DE10002595A1 - Messverfahren und Sensorvorrichtung für die chemische und pharmazeutische Analytik und Synthese - Google Patents

Abstract

Meßverfahren für die chemische oder pharmazeutische Analytik und Synthese, bei dem der Verlauf einer Reaktion anhand der Frequenzänderung eines Hochfrequenzoszillators erkannt wird und Sensorvorrichtung dafür, die eine Meßzelle 10 umfaßt, in der eine Reaktion abläuft, und wobei die Meßzelle einen Teil eines Resonators eines HF-Oszillators 1 bildet.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Meßverfahren und eine Sensorvorrichtung für die chemische oder pharmazeutische Ana­ lytik und Synthese.

In der chemischen und pharmazeutischen Industrie zeichnet sich für die Zukunft ein zunehmendes Interesse ab, For­ schungsschwerpunkte auf einem Gebiet der Bioelektronik zu setzen, auf dem eine Synergie zwischen der organischen Analy­ tik und der elektronischen Meßtechnik möglich scheint. Ein konkretes Ziel ist dabei, nicht wie bisher durch strategische Synthese nach verwertbaren Substanzen und Wirkstoffen zu su­ chen, indem man aus einer zunächst unüberschaubaren Menge an möglichen Reaktionen zwischen unterschiedlichsten Molekülen durch taktisches Vorgehen zu einer verwertbaren Substanz kommt, da dieser Weg in der Regel sehr zeitaufwendig ist. Vielmehr möchte man nach dem "trial & error"-Prinzip mög­ lichst zahlreiche Kombinationen von Molekülen auf potentielle Reaktionsmechanismen untersuchen, also in kürzester Zeit Aus­ sagen treffen können, ob Molekül A mit Molekül B reagiert hat, wie hoch die Ausbeute der Reaktion ist oder einfach nur ob eine Substanz ausschließlich aus Molekül A oder Molekül B besteht.

Es wird daher derzeit nach bioelektronischen Schnittstellen gesucht, mit denen der zeitliche Verlauf einer Reaktion über die Wirkung auf eine elektrische Größe wie etwa Stromfluß oder Spannung erfaßt werden kann.

Der klassische Weg in dieser Industriebranche war bisher die zielgerichtete Suche nach einem bestimmten Wirkstoff. Gut ausgebildete Mitarbeiter versuchen durch ihren Wissensstand Substanzen mit den gewünschten Eigenschaften über eine Auswahl potentieller Reaktionspartner zu synthetisieren und an­ schließend die Reaktionsprodukte zu analysieren.

Da ein solcher Vorgang bis zum Erfolg sehr viel Zeit in An­ spruch nimmt und damit auch nie alle Möglichkeiten abgedeckt werden können, besteht ein Interesse, zu automatisierten Ver­ fahren überzugehen. Aus diesem Hintergrund werden zum einen geeignete bioelektronische Interfacestrukturen erforscht, zu anderen befaßt man sich aber auch noch mit grundsätzlichen Fragen zu einer geeigneten Meßtechnik.

In Fig. 1 ist dazu eine Übersicht von bekannten elektroanaly­ tischen Verfahren dargestellt. Die vorgeschlagenen Methoden wenden Prinzipien der elektronischen Meßtechnik an und beru­ hen auf der Auswertung von klassischen elektronischen Größen. Dazu soll z. B. der zeitliche Verlauf einer Reaktion über die Änderung eines Stroms, der Spannung, einer Impedanz oder ei­ ner Kapazität erfaßt werden.

Grundsätzlich ist hier in jedem Fall die Empfindlichkeit des Meßsystems problematisch, d. h. die Wirkung der chemischen/­ biologischen Reaktion auf die zu messende Größe ist in der Regel sehr gering. So müssen z. B. Änderungen eines Stromflus­ ses im nA-Bereich erfaßt werden. Im engen Zusammenhang damit steht auch der begrenzte Dynamikbereich einer solchen Mes­ sung. Wollte man etwa einen Reaktionsverlauf über eine Kapa­ zitätsänderung erfassen, so kann sich diese in der Größenord­ nung der parasitären Kapazitäten einer Elektrodenanordnung bewegen. Sobald diese dominieren, ist eine bioelektronische Messung nicht mehr möglich.

Es ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein Meßver­ fahren und eine Sensorvorrichtung für die chemische oder pharmazeutische Analytik anzugeben, welches eine wesentlich höhere Empfindlichkeit aufweist. Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe dadurch gelöst, daß der Verlauf einer Reaktion anhand der Frequenzänderung eines Hochfrequenzoszillators erkannt wird.

Es ist dabei bevorzugt, daß die Reaktion in einer mit Elek­ troden versehenen Meßzelle abläuft, und diese Meßzelle als Teil des Resonators eines HF-Oszillators eingesetzt wird.

Vorzugsweise wird dabei durch die Auswertung der Schwingfre­ quenz des HF-Oszillators im zeitlichen Verlauf einer Reaktion charakteristische Information über den Ablauf dieser Reaktion gewonnen.

Vorzugsweise wird die Frequenzänderung für verschiedene be­ kannte organische Stoffe gemessen und gespeichert und durch Vergleich der Frequenzänderung bei Messung einer unbekannten Probe mit den gespeicherten Frequenzänderungen Informationen über die Identität dieser Probe gewonnen.

Es ist dabei besonders bevorzugt, die Frequenzänderung bei der gleichen Reaktion bzw. bei der gleichen Probe ausgehend von verschiedenen Grundfrequenzen (f₀) zu bestimmen, da auf diese Weise mit nur geringfügig größerem Aufwand erheblich mehr Information über die Reaktion bzw. die Probe gewonnen werden kann.

Es ist dabei besonders bevorzugt, über einen Kontrollpfad ein Teil des Oszillatorsignals zur Bestimmung der Schwingfrequenz zu verwenden. Besonders bevorzugt ist es, das Hochfrequenzsi­ gnal mittels einer Mischerschaltung in eine tiefere Frequenz­ lage umzusetzen, um die Weiterverarbeitung des Signals zu vereinfachen.

Die Frequenz kann dann beispielsweise mittels eines Frequenz- Spannungs-Umsetzers oder Frequenzzählers bestimmt werden.

Ebenso kann die Frequenz mittels Spektraltransformation be­ stimmt werden.

Die Spektraltransformation kann dabei vorzugsweise mittels eines digitalen Signalprozessors oder Mikroprozessors erfol­ gen.

Insbesondere für gentechnische Anwendungen ist ein Meßverfah­ ren bevorzugt, bei dem an einer inneren Oberfläche der Meß­ zelle einige Basen lange identische DNA- oder RNA-Einzel­ stränge angebracht werden, so daß sich die Impedanz und damit die Resonanz der Meßzelle ändert, wenn in der in die Meßzelle eingebrachten Probe DNA oder RNA mit einem passenden Einzel­ strangende vorhanden ist, da dieses dann an die Einzelstränge hybridisiert.

Der Abstand der Elektroden sollte kleiner 1 µm, vorzugsweise in der Größenordnung von 0,2 µm gewählt werden.

Es ist dabei besonders bevorzugt, daß alle Hochfrequenzkompo­ nenten für die Einzelzellen auf einem integrierten Schalt­ kreis angeordnet werden. Auf diese Weise läßt sich eine opti­ male Miniaturisierung erzielen.

Entsprechende integrierte Schaltkreise können vorzugsweise in CMOS-Technologie gefertigt werden.

Die erfindungsgemäße Aufgabe wird ebenso durch eine Sensor­ vorrichtung für die chemische oder pharmazeutische Analytik gelöst, bei der eine Meßzelle vorgesehen ist, in der eine Re­ aktion abläuft, und die Meßzelle einen Teil eines Resonators eines HF-Oszillators bildet.

Es ist dabei besonders bevorzugt, daß der HF-Oszillator auf verschiedene Grundfrequenzen einstellbar ist. Dadurch läßt sich bei der Messung wesentlich mehr Information gewinnen.

Vorzugsweise ist ein Kontrollpfad an den HF-Oszillator ange­ schlossen, der mit einer Mischerschaltung verbunden ist. Auf diese Weise kann die Frequenz des weiter zu verarbeitenden Signals in einen Frequenzbereich herabgesetzt werden, der im wesentlichen leichter zu verarbeiten ist.

An die Mischerschaltung ist vorzugsweise ein Frequenz- Spannungs-Umsetzer, ein Frequenzzähler oder eine Vorrichtung zur Spektraltransformation angeschlossen.

Als Vorrichtung zur Spektraltransformation kann beispielswei­ se ein digitaler Signalprozessor oder ein Mikroprozessor die­ nen.

Die erfindungsgemäße Vorrichtung kann vorzugsweise eine Viel­ zahl von Meßzellen umfassen, die mikroelektronisch auf einem Chip integriert sind. Auf diese Weise lassen sich eine Viel­ zahl von Proben gleichzeitig messen oder eine Vielzahl von Messungen gleichzeitig durchführten. Vorzugsweise wird der Chip in CMOS-Technologie ausgeführt, da analoge Hochfrequenz­ schaltungen für diese Anwendung in dieser Technologie leicht realisiert werden können.

Zur Anwendung in der Gentechnik ist es besonders bevorzugt, daß an einer inneren Oberfläche der Meßzelle einige Basen lange identische DNA- oder RNA-Einzelstränge angebracht sind, so daß sich die Impedanz und damit die Resonanz der Meßzelle ändert, wenn in der in die Meßzelle eingebrachten Probe DNA oder RNA mit einem passenden Einzelstrangende vorhanden ist.

Der Abstand der Elektroden liegt vorzugsweise unter 1 µm, bes­ ser noch in der Größenordnung von 0,2 µm.

Die an die Thematik geknüpften Rahmenbedingungen lassen gro­ ßes Anwendungspotential für eine mikroelektronische Lösung vermuten: Um eine automatisierte Analytik im großtechnischen Stil und in kürzester Zeit durchführen zu können, lehrt die Erfindung eine Vielzahl von Meßzellen incl. den entsprechen­ den elektronischen Schaltungen mikroelektronisch auf Silizium zu integrieren. Eine solche Meßzelle besteht im wesentlichen aus einem Behälter, der mit organischen Testsubstanzen ge­ füllt werden kann. In diesem Behälter ist eine geeignete Elektrodenstruktur als bioelektronische Schnittstelle ange­ ordnet. Die Ausführung der integrierten elektronischen Schal­ tungen ist abhängig von dem gewählten meßtechnischen Verfah­ ren.

Die vorliegende Erfindung soll im folgenden anhand des mit Hilfe der Zeichnungen erläuterten Ausführungsbeispiels der Erfindung dargestellt werden. Es zeigt:

Fig. 1 eine Übersicht über die elektroanalytischen Verfahren gemäß dem Stand der Technik;

Fig. 2 verschiedene Ausführungsformen der erfindungsgemäßen Sensorvorrichtung;

Fig. 3 ein Ersatzschaltbild für die Elektrodenstruktur;

Fig. 4 das Meßsignal im Verlauf einer Molekülreaktion;

Fig. 5 den Verlauf des Meßsignals für verschiedene Moleküle;

Fig. 6 den Aufbau einer erfindungsgemäßen mikroelektronisch integrierten Meßzelle;

Fig. 7 ein erfindungsgemäßes Verfahren zur elektronischen Erkennung einer Hybridisierung;

Fig. 8 ein impedanzspektroskopisches Verfahren zur Erkennung der Hybridisierung, gezeigt ist die Sensorvorrichtung vor der Hybridisierung; und

Fig. 9 zeigt die Vorrichtung der Fig. 8 nach der Hybridi­ sierung.

Als erfindungsgemäße Möglichkeit, einen biochemischen Vorgang zu analysieren, soll die Verschiebung einer Frequenz über den zeitlichen Verlauf des Vorgangs ausgewertet werden.

Mit Hilfe von Fig. 2 soll das Funktionsprinzip erklärt wer­ den:

Ein Hochfrequenzoszillator 1 schwingt auf einer bekannten Frequenz f₀. Seine Schwingfrequenz wird in jedem Fall festge­ legt durch ein frequenzbestimmendes Element (Resonator), das in der üblichen diskreten Schaltungstechnik als LC- oder RC- Typ ausgelegt ist.

Die Anordnung einer biochemischen Meßzelle 10 läßt sich nun durch ein elektronisches Ersatzschaltbild (ESB) beschreiben, wie es in einer einfachen Form in Fig. 3 exemplarisch gezeigt ist. Die Topologie und Dimensionierung der diskreten Elemente eines solchen ESB ist sicherlich abhängig von der gewählten Elektrodenstruktur (z. B. Interdigitalelektrode, MOS-Tran­ sistor) und vom Analyten, der untersucht werden soll. Dabei sind bestimmte Schaltungselemente in ihrer Größe festgelegt, da sie durch den geometrischen Aufbau der Meßzelle 10 gegeben sind. Andere werden ihre Werte im Verlauf einer biochemischen Reaktion des Analyten ändern.

Anstelle der direkten Auswertung sich ändernder Größen wie R und C kann die Meßzelle 10 an den Elektrodenanschlüssen 12, 14 vorzugsweise als Teil des Resonators eines HF-Oszillators 1 eingesetzt werden. Ändern sich während einer Reaktion be­ stimmte ESB-Elemente, führt dies zu einer Verschiebung der Schwingfrequenz des Oszillators 1. Bereits sehr kleine Ände­ rungen können dabei relativ große Frequenzverstimmungen be­ wirken. Durch die Auswertung der Schwingfrequenz im zeitli­ chen Verlauf einer Reaktion können nun charakteristische In­ formationen über einen Reaktionsablauf gewonnen werden.

Ein denkbares Meßszenario ist in Fig. 4 gezeigt. Hier wird angenommen, es befinden sich zwei Reaktanten (Molekül A und Molekül B) in einer Meßzelle 10.

Zum Zeitpunkt t = 0 hat noch keine Reaktion stattgefunden, der HF-Oszillator 1 schwingt auf einer Frequenz f₀. Im Verlauf der Reaktion verschiebt sich die Resonanz der Meßzelle 10 und damit die Oszillatorfrequenz zu f₁, bis schließlich ein ge­ sättigter Zustand eintritt. Über die Höhe der Frequenzver­ schiebung sind nun Aussagen über die Ausbeute der Reaktion möglich bzw. ob überhaupt eine Reaktion stattgefunden hat. Wenn sich nämlich überhaupt keine Frequenzänderung ergibt, ist festzustellen, daß keine Reaktion stattgefunden hat.

Ferner ist es möglich, falls die Oszillatorresonanzfrequenzen für verschiedene organische Substanzen bekannt sind, einzelne unbekannte Proben innerhalb eines Meßzyklus zu identifizie­ ren.

Durch Anwendung der Hochfrequenzmeßtechnik können Pegelunter­ schiede über mehrere Dekaden erfaßt werden. Ein entsprechend hoher Dynamikbereich ist zu erwarten. Die Qualität einer sol­ chen Messung ist im wesentlichen durch die erreichbare Güte des Resonators begrenzt, die durch den Aufbau der Meßzelle 10 und den Analyten mitbestimmt wird.

Die Dauer einer biochemischen Reaktion ist in den meisten Fällen um Größenordnungen höher als die benötigte Zeit für einen Meßzyklus (letzterer liegt im ms-Bereich). Es bietet sich somit an, eine Vielzahl von Messungen an verschiedenen Proben parallel durchzuführen.

Erfindungsgemäß wird zur Anwendung in der Biosensorik, z. B. der chemischen oder pharmazeutischen Analytik, ein Meßprinzip vorgeschlagen, das in diesem Zusammenhang neu ist. Das Ver­ fahren beruht auf der Auswertung der Frequenzänderung eines Hochfrequenzoszillators 1 abhängig vom Verlauf einer (biochemischen) Reaktion und ist für eine mikroelektronische Reali­ sierung gut geeignet. Diese Art der Meßtechnik läßt gegenüber den bekannten Verfahren bessere Resultate bezüglich Empfind­ lichkeit und Dynamikbereich erwarten.

Das erfindungsgemäße Meßverfahren kann zunächst unabhängig von der Wahl einer bestimmten Technologie als mikroelektro­ nisch integrierte Lösung umgesetzt werden.

Die Forderung nach hoher Integrationsdichte bei niedrigen Ko­ sten und die Tatsache, daß analoge Hochfrequenzschaltungen "on chip" untergebracht sind, bedeutet geringen Aufwand und leichte Handhabung der Meßtechnik. Benötigt werden ein Fest­ frequenzoszillator 1, dessen Schwingfrequenz durch die elek­ trischen Eigenschaften einer Biosensorelektrode 2 mitbestimmt wird. Über einen Kontrollpfad wird ein Teil des Oszillatorsi­ gnals zur Bestimmung der Schwingfrequenz verwendet. Um eine einfache Auswertung zu ermöglichen, wird mit einer Mischer­ schaltung 3 das Hochfrequenzsignal in eine tiefere Frequenz­ lage umgesetzt. Die Frequenz kann an dieser Stelle mit einem Frequenz-Spannungs-Umsetzer, Frequenzzähler oder über Spek­ traltransformation (DSP, Mikroprozessor) bestimmt werden, ab­ hängig davon, wie genau bzw. wie intelligent ein solches Meß­ system arbeiten soll.

Es ist denkbar, eine Vielzahl solcher Einzelheiten mikroelek­ tronisch zu integrieren, um Messungen im großtechnischen Stil durchführen zu können.

Claims (23)

1. Meßverfahren für die chemische oder pharmazeutische Analy­ tik und Synthese, dadurch gekennzeichnet, daß der Verlauf einer Reaktion anhand der Frequenzänderung eines Hochfrequenzoszillators erkannt wird.

2. Meßverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Reaktion in einer mit Elektroden versehenen Meßzelle abläuft, und diese Meßzelle als Teil des Resonators eines HF-Oszillators eingesetzt wird.

3. Meßverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch ge­ kennzeichnet, daß durch die Auswertung der Schwingfrequenz des HF-Oszillators im zeitlichen Verlauf ei­ ner Reaktion charakteristische Informationen über den Ablauf dieser Reakion gewonnen werden.

4. Meßverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, da­ durch gekennzeichnet, daß die Frequenzände­ rungen für verschiedene bekannte organische Stoffe gemessen und gespeichert werden, und durch Vergleich der Frequenzände­ rung bei Messung einer unbekannten Probe mit den gespeicher­ ten Frequenzänderungen Informationen über die Identität die­ ser Probe gewonnen werden.

5. Meßverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, da­ durch gekennzeichnet, daß die Frequenzände­ rung bei der gleichen Reaktion bzw. bei der gleichen Probe ausgehend von verschiedenen Grundfrequenzen (f₀) bestimmt wird.

6. Meßverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, da­ durch gekennzeichnet, daß über einen Kon­ trollpfad ein Teil des Oszillatorsignals zur Bestimmung der Schwingfrequenz verwendet wird.

7. Meßverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekenn­ zeichnet, daß das Hochfrequenzsignal mittels einer Mi­ scherschaltung (3) in eine tiefere Frequenzlage umgesetzt wird.

8. Meßverfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Frequenz mittels eines Fre­ quenz-Spannungs-Umsetzers oder Frequenzzählers bestimmt wird.

9. Meßverfahren nach Anspruch 6 oder 7, dadurch ge­ kennzeichnet, daß die Frequenz mittels Spektral­ transformation bestimmt wird.

10. Meßverfahren nach Anspruch 9, dadurch gekenn­ zeichnet, daß die Spektraltransformation mittels eines digitalen Signalprozessors (DSP) oder Mikroprozessors er­ folgt.

11. Meßverfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, da­ durch gekennzeichnet, daß an einer inneren Oberfläche der Meßzelle einige Basen lange identische DNA- oder RNA-Einzelstränge angebracht werden, so daß sich die Im­ pedanz und damit die Resonanz der Meßzelle ändert, wenn in der in die Meßzelle eingebrachten Probe DNA oder RNA mit ei­ nem passenden Einzelstrangende vorhanden ist, da dieses dann an die Einzelstränge hybridisiert.

12. Meßverfahren nach Anspruch 11, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der Abstand der Elektroden klei­ ner 1 µm, vorzugsweise in der Größenordnung von 0,2 µm gewählt wird.

13. Meßverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 12, da­ durch gekennzeichnet, daß alle Hochfre­ quenzkomponenten für die Einzelzellen auf einem integrierten Schaltkreis angeordnet werden.

14. Meßverfahren nach Anspruch 13, dadurch ge­ kennzeichnet, daß der integrierte Schaltkreis in CMOS-Technologie gefertigt wird.

15. Sensorvorrichtung für die chemische oder pharmazeutische Analytik und Synthese, dadurch gekennzeich­ net, daß sie eine Meßzelle (10) umfaßt, in der eine Reakti­ on abläuft, und die Meßzelle (10) einen Teil eines Resonators eines HF-Oszillators (1) bildet.

16. Vorrichtung nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß der HF-Oszillator (1) auf verschiedene Grundfrequenzen (f₀) einstellbar ist.

17. Vorrichtung nach Anspruch 15 oder 16, dadurch gekennzeichnet, daß ein Kontrollpfad an den HF- Oszillator (1) angeschlossen ist, der mit einer Mischerschal­ tung (3) verbunden ist.

18. Vorrichtung nach Anspruch 17, dadurch gekenn­ zeichnet, daß an die Mischerschaltung (3) ein Fre­ quenz-Spannungs-Umsetzer, ein Frequenzzähler oder eine Vor­ richtung zur Spektraltransformation angeschlossen ist.

19. Vorrichtung nach Anspruch 18, dadurch gekenn­ zeichnet, daß als Vorrichtung zur Spektraltransforma­ tion ein digitaler Signalprozessor oder ein Mikroprozessor dient.

20. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 19, da­ durch gekennzeichnet, daß sie eine Vielzahl von Meßzellen (10) umfaßt, die mikroelektronisch auf einem Chip integriert sind.

21. Vorrichtung nach Anspruch 20, dadurch gekenn­ zeichnet, daß sie in CMOS-Technologie ausgeführt ist.

22. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 21, da­ durch gekennzeichnet, daß an einer inneren Oberfläche der Meßzelle (10) einige Basen lange identische DNA- oder RNA-Einzelstränge angebracht sind, so daß sich die Impedanz und damit die Resonanz der Meßzelle (10) ändert, wenn in der in die Meßzelle eingebrachten Probe DNA oder RNA mit einem passenden Einzelstrangende vorhanden ist.

23. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 15 bis 22, da­ durch gekennzeichnet, daß der Abstand der Elektroden kleiner 1 µm ist, vorzugsweise in der Größenord­ nung von 0,2 µm liegt.