DE10002803A1

DE10002803A1 - System zur internen qualitativen und quantitativen Validierung von Markerindices

Info

Publication number: DE10002803A1
Application number: DE10002803A
Authority: DE
Inventors: Johannes Gerdes
Original assignee: CONBIO LIZENZVERWERTUNGSGESELL
Current assignee: CONBIO LIZENZVERWERTUNGSGESELL
Priority date: 2000-01-24
Filing date: 2000-01-24
Publication date: 2001-08-02
Also published as: US7560282B2; WO2001055346A3; DE60140346D1; US20030124563A1; JP5039264B2; WO2001055346A2; EP1250599A2; JP2003520600A; ATE447711T1; EP1250599B1; ES2333847T3

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die qualitative und quantitative Validierung von Markerindices insbesondere in der medizinischen Diagnostik und besonders die Bestimmung der Wachstumsfraktion in einer Probe mit Antikörpern gegen das Ki-67 Protein. DOLLAR A Diagnostisches Kit zur Quantifizierung einer durch einen Marker gekennzeichneten Zellfraktion in der in vitro Diagnostik, dadurch gekennzeichnet, dass ein Pseudogewebe zur intra- und inter Assay-Standardisierung des Markerindex verwendet wird.

Description

Technisches Gebiet

Die vorliegende Erfindung betrifft die qualitative und quantitative Validierung von Markerindices insbesondere in der medizinischen Diagnostik und besonders die Bestimmung der Wachstumsfraktion in einer Probe mit Antikörpern gegen das Ki-67- Protein.

Stand der Technik

Die Bestimmung von Markern und Markerindices ist integraler Bestandteil der modernen medizinischen Diagnostik in den unterschiedlichsten Medizin-Feldern. So gehört z. B. die Bestimmung des Verhältnisses von "High-Density-Lipoproteinen" (HDL) zu "Low-Density-Lipoproteinen" (LDL) zur Routine- Blutuntersuchung; die Bestimmung des Verhältnisses von CD4- zu CD8- positiven Blutzellen zu einem der wichtigsten Parameter der AIDS- Diagnostik; in der Tumordiagnostik gilt z. B. beim Brustkrebs die Bestimmung des Hormonrezeptor-Status als Indikator für eine der Operation folgende Therapie. Da als Marker die unterschiedlichsten Strukturen dienen, sind auch die Bestimmungsmethoden vielfältig: ELISA, RIA, chemische bzw. biochemische Titrationen, FACS-, Luminometrische, Nephelometrische, Densitometrische Analysen etc. sind dem Fachmann wohlbekannt.

In der Tumordiagnostik ist die feingewebliche bzw. die cytologische Untersuchung einer Probe nach wie vor die Methode der Wahl. Zu diesem Zweck wendet der geschulte Pathologe in zunehmendem Maße histochemische und immunhistochemische bzw. cytochemische und immuncytochemische Methoden an. So wird der oben erwähnte Hormonrezeptor-Status beim Mammakarzinom immunhistologisch bzw. immuncytologisch bestimmt. (Im Weiteren schließt der Begriff "immunhistochemisch" sowohl immunhistologisch als auch immuncytologisch ein.) Bei allen Markerbestimmunungen muss der Fachmann sicherstellen, dass die Testsysteme qualitativ und quantitativ validierbar sind. Dies gelingt z. B. durch Eichung gegen einen internen oder externen Standard und Erstellung von Eichkurven, durch parallele Messung geeigneter positiv- und negativ-Kontrollen. In der Immunhistochemie ist eine solche Validierung insbesondere eine quantitative Validierung nicht trivial, da kommerzielle Kits zur immunhistochemischen Markerdarstellung entweder gar keinen internen Standard enthalten oder aber, wie z. B. beim Hormonrezeptor, Zellpräparationen enthalten, die entweder positiv oder negativ sind, also nur eine ja-nein-Entscheidung erlauben und daher bestenfalls als eine semi-quantitative Validierung angesehen werden kann. In der Praxis behilft sich der geschulte Pathologe daher mit der parallelen Bestimmung des zu untersuchenden Markers an gut charakterisierten und voruntersuchten Fällen aus seinem Archiv. Dieses Verfahren ist zum einen wegen der bekannten Heterogenität von Geweben, insbesondere Tumoren, fachlich fraglich oder zumindest umstritten, zum anderen ethisch fragwürdig, was eine kommerzielle Umsetzung dieses Procederes unmöglich macht.

In der histopathologischen Tumordiagnostik sind Parameter zur Bestimmung der Proliferationsaktivität schon seit Anfang des 20. Jahrhunderts integraler Bestandteil. Immunhistologisch wurde die Darstellung von Strukturen, die den Zellteilungszyklus steuern, als Marker für Proliferation eingesetzt. Viele der beteiligten zellzyklus-assoziierten Proteine werden transient in einzelnen Zellzyklusphasen exprimiert. Im Gegensatz dazu ist das nukleäre Ki-67-Protein (Gerdes, J., et al. Int. J. Cancer, 1983, 31: 13-20) in allen aktiven Phasen des Zellzyklus nachweisbar, i. e. G1, S. G2 und Mitose, während Ruhephasezellen (G0) für dieses Protein konsistent negativ sind (Gerdes, J., et al J. Immunol. 1984, 133: 1710-1715). Dies bedeutet, dass die Ki-67-Protein-Expression (Ki-67 Markierungsindex) als Maß für die Wachstumsfraktion einer gegebenen Zellpopulation dienen kann. Daher fanden Antikörper gegen das Ki-67-Protein breite Anwendung in der Histopathologie, insbesondere in zahlreichen Studien zum Einsatz als Marker zur Malignitätsabschätzung bei humanen Neoplasien (Sawhney, N. and Hall, P. A., J. Pathol, 1992, 168: 161-162; Schwarting, R., Lab. Invest., 1993, 68: 597-599; Lelle, R. J., et al. Cancer, 1987, 59: 83-88; Lokhorst, H. M., et al. J. Clin. Invest 1987, 79: 1401-1411; Gerdes, J. et al Am. J. Path., 1987 128: 330-334 and 129: 486-492).

In retrospektiven Studien an verschiedenen Tumorentitäten wird die Rolle des Ki-67-Markierungsindex als Prognosemarker unterschiedlich diskutiert: während bei malignen Non-Hodgkin- Lymphomen einhellig eine Korrelation zwischen der Überlebenszeit der Patienten und dem Ki-67-Markierungsindex beschrieben wurde (Gerdes, J. et al. 1987, Lancet, ii 448-449; Grogan, T. M. et al. 1988 Blood, 71: 1157-1160; Hall, P. A. et al. J. Pathol. 1988, 154: 223-235) wird dies für andere Tumorentitäten z. T. kontrovers diskutiert: So fanden Harberg et al. (Prognostische und therapierelevante Faktoren beim Mamma-Karzinom, Novartis Pharma- Verlag, Nürnberg, 1997) für das Mammakarzinom in der multivarianten Analyse keine Korrelation, während (Clahsen, P. C. et. al., J. Clin. Oncol. 1998 Feb; 16(2): 470-479; Rozan, S. et. al., Int. J. Cancer 1998 Feb; 79(1): 27-33; Jansen, R. L. et. al., Br. J. Cancer 1998 Aug; 78(4): 460-465; Molino, A. et. al., Int. J. Cancer 1997 Aug; 74(4): 433-437) schlüssig bewiesen, dass die Darstellung des Ki-67-Proteins am Paraffinschnitt in der multivarianten, statistischen Analyse unabhängiger Prognose Parameter beim Mamma-Karzinom ist. Aaltoma et al 1997, Eur Urol 32: 410-415 und Borre et al 1998, J Urol 159: 1609-1614, zeigten, dass der Ki-67-Markierungsindex auch für das Prostatakarzinom ein unabhängiger Prognoseparameter ist, während Coetze et al 1997, J Urol 157: 214-218, den Wert des Ki-67-Markierungsindex als prognostischen Indikator in Frage stellen, und Uzoaru et al 1998, J Surg Oncol 67: 33-37, gar schlossen, dass der Ki-67- Markierungsindex keine signifikante Prognose zum Überleben der Patienten erlaubt.

Wie oben exemplarisch für die Hormonrezeptoren gezeigt, ist auch bei der Erhebung des Ki-67-Markierungsindex eine Standardisierung der Immunfärbetechnik als auch eine interne Validierung der quantitativen Auswertung und Aussagen bisher nicht möglich

Zusammenfassung der Erfindung

Daher liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Werkzeug bereitzustellen, das die qualitative sowie die quantitative Validierung von Markerindices insbesondere in der medizinischen Diagnostik, bevorzugt immunhistochemischen Diagnostik, insbesondere des Ki-67-Markierungsindex erlaubt.

Erfindungsgemäß wird dieses durch ein Kit gelöst, welches ein Pseudogewebe zur intra- und inter-Assay-Standardisierung enthält.

In einem weiteren Aspekt wird ein Kit bereitgestellt, welches Antikörper gegen einen Marker, bevorzugt gegen das Ki-67-Protein mit limitierter Inter-Spezies-Kreuzreaktivität, sowie fixiertes, paraffin-eingebettetes Pseudogewebe, bestehend aus Zell-Linien- Gemischen mit prädefinierten Markerindices, bevorzugt Ki-67- Markierungsindex, oder mikroskopischen Schnitten von Pseudogewebe, sowie Detektionsreagenzien enthält.

Beschreibung der Abbildungen

Abb. 1: Intra-Observer-Variabilität, Person 2 aus der Serie 2,

Abb. 2: Inter-Observer-Variabilität, Serie 1,

Abb. 3: Inter-Assay-Variabilität.

Ausführliche Darstellung der Erfindung

In einem weiteren Aspekt wird ein Kit bereitgestellt, welches Antikörper gegen einen Marker, bevorzugt gegen das Ki-57-Protein mit limitierter Inter-Spezies-Kreuzreaktivität, sowie fixiertes, paraffin-eingebettetes Pseudogewebe, bestehend aus Zell-Linien- Gemischen mit prädefinierten Markerindices, bevorzugt Ki-67- Markierungsindex, oder mikroskopischen Schnitten von Pseudogewebe, sowie Detektionsreagenzien enthält.

Jede Nachweisserie zur Darstellung eines Markers mit Hilfe eines erfindungsgemäßen Kits beinhaltet die Darstellung des Markers am zugehörigen Pseudogewebe. Der geschulte Pathologe kann damit zum einen die Darstellung des Markers sowohl qualitativ beurteilen (ist die Reaktion zufriedenstellend ausgefallen) als auch quantitativ validieren (wurde der prädefinierte Markerindex in dieser Nachweisserie erreicht und ist somit valide, oder ist der Nachweis durch Unterschreiten bzw. Überschreiten von prädefinierten Abweichungsthreshholds vom prädefinierten Markerindex, in der Regel plus minus einer Standardabweichung, invalid.

Als zu untersuchendes Material bzw. Probe sind Gewebeproben, Cytopräparate und Zell-/Blutausstriche erfindungsgemäß eingeschlossen.

Unter Pseudogewebe werden in eine Matrix eingebettet Zell-Linien- Zellen, besonders bevorzugt Gemische von zwei oder mehreren Zell- Linien-Zellen verstanden. Solche Pseudogewebe sollen eine histologische, besonders bevorzugt immunhistologische Untersuchung erlauben. Als Matrices können z. B. dienen:
schneidbare Kunststoffe, Agarose, nicht heparinisiertes Serum, Kollagene, Cellulose-, Chitin-, Chitosanderivate und andere Biopolymere oder wie in den Beispielen Fibrinklots hergestellt, wie unten beschrieben.

Marker können jedweder Natur sein: organische wie nicht organische Substanzen, Lipide, Lipopolysaccharide, Zucker, Proteine, Nukleinsäuren, endogene Enzyme wie z. B. Peroxydase oder saure Phosphatase, Zellmembranstrukturen mit und ohne CD- Bezeichnung, Cytoplasma- und Zellkernbestandteile etc.

Markerindices werden zum Teil unterschiedlich erhoben. Wie oben erwähnt, wird in der Aids-Diagnostik das Verhältnis von CD4- positiven und CD8-positiven Zellen als sogenannter T4/T8-Quotient dargestellt. Zumeist meint Markerindex jedoch die Anzahl für einen Marker positiver Zellen einer bestimmten Population in Prozent. Letztere Definition gilt auch für den Ki-67- Markierungsindex.

Das erfindungsgemäße, diagnostische Kit ist besonders für die Validierung des Ki-67-Markierungsindex geeignet. Durch den Einsatz Hormonrezeptor-positiver und -negativer Zell-Linien-Zellen zur Herstellung eines Pseudogewebes zum Einsatz in einem entsprechenden Kit ist die Erfindung auch zur Validierung der immunhistochemischen Bestimmung des Rezeptorstatus einsetzbar. Analoges gilt für die Bestimmung der HER-2/neu(c-erb-B2)Gen- und Protein-Expression beim Brustkrebs. Durch Einsatz von CD4- positiven CD8-negativen und CD4-negativen CD8-positiven Zell- Linien-Zellen zur Herstellung eines Pseudogewebes zum Einsatz in einem entsprechenden Kit ist die Erfindung auch für die Validierung der Bestimmung des T4/T8-Quotienten geeignet. Die vorliegende Erfindung ist demnach zur Validierung verschiedenster Markerindices einsetzbar.

Im folgenden wird die Erfindung anhand einer bevorzugten Ausführungsform näher erläutert aber nicht dadurch in irgendeiner Weise eingeschränkt.

Antikörper gegen das humane Ki-67-Protein zeigen z. T. eine limitierte Kreuzreaktion mit den Ki-67-äquivalenten Proteinen anderer Spezies. So eignet sich z. B. der monoklonale Antikörper MIB-1 hervorragend zur Darstellung des humanen Ki-67-Proteins in Paraffinschnitten. Der Nachweis des murinen Äquivalents an Paraffinschnitten gelingt mit dem Antikörper MIB-1 jedoch nicht. Diese limitierte inter-Spezies-Kreuzreaktivität wird sich bei der Präparation von Pseudogeweben mit prädefiniertem Ki-67- Markierungsindex zu Nutze gemacht.

Herstellen des Pseudogewebes

Eine humane Zelllinie, bevorzugt IM-9 und eine nicht humane, bevorzugt eine murine Zell-Linie, besonders bevorzugt Ag8, werden unter Standardbedingungen ausgesät und in der logorithmischen Wachstumsphase geerntet und mittels Dichtezentrifugation tote Zellen und Zelldetritus abgetrennt. Nach einmaligem Waschen in Kulturmedium wird die Zellzahl mit einem Sysmex-Platelet-Counter PL -100 (Sysmex TOA Medical Electronics GmbH, Tarpen 15 A, D- 22419 Hamburg) bestimmt. Dazu wird 10 µl Zellsuspension in 5 ml Puffer (Sysmex Cellpack PK-30 L 20 Liter, Best.-Nr. 834-0011-6) gut vermischt und die Zählung als Doppelbestimmung durchgeführt. (Einstellung des Counters: Discrimmator: Blood 10, Platelet 6; Sensitiv: 1; Alarm Time: 11). Aufgrund dieser Zählung werden 1 × 10⁷ Zellen zur Pseudogewebeherstellung eingesetzt.

Verwendete Reagenzien: Fibrinogen: F 4753, Sigma; Ansatz: 60 mg in einem Becherglas abwiegen und langsam 10 ml 0.9% NaCl-Lsg. dazugeben. 10 min bei 37°C stehen lassen, danach mit einer Pipette resuspendieren, bis die Lsg. klar ist. Die so angesetzte Lsg. ist 24 Stunden haltbar.

Thrombin: T 9010, Sigma; Ansatz: 1 vial in 500 µl aqua tridest. lösen, gut resuspendieren. Aliquots, die in Lösung bei -20°C gelagert werden, sind 6 Monate haltbar.) 1 × 10⁷ Zellen in 1,5 ml Schraubröhrchen bei 1200 upm abzentrifugieren, Überstand abgießen. Das Pellet (ca. 50-100 µl Zellen) gut resuspendieren. 200 µl Fibrinogen-Lösung zu den Zellen geben und gut resuspendieren. Anschließend 100 µl Thrombin-Lösung dazugeben, kurz mischen und auf Eis 30 min. inkubieren. Dabei bildet sich ein die Zellen einschließender Fibrinpfropf, der anschließend routinemäßig Formalin fixiert und in Paraffin eingebeatet wird (4% Formalin, mindestens 30 min., maximal 60 Stunden; Durchführung der Paraffineinbettung in handelsüblichen Automaten, z. B. HypercenterTM, Fa. Shandon). Mit Standardmethoden hergestellte Paraffinschnitte wurden dann, wie in den Beispielen beschrieben, immunzytochemisch gefärbt.

Wie in Beispiel 1 dargestellt, waren Paraffinschnitte von Pseudogeweben der murinen Zell-Linie Ag 8 erwartungsgemäß komplett negativ für MIB-1. Paraffinschnitte von Pseudogeweben der humanen Zell-Linie IM9, präpariert, wie oben beschrieben, waren immer zu 100% positiv für MIB-1. Dies bedeutete, dass durch einfache Mischung dieser Zell-Linien in verschiedenen Prozentsätzen Pseudogewebe mit jedwedem gewünschtem Prozentsatz MIB-1-positiver Zellen präparierbar sein müssten. Beispiel 2 zeigt, dass dies der Fall ist. Durch Nutzung der Pseudogewebs- Präparate in einem MIB-1-Detection-Kit (TM) zur Kontrolle der Bestimmung der Wachstumsfraktion mit Antikörpern gegen das humane Ki-67-Protein ist erstmals eine qualitative wie auch quantitative interne Validierung dieser Bestimmungen möglich geworden.

Beispiel 1 MIB-1-Immunfärbung von Pseudogeweben, deren Zellen zu 100% aus IM9- bzw. Ag8-Zellinien-Zellen bestehen

1-3 µm dicke Schnitte wurden mit nachfolgenden Reagenzien der Firma Monotec, Hamburg, und nach dem nachfolgenden Rezept des Herstellers gefärbt.

REAGENZIEN DES MIB-1-DETECTION-KITS

Färbeanleitung Deparaffinierung und Rehydration

Vor der Immunfärbung müssen die auf Objektträger aufgezogenen Paraffinschnitte entparaffiniert werden, um das Einbettmedium zu entfernen. Anschließend müssen die Schnitte rehydriert werden. Unzureichendes Entparaffinieren und unzureichende Rehydrierung sind unbedingt zu vermeiden, da dies zu einer erhöhten, unspezifischen Färbung führen kann.

Schritt 1

Schnitte in einem Xylol-Bad 5(+/-1) Minuten inkubieren. Bad wechseln und Inkubation einmal wiederholen.

Schritt 2

Überschüssige Flüssigkeit ablaufen lassen und dann Schnitte in 100% Alkohol-Bad 5(+/-1) Minuten inkubieren. Bad wechseln und Inkubation einmal wiederholen.

Schritt 3

Überschüssige Flüssigkeit ablaufen lassen und dann Schnitte in 70% Alkohol-Bad 5(+/-1) Minuten inkubieren. Bad wechseln und Inkubation einmal wiederholen.

Schritt 4

Überschüssige Flüssigkeit ablaufen lassen und dann Schnitte in 40% Alkohol-Bad 5(+/-1) Minuten inkubieren. Bad wechseln und Inkubation einmal wiederholen.

Schritt 5

Überschüssige Flüssigkeit ablaufen lassen und dann Schnitte in destilliertem Wasser 5(+/-1) Minuten inkubieren. Bad wechseln und Inkubation einmal wiederholen.

Xylol-, Alkohol- und Wasserbäder müssen nach je 40 Schnitten gewechselt werden.

Immunfärbungsprotokoll Schritt 1 Peroxydase-Blockierungs-Reagenz

Überschüssiges, destilliertes Wasser gut ablaufen lassen. Objektträger sorgfältig und vorsichtig mit einem nicht-fuselnden Tuch um die Schnitte herum trocknen, um sicherzustellen, daß die Reagenzien den Schnitt bedecken. Schnitte dann in eine feuchte Kammer legen und 100 µl Peroxydase-Blockierungs- Reagenz (Vial 1) auf den Schnitt bringen. (Wenn nötig, müssen mehr als 100 µl aufgebracht werden.)

10(+/-1) Minuten Inkubation bei Raumtemperatur.

Schnitte dann vorsichtig mit destilliertem Wasser oder Waschpuffer mittels einer Waschflasche abspülen, wobei darauf zu achten ist, daß der Flüssigkeitstrahl den Schnitt nicht berührt.

Schritt 2 Antigen-Recovery

Objektträger Küvette in ein Wasserbad stellen und mit 1 : 50 in destilliertem Wasser verdünnter Antigen-Recovery-Lösung (Vial 7) füllen. Wasserbad und somit die Antigen-Recovery-Lösung auf 95-99°C erhitzen. Anschließend die Peroxydase-blockierten Schnitte in diese Küvetten stellen und die Temperatur wieder auf 95-99°C bringen und dann 60(+/-1) Minuten bei 95-99°C inkubieren.

Objektträgerküvetten aus dem Wasserbad herausnehmen und die Schnitte in ein frisches Waschpuffer-Bad transferieren, 3(+/-1) Minuten inkubieren, dann Waschpuffer-Bad-Wechsel und Waschgang zweimal wiederholen.

Schritt 3 Primär-Antikörper MIB-1 bzw. Negativkontrollreagenz

Überschüssigen Waschpuffer ablaufen lassen und Objektträger, wie oben beschrieben, um die Schnitte herum trocknen.

Schnitte mit 100 µl Primärantikörper aus Vial 2 oder Schnitte mit 100 µl Negativkontrollreagenz aus Vial 4 überschichten.

30(+/-1) Minuten Inkubation bei Raumtemperatur.

Schnitte dann vorsichtig mit destilliertem Wasser oder Waschpuffer mittels einer Waschflasche abspülen, wobei darauf zu achten ist, dass der Flüssigkeitstrahl den Schnitt nicht berührt und die Schnitte in ein frisches Waschpuffer-Bad transferieren, 3(+/-1) Minuten inkubieren, dann Waschpuffer-Bad-Wechsel und Waschgang zweimal wiederholen.

Schritt 4 Nachweisreagenz

Schnitte mit 100 µl Nachweisreagenz aus Vial 3 überschichten.

30(+/-1) Minuten Inkubation bei Raumtemperatur.

Schritt 5 Entwicklungsreaktion

1 ml DAB-Substrat aus Vial 5 in Reagenzglas geben und 10 µl DAB-Chromogen dazufügen.

100 µl dieser Lösung auf die Schnitte geben.

10(+/-1) Minuten inkubieren bei Raumtemperatur.

Anschließend waschen, wie oben beschrieben.

Gegenfärben mit Mayer's Hämalaun und anschließend eindecken in Kaiser's Glyzerin-Gelatine.

Ergebnisse

Die Auswertung der Färbungen erfolgte mikroskopisch durch Auszählen von jeweils 200 Zellen durch 3 verschiedene Personen und Bestimmung des Prozentanteils der positiven Zellen im gefärbten Material.

ad-AG8-Pseudogewebe

Alle Färbungen mit dem Negativ-Kontrollreagenz sowie mit dem MIB1- Antikörper waren negativ, d. h. es lagen 0% positive Zellen vor. Intra- wie auch Inter-Assay-Abweichung sowie Intra- und Inter- Observer-Abweichungen waren gleich 0.

ad-IM9-Pseudogewebe

Alle Färbungen mit dem negativ-Kontrollreagenz waren, wie erwartet, negativ. 0% positive Zellen.

Intra- wie auch Inter-Assay-Abweichung sowie Intra- und Inter- Observer-Abweichungen für das Negativ-Kontrollreagenz waren gleich 0.

MIB-1-gefärbte Schnitte der IM9-Pseudogewebe zeigten fast immer 100% positive Zellen (Mittelwert 99,833%). In der Tabelle 1 dargestellte Versuchsserie war die Intra- und Inter-Observer sowie die Inter-Assay-Abweichung gleich 0.

Beispiel 2 Immunfärbung von Pseudogeweben mit definiertem Anteil an AG8- und IM9-Zellen

Wie oben dargestellt, wurden Paraffinblöcke von Pseudogewebe mit definierten Anteilen (0, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100%) an jeweils AG8- bzw. IM9-Zellen hergestellt.

Paraffinschnitte wurden dann, wie in Beispiel 1 dargestellt, immungefärbt.

Alle Färbungen mit dem Negativ-Kontrollreagenz waren für alle Blöcke, wie erwartet, negativ. 0% positive Zellen.

Es wurden zwei Serien durchgeführt.

Die Ergebnisse für die MIB-1-Färbungen sind in Tabelle 1 zusammengefasst.

Sowohl die Intraobserver- (Abb. 1) wie auch die Interobserver (Abb. 2) als auch die Interassayvarianz (Abb. 3) sind gering. Darüber hinaus liegen alle erhobenen Werte innerhalb des Konfidenzintervalls

Tabelle 1

Beispiel 3 Immunfärbungen von Pseudogeweben

Es wurden auch Pseudogewebe mit je 50%igem Anteil aus den Zell- Linien Raji (human) und Ag8 (murin) oder Jurkat und Ag8 hergestellt. Die Ergebnisse von MIB-1-Färbungen von Schnitten dieser Pseudogewebe lagen in demselben Bereich wie im Beispiel 2 für die 50% Pseudogewebe von IM9 und Ag8 dargestellt. Das Pseudogewebe kann daher auch mit anderen Zell-Linien- Kombinationen zuverlässig präpariert werden.

Claims

1. Diagnostisches Kit zur Quantifizierung einer durch einen Marker gekennzeichneten Zellfraktion in der in-vitro- Diagnostik, dadurch gekennzeichnet, dass ein Pseudogewebe zur Intra- und Inter-Assay-Standardisierung des Markerindex verwendet wird.

2. Diagnostisches Kit gemäß Anspruch 1, welches des Weiteren einen Antikörper zur Detektion des Markers enthält.

3. Diagnostisches Kit gemäß Anspruch 1, worin der Nachweis des Markers enzymatisch erfolgt.

4. Diagnostisches Kit gemäß einem der Ansprüche 1 und 3, weiterhin ein Reagenz zur Detektion eines Enzyms enthaltend.

5. Diagnostisches Kit gemäß einem der Ansprüche 1 und 2 zur Quantifizierung der Fraktion an proliferierenden Zellen.

6. Diagnostisches Kit gemäß einem der Ansprüche 1, 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper gegen das Ki-67- Protein gerichtet ist.

7. Diagnostisches Kit gemäß einem der Ansprüche 1, 2, 5 und 6, dadurch gekennzeichnet, dass der Antikörper gegen das Ki-67- Protein MIB-1 ist.

8. Verfahren zur Quantifizierung einer durch einen Marker gekennzeichneten Zellfraktion in der in-vitro-Diagnostik, dadurch gekennzeichnet, dass zur Quantifizierung ein Pseudogewebe als Intra- und Inter-Assay-Standardisierung verwendet wird.

9. Verfahren gemäß Anspruch 8, umfassend die Verwendung des diagnostischen Kits gemäß einem der Ansprüche 1-7.

10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 und 9, weiterhin umfassend den Schritt der Markierung des Markermoleküls mittels eines Antikörpers.

11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 und 9, weiterhin umfassend einen Schritt zum enzymatischen Nachweis des Markers.

12. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 8 bis 11, dadurch geknenzeichnet, dass zwei oder mehr Marker und deren Markerindices verwendet und bestimmt werden.

13. Verwendung des diagnostischen Kits gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Quantifizierung eines oder mehreren Marker(s) in einer Probe.

14. Verwendung des diagnostischen Kits gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur Bestimmung des Proliferationsindex.

15. Verwendung des diagnostischen Kits gemäß einem der Ansprüche 1 bis 7 zur in-vitro-Diagnostik bei der Diagnose und Behandlung von Krebs.

16. Pseudogewebe, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen verkapselt eingebracht vorliegen und eine definierte Menge an Zellen enthält, die den zu detektierenden Marker aufweist.

17. Pseudogewebe gemäß Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellen Zellkulturzellen sind.

18. Pseudogewebe gemäß einem der Ansprüche 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, dass die im Pseudogewebe enthaltenen Zellen aus mindestens zwei verschiedenen Zellarten bestehen.

19. Pseudogewebe gemäß einem der Ansprüche 16 und 18, wobei das Material zum Einkapseln ausgewählt ist aus schneidbaren Kunststoffen, Agarose, nicht heparinisiertem Serum, Fibrinpfropfen, Kollagenen, Cellulose-, Chitin-, Chitosanderivaten oder anderen Biopolymeren.

20. Verfahren zur Herstellung des Pseudogewebes, das den folgenden Schritt umfasst:
Bestimmung der Zellzahl der Zellen, die den Marker enthalten und der Zellzahl der Zellen, die den Marker nicht enthalten.

21. Verfahren zur Herstellung des Pseudogewebes gemäß Anspruch 20, weiterhin umfassend den Schritt:
Einkapseln des Zellgemisches, welches aus einer homogenen Mischung eines definierten Anteils an Zellen, die den Marker enthalten, mit Zellen, die den Marker nicht enthalten, besteht.

22. Verwendung des Pseudogewebes als Standard zur Intra- und Inter-Assay-Validierung eines Kits.

23. Nachweissystem zur quantitativen Bestimmung eines Moleküls, enthaltend ein Pseudogewebe gemäß einem der Ansprüche 16 bis 19 und eine Nachweissubstanz zum spezifischen Nachweis des zu bestimmenden Moleküls, dadurch gekennzeichnet, dass eine Intra- und Inter-Assay-Validierung des Systems möglich ist.