zentral dämpfender Effekt) (essentieller Tremor, Erregungstremor, Alkohol- Entzugssyndrom)

Die erfindungsgemäße Verwendung eine Inhibitors des PKI-alpha (hierin im folgenden auch als PKI-alpha-I bezeichnet) beruht wiederum auf der überraschenden Erkenntnis, daß PKI- alpha eine konzentrationsabhängige, inotrope Wirkung besitzt und an der beta-adrenergen Signaltransduktion beteiligt ist. Im Lichte dieser Eigenschaften von PKI-alpha kann ein Inhi bitor von PKI-alpha zu einer Modifizierung und Umkehr der Wirkungen von PKI-alpha füh ren. Infolge dessen kann ein Inhibitor von PKI-alpha zur Blutdruckerhöhung bzw. eines hier für geeigneten Medikamentes verwendet werden. Nachdem der Inhibitor von PKI-alpha auf einen Inhibitor der beta-adrenergen Signalübertragung einwirkt, agiert er selbst als beta- Agonist und kann entsprechend verwendet werden. Diese Verwendung umfaßt allgemein die Verwendung zur Herstellung eines Medikamentes für die Behandlung und Prävention von Krankheiten, bei denen beta-Agonisten verwendet werden können: Somit kann ein Inhibitor von PKI-alpha in Ergänzung zu dem bzw. den bisher verwendeten beta-Agonisten in Medikamenten verwendet werden. Grundsätzlich bestehen dabei keinerlei Einschränkungen, so daß mit dem Inhibitor von PKI-alpha nun ein Ersatz für ein jegliches, einen beta-Agonisten als pharmazeutischen Wirkstoff enthaltendes Medikament bereitgestellt wird.

Dem Begriff des Inhibitors von PKI-alpha liegt dabei wiederum eine funktionelle Definition zugrunde. Ein Inhibitor von PKI-alpha ist somit eine jegliche Verbindung, die die Wirkung von PKI-alpha inhibiert, wobei unerheblich ist, in welchem Maße die Inhibierung des PKI- alpha erfolgt, welcher chemischen Verbindungsklasse der Inhibitor des PKI-alpha zugeordnet werden kann und auf der Grundlage welches Mechanismus der Inhibitor von PKI-alpha seine Wirkung entfaltet.

Ein Mechansimus, der der Wirkung eine Inhibitors von PKI-alpha zugrunde liegen kann, ist die Inhibierung der Transkription von PKI-alpha. Als Inhibitor in diesem Sinne wirkt bspw. das Genprodukt des zweiten offenen Leserahmens des PKI-alpha-Gens. Daß dabei das Gen produkt das aktive Agens sein kann, scheint sich aus Wang X. et al.; Mol Pharm 54, 514-524 (1998) zu ergeben. Die Aminosäuresequenz dieses Genproduktes vom Menschen lautete

Met Trp Ile Phe Gly Ser Asn Asp

und ist als SEQ ID No. 3 zusammen mit der sie codierenden Nukleinsäuresequenz hierin auf genommen.

Die korrespondierende Sequenz vom Schwein lautet

Met Trp Ile Phe Val Ser Asn Asp

und ist als SEQ ID No. 4 zusammen mit der sie codierenden Nukleinsäuresequenz hierin auf genommen.

Der zwischen den beiden Arten Mensch und Schwein bestehende Unterschied in Form eines Aminosäureaustausches an der Position 5 der Aminosäuresequenz beruht auf einem Aus tausch auf Ebene der Nukleinsäure, wobei Position 2 des fünften Codons geändert ist. Im Falle der Sequenz beim Menschen findet sich Glycin als fünfte Aminosäure, wohingegen die se im Falle der Sequenz vom Schwein Valin ist. Der hierzu korrespondierende Basenaus tausch ist eine Änderung von G (human) zu T (Schwein).

Für den Fachmann ist offensichtlich, daß Abweichungen von den in SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4 offenbarten Sequenzen möglich sind, so lange das von den Sequenzen abgeleitete Derivat nach wie vor eine für PKI-alpha, insbesonder dessen Transkription, inhibitorische Wirkung aufweist.

Beta-Agonisten und damit Inhibitoren von PKI-alpha, wie hierin offenbart, können verwendet werde zur bzw. bei

1. Erhöhung der Kontraktilität des Myokards (wünschenswert bei schwerer Herzinsuffi zienz oder bei Herzinfarktpatienten (chronische Herzinsuffizienz und akute Herzinsuf fizienz)
2. Hypotonie

Es ist für den Fachmann offensichtlich, daß die erfindungsgemäßen Verwendungen im Rah men von therapeutischen und präventiven Behandlungen eingesetzt werden können, insbe sondere an Personen, die einer solchen Behandlung bedürfen.

Bei den erfindungsgemäßen Verfahren handelt es sich um Verfahren, mittels derer Verbin dungen ermittelt bzw. bereitgestellt werden, die als PKI-alpha, d. h. als Inhibitoren der Pro teinkinase A bzw. als Inhibitoren derselben verwendet werden können, insbesondere im Zu sammenhang mit einem oder mehreren der hierin offenbarten Krankheiten oder Indikations felder. Dabei können die Verfahren auch darauf gerichtet sein, daß ausgehend von einer Vielzahl von Verbindungen eine oder mehrere daraus mit einer entsprechenden Eigenschaft er mittelt werden soll(en) ("Screenen"). Eine Verbindung, die möglicherweise eine entsprechen de Eigenschaft aufweist, wird hierin auch als "Kandidaten"-Verbindung bezeichnet.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung bzw. zum Screenen einer im weite sten Sinne beta-antagonistisch wirkenden Verbindung kann der bereitgestellte Rezeptor als isoliertes Molekül, bspw. in Lösung oder immobilisiert, vorliegen. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß der Rezeptor in einem biologischen System vor liegt. Ein derartiges biologisches kann ein in vitro System oder ein in vivo System sein. Ein typisches in vitro System ist dabei ein Translations- oder Transkriptionssystem. Ein typisches in vivo System ist dabei ein zelluläres System, bspw. eine Zelle, insbesondere eine Myokard- oder Nervenzelle, die die genetische Information für PKI-alpha enthält. Ein zelluläres System kann aber auch eine Zelle sein, in die, bevorzugterweise mittels gentechnologischer Metho den, eine für PKI-alpha oder einen Teil davon codierende Nukleinsäure oder dessen bzw. de ren Expression steuernde Nukleinsäure eingeführt ist. Bei der Verwendung der in vivo und in vitro Systeme kann dabei von der hierin ebenfalls offenbarten Stressinduzierbarkeit des PKI- alpha Gebrauch gemacht werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann weiterhin vorgesehen sein, daß die Wirksamkeit eines Kandidaten-Antagonisten bewertet wird auf der Grundlage eines Vergleiches der Wir kung von PKI-alpha und seinen Derivaten, wie sie hierin beschrieben sind. Dadurch kann bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt des Screenens bzw. des Entwicklungsprozesses neuar tiger beta-Antagonisten und beta-Agonisten eine Quantifizierung der Wirksamkeit der gete steten Verbindungen erfolgen. Dabei kann das erfindungsgemäße Verfahren auch vorsehen, daß ein beta-Agonist, wie er hierin beschrieben ist, verwendet wird.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Bestimmung bzw. zum Screenen einer im weite sten Sinne beta-agonistisch wirkenden Verbindung kann der bereitgestellte beta-Agonist als isoliertes Molekül, bspw. in Lösung oder immobilisiert, vorliegen. Es ist jedoch auch im Rahmen der vorliegenden Erfindung, daß der Kandidaten-Agonist in einem biologischen System vorliegt. Ein derartiges biologisches System kann ein in vitro System oder ein in vivo System sein. Ein typisches in vitro System ist dabei typischerweise ein zellfreies Translations- oder Transkriptionssystem. Ein typisches in vivo System ist dabei ein zelluläres System, bspw. eine Zelle, insbesondere eine Myokard- oder Nervenzelle, die die genetische Informati on für den Kandidaten-beta-Agonisten enthält. Ein zelluläres System kann aber auch eine Zelle sein, in die, bevorzugterweise mittels gentechnologischer Methoden, die für den Kandi daten-beta-Agonisten oder einen Teil davon codierende Nukleinsäure oder dessen bzw. deren Expression steuernde Nukleinsäure eingeführt ist.

Das im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Transkriptionssystem für ei nen beta-Antagonisten kann dabei ein in vivo System oder ein in vitro System sein. Ein typi sches in vitro System ist dabei ein Translations- oder Transkriptionssystem. Ein typisches in vivo System ist dabei ein zelluläres System, bspw. eine Zelle, insbesondere eine Myokard- oder Nervenzelle, die die genetische Information für PKI-alpha enthält. Ein zelluläres System kann aber auch eine Zelle sein, in die, bevorzugterweise mittels gentechnologischer Metho den, die für PKI-alpha oder einen Teil davon codierende Nukleinsäure oder dessen bzw. deren Expression steuernde Nukleinsäure eingeführt ist. Bei der Verwendung der in vivo und in vitro Systeme kann dabei von der hierin ebenfalls offenbarten Stressinduzierbarkeit des PKI- alpha Gebrauch gemacht werden.

Es ist auch im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren, daß das Transkriptionssystem für einen beta-Antagonisten auch den Kandidaten-beta-Agonisten bzw. die für ihn codierende oder dessen Expression steuernde Nukleinsäure umfaßt. Des weiteren ist es im Rahmen der erfindungsgemäßen Verfahren, daß beta-Antagonisten und beta-Agonisten, wie sie hierin of fenbart und beschrieben sind bzw. nach einem der hierin offenbarten Verfahren ermittelt oder als solche bestimmt werden können, darin verwendet werden.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann weiterhin vorgesehen sein, daß die Wirksamkeit eines Kandidaten-beta-Agonisten bewertet wird auf der Grundlage eines Vergleiches der un ter dem Einfluß des Kandidaten-beta-Agonisten beobachteten Änderung der Transkription des beta-Antagonisten mit der unter dem Einfluß eines beta-Agonisten, wie er hierin beschrieben ist, beobachteten Änderung der Transkription des beta-Antagonisten. Dadurch kann bereits zu einem sehr frühen Zeitpunkt des Screenens bzw. des Entwicklungsprozesses neuartiger beta- Agonisten eine Quantifizierung der Wirksamkeit der getesteten Verbindungen erfolgen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Figuren, Beispiele und das Sequenzprotokoll weiter veranschaulicht werden, woraus sich weitere Merkmale und Vorteile der Erfindung ergeben können. Dabei zeigt:

Fig. 1 die Funktion der Proteinkinase A und des PKI-alpha bei der beta-adrenergen Signaltransduktion: Genauer ist die Signaltransduktionskaskade der β1- und β2-Rezeptoren (β1 und β2 AR) gezeigt, die über a-, β- und y-G-Protein-Untereinheiten sowie die Adenylatcycla se (AC) und cAMP-Erhöhungen die Proteinkinase A aktivieren. Die Proteinkinase A kann durch den PKI-alpha inhibiert werden, wodurch die Effekte der Proteinkinase A antagonisiert werden können. Die Proteinkinase A phosphoryliert insbesondere Phospholamban, wodurch die positiv inotrope Wirkung erklärt werden kann.

Fig. 2 die Abnahme der Funktion des linken Herzventrikels nach Verabreichung von PKI-alpha ausgedrückt als dp/dt und externe Herzarbeit (EHW).

BEISPIELE Beispiel 1 Untersuchungen zur Wirkung von PKI-alpha an einem arbeitenden Rattenherz

Die Herzen von insgesamt sechs Sprague Dawley-Ratten mit einem Gewicht von etwa 300 g wurden isoliert und wie bei Schulze et al. (Schulze et al.; Circulation 1990: 959-69) beschrie ben perfundiert. Die hämodynamischen Parameter einschließlich Kontraktilität, externe Herz arbeit (EHW), Koronar- und Aortenfluß, wurden etwa 15 Minuten nach antegrader Perfusion aufgezeichnet. Zellpermeabler, rekombinanter PKI-alpha (Aminosäuren 14 bis 22, Calbio chem # 476485) wurde dann verabreicht. Die Verbindung wurde direkt mittels einer Motor pumpe in die Atriumkanüle infundiert. Die Infusionsgeschwindigkeit wurde dem Auswurfvolumen (der Summe aus Aorta- und Koronarfluß) fortdauernd angepaßt und in fünfmi nütigen Intervallen erhöht, um die letztendlichen PKI-alpha-Konzentrationen im Perfusat von 0,5, 1,0 und 2,0 µmol/l zu erreichen. Die Ergebnisse betreffend das externe Herzvolumen und den Verlauf von dp/dt_max unter diesen Versuchsbedingungen sind in Fig. 2 dargestellt.

Die Infusion des verkürzten PKI-alpha verursachte eine ausgeprägte, reversible, konzentrati onsabhängige (bis zu 2 µMol) Depression der Myokardfunktion, die vergleichbar war der nach kurzer koronarer Okklusion beobachteten Dysfunktion. Die gemessene Verringerung der externen Herzarbeit und dp/dt-max war im gepaarten T-Test (engt.: "paired t-test") für alle getesteten Konzentrationen signifikant. Die Perfusion mit dem verkürzten PKI-alpha führte zu einer Verringerung der externen Herzarbeit um 43% und einer Abnahme der linksventrikulä ren Funktion, ausgedrückt als dp/dt-max, um 53%.

Aus diesen Untersuchungen ergibt sich, daß die verkürzte Form des PKI-alpha geeignet ist zur Blutdrucksenkung und allgemein zur Verwendung als eine neue Form bzw. Substanzklas se eines beta-Antagonisten.

Beispiel 2 Untersuchungen an Zellkulturen

Auf Zellkulturen von Myozyten (z. B. C9H2-Zellen, zu beziehen von der American Type Culture Collection) wurde der auf die Aminosäuren 14 bis 22 verkürzte Proteinkinase- Inhibitor-alpha gegeben und die Aktivität der Proteinkinase A bestimmt. Es wurde eine do sisabhängige Abnahme der Aktivität festgestellt.

Auf Zellkulturen von Myozyten wurde der 9 Aminosäuren lange PKI-alpha-Inhibitor (das Genprodukt des zweiten offenen Leserahmens der PKI-Gens beim Menschen und beim Schwein) gegeben und die Expression des PKI-alpha sowie die Aktivität der Proteinkinase A bestimmt. Es wurde eine von der Dosis des PKI-alpha-Inhibitors abhängige Zunahme der Aktivität der PKA festgestellt.

Zellkulturen von Myozyten wurden mit einem Expressionsplasmid mit der Sequenz von PKI- alpha, wie bspw. beschrieben bei Olsen (Olsen et al.; Endocrinology 5; 1246-1256 (1991)) transfiziert und die Expression des PKI-alpha bestimmt. Gleichzeitig wurde die Aktivität der Proteinkinase A, die spezifisch durch PKI-alpha inhibiert wird, bestimmt. (Proteinkinase A ist sowohl in quergestreiften als auch glatten Muskelzellen enthalten (Wang X. et al.; Mol Pharm 54, 514-524 (1998))). Auf diese Zellkulturen wurden verschiedene Konzentrationen des Pro teinkinase-Inhibitor-alpha-Inhibitors (PKI-alpha-I) gegeben. Die Expression des PKI-alpha wurde in Abhängigkeit von der Konzentration des PKI-alpha-Inhibitors verringert.

Die Offenbarung der verschiedenen hierin zitierten Literaturstellen wird hiermit durch Be zugnahme vollständig aufgenommen.

Die in der vorstehenden Beschreibung, den Ansprüchen und der Zeichnung offenbarten Merkmale der Erfindung können sowohl einzeln als auch in beliebigen Kombinationen für die Verwirklichung der Erfindung in ihren verschiedenen Ausführungsformen wesentlich sein.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivaten zur Blutdrucksenkung.

2. Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivaten als beta-Antagonist.

3. Verwendung von PKI-alpha und/oder dessen Derivate zur Herstellung eines Medika mentes für die Prävention und/oder Behandlung von Krankheiten, bei denen ein beta- Antagonist verwendet werden kann.

4. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß PKI- alpha eine in SEQ ID No. 2 dargestellte Aminosäuresequenz umfaßt.

5. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha codiert wird von einer Nukleinsäure, die der codierenden Sequenz der in SEQ ID No. 1 dargestellten Sequenz oder einer sich daraus infolge der Degeneriertheit des genetischen Codes ergebenden oder einer daran hybridisierenden Nukleinsäure entspricht.

6. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha in einer verkürzten Form verwendet wird.

7. Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha die Ami nosäuren 14 bis 22 der PKI-alpha-Sequenz, insbesondere der Sequenz von PKI-alpha nach SEQ ID No. 1 oder SEQ ID No. 2 umfaßt.

8. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten verwendet, wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Herzrhythmusstörungen, hyperkinetisches Herz syndrom, Angina pectoris, Myokardinfarkt, akuter Myokardinfarkt, Herzinsuffizienz, arterieller Hypertonus, essentielle und renale Hypertonie, Pfortaderhochdruck, Blutungen aus Oesophagusvarizen, Phäochromozytom, Überdosierung von beta- Sympathomimetika und Cholinrezeptoren-Blockern, Glaucoma simplex, Hyperthyreo se, Thyreotoxikose, Migräne, essentieller Tremor, Erregungstremor und Alkohol- Entzugssyndrom umfaßt.

9. Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha zur Postinfarkt-Medikation, Prophylaxe der Reinfarktes und/oder als Beru higungsmittel verwendet wird.

10. Verwendung eines Inhibitors von PKI-alpha oder eines Derivates davon zur Blutdruc kerhöhung.

11. Verwendung eines Inhibitors des PKI-alpha oder eines Derivates davon als beta- Agonist.

12. Verwendung eines Inhibitors des PKI-alpha oder eines Derivated davon zur Herstel lung eines Medikamentes für die Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Agonist verwendet werden kann.

13. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor die Transkription des PKI-alpha beeinflußt.

14. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß der PKI-alpha ein PKI-alpha nach einem der Ansprüche 1 bis 9 ist.

15. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor des PKI-alpha eine Aminosäuresequenz umfaßt, die ausgewählt ist aus der Gruppe, die Sequenzen mit der SEQ ID No. 3 und SEQ ID No. 4 umfaßt.

16. Verwendung nach einem der Ansprüche 10 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß der Inhibitor des PKI-alpha zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten ver wendet wird, die ausgewählt sind aus der Gruppe, die Herzinsuffizienz, Herzinfarkt, chronische und akute Herzinsuffizienz und Hypotonie umfaßt.

17. Verfahren zum Screenen auf Mittel zur Blutdrucksenkung, beta-Antagonisten und/oder Mitteln zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta-Antagonist verwendet werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß

18. Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die unter dem Einfluß des Kandidaten-beta-Antagonisten beobachtete Änderung des Bindungsverhaltens des be ta-Agonsiten an den beta-Rezeptor verglichen wird mit der unter dem Einfluß des be ta-Antagonisten nach einem der Ansprüche 1 bis 9 beobachteten Änderung des Bin dungsverhaltens des beta-Agonisten an den beta-Rezeptor.

19. Verfahren nach Anspruch 17 oder 18, dadurch gekennzeichnet, daß der beta-Rezeptor ausgewählt ist aus der Gruppe, die beta1- und beta2-Rezeptoren umfaßt.

20. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 19, dadurch gekennzeichnet, daß der be ta-Agonist ein Sympathomimetikum ist, insbesondere ein solches, das ausgewählte ist aus der Gruppe, die Noradrenalin, Adrenalin, Dopamin und Dobutamin umfaßt.

21. Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 20, dadurch gekennzeichnet, daß der be ta-Agonist ein beta-Agonist nach einem der Ansprüche 10 bis 16 ist.

22. Verfahren zum Screenen auf Mittel zur Blutdrucksenkung, beta-Agonisten und/oder Mittel zur Behandlung und/oder Prävention von Krankheiten, bei denen ein beta- Agonist verwendet werden kann, dadurch gekennzeichnet, daß

23. Verfahren nach Anspruch 22, dadurch gekennzeichnet, daß die unter dem Einfluß des Kandidaten-beta-Agonisten beobachtete Änderung der Transkription des beta- Antagonisten verglichen wird mit der unter dem Einfluß des beta-Agonisten nach ei nem der Ansprüche 11 bis 16 beobachteten Änderung der Transkription des beta- Antagonisten.

24. Verfahren nach Anspruch 22 oder 23, dadurch gekennzeichnet, daß der beta- Antagonist ein solcher nach einem der Ansprüche 1 bis 9 ist.

25. Verfahren nach einem der Ansprüche 22 bis 24, dadurch gekennzeichnet, daß der beta- Antagonist erhältlich ist nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 17 bis 21.