DE1094927B

DE1094927B - Process for the production of cobalamines

Info

Publication number: DE1094927B
Application number: DEC16973A
Authority: DE
Inventors: Dr Abraham Louis Baron; Dr Emil Maxion
Original assignee: Chase Chemical Co LP
Current assignee: Chase Chemical Co LP
Priority date: 1958-06-09
Filing date: 1958-06-09
Publication date: 1960-12-15

Description

Verfahren zur Gewinnung von Cobalaminen Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung von Cobalaminen aus wäßrigen Lösungen, z. B. aus Gärungsprodukten, Konzentraten, welche diese Stoffe enthalten. Die Cobalamine sind Vitamin B12 und Vitamin-I3 12-artige Stoffe, die im wesentlichen die gleichen chemischen und biologischen Eigenschaften wie Vitamin B12 besitzen.Method for Obtaining Cobalamins The invention relates to a Process for the recovery of cobalamines from aqueous solutions, e.g. B. from fermentation products, Concentrates containing these substances. The cobalamins are vitamin B12 and Vitamin I3 12-like substances that are essentially the same chemical and biological Have properties like vitamin B12.

Obwohl die Cobalamine sich in vielen Pflanzen und tierischen Organen, insbesondere in der Tierleber, finden und häufig in roher Form, z. B. in der Form von Leberextrakt, verwendet werden, bildet die Hauptquelle für diese Stoffe doch die Vergärung oder die biologische Aktivität bestimmter Mikroorganismen. Die Extraktion und Reinigung von Vitamin Bt2 und Vitamin-B,2-artigen Stoffen, ausgehend von der Primärquelle in vergorenen Flüssigkeiten, bietet außerordentliche Schwierigkeiten, und zwar wegen der Vielzahl der erforderlichen Verfahrensgänge und der außergewöhnlich geringen Ausbeuten, welche man in der Regel erzielt. Die technische Literatur gibt z. 13. eine Aubeute von nicht mehr als 1 bis 2 Fg/ccm vergorener Flüssigkeit an, d. h. eine Konzentration von 0,0001 bis 0,0002 °/o. Nach bekannten Verfahren können diese Spuren des Produkts durch Absorptionsmittel, z. B. Fullererde, Bentonit, aktivierte Tonerde, aktivierte Holzkohle, Montmorillonit u. dgl., oder durch Lösungsmittel, wie Phenol, Kresol, Benzylalkohol, Salicylsäure, p-Oxybenzoesäure, extrahiert bzw. ausgefällt werden. Alle bisher bekannten und zur Durchführung gelangten Methoden besaßen jedoch einen oder mehrere schwerwiegende Nachteile, z. B. große zu behandelnde Volumina, ungenügende Wirksamkeit, hohe Verluste und sich daraus ergebende hohe Verfahrenskosten sowie Gefahren und Unbequemlichkeiten für das Personal. Es fehlt daher zur Zeit an einem verhältnismäßig einfachen und wirksamen Verfahren zur Gewinnung von Vitamin B12 und Vitamin-Bt2-artigen Stoffen. Although the cobalamins are found in many plants and animal organs, especially in animal liver, and often in raw form, e.g. B. in the form liver extract, is the main source of these substances the fermentation or biological activity of certain microorganisms. The extraction and purification of vitamin Bt2 and vitamin B, 2-like substances, starting from the Primary source in fermented liquids, presents extraordinary difficulties because of the large number of procedures required and the extraordinary low yields, which are usually achieved. The technical literature there z. 13. a yield of no more than 1 to 2 μg / cc of fermented liquid, d. H. a concentration of from 0.0001 to 0.0002%. According to known methods can these traces of the product by absorbents, e.g. B. Fuller's earth, bentonite, activated Clay, activated charcoal, montmorillonite and the like, or with solvents, such as phenol, cresol, benzyl alcohol, salicylic acid, p-oxybenzoic acid, extracted or be precipitated. All previously known and implemented methods however, had one or more serious disadvantages, e.g. B. great to be treated Volumes, insufficient effectiveness, high losses and the resulting high Procedural costs as well as dangers and inconveniences for the personnel. Something is missing therefore currently working on a relatively simple and effective method of extraction of vitamin B12 and vitamin Bt2-like substances.

Gemäß der Erfindung gewinnt man nun die Cobalamine aus ihren wäßrigen Lösungen in überraschend hoher Aubeute und in wirtschaftlicher Weise, indem man zu ihrer Ausfällung Methylendisalicylsäure, Oxynaphthalincarbcnsäure oder Methylen-bis-oxynaphthalincarbonsäure oder ein durch Alkylgruppen, Phenilgruppen, Halogen oder Nitrogruppen kernsubstituiertes Derivat einer Oxybenzoesäure oder einer der genannten Säuren verwendet und gegebenenfalls das abgetrennte Additionsprodukt zerlegt. Einige der substituierten Oxybenzoesäure- und Oxynaphthalincarbonsäurederivate sind wirksamer als die anderen, einige arbeiten bei verschiedenen pH-Werten am besten, und wieder andere erfordern besondere Bedingungen, die sich jedoch für den Fachmann von selbst ergeben. According to the invention, the cobalamins are now obtained from their aqueous ones Solutions in a surprisingly high yield and in an economical manner by for their precipitation methylenedisalicylic acid, oxynaphthalenecarboxylic acid or methylene-bis-oxynaphthalenecarboxylic acid or one ring-substituted by alkyl groups, phenil groups, halogen or nitro groups Derivative of an oxybenzoic acid or one of the acids mentioned used and optionally decomposed the separated addition product. Some of the substituted oxybenzoic acid and oxynaphthoic acid derivatives are more effective than the others, some work best at different pH values, and still others require special conditions, which, however, arise by themselves for the person skilled in the art.

Einige sind verhältnismäßig billig, und wieder andere sind manchmal in den für einen technischen Betrieb erforderlichen Mengen nicht erhältlich. Die jeweils verwendete Verbindung wird daher zweckmäßig nach wirtschaftlichen Gesichtspunkten ausgewählt. Im Augenblick dürfte Methylendisalicylsäure am wirtschaftlichsten und praktischsten sein. Die mit den genannten Säuren erzielten Ausbeuten liegen zwischen 90 und 100°/o. Es ist erstaunlich, daß man z. B. mit der erfindungsgemäß kernsubstituierten 5-Nitrosalycylsäure gegenüber den nichtsubstituierten Oxybenzoesäuren, wie Salicylsäure und p-Oxybenzoesäure, um über 1000/o höhere Ausbeuten erzielt. Es muß dies auf der durch den Kernsubstituierten gegebenen, besonderen Molekülstruktur der erfindungsgemäß verwendeten Säure beruhen.Some are relatively cheap and some are relatively cheap are sometimes not available in the quantities required for technical operation. the the compound used in each case is therefore expedient from an economic point of view selected. Right now, methylenedisalicylic acid is believed to be the most economical and be most practical. The yields achieved with the acids mentioned are between 90 and 100 ° / o. It is astonishing that z. B. with the core-substituted according to the invention 5-nitrosalycylic acid versus the unsubstituted oxybenzoic acids, such as salicylic acid and p-oxybenzoic acid, obtained over 1000 / o higher yields. It must do this on the given by the core-substituted, special molecular structure of the invention acid used.

Die Additionsprodukte von Vitamin B12 und Vitamin-B,2-artigen Stoffen mit den erfindungsgemäß zu verwendenden Säuren fallen aus wäßriger Lösung bei einem sauren p-Wert aus und lösen sich bei einem alkalischen p-Wert wieder auf. Durch Verwendung von Aceton oder anderen geeigneten Lösungsmitteln, in welchen Vitamin Bl2 und Vitamin-Bl2-artige Stoffe unlöslich sind, kann der Überschuß der verwendeten Säure aufgelöst und abgetrennt werden. Nach Behandlung mit Aceton oder einem anderen geeigneten Lösungsmittel verbleibt eine kleine Menge der Säure in festerer Verbindung mit Vitamin Bt2 und Vitamin-B12-artigen Stoffen. Eine vollständigere Abtrennung erfordert ein Auswaschen mit Wasser, zweckmäßig mit heißem Wasser, und zwar vorzugsweise, jedoch nicht unbedingt, bei einem sauren pn-Wert. Durch gründliche Extraktion mit Wasser, vorzugsweise mit heißem Wasser, bei einem sauren pH-Wert werden Vitamin B12 und Vitamin-B12-artige Stoffe leicht abgetrennt. Die Trennung kann auch durch Extraktion mit Lösungsmitteln, wie Benzylalkohol, Phenolen, Kresol, chlorierten Phenolen u. dgl., in welchen Vitamin B12 und Vitamin-Bl2-artige Stoffe löslich sind, erfolgen. Die so aus dem Additionsprodukt abgespaltenen Cobalamine fallen in ziemlich reiner Form an, was anzeigt, daß die Säuren bei der Ausfällung und bei der Bildung eines Additionsprodukts eine reinigende und selektive Wirkung ausüben. Die Menge der verwendeten Fällungssäure beträgt bei Methylendisalicylsäure zwischen 0,01 und 10 0/0 und für andere Verbindungen unter Berücksichtigung des Molekulargewichts umgerechnete, entsprechende Mengen. The addition products of vitamin B12 and vitamin B, 2-like substances with the acids to be used according to the invention fall from aqueous solution in one acidic p-value and dissolve again at an alkaline p-value. By Use of acetone or other suitable solvents in which vitamin Bl2 and vitamin Bl2-like substances are insoluble, the excess of the used Acid are dissolved and separated. After treatment with acetone or another A small amount of the acid remains in a more solid bond with a suitable solvent with vitamin Bt2 and vitamin B12-like substances. A more complete separation requires washing with water, expediently with hot water, and preferably, but not necessarily with an acidic pn value. Thorough extraction with Water, preferably with hot water, should be at an acidic pH vitamin Easily separated B12 and vitamin B12-like substances. The separation can also be through Extraction with solvents such as benzyl alcohol, phenols, cresol, chlorinated Phenols and the like, in which vitamin B12 and vitamin B12-like substances are soluble, take place. The cobalamins split off from the addition product in this way are fairly common pure form, indicating that the acids are in the process of precipitation and formation of an addition product exert a cleaning and selective effect. The amount the precipitating acid used is between 0.01 and methylenedisalicylic acid 10 0/0 and for other compounds taking into account the molecular weight converted, corresponding quantities.

Die Erfindung wird so durchgeführt, daß man Methylendisalicylsäure oder eine andere der angegebenen Säuren in der das Vitamin B12 und die Vitamin-BI2-artigen Stoffe enthaltenden wäßrigen Flüssigkeit bei einem p-Wert zwischen etwa 4,0 und 10,0 und vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7,0 löst, die erhaltene Lösung dann bis zu einem pH-Wert von etwa 1,0 bis 4,0, vorzugsweise 2,0, ansäuert, worauf sich ein das gesamte Vitamin Bt2 und die Vitamin-BX2-artigen Stoffe enthaltender Niederschlag bildet, welcher leicht aus der Flüssigkeit durch Filtration, Zentrifugierung u. dgl. abgetrennt werden kann. The invention is carried out by using methylenedisalicylic acid or another of the specified acids in which the vitamin B12 and the vitamin BI2-like Aqueous liquid containing substances at a p-value between approximately 4.0 and 10.0 and preferably at a pH of 7.0, the resulting solution then dissolves acidified to a pH of about 1.0 to 4.0, preferably 2.0, whereupon a precipitate containing all of the vitamin Bt2 and vitamin BX2-like substances forms, which can easily be extracted from the liquid by filtration, centrifugation and the like. Like. Can be separated.

Die Ansäuerung erfolgt zweckmäßig mit einer Mineralsäure. Salzsäure ist bevorzugt, jedoch kann auch jede andere Säure verwendet werden. Der gebildete Niederschlag ist eine Kombination der Cobalamine mit dem substituierten Oxybenzoesäure-oder Oxynaphthalincarhonsäurederivat und kann in Form dieses Additionsprodukts isoliert und getrocknet werden. Der Säureanteil kann leicht durch Lösen in einem Lösungsmittel, z.B. Aceton, in welchem die Cobalamine sowie deren Additionsprodukte unlöslich sind, entfernt werden. Auf diese Weise kann man konzentrierte oder verhältnismäßig starke, genügend reine Vitamin-Bl2-artige Stoffe bzw. Vitamin Bl2 selbst mit hoher biologischer Wirksamkeit ohne die den bisherigen Methoden anhaftenden Nachteile auf äußerst wirtschaftliche, einfache und wirksame Weise erhalten.The acidification is expediently carried out with a mineral acid. hydrochloric acid is preferred, but any other acid can be used. The educated Precipitation is a combination of the cobalamine with the substituted or oxybenzoic acid Oxynaphthalincarhonsäurederivat and can be isolated in the form of this addition product and dried. The acid content can easily be determined by dissolving it in a solvent, e.g. acetone, in which the cobalamins and their addition products are insoluble, removed. In this way one can be concentrated or relatively strong, enough pure vitamin Bl2-like substances or vitamin Bl2 itself with a high biological level Effectiveness without the disadvantages inherent in the previous methods on extremely economic, easy and effective way to get it.

Wie vorstehend angezeigt, ist Methylendisalicylsäure die bevorzugte Fällungssäure, da sie billig, leicht zugänglich, unschädlich und ungiftig und äußerst wirksam ist. Der nach dem Ansäuern gebildete Niederschlag ist leicht aus der wäßrigen Flüssigkeit abzutrennen und kann getrocknet und den Haustieren in die Nahrung gemischt werden. As indicated above, methylenedisalicylic acid is preferred Precipitating acid because it is cheap, easily accessible, harmless and non-toxic and extremely is effective. The precipitate formed after acidification is easily removed from the aqueous Separate liquid and can be dried and mixed into the pet's food will.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert: Beispiel 1 Eine wäßrige Lösung mit einem pn-Wert von 7,0, die 1,0 mg Vitamin B12 in einer Konzentration von 10 Fglccm enthielt, wurde mit 200 mg Methylendisalicylsäure, die in verdünnter Natronlauge gelöst war, versetzt, und die Mischung wurde gerührt. Man gab dann unter andauerndem Rühren verdünnte Salzsäure bis zur Erzielung eines p-Wertes von 2,0 zu. Dabei bildete sich ein dunkelroter Niederschlag. Die trübe Lösung wurde dann in ein Reagenzglas übertragen und zentrifugiert. Man dekantierte die überstehende farblose, klare Flüssigkeit ab und verwarf sie. Der dunkel rote Niederschlag war im Wasser unlöslich. Bei Zugabe von einem Überschuß an Aceton löste sich die Hauptmenge des Niederschlags auf, die Acetonlösung blieb jedoch farblos, und auf dem Boden des Reagenzglases verblieben stark dunkel rote Flecken. Nach Abdekantieren und Verwerfen der Acetonlösung und Zugabe von Wasser zu dem Reagenzglas lösten sich die roten Flecken sofort zu einer für Vitamin B12 charakteristischen roten Lösung auf. The invention is illustrated in more detail by the following examples: Example 1 An aqueous solution with a pn value of 7.0 containing 1.0 mg of vitamin B12 contained in a concentration of 10 Fglccm, was with 200 mg methylenedisalicylic acid, which was dissolved in dilute sodium hydroxide solution was added, and the mixture was stirred. Dilute hydrochloric acid was then added with constant stirring until one was obtained p-value of 2.0 too. A dark red precipitate formed. The cloudy Solution was then transferred to a test tube and centrifuged. One decanted the excess colorless, clear liquid and discarded it. The dark red one Precipitate was insoluble in water. Dissolved when an excess of acetone was added the bulk of the precipitate was retained, but the acetone solution remained colorless, and strong dark red spots remained on the bottom of the test tube. To Decant and discarding the acetone solution and adding water to the test tube dissolved the red spots immediately turn into a red solution characteristic of vitamin B12 on.

Beispiel 2 Zu einer 2,0 mg Vitamin B12 in einer Konzentration von 10 Ftg/cem enthaltenden wäßrigen Lösung mit einem p-Wert von 7,0 gab man 20 mg Methylendisalicylsäure zu, die in verdünnter Natronlauge gelöst war, und rührte die Mischung durch. Dann gab man unter andauerndem Rühren verdünnte Salzsäure bis zur Erzielung eines pn-Wertes von 2,0 zu. Der Niederschlag wurde in Äthylalkohol gelöst, und man beobachtete das Absorptionsspektrum im Beckman-Spectrophotometer, wobei man eine Lösung von 20 mg Methylendisalicylsäure in 200 ccm Äthylalkohol als Blindprobe verwendete. Bei 361, 430 und 546 mm beobachtete man Absorptionsmaxima. Die Identität von Vitamin B12 wurde unverändert durch die Ausfällung durch die folgende Berechnung festgestellt: A361 = 0.275 A550 0,080 (erlaubt für Identität mit Vitamin R,,; 3,0 bis 3,5), A550 0,080 = = 2,5 A430 0,032 (erlaubt fiir Identität mit Vitamin B12; 2,5 bis 2,9). Example 2 To a 2.0 mg vitamin B12 in a concentration of Aqueous solution containing 10 μg / cem and having a p-value of 7.0 was given 20 mg of methylenedisalicylic acid to, which was dissolved in dilute sodium hydroxide solution, and stirred the mixture through. then dilute hydrochloric acid was added with constant stirring until a pn value was achieved from 2.0 to. The precipitate was dissolved in ethyl alcohol and this was observed Absorption spectrum in the Beckman spectrophotometer, using a solution of 20 mg Methylenedisalicylic acid in 200 cc of ethyl alcohol was used as a blank. At 361, Absorption maxima were observed at 430 and 546 mm. The identity of vitamin B12 was determined unchanged by the precipitation by the following calculation: A361 = 0.275 A550 0.080 (allowed for identity with vitamin R ,,; 3.0 to 3.5), A550 0.080 = = 2.5 A430 0.032 (allowed for identity with vitamin B12; 2.5 to 2.9).

Verwendet man die Zusammensetzung von U. S. P. Using the composition of U. S. P.

XIV, S. 661, berechnet sich die Konzentration an Vitamin B12 zu 11,7 Fg/ccm, was 1011g/ccm, bezogen auf die auf dem Etikett angegebene Konzentration, entspricht und anzeigt, daß durch die Ausfällung kein merklicher Verlust bzw. keine merkliche Inaktivierung eingetreten ist.XIV, p. 661, the concentration of vitamin B12 is calculated to be 11.7 Fg / ccm, which is 1011g / ccm, based on the concentration stated on the label, corresponds and indicates that no noticeable loss or none due to the precipitation noticeable inactivation has occurred.

Beispiel 3 Einem aus Gärungsfiüssigkeiten erhaltenem, rohem, wäßrigem Konzentrat mit einem pn-Wert von 7,0, das 152 pg Vitamin B12 pro ccm enthielt, gab man 0.1 0/o Methylendisalicylsäure zu und rührte die Mischung kräftig durch. Dann gab man unter andauerndem Rühren bis zur Erzielung eines pH-Wertes von 2,0 konzentrierte Salzsäure zu. Der Niederschlag wurde abgetrennt und getrocknet, wobei man ein braunrosa Pulver mit Vitamin-Bl2-Wirksamkeit von 6,2 pg/mg erhielt, bestimmt durch einen mikrobiologischen Versuch. Example 3 A raw, aqueous solution obtained from fermentation liquids Concentrate with a pn value of 7.0 and containing 152 pg vitamin B12 per cc gave 0.1 0 / o methylenedisalicylic acid was added and the mixture was stirred vigorously. then was added with constant stirring until a pH of 2.0 was reached Hydrochloric acid too. The precipitate was separated and dried, turning a brownish pink Powder obtained with vitamin Bl2 effectiveness of 6.2 pg / mg, determined by a microbiological Attempt.

Beispiel 4 2 1 zentrifugierte Gärungsflüssigkeit mit einem p,-Wert von 7-0, welche eine Vitamin-Bl2-Wirksamkeit von 1,201lg/cem zeigte, wurden mit 2 g Methylendisalicylsäure versetzt. Man gab unter Rühren bis zur Erzielung eines p-Wertes von 2,0 konzentrierte Salzsäure zu. Der Niederschlag wurde abgetrennt, und die klare überstehende Flüssigkeit ergab eine Vitamin-Bl2-Wirksamkeit entsprechend 0,07 µg/ccm. Example 4 2 1 centrifuged fermentation liquid with a p 1 value of 7-0, which showed a vitamin Bl2 activity of 1.201 lg / cem, were with 2 g of methylenedisalicylic acid are added. It was added with stirring until one was obtained p-value of 2.0 concentrated hydrochloric acid. The precipitate was separated off, and the clear supernatant fluid showed a vitamin B1 activity accordingly 0.07 µg / cc.

Beispiel 5 2 1 flltrierte Gärungsflüssigkeit mit einem pE-Wert von 7,0 und mit einer Vitamin-Bl2-Wirksamkeit von 2,8Ccg/ccm wurden mit 2g Methylendisalicylsäure versetzt. Man gab unter Rühren bis zur Erzielung eines p11-Wertes von 2,0 konzentrierte Salzsäure zu. Example 5 2 1 filtered fermentation liquid with a pE value of 7.0 and with a vitamin Bl2 activity of 2.8 ccg / ccm were with 2g methylenedisalicylic acid offset. Concentrated products were added with stirring until a p11 value of 2.0 was achieved Hydrochloric acid too.

Der Niederschlag wurde abgetrennt, und die klare überstehende Flüssigkeit zeigte eine Vitamin-Bl2-Wirksamkeit entsprechend 0,12 Fg/ccm. Der Niederschlag wurde mit Wasser, einem Acetontiberschuß und mit Äther ausgewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Das Endprodukt bestand aus 1,5 g eines braunrosa Pulvers, das eine Vitamin-Bl2-Wirksamkeit entsprechend 3,2 Fg/mg aufwies.The precipitate was separated off and the clear supernatant liquid showed a vitamin B12 activity corresponding to 0.12 μg / ccm. The precipitate was Washed out with water, an excess of acetone and with ether and then in vacuo dried. The end product consisted of 1.5 g of a brownish-pink powder that had vitamin Bl2 activity corresponding to 3.2 μg / mg.

Beispiel 6 2,7 1 filtrierte Gärungsflüssigkeit mit einem pH-Wert von 7,0 und einer Vitamin-Bl2-Wirksamkeit entsprechend 1,161lg/cem wurden mit 5,4 g Methylendisalicvlsäure und 54 g Natriumchlorid versetzt. Man gab unter Rühren bis zur Erzielung eines pH-Wertes von 2,0 konzentrierte Salzsäure zu, trennte den Niederschlag ab, wusch mit Wasser aus und wog im Vakuum. Das trockene Pulver wog 9,0 g. Nach der Extraktion mit Aceton und Äther und Trocknung beobachtete man einen Gewichtsverlust von 5,3 g, was ziemlich genau dem Gewicht der anfänglich zugesetzten Methylendisalicylsäure entspricht. Die das Endprodukt bildenden 3,7 g braunrosa Pulver zeigten eine Vitamin-Bl2-Wirksamkeit entsprechend 0,8 Fg/mg. Example 6 2.7 1 filtered fermentation liquor with a pH value of 7.0 and a vitamin Bl2 activity corresponding to 1.161 lg / cem were 5.4 g methylenedisalicylic acid and 54 g sodium chloride are added. One gave with stirring concentrated hydrochloric acid until a pH of 2.0 was reached, separated the Precipitate was washed off with water and weighed in vacuo. The dry powder weighed 9.0 g. After extraction with acetone and ether and drying, one was observed Weight loss of 5.3 g, which is pretty much the weight of the initially added Methylenedisalicylic acid. The 3.7 g of brown-pink forming the end product Powders showed a vitamin Bl2 activity corresponding to 0.8 μg / mg.

Beispiel 7 5 g Methylendisalicylsäure pro Liter wurden zur Ausfällung von 4,12 g voll Verbindungen mit Vitamin-Bl2-Wirksamkeit pro ccm aus 2,93 1 Gärungsflüssigkeit verwendet. Der Niederschlag wurde mit einer Lösung voil Kaliumcyanid behandelt und dann im Vakuum getrocknet. Das trockene Pulver wurde gündlich mit Aceton extrahiert, der Acetonextrakt wurde verworfen, und der Rückstand wurde dann gründlich mit heißem Wasser bei einem pn-Wert von 2,0 extrahiert. Der so erhaltene wäßrige Extrakt wurde mit Ätznatron neutralisiert, mit Ammoniumsulfat gesättigt, mit Benzylalkohol extrahiert, und die Vitamin-Bl2-artigen Stoffe sowie das Vitamin B1., fielen aus dem Benzylalkoholextrakt bei Zugabe von 5 Volumina Äthyläther aus. Nach dem Trocknen, dem Wiegen und dem Testen auf Vitamin-Bl2-Wirksamkeit ergab sich, daß das dunkelrote Pulver eine Wirksamkeit entsprechend 105 tag Vitamin B12 pro mg besaß, was 70 °/o der ursprünglich in der Gärungsflüssigkeit enthaltenen Vitamin-Bt2-Wirksamkeit entspricht. Example 7 5 g of methylenedisalicylic acid per liter was used for precipitation of 4.12 g full of compounds with vitamin B12 activity per ccm from 2.93 l fermentation liquid used. The precipitate was treated with a solution of potassium cyanide and then dried in vacuo. The dry powder was extracted orally with acetone, the acetone extract was discarded and the residue was then washed thoroughly with hot Water extracted at a pn value of 2.0. The aqueous extract thus obtained was neutralized with caustic soda, saturated with ammonium sulfate, extracted with benzyl alcohol, and the vitamin B1-like substances and vitamin B1., fell out of the benzyl alcohol extract when 5 volumes of ethyl ether are added. After drying, weighing and Testing for vitamin Bl2 activity showed that the dark red powder had activity corresponding to 105 days of vitamin B12 per mg possessed, which is 70% of that originally in the The vitamin Bt2 content contained in the fermentation liquid corresponds to the effectiveness.

Beispiel 8 1/2 g des Additionsprodukts von Vitamin Bt2 und Methylendisalicylsäure wurde durch Zugabe von Ätznatron bis zu einem pH-Wert von 7,0 unter Rühren in Wasser gelöst. Die Lösung wurde dann mit Ammoniumsulfat gesättigt, und das Ganze wurde mit Benzylalkohol extrahiert. Man beobachtete, daß das Vitamin B12 von dem Benzylalkohol extrahiert wurde, während die Methylendisalicylsäure in der wäßrigen Phase als gummiartiger Niederschlag zurückblieb. Example 8 1/2 g of the addition product of vitamin Bt2 and methylenedisalicylic acid was made by adding caustic soda to a pH of 7.0 with stirring in water solved. The solution was then saturated with ammonium sulfate and the whole was extracted with benzyl alcohol. It was observed that the vitamin B12 was derived from the benzyl alcohol was extracted, while the methylenedisalicylic acid in the aqueous phase as gummy Precipitation remained.

Beispiel 9 Das Verfahren von Beispiel 8 wurde wiederholt, wobei jedoch an Stelle von Benzylalkohol Phenol verwendet wurde. Dabei erhielt man im wesentlichen das gleiche Ergebnis. Example 9 The procedure of Example 8 was repeated except that phenol was used in place of benzyl alcohol. This essentially gave the same result.

Beispiel 10 Das Verfahren von Beispiel 8 wurde wiederholt, wobei jedoch an Stelle von Benzylalkohol unter Erzie- lung im wesentlichen derselben Ergebnisse Kresol verwendet wurde. Example 10 The procedure of Example 8 was repeated, wherein but instead of benzyl alcohol under education essentially the same results Cresol was used.

Beispiel 11 Eine Reihe von Verbindungen wurde auf ihre Brauchbarkeit als Fällungsmittel für Vitamin B1 getestet. In jedem Falle wurde die Verbindung in einer alkalischen wäßrigen, Vitamin Blp enthaltenden Lösung gelöst, und die Mischung wurde mit Salzsäure bis zum Auftreten eines Niederschlags angesäuert. Example 11 A number of compounds were tested for utility tested as a precipitant for vitamin B1. In either case, the connection was made dissolved in an alkaline aqueous solution containing vitamin Blp, and the mixture was acidified with hydrochloric acid until a precipitate appeared.

Wenn nötig, wurde die Ausfällung durch Kühlung oder andere geeignete Mittel unterstützt.If necessary, the precipitation was carried out by cooling or other suitable means Funds supported.

Der Vitamin-Bl9-Gehalt jeder der verbleibenden überstehenden Lösungen wurde auf Grund der Intensität der rosa oder roten Farbe geschätzt. Wenn Vitamin B12 aus der Lösung ausgefällt und abgetrennt war, wurde der Niederschlag mit Wasser ausgewaschen und getrocknet. Das überschüssige Fällungsmittel wurde durch Extraktion mit Aceton aus dem Niederschlag entfernt, worauf man Wasser oder manchmal heißes, angesäuertes Wasser zugab, so daß Vitamin Blp unter Bildung der charakteristischen rosa oder roten Farbe des Vitamins frei wurde. Die Ultraviolettspektren der wie vorstehend beschrieben behandelten Extrakte entsprachen jeweils denjenigen einer authentischen Probe des Vitamins. The vitamin BI9 content of each of the remaining supernatant solutions was estimated based on the intensity of the pink or red color. When vitamin B12 was precipitated from solution and separated, the precipitate was mixed with water washed out and dried. The excess precipitant was removed by extraction removed from the precipitate with acetone, after which water or sometimes hot, Acidified water was added so that vitamin Blp formed the characteristic pink or red color of the vitamin became free. The ultraviolet spectra of the like the extracts treated as described above each corresponded to those of one authentic sample of the vitamin.

Die folgenden Ergebnisse wurden erzielt: Vitamin B12, VitaminDz2, ausgefällt nidit ausgefällt 5-Bromsalicylsäure 2,3,4,5-Tetraoxy- adipinsäure 5-Chlorsalicvlsäure Stearinsäure 5-Nitrosalicylsäure Renzoesäure Methylendisalicylsäure Gerbsäure 3-Oxy-2-naphthalincarbonsäure Zein Methylen-bi s-3-oxy-2-naphthaliii- Casein carbonsaure l -Oxy-2-naphthalincarbonsäure Borsäure Methylen-bis-l -oxy-9-naphthalin- carbonsäure 3-phenylsalicylsäure Methylen-l)is-4-oxyl)enzoesäure Nfethylen-bis-3-oxybenzoesäure 5-Phenylsalicylsäure ortho-Methylsalicylsäure Methylen-bis-orl-ho-methylsal icyl- säure Die Erfindung liefert somit ein einzigartiges und äußerst wirksames Verfahren zur Erzielung, Konzentrierung und teilweisen Reinigung von Stoffen mit Vitamin-Bl2-Wirksamkeit aus wäßrigen Lösungen oder Konzentraten oder aus Gärungsflüssigkeiten durch Ausfällung dieser Stoffe mit Methylendisalicylsäure oder anderen substituierten Oxybenzoesäure-und Oxynaphthalincarbonsäureverbindungen. Bei Verwendung von Methylendisalicylsäure in einer Menge von 0,01 bis 10 Gewichtsprozent der Lösung enthält der Niederschlag die Stoffe mit Vitamin-Blp-Wirksamkeit in einem Verhältnis von 1:1 bis l: 000 in bezug auf die SIethylendisalicylsäure.The following results were obtained: Vitamin B12, VitaminDz2, precipitated not precipitated 5-bromosalicylic acid 2,3,4,5-tetraoxy- adipic acid 5-chlorosalic acid stearic acid 5-nitrosalicylic acid renzoic acid Methylenedisalicylic acid tannic acid 3-oxy-2-naphthoic acid zein Methylene-bis-3-oxy-2-naphthalene-casein carboxylic acid l-Oxy-2-naphthoic acid boric acid Methylene-bis-l -oxy-9-naphthalene- carboxylic acid 3-phenylsalicylic acid Methylene-1) is-4-oxyl) enzoic acid N-ethylene-bis-3-oxybenzoic acid 5-phenylsalicylic acid ortho-methylsalicylic acid Methylene-bis-orl-ho-methylsalicyl- acid The invention thus provides a unique and extremely effective method for obtaining, concentrating and partially purifying substances with vitamin B1 activity from aqueous solutions or concentrates or from fermentation liquids by precipitating these substances with methylenedisalicylic acid or other substituted oxybenzoic acid and oxynaphthoic acid compounds. If methylenedisalicylic acid is used in an amount of 0.01 to 10 percent by weight of the solution, the precipitate contains the substances with vitamin Blp activity in a ratio of 1: 1 to 1: 000 in relation to the methylenedisalicylic acid.

Es brauchen nicht nur eine einzelne substituierte Oxybenzoesäure oder Oxynaphthalincarbonsäure verwendet zu werden, sondern es können auch mit Erfolg mehrere gleichzeitig zur Anwendung kommen. It doesn't just need a single substituted oxybenzoic acid or oxynaphthoic acid to be used, but it can also be used with success several can be used at the same time.

Claims

PATENT CLAIM: Process for the production of cobalamines from their acidic aqueous solutions by precipitating an addition product with an aromatic one Oxycarboxylic acid, characterized in that one for the precipitation of the addition product Methylenedisalicylic acid, oxynaphthalenecarboxylic acid or methylene-bis-oxynaphthalenecarboxylic acid or one ring-substituted by alkyl groups, phenyl groups, halogen or nitro groups Derivative of an oxybenzoic acid or one of the acids mentioned used and optionally decomposed the separated addition product.

References considered: U.S. Patent No. 2745 787.