DE10004802A1

DE10004802A1 - Vorrichtung zur Durchführung von Färbe- und Hybridisierungsreaktionen

Info

Publication number: DE10004802A1
Application number: DE2000104802
Authority: DE
Inventors: Heinrich Gausepohl
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2000-02-03
Filing date: 2000-02-03
Publication date: 2001-08-09

Abstract

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung komplexer Protokolle in der Immuncytochemie und in situ Hybridisierung an biologischen Proben auf Objektträgern oder vergleichbaren Halterungen. Hauptzweck der Erfindung ist es, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, mit deren Hilfe derartige Protokolle in einem dafür geeigneten Automaten durchgeführt werden können. Gelöst wird das durch eine Vorrichtung, in die der Träger, z. B. ein Objektträger mit einem Gewebsschnitt, so eingespannt werden kann, daß ein Flüssigkeitsaustausch ohne Öffnen der Vorrichtung erfolgen kann. Die Flüssigkeit wird dabei in einem schmalen Spalt zwischen der Vorrichtung und dem Objektträger so gehalten, daß eine nennenswerte Verdunstung auch bei erhöhter Temperatur vermieden wird.

Description

Die Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie und in situ Hybridisierung an biologischen Proben auf Objektträgern oder vergleichbaren Halterungen. Die Analyse von Genexpressionsmustern oder der Verteilung immunreaktiver Moleküle ist eine gängige Methode in der modernen Biologie und Medizin. Während die meisten solcher Untersuchungen zur Zeit an Gewebsschnitten durchgeführt werden, wächst ein neues Anwendungsfeld rasch heran. Dabei werden Expressionsmuster an Bibliotheken mechanisch auf einen Träger aufgebrachter biologischer Moleküle analysiert. Die Technik ist unter den Namen "Biochips", "Mikroarrays" oder "DNA Chips" bekannt. Alle diese Protokolle sind arbeitsintensiv und erfordern eine Reihe von Inkubationen mit verschiedenen Waschflüssigkeiten und Reagenzien. Einige der Schritte müssen bei definierter Temperatur durchgeführt, und in vielen der Schritte muß eine Kontamination mit ubiquitären Enzymen verhindert werden. Der zentrale Schritt ist immer eine Inkubation über oft mehrere Stunden mit einer zu untersuchenden Probe, deren zur Verfü gung stehendes Volumen limitiert sein kann. Die Vielzahl der Schritte die in der Regel an mehreren Proben parallel durchgeführt werden müssen macht eine Automatisierung der Protokolle wünschenswert.

In der Literatur sind Geräte und Verfahren zur Automatisierung vor allem im Bereich der Immuncytochemie beschrieben [z. B. Wilkinson: In situ Hybridization, Oxford IRL Press 1992]. Zur Durchführung einfacher Fär bereaktionen [z. B. Gerät von DAKO] und auch komplexerer Protokolle sind Automaten im Markt bekannt [Gerät von Biogenex, Gerät von Ven tana]. Alle Automaten haben aber Defizite, wenn für jeden Objektträger eine im Volumen limitierte Menge an Probenmaterial zur Verfügung steht. Darüber hinaus werden in keiner der bekannten Vorrichtungen ge schlossene Kammern zur Durchführung der eigentlichen Hybridisierung eingesetzt. Die in der Pathologie verwendeten Färbeautomaten sind per se nicht zur Hybridisierung bei erhöhter Temperatur nutzbar.

Kammern zur manuellen Durchführung der Protokolle sind bekannt und z. B. bei der Firma Sigma-Aldrich erhältlich. Hier wird auf den Objektträ ger mit Hilfe einer Silikonmaske eine Plastikmembran mit zwei Öffnun gen aufgeklebt. Über die Öffnungen sind Flüssigkeiten manuell einfüllbar und während der Hybridisierung werden die Öffnungen verschlossen. Ein automatisierter Flüssigkeitsaustausch ist nicht vorgesehen und nicht realisierbar.

Die zur Bearbeitung nötigen Schritte und die verwendeten Reagenzien sind sehr ähnlich zu den in der Patentschrift DE 196 50 880 C1 vom 07.12.96 beschriebenen. Die dort beschriebene Vorrichtung bezieht sich aber auf Hybridisierungen an ganzen, d. h., nicht geschnittenen Objek ten.

Aufgabe der Erfindung ist es nun, eine Vorrichtung zur Verfügung zu stellen, die die folgenden Bedingungen erfüllt:

- Einschluß des Objektträgers mit dem biologischen Material in der Art, daß über dem Gewebsschnitt oder der Bibliothek von Sonden eine dünne, abgeschlossene Kammer entsteht
- Zugang zu der Kammer über Öffnungen zur Zu- und Abfuhr von Rea genzien
- Zugänglichkeit für automatischen Flüssigkeitstransfer;
- Reduktion der Verdunstung während längerer Inkubationsschritte bei erhöhter Temperatur
- Verwendung inerter Materialien
- Sterilisierbarkeit

Gelöst wird die Aufgabe durch die in den Zeichnungen 1-3 beschriebe ne Vorrichtung und die Merkmale der Patentansprüche. Die erfindungs gemäße Vorrichtung erlaubt die automatisierte Durchführung von Proto kollen zur in situ Hybridisierung in dafür vorgesehenen Automaten. Da durch wird eine erhebliche Arbeitserleichterung erreicht und die Durch führung der Experimente wird reproduzierbarer.

Zur Durchführung der Experimente wird zunächst die Halterung nach Zeichnung 1 mit einer ovalen Ringdichtung (2) versehen. Auf diese Hal terung wird der Objektträger mit dem biologischen Material so aufgelegt, daß das zu untersuchende Material im Bereich der Ringdichtung liegt und zur Halterung weist. Dieser Bereich bildet zwischen Halterung, Ob jektträger und Dichtung den Hybridisierungsspalt (9), bzw. die Hybridisie rungskammer aus. Anschlagkanten (9) erleichtern die Positionierung des Objekträgers und die Handhabung.

Dieser Aufbau wird in das Klemmblech (14) nach Zeichnung 2 einge schoben. Objektträger, Dichtung (12) und Halterung (1) bilden nun eine flache Kammer, die über zwei Kanäle (4, 5) in der Halterung mit der Au ßenwelt verbunden ist. In solchen Klemmhalterungen (14) können nun eine Vielzahl von Objektträgern ohne Kontaminationsgefahr bearbeitet oder gelagert werden.

Zur automatisierten Bearbeitung wird nun eine Vielzahl von Proben in Klemmhalterungen in einen Automaten eingebracht, der Flüssigkeits wechsel vornehmen kann. Falls eine Temperierung erforderlich ist, muß die Aufnahmevorrichtung des Automaten eine solche Temperierung vor sehen.

Die Halterungen werden so in den Automaten eingesetzt, daß die außen zugängliche Öffnung des Zuführungsstutzens (4) nach oben weist. In der in den Zeichnungen beschriebenen Ausführung steht d bei die Halte rung aus Platzgründen hochkant, es ist aber auch eine Variante mit ver tikaler Ausrichtung der Objektträger realisierbar.

Nun wird über einen der Zuführungskanäle (4) die erste Waschflüssigkeit eingebracht. Welcher der Kanäle zur Zufuhr bzw. Abführung von flüs sigkeiten dient, hängt von der jeweiligen Ausführungsform ab. Es ist auch denkbar, daß beide Kanäle wechselweise benutzt werden können. Die Patentansprüche decken mehrere sehr ähnliche Varianten ab, die in den Zeichnungen dargestellt sind.

Die Flüssigkeit dringt nun über den Zuführungskanal durch eine enge Bohrung (5) in die Kammer ein und benetzt die innerhalb der Dichtung liegende Fläche (3) des Objektträgers. Zur vollständigen Benetzung und Entfernung alter Luftblasen kann es notwendig werden, die Kammer mit einem mehrfachen ihres Volumens zu überspülen. Je nach Ausführung der Kammer läuft die Flüssigkeit auf der anderen Seite aus einem Über lauf ab (5) oder sie wird auf der anderen Seite aktiv abgesaugt [Zeich nung 3, (5)].

Im weiteren Verlauf des Experiments werden nun der Reihe nach in alle Kammern Reagenzien eingebracht. Nach der für jedes Reagenz defi nierten Reaktionszeit wird das im Protokoll vorgesehene nächste Rea genz eingebracht. Dabei sollen keine Luftblasen eingetragen werden und das Volumen wird jeweils so gewählt, daß ein vollständiger Austausch erfolgt. Um den Eintrag von Luftblasen zu verhindern kann es erforder lich sein, neu eingebrachte Reagenzien unter dem Flüssigkeitsspiegel im Zulaufstutzen (4) einzubringen.

Für die Hybridisierung wird die Probe auf dem gleichen Weg einge bracht. Wenn das Volumen limitiert ist, kann der Zuführungskanal an schließend mit einer inerten Waschflüssigkeit gefüllt werden. Falls es das Protokoll erfordert, werden Reagenzien aus vorgewärmten Vorrats lösungen eingebracht. Alternativ läßt sich die gesamte Halterung zur Aufnahme der einzelnen Klemmhalter ebenfalls temperieren.

Die Verdunstung von Probenflüssigkeit während der oft über bis zu 30 Stunden erfolgenden Hybridisierung bei 40-70°C wird durch einzelne oder mehrere der folgende Maßnahmen verhindert:

- Verschluß der Zuführungsöffnung (4) mit einem Septum oder einem Deckel mit sehr enger Öffnung (nicht dargestellt)
- Überschichtung der Flüssigkeit im Zuführungsstutzen (4) mit einer schwer verdampfbaren zweiten Flüssigkeit, wie z. B. Glyzerin, Poly ethylenglykol oder Öl
- Umbau der gesamten Halterung mit einer befeuchtbaren Kammer
- Ersatz verdunsteter Lösung während der Inkubation.

Nach der Hybridisierung erfolgen typischerweise Waschschritte mit salz haltigen Lösungen bei definierter Temperatur, die genau so durchgeführt werden wie oben beschrieben. Je nach Protokoll können sich weitere Inkubationen mit einem oder mehreren Nachweisreagenzien anschlie ßen, die im wesentlichen nach dem gleichen Ablauf erfolgen. Zum Schluß wird die Probe salzfrei gespült und steht dann für die Auswertung zur Verfügung. Je nach Protokoll kann die Probe in der Halterung bis zur unmittelbaren Auswertung bearbeitet werden. Falls eine visuelle Kon trolle der letzten Reaktionsschritte notwendig ist, ist die Beobachtung durch die offene Seite der Klemmhalterung (14) problemlos möglich. Der Vorteil der Handhabung in einer geschlossenen Halterung bleibt also bis zum Abschluß des Protokolls erhalten.

Der Objektträger wird dann aus der Klemmhalterung herausgeschoben und steht nun wie bei manuellen Protokollen zur weiteren Analyse, Be arbeitung oder Lagerung zur Verfügung. Die Halterung (1) und Dichtung (12) werden nun durch chemische oder thermische Desinfektion nach gängigen Verfahren gereinigt und stehen dann für weitere Experimente zur Verfügung. Die Klemmhalterung (14) kommt mit dem biologischen Material nicht in Berührung und unterliegt damit weniger stringenten Rei nigungsvorschriften.

Legende der Zeichnungen

1

Grundkörper der Halterung

2

Nut zur Aufnahme der Dichtung

3

Hybridisierungsbereich, Bereich der Kammer

4

Zulaufstutzen

5

Ablaufstutzen

6

Zulaufbohrung mit engem Querschnitt

7

Ablaufbohrung mit engem Querschnitt

8

Belüftungsbohrung

9

Anschlagkanten

10

Stufe für den Spalt

11

optionale Maske

12

Dichtung (nur keilförmige Version dargestellt)

13

erweiterter Bereich des Zulaustutzens

14

Klemmvorrichtung

Claims

1. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß zwischen einer Halterung (1) mit Kanälen für die Zu- und Abfuhr von Flüssigkeiten (4, 5), dem Objektträger und gegebenenfalls einer Dichtung (12) ein schmaler Spalt (3) zum Überspülen der am Ob jektträger fixierten Probe besteht.

2. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß Objektträger und Halterung in eine Klemmvorrichtung (14) ein gespannt werden, die den Objektträger dicht auf die Halterung oder eine darin liegende umlaufende Dichtung drückt.

3. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß Spülflüssigkeiten und Reagenzien über einen Zufuhrkanal (4) eingebracht werden und für weitgehend frei definierbaren Zeiträume den Spalt über dem Objektträger füllen.

4. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß Spülflüssigkeiten und Reagenzien gegebenenfalls durch einen Pipettierroboter eingebracht werden können in dem die montierten halterungen mit den nach oben weisenden Zuführungsöffnungen angeordnet werden.

5. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Öffnungen der Zu- und Abführungskanäle nach außen und zum Spalt hin Querschnittsverengungen (6, 7) aufweisen, die Ver dunstung und Diffusion von Flüssigkeiten reduzieren.

6. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Zuführungskanal gegenenenfalls eine erweiterte Stelle (13) aufweist, die als Reservoir fungiert.

7. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Ablaufkanal aus einem Überlauf (5, 6) besteht.

8. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Ablaufkanal mit einer Entlüftungsöffnung (8) versehen ist, die das unkontrollierte Leerlaufen durch hydrostatische Effekte ver hindert.

9. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Objektträger in der Halterung hochkant oder quer aufgestellt wird.

10. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Zulauf an der unteren Seite des Spaltes (6) und der Ablauf (7) oben liegt.

11. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Überlauf (7) bei vertikaler Anordnung der montierten Vor richtung oberhalb des benetzten Spalts (3) liegt.

12. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Zulaufstutzen (4) nach oben mit einem Septum aus elasti schem Material wie Gummi oder Silikon abgeschlossen werden kann.

13. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, oder daß der Zulaufstutzen (4) nach oben mit einem Stopfen abge schlossen werden kann, der eine kleine zentrale Bohrung aufweist.

14. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuführung von Reagenzien durch eine Kanüle erfolgt, die in dem Loch des Stopfens nach Anspruch 13 abdichtet oder das Sep tum nach Anspruch 12 durchdringt und Reagenzien so unter Über druck eingebracht werden können.

15. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuführung von Reagenzien durch eine Kanüle erfolgt, die über ihre Länge eine Stelle aufweist, die in dem Loch des -Stopfens nach Anspruch 13 nicht abdichtet und so die wahlweise Dosierung ohne Überdruck erlaubt.

16. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Zuführung von Reagenzien in den erweiterten Bereich (13) des Zulaufstutzens (4) so erfolgt, daß keine Luftblasen eingetragen werden.

17. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Ablauf in ein Reservoir mündet, das aktiv geleert werden muß.

18. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß das Ablaufreservoir nach Anspruch 17 mit einem Septum oder Stopfen nach Anspruch 12-15 verschlossen wird.

19. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß der Zulaufstutzen einen festen Anschluß an ein Spülsystem hat und darüber hinaus die Zugabe der Probe durch ein Septum erlaubt.

20. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Halterung (1) und die Klemmvorrichtung (14) aus inertem Material bestehen.

21. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Halterung (1) aus Teflon, Polyolefin, Polyoxymethylen, Po lysulfon, Glas oder Keramik besteht und die Klemmvorrichtung (14) aus Edelstahl oder Titan.

22. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Dichtung (12) aus einem gegenüber den verwendeten Puffern inerten Material benutzt wird.

23. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß als Dichtungsmaterial Silikon, Silikonschaum, Gummi, Neopren oder Viton benutzt wird.

24. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Dichtung (12) einen ringförmigen, keilförmigen oder recht eckigen Querschnitt aufweist.

25. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltbreite durch eine Stufe (10) in der Halterung zwischen dem äußeren Auflagerand und dem Bereich des Spalts bestimmt wird.

26. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, oder daß die Spaltbreite (10) durch die Gestaltung der Dichtung (12) bestimmt wird.

27. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Spaltbreite (10) durch eine fixierte oder austauschbare Di stanzplatte (11) außerhalb des durch die Dichtung bestimmten Fen sters (3) bestimmt wird.

28. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß eine Distanzplatte (11) benutzt wird, die gleichzeitig des über spülte Fenster (3) und die Spaltbreite (10) definiert.

29. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Distanzplatte (11) nach Anspruch 27 und 28 mit einem hochviskosen Dichtungsmaterial bestrichen die Dichtungsfunktion übernimmt.

30. Vorrichtung zur Durchführung von Protokollen der Immuncytochemie, in situ Hybridisierung und verwandten Verfahren an biologischem Material auf Objektträgern oder ähnlichen Halterungen, dadurch gekennzeichnet, daß die Distanzplatte nach Anspruch 27-29 aus Edelstahl, Polyole finfolie, Teflonfolie, Silikonfolie oder Gummifolie besteht.