DE1041648B

DE1041648B - Process for the production of pharmaceutical preparations containing antigens

Info

Publication number: DE1041648B
Application number: DEI12795A
Authority: DE
Inventors: Philip Alexander Melvin; Jean-Michel Gustave Pryce
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1956-02-06
Filing date: 1957-02-06
Publication date: 1958-10-23

Description

Verfahren zur Herstellung von Antigene enthaltenden pharmazeutischen Präparaten Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von Antigene enthaltenden pharmazeutischen Präparaten, wie beispielsweise Vaccinen, toxoiden und diagnostischen Stoffen. Process for the preparation of pharmaceuticals containing antigens Preparations The present invention relates to the production of antigens containing pharmaceutical preparations, such as vaccines, toxoid and diagnostic substances.

Es ist bekannt, Mittel herzustellen, welche Antigene entkalten,, z. B. immunisierende Stoffe, wie Vaccine enthaltende Antigene, durch Behandlung von infektiösen Mikroorganismen, beispielsweise infektiösen Viren, mit inaktivierenden Stoffen, wie z. B. Phenol, Formaldehyd, Wasserstoffsuperoxyd. Auch die Einwirkung von Wärme oder ultraviolettem Licht ist bekannt, wodurch die infektiösen Eigenschaften der Organismen zerstört werden, ihre antigenen Eigen schaften aber beibehalten werden. Diese inaktivierenden Mittel haben aber verschiedene Nachteile insofern, als sie bisweilen den antigenen Aufbau von. Mikroorganismen, beispielsweise Viren, zu weitgehend zerstören, und es ist häufig schwierig, eine vollkommene Zerstörung der infektiösen Eigenschaften der Mikroorganismen herbeizuführen und gleichzeitig die antigenen Eigenschaften der Mikroorganismen beizubehalten. Weiterhin ist es möglich, daß gewisse infektiöse Mikroorgan.ismen. welche während der Behandlungszeit mit einem bestimmten inaktivierenden Mittel, beispielsweise Formaldehyd. inaktiviert werden, ihre infelctiösen Eigenschaften wiedererhalten und somit während der Lagerung oder nach der Anwendung derselben bei einem Patienten als Vaccin wieder zu I<rankheiten hervorrufenden Mitteln werden. Weiterhin ist es möglich, daß bestimmte inaktivierende Mittel. wie beispielsweise Formaldehyd, oder die Einwirkung von ultraviolettem Licht die Bildung von Aggregaten von Mikroorganismen hervorrufen können. Diese Aggregate können unter Umständen unbehandelte Teile der infektiösen Mikroorganismen zurückhalten. It is known to produce agents which de-cold antigens, z. B. immunizing substances, such as vaccine-containing antigens, by treatment of infectious microorganisms, for example infectious viruses, with inactivating Substances such as B. phenol, formaldehyde, hydrogen peroxide. Also the impact exposure to heat or ultraviolet light is known to reduce its infectious properties of the organisms are destroyed, but their antigenic properties are retained. However, these inactivating agents have various disadvantages in that they sometimes the antigenic structure of. Microorganisms, such as viruses, too largely destroy, and it is often difficult to completely destroy the infectious Bring about properties of the microorganisms and at the same time the antigenic Maintain properties of the microorganisms. It is also possible that certain infectious microorganisms. which during the treatment time with a certain inactivating agents such as formaldehyde. be inactivated, their infectious Properties are retained and thus during storage or after use the same in a patient as a vaccine to cause illnesses again Funds will be. It is also possible that certain inactivating agents. how for example formaldehyde, or the action of ultraviolet light the formation of aggregates of microorganisms. These aggregates can under Hold back untreated parts of the infectious microorganisms.

Es wurde nun gefunden, daß diese Nachteile überwunden werden können, wenn eine besondere Klasse eines inaktivierenden Mittels, wie beispielsweise N-Acetyläthylenimin, bei der Herstellung von immunisierenden Mitteln angewandt wird, welche Antigene, z. B. Vaccine und Toxoide, enthalten. It has now been found that these disadvantages can be overcome when a particular class of inactivating agent, such as N-acetylethyleneimine, is used in the production of immunizing agents which contain antigens, z. B. vaccines and toxoids.

Gemäß der vorliegenden Erfindung wird nunmehr ein Verfahren zur Herstellung von Antigene enthalwenden Mitteln vorgeschlagen, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß infektiöse Mikroorganismen und/ oder Antigene derselben der Einwirkung einer Verbindung der Formel unterworfen werden. worin R ein Methyl-. Äthyl-, n-Propyl- oder Isopropylradikal bezeichnet.According to the present invention, a process for the production of agents containing antigens is now proposed, which is characterized in that infectious microorganisms and / or antigens thereof are exposed to the action of a compound of the formula be subjected. wherein R is methyl. Called ethyl, n-propyl or isopropyl radical.

Es ist darauf hinzuweisen, daß der Ausdruck infektiöse Mikroorganismen audi Viren einschließt, beispielsweise den Pferdeencephalomvelitisvirus. der Maus angepaßten Lansing-Poliomyelitisvirus. Ricl;ettsiae, z. B. R. bnrnetti, und Bakterien, beispielsweise Staphylococcus albus. It should be noted that the term infectious microorganisms also includes viruses such as equine encephalomvelitis virus. the mouse adapted Lansing poliomyelitis virus. Ricl; ettsiae, e.g. B. R. bnrnetti, and bacteria, for example Staphylococcus albus.

Die erwähnten infektiösen Mirkroarganismen und/ oder Antigene derselben, welche als Ausgangsmaterial verwendet werden, können in Form einer wäßrigen Suspension vorliegen, welche gewünschtenfalls Schutzmittel, beispielsweise ein Puffermittel. z. B. eine geeignet Menge an saurem Natriumphosphat, enthalten kann, um eine wäßrige Suspension mit einem pH-AVert von 8.0 zu ergeben. Diese infektiösen Mikroorganismen und/oder Antigene derselben, welche als Ausgangsmaterial verwendet werden, können gewünschtenfalls auch mit tierischem Zellengewebe vermischt werden, wie beispielsweise Meerschweinchen- oder Mäusegehirn und Rückenmark. The mentioned infectious micro-organisms and / or antigens of the same, which are used as the starting material can be in the form of an aqueous suspension present which, if desired, protective agents, for example a buffering agent. z. B. a suitable amount of acidic sodium phosphate, may contain an aqueous To give suspension with a pH A value of 8.0. These infectious microorganisms and / or antigens thereof used as the starting material if desired, can also be mixed with animal cell tissue, such as, for example Guinea pig or mouse brain and spinal cord.

Als besonders geeignete Verbindung der oben angegebenen Formel- kann N-Acetyläthylenimin genannt werden. Diese Verbindung wird im allgemeinen den infektiösen Mikroorganismen und/oder Antigenen derselben zugesetzt, vorzugsweise in Form einer wäßrigen Suspension, und zwar bei einer niedrigen Tempe- ratur von zwischen etwa 0 und etwa 370 C um ein Material zu erhalten, welches einen hohen Anteil an nicht infektiösem, nicht toxischem, antigenem Material aufweist, Es ist jedoch darauf hinzuweisen, daß auch höhere Arbeitstemperaturen angewandt werden können, obwohl das so erhaltene Material. die nicht infektiösen, nicht toxischen, antigenen Stoffe in verringerter Menge enthält. A particularly suitable compound of the formula given above can N-acetylethyleneimine are mentioned. This compound is generally considered to be infectious Microorganisms and / or antigens added to the same, preferably in the form of a aqueous suspension, at a low temperature rature from between about 0 and about 370 C in order to obtain a material which has a high Contains proportion of non-infectious, non-toxic, antigenic material, It is however, it should be pointed out that higher working temperatures are also used can, although the material thus obtained. the non-infectious, non-toxic, Contains reduced amounts of antigenic substances.

Die Zeitdauer, welche notwendig ist, um die Inaktivierung hinsichtlich der Infektionsfähigkeit der infektiösen Mikroorganismen und hinsichtlich der Toxidität der Antigene derselben herbeizuführen, hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von der Art des besonderen angewandten Mikroorganismus oder Antigens desselben, der Konzentration der angewandten Verbindung der oben angegebenen Formel, der Ausgangskonzentration des angewandten infektiösen Mikroorganismus oder des Antigens, der Konzentration von etwa vorhandenem tierischem Zelleng-ewe1)e und der Temperatur, bei der das Verfahren durchgeführt wird. The length of time it takes for inactivation to occur the infectious ability of the infectious microorganisms and in terms of toxicity of the antigens of the same depends on various factors, for example on the type of particular microorganism or antigen applied, the concentration of the compound of the formula given above, the starting concentration the applied infectious microorganism or antigen, the concentration of any animal cells present and the temperature at which the process is carried out.

Wie schon oben erwähnt, können geeignete Mikro organismen beispielweise Viren sein, wie der Pferdeencephalomyeliti svi rus (New-Jersey-Stamm) und der der Maus angepaßte Lansing-Poliomyelitisvirus. Es ist zweclimäKig, eine 209/obige Gew./Vol.-Suspension einer Mischung der infektiösen Mikroorganismen und Tiergewebe in einer sterilen wäßrigen Salzlösung als Rusgangsmaterial vor der Zentrifugenbehandlung zu verwenden, Die Vefl>indung der oben angegebenen Formel, wie beispielsweise N-Acetyläthylenimin, wird im al,lgemeinen in Form einer Lösung in sterilem destilliertem Wasser verwendet, und die Konzentration dieser Verbindung liegt vorzugsweise innerhalb des Bereiches von etwa 0,005 und etwa 1 O/o Vol./Vol., bezogen auf das vereinigte Volumen der wäßrigen Suspension des Mikroorganismus oder Antigens desselben und der Lösung der Verbindung. Unter den angegebenen Bedingungen beträgt die Zeitdauer, welche erforderlich ist, um die Inaktivferung hinsichtlich der Infektionsfähigkei.t der infektiösen Mikroorganismen oder-hinsichtlich der Toxidität der Antigene derselben herbeizuführen, bei einer Temperatur von etwa 18 bis 37° C im allZgemeinen in der Größenordnung von etwa 1 Stunde bis zu etwa 12 Stunden. As already mentioned above, suitable microorganisms can, for example Viruses such as equine encephalomyeliti svi rus (New Jersey strain) and the Mouse Adapted Lansing Poliomyelitis Virus. It is zweclimäKig, a 209 / above w / v suspension a mixture of the infectious microorganisms and animal tissues in a sterile one to use aqueous saline solution as the starting material before centrifuge treatment, The formula given above, such as N-acetylethyleneimine, is generally used in the form of a solution in sterile distilled water, and the concentration of this compound is preferably within the range of about 0.005 and about 10 / o v / v, based on the combined volume of the aqueous suspension of the microorganism or antigen thereof and the solution of the Link. Under the given conditions, the length of time is what is required is to the inaktivferung with regard to the infectious ability of the infectious To induce microorganisms or - with regard to the toxicity of the antigens - of the same, generally of the order of magnitude at a temperature of about 18 to 37 ° C from about 1 hour to about 12 hours.

Die so erhaltenen Präparate, welche das nicht infektiöse und nicht toxische antigene Material enthalten, können durch Ausfrieren getrod<net werden, um ein trockenes Präparat zu ergeben, das stabil ist und das unter Vakuum bis zum Gebrauch gelagert werden kann. So können die wäßrigen Präparate mit einer sterilen wäßrigen Lösung von Saccharose vorzugsweise in einem Verhältnis von 5 ovo Gew./Vol. gemischt werden. Die so erhaltenen Mischungen werden durch etwa 24stündiges Ausfrieren getrocknet und dann unter Vakuum gelagert. Die getrockneten Präparate behalten während der Lagerung ihre antigenen Eigenschaften und können leicht in Form eines Vaccins durch Zusatz sterilen destillierten Wassers oder einer entsprechenden, Salzlösung anwendbar gemacht werden. The preparations thus obtained, which are the non-infectious and not contain toxic antigenic material, can be killed by freezing, to give a dry preparation that is stable and that under vacuum up to Use can be stored. So can the aqueous preparations with a sterile aqueous solution of sucrose preferably in a ratio of 5 ovo wt / vol. be mixed. The mixtures obtained in this way are frozen out for about 24 hours dried and then stored under vacuum. The dried preparations keep during the storage of their antigenic properties and can easily be in the form of a vaccine by adding sterile distilled water or an equivalent saline solution can be made applicable.

Nicht infektiöse Präparate von Mikroorganismen, wie beispielsweise Viren, Bakterien und anderen Orga nissen, welche nicht toxische antigene Eigenschaften besitzen oder die neben der Infektionsfähigkeit andere Eigenschaften aufweisen, können dadurch hergestellt werden, daß eine der angegebenen Verbindungen, wie beispielsweise Acetyläthylenimin, angewandt wird. Non-infectious preparations of microorganisms such as Viruses, bacteria and other organisms that have non-toxic antigenic properties have or have other properties in addition to being infectious, can be prepared in that one of the specified compounds, such as Acetylethyleneimine, is applied.

Derartige Präparate, beispielsweise mit Acetyläthylenimin behandelter Poliomyel itisvirus oder Influenzavirus, können als diagnostisches Mittel für medizinische, tierärztliche oder andere Zwecke verwendet werden, Wie schon oben ausgeführt, werden durch die Verwendung der Verbindungerr der oben angegebenen Formel beim Verfahren gemäß der Erfindung beständige und zuverlässige Präparate von nicht infektiösen und nicht toxischen Mitteln geliefert, welche antigene Eigenschaften besitzen, wie beispielsweise immunisierende Mittel, z. B. Vaccine, Die vollkominene Entfernung der inf,ektiösen Eigenschaften der Mikroorganismen oder der toxischen Eigenschaften dler Antigene derselben wird mit nur wenig oder überhaupt keinem Verlust der antigenen Eigenschaften erreicht.Such preparations, for example treated with acetylethyleneimine Poliomyelitisvirus, or influenza virus, can be used as a diagnostic tool for medical, used for veterinary or other purposes, as stated above by the use of the compounds of the formula given above in the process according to the invention stable and reliable preparations of non-infectious and non-toxic agents which have antigenic properties, such as for example immunizing agents, e.g. B. Vaccine, The Totally Coming Removal the infectious properties of microorganisms or the toxic properties The antigens of the same become with little or no loss of the antigens Properties achieved.

In den folgenden Beispielen ist die Erfindung erläutert, ohne darauf beschränkt zu sein. The invention is illustrated in the following examples, without going beyond this to be limited.

Beispiel 1 Meerschweindengehirn, welches mit Pferdeencephalomyelitisvi rus (New-Jersey-Stamm) infiziert worden ist, wird mit sterilem Sand unter sterilen Bedingungen vermahlen und dann zu einer 209/obigen Gew./Vol.-SuspensSion aufgearbeitet, indem eine sterile 0,85oige Gew.IVol. wäßrige Natriumchloridlösung zugesetzt wird. Die so erhaltene 200/obige Gew./Vol.-Suspension wird 15 Minuten lang mit 4000 U/min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit sorgfältig entfernt. Die so ,erhaltene Flüssigkeit wird weitere 5 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit dann sorgfältig entfernt. Diese überstehende Flüssigkeit wird mit einer gleichen Volumenmenge einer 20/eigen Vol./Vol. sterilen Lösung von N-Acetyläthylenimin in abgekühltem destilliertem Wasser gemischt und die so erhaltene Mischung 90 Minuten lang unter gelegentlichem sanftem Schütteln bei 18 bis 220 C gehalten. Example 1 Guinea pig brain infected with equine encephalomyelitis vi rus (New Jersey strain) is infected with sterile sand under sterile Conditions ground and then worked up to a 209 / above w / v suspension, by a sterile 0.85% wt. IVol. aqueous sodium chloride solution is added. The thus obtained 200 / above w / v suspension is for 15 minutes at 4000 rpm centrifuged and the supernatant liquid carefully removed. The so, received Liquid is centrifuged for an additional 5 minutes at 4000 rpm and the supernatant The liquid is then carefully removed. This supernatant liquid is with a same volume of a 20 / own vol./vol. sterile solution of N-acetylethyleneimine mixed in cooled distilled water and the resulting mixture for 90 minutes Maintained at 18 to 220 C for a long time with occasional gentle shaking.

Eine Probe des so erhaltenen Präparates wird 12 Mäusen in das Gehirn (intracerebral) eingeimpft, und zwar 0,03 ccm pro Maus, um hierdurch das Vorhandensein von lebenden Viren zu ermitteln, Es wurde hierbei kein lebender Virus in dem Präparat festgestellt, was sich daraus ergab, daß sämtliche Mäuse diese Behandlung mit gutem Gesundheitszustand überwunden haben. A sample of the preparation thus obtained is put into the brain of 12 mice (intracerebral) inoculated, namely 0.03 ccm per mouse, to thereby ensure the presence of live viruses. No live virus was found in the preparation found that all of the mice passed this treatment with good Health condition.

Dem Rest des Präparates wird 1/4 Volumteil einer 5°/oigen Gew./Vol. sterilen wäßrigen Saccharoselösung zugesetzt. Die so erhaltene Mischung wird dann in Mengen von je 2 ccm in Ampullen verteilt, durch Ausfrieren 24 Stunden lang getrocknet und dann unter Vakuum verschlossen. Diese verschlossenen Ampullen, welche das getrocknete Vaccinpräparat enthalten, werden dann bei einer Temperatur von 20 C gelagert. The remainder of the preparation is 1/4 volume part of a 5% w / v. sterile aqueous sucrose solution added. The mixture thus obtained is then Distributed in ampoules in quantities of 2 cc each, dried by freezing for 24 hours and then sealed under vacuum. These sealed ampoules, which the dried Containing vaccine preparation are then stored at a temperature of 20 C.

Wenn die Ampullen gebraucht werden, wird der Inhalt derselben mit einer Menge von 2 ccm sterilem destilliertem Wasser versetzt und aufgelöst. Es ergibt eine klare Flüssigkeit. Proben dieser Flüssigkeit werden auf ihre Infektionsfähibolkeit und Toxidität geprüft, indem dreimal aufeinander je 0,5 ccm 20 Mäusen intraperitoneal mit einem Zwischenraum von 7 Tagen zwischen jeder Injektion injiziert werden, so daß jede Maus also eine Gesamtinjektion von insgesamt 1,5 ccm erhält. Aus diesem Versuch zeigte sich, daß die Präparate vollkommen frei von jeder Infektionsfähigkeit und Toxidität sind, was sich daraus ergab, daß sämtliche Mäuse sich 4 Monate später in einem sehr guten Gesundheitszustand befanden. When the ampoules are used, the contents of the same are used an amount of 2 cc sterile distilled water was added and dissolved. It results a clear liquid. Samples of this fluid are tested for their infectious potential and toxicity tested by intraperitoneally injecting 20 mice with 0.5 ccm three times on each other be injected with an interval of 7 days between each injection, so so that each mouse receives a total injection of 1.5 cc. For this The experiment showed that the preparations were completely free from any potential for infection and toxicity are what was found when all mice turned 4 months later found in very good health.

In einer zweiten Versuchsreihe wurden 20 Mäuse vacciniert und dann in folgender Weise mit lebendem Virus infiziert: Zwanzig frisch entwöhnte Mäuse mit einem mittleren Gewicht von 12 bis 15 g werden je mit 0,5 ccm des in der oben angegebenen Weise hergestellten Vaccins interperitoneal dreimal aufeinanderfolgend mit einem Zwischenraum von je 7 Tagen zwischen jeder Injektion injiziert, so daß jeder Maus eine Menge von 1,5 ccm verabfolgt wird. 7 Tage nach der letzten Vaccinverabfolgung werden die Mäuse mit lebendem Virus in das Gehirn hinein geimpft, wobei die Menge dieser Dosis das 30fache derjenigen Menge beträgt, welche zu 1000/o bei Mäusen tödlich wirkt, wenn sie in das. Gehirn eingeimpft wird. Es wurde gefunden, daß 40010 de' Mäuse diese Impfung mit lebendem Virus überlegen. Bei einem Kontrollversuch unter Anwendung von nicht vaccinierten Mäusen wurden sämtliche Mäuse getötet, wenn sie mit dem lebenden Virus geimpft wurden. In a second series of experiments, 20 mice were vaccinated and then infected with live virus in the following manner: Twenty newly weaned mice with an average weight of 12 to 15 g each with 0.5 ccm of the vaccine prepared in the manner indicated above interperitoneally three times consecutively with an interval of 7 days between each injection is injected so that an amount of 1.5 cc is administered to each mouse. 7 days after The last time the vaccine was administered, the mice had live virus in the brain vaccinated into it, the amount of this dose being 30 times that amount, which is 1000 / o fatal in mice when inoculated into the brain. 40010 de 'mice were found to be superior to this live virus vaccination. In a control experiment using non-vaccinated mice, all Mice killed when vaccinated with the live virus.

Beispiel 2 Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt unter Anwendung von 0,5'/o Vol./Vol. Example 2 The procedure described in Example 1 is repeated using 0.5% v / v

N-Acetyläthylenimin an Stelle von 20/o Vol./Vol.N-acetylethyleneimine instead of 20 / o v / v

N-Acetyläthylemmin, und die so erhaltene Mischung wird 3 Stunden lang unter gelegentlich leichtem Schütteln bei etwa 18 bis 220 C gehalten.N-Acetyläthylemmin, and the mixture thus obtained is for 3 hours kept at about 18 to 220 C with occasional gentle shaking.

Eine Probe des so erhaltenen Präparates wird intracerebral in einer Menge von 0,03 ccm je Maus 12 Mäusen eingeimpft, um das Vorhandensein von lebendem Virus festzustellen. Hierbei ergab sich, daß in dem Präparat kein lebende Virus zugegen war, da nämlich sämtliche Mäuse diese Behandlung mit gutem Gesundheitszustand überlebten. A sample of the preparation obtained in this way is intracerebral in a Amount of 0.03 cc per mouse 12 mice inoculated for the presence of living Detect virus. It was found that there was no live virus in the preparation was present because all of the mice received this treatment in good health survived.

Dem Rest des Präparates wird 1/4 Volumteil einer 50/oigen Gew./Vol. sterilen wäßrigen Saccharoselösung zugesetzt. Die so erhaltene Mischung wird in Mengen von 2 ccm in Ampullen verteilt und 24 Stunden lang durch Ausfrieren getrocknet und dann unter Vakuum geschlossen. Die das getrocknete Vaccinpräparat ent haltenen verschlossenen Ampullen wurden dann bei einer Temperatur von 20 C gelagert. The remainder of the preparation is 1/4 volume part of a 50% w / v. sterile aqueous sucrose solution added. The mixture thus obtained is in 2 cc quantities dispensed into ampoules and freeze dried for 24 hours and then closed under vacuum. Containing the dried vaccine preparation sealed ampoules were then stored at a temperature of 20 ° C.

Bei Gebrauch der Ampullen wurde der Inhalt derselben mit 2 ccm sterilem destilliertem Wasser versetzt, wobei sich. dieser rasch auflöste und sich eine klare Flüssigkeit bildete. Proben dieser Flüssigkeit wurden hinsichtlich ihrer Infektionsfähigkeit und Toxidität geprüft, indem 20 Mäuse dreimal aufeinanderfolgend mit je 0,5 ccm intraperitoneal injiziert wurden, wobei zwischen jeder Injektion ein Zeitraum von 7 Tagen lag, so daß also jeder Maus eine Gesamtmenge von 1,5 ccm dieser Lösung injiziert wurde. Es zeigte sich, daß das Präparat frei von jeder Infektionsfähigkeit und Toxidität war, da sämtliche Mäuse sich 4 Monate nach dieser Behandlung in einem sehr guten Gesundheitszustand befanden Bei einem zweiten Versuch wurden 20 Mäuse vacciniert und dann mit lebendem Virus in folgender Weise geimpft. Zwanzig frisch entwöhnte Mäuse mit einem mittleren Gewicht von 12 bis 15 g werden je mit 5 ccm des in der oben beschriebenen Weise hergestellten Vaccins dreimal aufeinanderfolgend intraperitoneal injiziert, und zwar mit einem Zwischenraum von 7 Tagen zwischen jeder Injektion, so daß jeder Maus eine Gesamtmenge von 1,5 ccm des Präparates verabfolgt wurde. 7 Tage nach der letzten Vaccinierung wurden die Mäuse intracerebral mit lebendem Virus. geimpft, wobei die Menge der Dosis das 30fache derjenigen betrug, welches zu 100°/o tödlich ist, wenn sie den Mäusen intracerebral verabfolgt wird. Es wurde gefunden, daß 50°/o der Mäuse diese Behandlung mit dem lebenden Virus überlebten. Bei einem Kontrollversuch unter Anwendung von nicht vaccinierten Mäusen wurde festgestellt, daß sämtliche Mäuse ge- tötet wurden, wenn sie mit dem lebenden Virus infiziert wurden. When the ampoules were used, the contents of the same were made sterile with 2 cc distilled water added, whereby. this quickly dissolved and became clear Liquid formed. Samples of this fluid were tested for infectivity and toxicity tested by placing 20 mice three times in succession with 0.5 ccm each were injected intraperitoneally with a period of 7 days, so that each mouse injected a total of 1.5 cc of this solution became. It was found that the preparation was free from any infectiousness and toxicity was, as all mice were in very good condition 4 months after this treatment In a second experiment, 20 mice were vaccinated and then vaccinated with live virus in the following manner. Twenty newly weaned Mice with an average weight of 12 to 15 g are each with 5 ccm of the in the vaccines prepared three times in succession intraperitoneally as described above injected with an interval of 7 days between each injection, so that a total of 1.5 cc of the preparation was administered to each mouse. 7 days after the last vaccination, the mice were intracerebral with live Virus. vaccinated, the amount of the dose being 30 times that which 100% fatal when administered intracerebrally to mice. It was found that 50% of the mice survived this live virus treatment. In a control experiment using non-vaccinated mice it was found that that all mice killed when infected with the live virus.

Beispiel 3 Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt unter Anwendung von 0,25°/o Vol./Vol. Example 3 The procedure described in Example 1 is repeated using 0.25% v / v

N-Acetyläthylenimin an Stelle von 20/o Vol../Vol. N-acetylethyleneimine instead of 20 / o vol ../ vol.

N-Acetyläthylenimin und die so erhaltene Mischung 3 Stunden lang unter gelegentlichem sanftem Schütteln bei 370 C gehalten. N-acetylethyleneimine and the mixture thus obtained for 3 hours kept at 370 ° C. with occasional gentle shaking.

Da so erhaltene Präparat enthält keinen lebenden Virus, wie durch intracerebrales Einimpfen einer Probe dieses Präparates bei Mäusen festgestellt wurde. The preparation obtained in this way does not contain any live virus, as demonstrated by intracerebral inoculation of a sample of this preparation in mice became.

Dem Rest des Präparates wurde 1/4 Volumenmenge einer 50/oigen Gew./Vol. sterilen wäßrigen Saccharoselösung zugesetzt. Die so erhaltene Mischung wird in Mengen von 2 ccm in Ampullen verteilt und durch Ausfrieren 24 Stunden getrocknet und dann unter Vakuum verschlossen. Die verschlossenen Ampullen enthalten das getrocknete Vaccinpräparat und werden bei einer Temperatur von 20 C gelagert. The remainder of the preparation was 1/4 volume of a 50% w / v. sterile aqueous sucrose solution added. The mixture thus obtained is in Quantities of 2 cc distributed in ampoules and dried by freezing for 24 hours and then sealed under vacuum. The sealed ampoules contain the dried one Vaccine preparation and are stored at a temperature of 20 C.

Wenn die Ampullen gebraucht werden, wird der Inhalt jeder Ampulle mit 2 ccm sterilem destilliertem Wasser versetzt, wobei sich der Inhalt rasch auflöst und eine klare Lösung ergibt. Proben dieser Flüssigkeit werden auf Infektionsfähigkeit und Toxidität geprüft, indem 0,5 ccm derselben je 20 Mäusen intraperitoneal dreimal aufeinanderfolgend einverleibt werden, wobei zwischen jeder Injektion eine Zeitspanne von 7 Tagen liegt und somit jeder Maus eine Gesamtmenge von 1,5 ccm des Präparates verabfolgt wird. When the ampoules are used, the contents of each ampoule become mixed with 2 ccm of sterile distilled water, the contents quickly dissolving and gives a clear solution. Samples of this fluid are checked for infectivity and tested for toxicity by giving 0.5 cc of the same per 20 mice intraperitoneally three times consecutively, with a period of time between each injection of 7 days and thus a total of 1.5 ccm of the preparation for each mouse is administered.

Bei diesem Versuch zeigt sich, daß das Präparat frei von jeder Infektionsfähigkeit und Toxidität ist, was daraus hervorgeht, daß sich sämtliche Mäuse 4 Monate nach dieser Behandlung in sehr gutem Gesundheitszustand befanden.This experiment shows that the preparation is free from any potential for infection and toxicity is what appears from all mice after 4 months found in very good health after this treatment.

Bei einem zweiten Versuch wurden 20 Mäuse zunächst vacciniert und dann mit lebendem Virus in folgender Weise infiziert. 20 frisch entwöhnte Mäuse mit einem mittleren Gewicht von 12 bis 15 g wurden mit 0,5 ccm des in der beschriebenen Weise bergestellten Vaccins intrapentonel dreimal aufeinanderfolgend injiziert, wobei zwischen jeder Injektion eine Zeitspanne von 7 Tagen lag, so daß also jede Maus mit einer Flüssigkeitsmenge von 1,5 ccm injiziert wurde. 7 Tage nach der letzten Vaccinierung wurden die Mäuse intracerebral mit lebendem Virus geimpft, wobei die angewandte Dosis das 20fache derjenigen betrug, die zu 100°/o bei Mäusen tödlich ist, wenn sie intracerebral verabfolgt wird. Es wurde gefunden, daß 74°/o der Mäuse diese Infektion mit dem lebenden Virus überlebten. Bei einem Kontrollversuch, der mit nicht vaccinierten Mäusen durchgeführt wurde, wurden sämtliche. Mäuse getötet, wenn sie mit dem lebenden Virus infiziert wurden. In a second experiment, 20 mice were first vaccinated and then infected with live virus in the following manner. 20 newly weaned mice with an average weight of 12 to 15 g were 0.5 ccm of the described in Injected vaccines intrapentonel three times in a row, with a period of 7 days between each injection, so that each Mouse was injected with a fluid volume of 1.5 cc. 7 days after the last Vaccination, the mice were vaccinated intracerebrally with live virus, with the applied dose was 20 times that which is 100% fatal in mice when administered intracerebrally. It was found that 74% of the mice survived this infection with the live virus. In a control attempt that performed with non-vaccinated mice, all. Mice killed, if they have been infected with the live virus.

Beispiel 4 Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt unter Anwendung von 0,1 0/o Vol./Vol. Example 4 The procedure described in Example 1 is repeated using 0.1% v / v

N-Acetyläthylenimin an Stelle von 2 °/o Vol./Vol.N-acetylethyleneimine instead of 2% v / v

N-Acetyläthylenimin und die erhaltene Mischung 4 Stunden lang unter gelegentlichem sanftem Schütteln bei 370 C gehalten. Das so erhaltene Präparat wird durch das oben beschriebene Verfahren durch Ausfrieren getrocknet und das getrocknete Produkt dann mit sterilem destilliertem Wasser aufgenommen um ein Vaccin zu ergeben. Wenn mit diesem Vaccin Mäuse geimpft werden und diese dann mit lebendem Virus in der im Beispiel 3 beschriebenen Weise infiziert werden, so ergibt sich. daß 1000/o der Mäuse diese Infektion mit dem lebenden Virus überstehen.N-Acetyläthylenimin and the resulting mixture for 4 hours under Maintained at 370 ° C with occasional gentle shaking. The preparation thus obtained is dried by the method described above by freezing and the dried Product then absorbed with sterile distilled water to make a vaccine. If mice are vaccinated with this vaccine and then put in with live virus infected in the manner described in Example 3, it results. that 1000 / o of the mice survive this infection with the live virus.

Bei einem Kontrollversuch, der mit nicht vaccinierten Mäusen durchgeführt wird, wurden sämtliche Mäuse getötet, wenn diese mit lebendem Virus infiziert wurden.In a control experiment carried out with non-vaccinated mice all mice were killed when infected with live virus.

Beispiel 5 Mäusegehirn und Cordgewebe, das mit der Maus angepaßtem Lensing-Poliomyelitisvirus infiziert worden ist, wird mit sterilem Sand unter sterilen Bedingungen vermahlen und dann hieraus durch Zusatz von einer sterilen 0,80/oigen Gew./Vol. wäßrigen Natriumchloridlösung eine 200/oige Gew./Vol.-Suspension hergestellt. Die so erhaltene 200/oige Suspension wird 30 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert, und die obenstehende Flüssigkeit wird sorgfältig entfernt. Die so erhaltene obenstehende Flüssigkeit wird erneut 5 Minuten lang bei 4000 U/min zentrifugiert und die obenstehende Flüssigkeit wird wiederum sorgfältig entfernt. Diese Flüssigkeit wird mit einer gleichen Volumenmenge einer 20/oigen Vol./Vol. sterilen Lösung von N-Acetyläthylenimin in abgekühltem destilliertem Wasser gemischt und die Mischung 2 Stunden lang unter gelegentlichem sanftem Schütteln bei einer Temperatur von 18 bis 220 C gehalten. Example 5 Mouse Brain and Cord Tissue Adapted to the Mouse Lensing poliomyelitis virus is infected with sterile sand under sterile Conditions ground and then from this by adding a sterile 0.80 / oigen Weight / volume aqueous sodium chloride solution produced a 200% weight / volume suspension. The 200% suspension obtained in this way is centrifuged for 30 minutes at 4000 rpm, and the above liquid is carefully removed. The above thus obtained Liquid is centrifuged again for 5 minutes at 4000 rpm and the above Fluid, in turn, is carefully removed. This liquid comes with a the same volume of a 20% vol./vol. sterile solution of N-acetylethyleneimine mixed in chilled distilled water and taking the mixture under for 2 hours occasional gentle shaking kept at a temperature of 18 to 220 C.

Eine Probe des so erhaltenen Präparates wird intra cerebral mit einer Menge von 0,03 ccm je Maus 17 Mäusen eingeimpft, um das Vorhandensein von lebendem Virus festzustellen. Es wurde hierbei kein lebender Virus festgestellt, was sich daraus ergibt, daß sich sämtliche Mäuse nach 28 Tagen in gutem Gesundheitszustand befanden. Eine Kontrollgruppe von 38 Mäusen wird intracerebral mit einer 100/obigen Gew./\~ol.-Suspension von Mäusen angepaßtem Lansing-Poliomyelitisvirus in einer sterilen 0,85°/oigen Gew./Vol. wäßrigen Natriumchloridlösung vor der Behandlung mit Acetyläthylenimin geimpft. Diese Tiere wurden sämtlich mit dem lebenden Virus infiziert, und sie starben alle innerhalb von 10 Tagen nach der Impfung. A sample of the preparation obtained in this way is intra cerebral with a Amount of 0.03 ccm per mouse inoculated 17 mice for the presence of living Detect virus. No live virus was found, which is this shows that all of the mice are in good health after 28 days found. A control group of 38 mice is intracerebral with a 100 / above W / V suspension of Lansing poliomyelitis virus adapted to mice in a sterile 0.85% w / v aqueous sodium chloride solution before treatment vaccinated with acetylethyleneimine. These animals were all infected with the live virus infected and they all died within 10 days of vaccination.

Dem Rest des Präparates wurde 1/4 Volumenmenge einer 50/oigen Gew.iVol. sterilen wäßrigen Saccharoselösung zugesetzt. Die so erhaltene Mischung wird in Mengen von je 2 ccm in Ampullen verteilt, 24 Stunden lang lyophilisiert und dann unter Vakuum verschlossen. The remainder of the preparation was given 1/4 volume of a 50% weight per volume. sterile aqueous sucrose solution added. The mixture thus obtained is in Quantities of 2 cc each dispensed into ampoules, lyophilized for 24 hours and then sealed under vacuum.

Die das getrocknete Vaccinpräparat enthaltenen verschlossenen Ampullen werden dann bei einer Tempe ratur von 20 C gelagert.The sealed ampoules containing the dried vaccine preparation are then stored at a temperature of 20 C.

Wenn die Ampullen gebraucht werden, wird der Inhalt jeder Ampulle mit 2 ccm sterilem destilliertem Wasser versetzt, wobei sich der Inhalt rasch auflöst und eine klare Flüssigkeit bildet. Proben dieser Flüssigkeit werden hinsichtlich der Infektionsfähig I;eit und Toxidität geprüft, indem 0,5 ccm derselben dreimal mit einem Zwischenraum von 7 Tagen zwischen jeder Injektion 20 Mäusen intraperitoneal injiziert wurden. so daß jeder Maus eine Menge von 1,5 ccm verabfolgt wurde. Hierbei zeigte sich, daß dieses Mittel keine Infchtionsfähiglceit und Toxidität besitzt da sämtliche Mäuse sich mehrere Monate später in einem sehr guten Gesundheitszustand befand,'n, Beispiel 6 Dt:, im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt unter Verwendung von 0,2apo Vol./Vol. When the ampoules are used, the contents of each ampoule become mixed with 2 ccm of sterile distilled water, the contents quickly dissolving and forms a clear liquid. Samples of this liquid are made regarding the infectiousness and toxicity tested by adding 0.5 cc of the same three times with an interval of 7 days between each injection, 20 mice intraperitoneally were injected. so that an amount of 1.5 cc was administered to each mouse. Here It was found that this agent is neither infectious nor toxic since all mice are in very good health several months later found, 'n, Example 6 Dt :, the procedure described in Example 5 is repeated using 0.2 apo v / v

N-Acetyläthylenimin an Stelle von 2°/o N-Acetylathylenimin und die so erhaltene Mischung unter gelegentlichem sanftem Schütteln 6 Spunden lang bei einer Temperatur von etwa 18 bis 22° C gehalten.N-acetylethyleneimine instead of 2% N-acetylethyleneimine and the so obtained mixture with occasional gentle shaking for 6 bungs maintained at a temperature of about 18 to 22 ° C.

Dieses Präparat en,thält-keinen lebenden Virus und kann nach dem im- Beispiel 5 beschriebenen Verfahren durch Lyophilisieren getrocknet werden. Das getrocknete Material kann zwecks Anwendung durch Zusatz von sterilem destilliertem Wasser aufgenommen werden. Wenn die erhaltene klare Lösung Mäusen intraperitoneal injiziert wird, so zeigt es sich, daß diese Flüssigkeit frei von Infektionsfähigkeit und Toxidität ist, was daraus hervorgeht, daß sich sämtliche Mäuse mehrere Monate später in einem sehr guten Gesundheitszustand befinden. This preparation does not contain a live virus and can be used after in the method described in Example 5 are dried by lyophilization. That Dried material can be distilled for the purpose of application by adding sterile Water can be absorbed. When the clear solution obtained intraperitoneally into mice is injected, it turns out that this liquid is free from infectiousness and toxicity is what appears from all mice being away for several months will later be in very good health.

Beispiel 7 Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt unter Anwendung von O,250/o Vol./Vol. Example 7 The procedure described in Example 5 is repeated using 0.250 / o v / v

N-Acetyläthylenimin an Stelle von 2 0/o N - Acetyläthylenimin, und die erhaltene Mischung wird rd4Stunden lang unter gelegentlichem sanftem Schütteln bei einer Temperatur von etwa 370 C gehalten.N-acetylethyleneimine instead of 2 0 / o N - acetylethyleneimine, and the mixture obtained is stirred for about 4 hours with occasional gentle shaking held at a temperature of about 370C.

Das so hergestellte Präparat enthält keinen lebenden Virus, und es kann durch Lyophilisieren nach dem im Beispiel 5 beschriebenen Verfahren getrocknet werden. Das getrocknete Material kann durch Zusatz von sterilem destilliertem Wasser wieder aufgenommen werden. Wlenn die so erhaltene klare Lösung Mäusen intraperitoneal injiziert wird, so zeigt es sich, daß diese Flüssigkeit frei von Infektionsfähigkeit und Toxidität ist, was daraus hervorgeht, daß sich sämtliche Mäuse mehrere Monate später in einem sehr guten Gesundheitszustand befinden. The preparation so produced does not contain a live virus, and it does can be dried by lyophilization according to the method described in example 5 will. The dried material can be removed by adding sterile distilled water to be resumed. If the clear solution thus obtained is intraperitoneally applied to mice is injected, it turns out that this liquid is free from infectiousness and toxicity is what appears from all mice being away for several months will later be in very good health.

Beispiel 8 Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt unter Anwendung von 0,1 0/o Vol.,/',Tol. Example 8 The procedure described in Example 5 is repeated using 0.1% by volume, / ', tol.

N-Acetyläthylenimin an Stelle von 2°/o N-Acetyläthylenimin und die erhaltene Mischung 4 Stunden unter gelegentlichem sanftem Schütteln bei einer Temperatur von 370 C gehalten.N-acetylethyleneimine instead of 2% N-acetylethyleneimine and the obtained mixture for 4 hours with occasional gentle shaking at a temperature held at 370 C.

Eine Probe dieses Präparates wird intracerebral zwanzig jungen Mäusen in einer Menge von 0,3 ccm je Maus injiziert, um es auf die Gegenwart von lebendem Virus zu prüfen.. Es wurde kein lebender Virus festgestellt, was daraus hervorgeht, daß sich sämtliche Mäuse 40 Tage später in gutem Gesundheitszustand befanden. In ~ einem Kontrollversuch wurden 39 Mäuse intracerebral mit 20 Gew«/Vol. der Maus angepaßtem Lansing-Poliomyelitisvirus in steriler 0,85°/oiger Gew./Vol. wäßriger Natriumchloridlösung injiziert, und zwar in einer Menge von 0,03 ccm pro Maus, und zwar vor der Behandlung mit dem Acetyl äthylenimin. Diese Tiere wurden sämtlich mit dem lebenden Virus infiziert, und sie starben sämtlich innerhalb von 10 Tagen nach der Impfung. A sample of this preparation is taken intracerebrally from twenty young mice injected in an amount of 0.3 cc per mouse in order to detect the presence of living Virus to Check. No live virus was detected, indicating that all mice were in good health 40 days later. In In a control experiment, 39 mice were intracerebral with 20 wt. / vol. the mouse adapted Lansing poliomyelitis virus in sterile 0.85% w / v. more watery Sodium chloride solution injected, in an amount of 0.03 cc per mouse, and before treatment with the acetyl ethylene imine. These animals all became infected with the live virus and they all died within 10 days after vaccination.

Dem Rest des Präparates wird 1/4 Volumteil 5°/oiger Gew./Vol. steriler wäßriger Saccharoselösung zugesetzt. Die erhaltene Mischung wird in Mengen von je 2 ccm in Ampullen verteilt, 24 Stunden lang lyophilisiert und dann die Ampullen unter Vakuum verschlossen. Diese enthalten das getrocknete Vaccinpräparat und können bei einer Temperatur von 20 C gelagert werden. 1/4 volume part of 5% w / v is added to the rest of the preparation. more sterile added to aqueous sucrose solution. The mixture obtained is in amounts of each 2 cc divided into ampoules, lyophilized for 24 hours and then the ampoules sealed under vacuum. These contain the dried vaccine preparation and can be stored at a temperature of 20 C.

Wenn die Ampullen gebraucht werden, so wird d-r Inhalt jeder Ampulle durch Zusatz von 2 ccm sterilem destilliertem Wasser aufgenommen, worin der Inhalt der Ampulle sich rasch löst und eine klare Flüssigliuit bildet. Proben dieser Flüssigkeit werden auf Injek tionsfähigkeit, Toxidität und Immunisierungskraft geprüft, indem 20 Mäuse mit je 0,5 ccm dieser Flüssigkeit intraperitoneal viermal injiziert werden, wobei zwischen den ersten drei Dosen ein Zwischenraum von 10 Tagen liegt und zwischen der dritten und vierten Dosis ein Zwischraum von 14 Tagen, so daß jede Maus mit einer Gesamtmenge von 2 ccm der Flüssigkeit injiziert wird. 14 Tage nach der letzten Injektion befanden sich sämtliche Mäuse in sehr gutem Gesundheitszustand, woraus hervorgeht, daß das Vaccin frei von Infektionsfähigkeit und Toxidität war. Diese Mäuse wurden dann intracerebral mit lebendem Virus geimpft wobei die Menge dieser Dosis das 30fache derjenigen betrug, die zu 1000/o bei Mäusen tödlich wirkt, wenn sie intracerebral verabfolgt wird. Es zeigte sich, daß 35 O/o der Mäuse diese Behandlung mlit dem lebenden Virus überstanden. Bei einem Vergleichsversuch, der mit nicht vaccinierten Mäusen durchgeführt wurde, starben sämtliche Mäuse, wenn sie mit dem lebenden Virus geimpft wurden. When the ampoules are used, the contents of each ampoule become the same taken up by adding 2 cc of sterile distilled water, in which the contents the ampoule dissolves quickly and forms a clear liquid. Samples of this liquid are tested for injectability, toxicity and immunization power by 20 mice each with 0.5 ccm of this liquid are injected intraperitoneally four times, with a gap of 10 days and there is an interval of 14 days between the third and fourth dose, see above that each mouse is injected with a total of 2 cc of the liquid. 14th Days after the last injection, all mice were in very good health, from which it can be seen that the vaccine was free of infectivity and toxicity. These mice were then vaccinated intracerebrally with live virus with the amount this dose was 30 times that which is 1000 / o fatal in mice, when administered intracerebrally. It was found that 35% of the mice had these Treatment with the live virus survived. In a comparison experiment, the was carried out with non-vaccinated mice, all mice died when they have been vaccinated with the live virus.

Beispiel 9 Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt unter Anwendung von O,OO/o Vol,/Vol N-Acetyläthylenimin an Stelle von 2e/o N-Acetyläthylenimin und die erhaltene Mischung unter gelegentlichem sanftem Schütteln 12 Stunden bei 370 C gehalten. Example 9 The procedure described in Example 5 is repeated using O, OO / o vol, / vol N-acetylethyleneimine instead of 2e / o N-acetylethyleneimine and the resulting mixture with occasional gentle shaking for 12 hours 370 C held.

Eine Probe des so hergestellten Präparates wird intracerebral fünfundzwawiig jungen Mäusen in einer Menge von 0,03 ccm pro Maus eingeimpft, um es auf das Vorhandensein von lehendem Virus zu prüfen. Es wurde kein lebender Virus festgestellt, was sich daraus ergibt, daß sich 35 Tage nach der Behandlung sämtliche Mäuse im guten Gesundheitszustand befanden. A sample of the preparation produced in this way becomes twenty-five intracerebral young mice inoculated at a rate of 0.03 cc per mouse to check for its presence to test of leaning virus. No live virus was found, which was found from this it is found that all mice are in good health 35 days after treatment found.

Dem Rest des Präparates wurde 1/4 Volumteil einer 5S°/oigen Gew./Vol. sterilen wäßrigen Saccharoselösung zugefügt. Die so erhaltene Mischung wird in Mengen von je 2 com in Ampullen verteilt, durch Ausfrieren 24 Stunden lang getrocknet und die Ampullen dann unter Vakuum verschlossen. Die Ampullen. welche das getrocknete Vaccinpräparat enthielten, wurden dann bei 20 C gelagert. 1/4 volume part of a 5½% w / v was added to the remainder of the preparation. sterile aqueous sucrose solution added. The mixture thus obtained is used in quantities of 2 com distributed in ampoules, dried by freezing for 24 hours and the ampoules then sealed under vacuum. The ampoules. which the dried Containing vaccine preparation were then stored at 20 ° C.

Wenn die Ampullen gebraucht wurden, wurde der Inhalt jeder Ampulle durch Zusatz von 2 ccm sterilem destilliertem Wasser aufgenommen, wobei eine rasche Auflösung stattfindet und sich eine klare Flüssigkeit bildete. When the ampoules were used, the contents of each ampoule became absorbed by the addition of 2 cc of sterile distilled water, with a rapid Dissolution takes place and a clear liquid is formed.

Proben dieser Flüssigkeit wurden auf ihre Infektionsfähigkeit, Toxidität und Immunisierungskraft geprüft, indem 25 Mäuse mit je 0,5 ccm intraperitoneal viermal aufeinanderfolgend injiziert wurden, und zwar mit einem Zwischenraum von je 10 Tagen zwischen den ersten drei Dosen und 14 Tagen zwischen der dritten und vierten Dosis so daß jede Maus mit einer Flüssigkeitsmenge von 2 ccm injiziert wurde. Samples of this fluid were tested for infectivity and toxicity and immunization potency tested by placing 25 mice with 0.5 ccm intraperitoneally four times were injected consecutively, with an interval of 10 days between the first three doses and 14 days between the third and fourth doses so that each mouse was injected with an amount of fluid of 2 cc.

1OTage nach der letzten Vaccinisierung befanden sich die Mäuse in einem sehr guten Gesundheitszustand, woraus hervorgeht, daß die Vaccine keine Infektionsfähigkeit und Toxidität aufwiesen. Diese Mäuse wurden dann intracerebral mit lebendem Virus geimpft, wobei die Menge dler angewandten Dosis das 30fache derjenigen betrug, die 100'/o bei Mäusen tödlich ist, wenn sie intracerebral verallfolgt wird. Es wurde gefunden, daß 44°/o der Mäuse diese Behandlung mit dem lebenden Virus überlebten. Bei einem Kontrollversuch, bei dem mit nicht vaccinierten Mäusen gearbeitet wurde, überlebte keine Maus diese Behandlung, wenn sie intracerebral mit lebendem Virus infiziert wurde. 10 days after the last vaccination, the mice were in a very good state of health, from which it can be seen that the vaccine is not infectious and toxicity. These mice were then intracerebral with live virus vaccinated, the amount of the dose used being 30 times that of the 100% is fatal in mice if traced intracerebrally. It was found that 44% of the mice survived this live virus treatment. In a control experiment in which non-vaccinated mice were used, No mouse survived this treatment when intracerebral with live virus got infected.

Beispiel 10 Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt unter Anwendung von 0,025 0/o Vol iVol. Example 10 The procedure described in Example 5 is repeated using 0.025% vol iVol.

N-Acetyläthylenimin an Stelle von 2°/o N-Acetyläthylenimin; und die Mischung unter gelegentlichem sanftem Schütteln 12 Stunden bei 370 C gehalten.N-acetylethyleneimine instead of 2% N-acetylethyleneimine; and the Mixture kept at 370 C for 12 hours with occasional gentle shaking.

Eine Probe des so erhaltenen Präparates wird intracerebral zwanzig jungen Mäusen in einer Menge von 0,03 ccm pro Maus eingeimpft, um es auf das Vorhandensein von lebendem Virus zu prüfen. Es wurde kein lebender Virus festgestellit, was sich daraus ergibt, daß sämtliche Mäuse sich 35 Tage nach der Behandlung in einem guten Gesundheitszustand befanden. A sample of the preparation thus obtained becomes twenty intracerebrally young mice inoculated at a rate of 0.03 cc per mouse to check for its presence to test of live virus. No live virus was detected from this it is found that all mice are in good condition 35 days after treatment State of health.

Zu dem Rest des Präparates wird l/4Volumenmenge einer 50/obigen Gew./Vol. sterilen wäßrigen Saccharoselösung zugesetzt. Die so erhaltene Mischung wird in Mengen von je 2 ccm in Ampullen verteilt und durch Ausfrieren 24 Stunden lang getroclinet, worauf dann die Ampullen unter Vakuum verschlossen werden. Sie enthalten das getrocknete Vaccinpräparat und werden bei einer Temperatur von 20 C gelagert. To the remainder of the preparation 1/4 volume of a 50 / above w / v. sterile aqueous sucrose solution added. The mixture thus obtained is in Quantities of 2 ccm each distributed in ampoules and dried out for 24 hours by freezing, whereupon the ampoules are sealed under vacuum. They contain the dried Vaccine preparation and are stored at a temperature of 20 C.

Wenn die Ampullen gebraucht werden, wird der Inhalt jeder Ampulle durch einen Zusatz von 2 ccm sterilem destilliertem Wasser aufgenommen, wobei er sich rasch auflöst und eine klare Flüssigkeit bildet. When the ampoules are used, the contents of each ampoule become absorbed by the addition of 2 cc of sterile distilled water, whereby he dissolves quickly and forms a clear liquid.

Proben jeder Flüssigkeit werden auf Infektionsfähigkeit, Toxidität und Immunisierungskraft geprüft, indem 20 Mäuse mit je 0,5 ccm intraperitoneal dreimal geimpft wurden mit einem Zwischenraum von 7 Tagen zwischen der Verabfolgung der ersetzen und zweiten Dosis des Vaccins und 14 Tage zwischen der zweiten und dritten Dosis, so daß also jede Maus mit einer Gesamtmenge von 1,5 ccm Flüssigkeit injiziert wurde. Samples of each liquid are checked for infectivity, toxicity and immunization potency tested by placing 20 mice with 0.5 ccm intraperitoneally three times were vaccinated with an interval of 7 days between the administration of the replace and second dose of vaccine and 14 days between the second and third Dose so that each mouse injects a total of 1.5 cc of fluid became.

10 Tage nach der Verabfolgung der letzten Vaccindosis befanden sich sämtliche Mäuse in einem sehr guten Gesundheitszustand, woraus hervorgeht, daß das Vaccin keine Infektionsfähigkeit und Toxidität besitzt. Die Mäuse wurden dann intracerebral mit lebendem Virus geimpft, wobei die Menge der angewandten Dosis das lOfache derjenigen beträgt, die zu 100'ovo bei Mäusen tödlich ist, wenn sie intracerebral verabfolgt wird. Es zeigt sich, daß 550/0 der Mäuse diese Behandlung mit dem lebenden Virus überlebten. Bei einem Kontrollversuch, der mit nicht vaccinierten Mäusen durchgeführt wurde, überlebte keine Maus diese Behandlung, wenn sie mit lebendem Virus intraoerebral geimpft wurde.10 days after the last dose of vaccine was administered all mice in very good health, which shows that the Vaccine is neither infectious nor toxic. The mice then became intracerebral vaccinated with live virus, the amount of the dose applied being 10 times that which is 100'ovo fatal in mice when administered intracerebrally will. It was found that 550/0 of the mice received this treatment with the live virus survived. In a control experiment carried out with non-vaccinated mice no mouse survived this treatment when intraoerebral with live virus was vaccinated.

Bei s p i e 11 Eine voll ausgewachsene Kultur von Staphylococcus albus. welche ursprünglich von der menschlichen Haut isoliert wurde, wurde zentrifugiert. Die Bakterienzellen werden in einer sterilen 0,850/oigen Gew./Vol. wäßrigen Natriumchloridlösung suspendiert, zentrifugiert und dann erneut in einer weiteren Menge steriler 0,85 0/oiger Gew./Vol. wäßrigen Natriumchloridlösung suspendiert, um eine Zellensuspension zu ergeben, die eine optische Dichte von 1,6 besitzt. wenn eine Probe dieser Lösung in einer mit einer 1 cm langen Lichtbahn versehenen Spektrophotometerzelle unter Anwendung einer Wellenlänge von 5800 Ä untersucht wird. Zu 4 Teilen der so erhaltenen Zellenr suspension wird 1 Teil einer 10/obigen Vol./Vol.-Lösung von N-Acetyläthylenimin im abgekühlten destill ierten Wasser zugesetzt und die sich ergebende Mischung unter gelegentlichem sanftem Schütteln 24 Stunden lang bei 370 C gehalten. At s p i e 11 a fully grown culture of Staphylococcus albus. which was originally isolated from human skin was centrifuged. The bacterial cells are in a sterile 0.850% w / v. aqueous sodium chloride solution suspended, centrifuged and then again in another amount of sterile 0.85 0% w / v aqueous sodium chloride solution suspended to form a cell suspension which has an optical density of 1.6. if a sample of this solution in a spectrophotometer cell provided with a 1 cm long light path Application of a wavelength of 5800 Å is investigated. To 4 parts of the thus obtained Cell suspension is 1 part of a 10 / above v / v solution of N-acetylethyleneimine in the cooled distilled water added and the resulting mixture under Maintained at 370 ° C for 24 hours with occasional gentle shaking.

Eine Probe des so erhaltenen Präparates wird auf eine Bakteriennährlösung aufgeimpft und außerdem auf ein Agar-Agar-Baliterienn,ährmedium in einer Kulturschale. Es wurden keine lebenden Bakterien festgestellt. was daraus zu schließen ist, daß innerhalb von 6 Tagen bei einer Temperatur von 370 C kein ,akterienwuchs auftrat. A sample of the preparation obtained in this way is tested for a bacterial nutrient solution inoculated and also on an agar-agar-Baliterienn, nutrient medium in a culture dish. No living bacteria were found. what is to be concluded that within no acter growth for 6 days at a temperature of 370 C. occurred.

Dem Rest des Präparates wurde 1/4 Volumteil einer 50,gen GewiVol. wäßrigen Saccharoselösung zugesetzt. Die so erhaltene Nfisebung wird in Mengen von je 2 ccm in Ampullen verteilt und 18 Stunden lang lyophilisiert, worauf die Ampullen dann unter Vakuum verschlossen wurden. Die das getrocknete Vaccinpräparat enthaltenden Ampullen wurden dann bei Temperaturen von 18 bis 220 C gelagert. The remainder of the preparation was 1/4 volume part of a 50, gen GewiVol. added to aqueous sucrose solution. The Nfisebung thus obtained is in amounts of 2 cc each distributed in ampoules and lyophilized for 18 hours, whereupon the ampoules then sealed under vacuum. Those containing the dried vaccine preparation Ampoules were then stored at temperatures of 18-220 ° C.

Zum Gebrauch wurde der Inhalt jeder Ampulle mit einem Zusatz von 2 ccm sterilem destilliertem Wasser versetzt, wodurch eine rasche Auflösung eintrat und eich eine glatte gleichmäßige Suspension bildete. Proben dieses Materials wurden hinsichtlich des Vorhandenseins von lebenden Bakterien geprüft, indem dieses Material einer Bakteriennährlösung eingeimpft wurde. die dann 6 Tage bei 370 C gehalten wurde. Die Abwesenheit von lebenden Bakterien. ließ sich dadurch feststellen. daß innerhalb dieses Zeitraums kein Bakterienwuchs auftrat. Das so hergestellte Vaccin wird Kaninchen subcutan durch Injektion verabfolgt. In einem Falle wurden bei den Versuchstieren Vergiftungserscheinungen durch die Injektion der Vaccine festgestellt. Jedem Raninchen wurden in der ersten Nvoebe zwei Vaccinierungsinjektion,en von je 0,5 ccm verabfolgt und in der weiten Woche zwei Vaccinierungsinjektionen von je 1 ccm. Von diesen Kaninchen und von den nicht vaccinierten Kaninchen gebildetes Serum wird dann gesammelt. Die Antikörpertitration des Serums wird durch eine Agglutinierungsreaktion mit einer lebenden Suspension desselben Bakteriums festgestellt. Es zeigt sich ein beträchtliches Anwachsen des agglutinierenden Antikörpers in dem vaccinierten Kaninchenserum im Vergleich zu dem nicht vaccinierten Kaninchenserum. The contents of each ampoule with an addition of 2 cc of sterile distilled water were added, causing rapid dissolution and formed a smooth uniform suspension. Samples of this material were made checked for the presence of live bacteria by this material inoculated with a bacterial nutrient solution. which was then held at 370 ° C. for 6 days. The absence of live bacteria. could be determined thereby. that within no bacterial growth occurred during this period. The vaccine thus produced becomes rabbit administered subcutaneously by injection. In one case, the test animals Symptoms of intoxication from the injection of the vaccine were found. Every rabbit two vaccination injections of 0.5 ccm each were administered in the first episode and two vaccination injections of 1 cc each during the week. From these rabbits and serum produced from the non-vaccinated rabbits is then collected. the Antibody titration of the serum is carried out by an agglutination reaction with a living suspension of the same bacterium was found. It turns out to be a considerable one Growth of the agglutinating antibody in the vaccinated rabbit serum im Compared to the non-vaccinated rabbit serum.

Beispiel 12 24 Stunden nach der Infektion mit geringen Mengen Influenza-A-Virus werden die chorioallontoischen Membranen voll 30 12 Tage alten befruchteten Hühnereiern gewonnen. Die eingesetzten Membranen werden dann dreimal abwechselnd bei 700 C gefroren und bei 37° C wieder aufgebaut, und 30 ccm einer gepuffrerten M1100-Phosphatsalzlösung werden zugesetzt. Nach dem Vermischen werden die Membranen bei 3000 U/min 5 Minuten zentrifugiert und der überstehende Membranextrakt entfernt. Eine Probe des Extraktes wird auf seine Infektionsfähigkeit gegenüber befruchteten Hühnereiern geprüft und festgestellt, daß eine Menge von 1 ccm derselben in einer Verdünnung von 10-6,2 50% der Eier infiziert. d. h. also, daß der Extrakt im ccm 106,2 50%ige eierinflzierende Dosen (EID50) enthält. Example 12 24 hours after infection with low levels of influenza A virus the chorioallontoic membranes become full of 30 12-day-old fertilized chicken eggs won. The membranes used are then alternately frozen at 700 ° C. three times and rebuilt at 37 ° C, and 30 cc of M1100 buffered phosphate salt solution are added. After mixing, the membranes run at 3000 rpm for 5 minutes centrifuged and the supernatant membrane extract removed. A sample of the extract is tested for its ability to infect fertilized chicken eggs and found that an amount of 1 cc of the same in a dilution of 10-6.2 50% of the eggs infected. d. H. So that the extract in the ccm 106.2 50% egg-inflating Contains cans (EID50).

Zu einer Probe dieses Membranextraktes wird nun Acetyläthylimin zugegeben. um eine Endkonzentration von 1 0/o Vol./Vol. Acetyläthylinamin zu ergeben, und die Mischung 4 Stunden bei einer Temperatur von 30¢ C gehalten. In einer Verdünnung von 1 :10 infiziert der so behandelte Extrakt keine Eier, wenn 10 Eier mit 1 ccm desselben geimpft wurden. Der unbehande te Extrakt ist demgegenüber für Eier giftig. Acetylethylimine is then added to a sample of this membrane extract. to a final concentration of 1 0 / o v / v. Acetyläthylinamin to give, and the The mixture was kept at a temperature of 30 ° C. for 4 hours. In a dilution of 1: 10, the extract treated in this way does not infect any eggs if 10 eggs with 1 ccm of the same were vaccinated. The untreated extract, on the other hand, is poisonous for eggs.

Wenn j loch der Virus durch Absorption durch die roten Blutzellen von Meerschweinchen abgetrennt wird und er in eine 0,850/oige Natriumchloridlösung eingetragen wird, so stellt sich heraus, daß mit dieser Flüssiglçeit von 10 Eiern keines infiziert wird, wenn diese mit 1 ccm derselben geimpft werden.When j hole the virus by absorption by the red blood cells from The guinea pig is separated and it is introduced into a 0.850% sodium chloride solution it turns out that none of the 10 eggs infect with this liquid if these are vaccinated with 1 cc of the same.

Wenn die unbehandelten und die mit Acetyläthylenimin behandeften Extrakte parallel durch das übliche Verfahren (Salk-Musterprobe) geprüft werden, so wird gefunden, daß diese die gleichen Fähigkeiten haben, die' roten Blutzellen von Meerschweinchen zu agglutinieren. Die Hämaglutinintiter betragen 101,0 und 102,05-Hämaglutinineinheiten pro ccm. Diese Werte sind bei Berücksiehtigung der angewandten Arbeitsweise nicht als wesentlich verschieden voneinander zu bezeichnen. When the untreated and those treated with acetylethyleneimine Extracts are tested in parallel using the usual procedure (Salk sample), so it is found that these have the same abilities as the 'red blood cells agglutinate from guinea pigs. The hemaglutinin titers are 101.0 and 102.05 hemaglutinin units per ccm. These values are not valid if the working method used is taken into account to be described as essentially different from one another.

Wenn die gleiche Probe mit menschlichem kekonvaleszeutenserum durchgeführt wird, welches Antikörper des löslichen Antigens der Influenzatype A enthält, so ist festzustellen, daß die unbehandelten und die mit Acetyläthylenimin behandelten Extrakte nicht unterscheidbare Mengen an löslichem Antigen enthalten, wie durch entsprechende Bestimmung festgfestellt wurde. Die Einheiten an löslichem Antigen betragen hierbei 10305 und 1032 pro ccm. When the same sample is performed with human convalescence serum which antibody of the soluble antigen of influenza type A contains, so it can be seen that the untreated and those treated with acetylethyleneimine Extracts contain indistinguishable amounts of soluble antigen, such as by corresponding provision has been established. The units of soluble antigen are 10305 and 1032 per ccm.

Bei der Diagnose einer Infinenzainfektion bei Menschen wurden Serumantikörper auf ihre Bindekraft mit dem Hämaglutinin oder mit dem löslichen Antigen des Influenzavirus festgestellt. Die nicht infektiösen. mit Acetyl äthylen imin behandelten Influenzaviruspräparate, welche in der oben beschriebenen Weise erhalten werden können, können also für diesen Zweck angewandt werden. Serum antibodies were used when diagnosing infinenza infection in humans on their binding force with the hemaglutinin or with the soluble antigen of the influenza virus established. The non-infectious. Influenza virus preparations treated with acetylene imine, which can be obtained in the manner described above, so can for this Purpose to be applied.

PATENTANSPRSCHE 1. Verfahren zur Herstellung von Antigene enthaltenden pharmazeutischen Präparaten, dadurch gekennzeichnet, daß infektiöse Mikroorganismen und/oWder Antigene derselben der Einwirkung einer Verbindung der allgemeinen Formel unterworfen werden, worin R ein Methyl-, Äthyl-, n-Propyl- oder Isopropylradikal bezeichnet.PATENT CLAIMS 1. Process for the production of pharmaceutical preparations containing antigens, characterized in that infectious microorganisms and / or the antigens thereof are exposed to the action of a compound of the general formula where R denotes a methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl radical.

Claims

2. The method according to claim 1, characterized in that as infectious Microorganisms Viruses, Rickettsiae and bacteria or their antigens are used.

3. The method according to claim 1 and 2, characterized in that the Microorganism used as starting material and / or the antigen of the same in The form of an aqueous suspension is present, which protective or buffer substances for adjustment to the pn value 8.0 and is mixed with animal tissue.

References considered: U.S. Patent No. 2,526 961; British Patent No. 527 803.