DD84450B1

DD84450B1 - Verfahren zur Gewinnung eines Makrolid-Antibiotikums

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Publication number: DD84450B1
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Publication date: 1980-06-25

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Gewinnung eines Makrolid-Antibiotikums mit wertvollen therapeutischen Eigenschaften, das als Turimycin bezeichnet wird. In der Veterinär-Medizin wird als Mykoplasmen-wirksames Antibiotikum Tylosin eingesetzt, das von einer Firma in den USA hergestellt wird. Die Erfindung bezweckt ein inländisches Produkt für dieses Indikationsgebiet zur Verfügung zu haben. Ihr liegt die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Gewinnung eines Antibiotikums anzugeben, das bevorzugt gegen Mykoplasmen wirksam ist.

Es wurde gefunden, daß in den Fermentationslösungen eines Stammes der Gattung Streptomyces dieses therapeutisch wichtige Makrolid-Antibiotikum mit Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien und Mykoplasmen gebildet wird und unter den im folgenden beschriebenen Verfahrensbedingungen isoliert werden kann. Der Mikroorganismus zur Gewinnung dieser Substanz gehört zu der Art Streptomyces hygroscopicus (JENSEN 1931) WAKSMAN et HENRICI 1948 und ist in der Starransammlung des Institutes für Mikrobiologie und experimentelle Therapie, Jena, der Deutschen Akademie der Wissenschaften zu Eerlin unter der Nummer JA 6599 hinterlegt.

Das erfindungsgemäß isolierte Antibiotikum stellt einen Komplex aus mehreren Komponenten dar und kann in die Gruppe der Leucomycine eingeordnet werden, die bisher nur von Streptomyces-Stämmen der Art Streptomyces kitasatcensis HATA et al. 1953, bzw. Streptomyces reticuli (WAKSMAN et CURTIS 1916) WAKSMAN et HENRICI 1948 gewonnen werden konnten. Erfindungsgemäß ist das Verfahren zur Gewinnung eines Makrolid-Antibiotikums durch Züchtung eines Streptomyces-Stammes unter aeroben Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen dadurch gekennzeichnet, daß als produzierender Stamm Streptomyces hygroscopicus JA 6599 oder seine Mutanten oder Varianten eingesetzt werden, die Züchtung in geeigneten NühriOedien bei einer Temperatur von 2 8 bis 32 °C während 2 bis 5 Tagen unter Belüftung und Rührung durchge-

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führt wird und schließlich das Antibiotikum nach Abtrennen der Feststoffe durch Extraktion mit Halogenkohlenwasserstoffen oder Estern, vorzugsweise mit Butylacetat, nachfolgende Reextraktion mit sauren Pufferlösungen oder verdünnten Säuren, erneute Extraktion mit Halogenkohlenwasserstoffen oder Estern, vorzugsweise mit Chloroform, Ausfällen der Base aus dem Chloroformkonzentrat mit Petroläther und gegebenenfalls durch Säulenchromatographie in reiner Form gewonnen wird. Der Stamm JA 6599 wurde im Jahre 1959 aus einer Gartenerde von Tunghua (China) isoliert. Er bildet weißliches, ockergelbes bis hellbraunes Substratmycel. Das weiße Luftmycel versport grau bis braungrau und zeigt stellenweise durch Autolyse entstandene schwarze feuchte Fleckenbildung. Die versporten Lufthyphen zweigen von einer langen Haupthyphe ausgehend, in gleichmäßigen Abständen einzeln, vielfach zu mehreren auch pseudo-wirtelartig ab und enden in regelmäßigen und unregelmäßigen Spiralen, die teils dichte Knäuel bilden. Elektronenoptische Aufnahmen zeigen ovale, unregelmäßig geformte Abschnürungen mit glatter Oberfläche. Es werden keine melanoiden Pigmente gebildet. Der dieser Beschreibung zugrunde liegende Stamm JA 6599 kann auf Grund seiner morphologischen und physiologischen Eigenschaften (im Sinne von TRESNER und BACKUS 1956) der umfangreichen Species Streptomyces hygroscopicus (JENSEN 1931) WAKSMAN et HENRICI 1948 zugeordnet werden. Die morphologischen und physiologischen Eigenschaften des JA 6599 sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Die Kulturlösungen des Stammes JA 6599 zeigen gute Wirksamkeit gegen grampositive Bakterien, schwache auch gegen Mykobakterien, mittlere bis gute Aktivität gegen Hefen und Pilze sowie auch gegen Myccplasma gallisepticum.

Neben dem antibakteriell wirksamen Turimycin konnte ein antifungales Antibiotikum isoliert werden, das nicht zu den Polyenantibiotika gehört, in die Kulturlösung ausgeschieden wird, woraus es durch Extraktion mit Butanol gewonnen werden kann. Auf Grund der Aktivitätsteste und papierchromatographischen

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Untersuchungen der Extrakte liegt ein Antibiotikum der Cycloheximid -Gruppe vor.

Die Kultivierung des Stammes JA 6599 sowie von dessen Varianten oder Mutanten erfolgt unter aeroben Bedingungen. Ausgehend von an Erde getrocknetem Sporenmaterial werden geeignete Agarnährböden und anschließend ausgewählte flüssige Nährmedien beimpft. Diese Nährböden können als Kohlenstoffquellen z.B. Stärke, Saccharose, Glukose und als Stickstoffquelle z.B. Sojabohnenmehl, Hefe oder Maisquellwasser enthalten. Die Antibiotikumbildung erreicht ihr Maximum im allgemeinen zwischen drittem bis fünftem Tag, wenn Temperaturen von 28 bis 32 ⁰C, bevorzugt 30 ⁰C, gewählt werden.

Turimycin kann aus den Kulturfiltraten durch Extraktion mit wasserunlöslichen Lösungsmitteln, wie Halogenkohlenwasserstoffen, Ketonen oder Estern, bevorzugt Butylacetat, extrahiert werden. Aus den Extrakten läßt sich das basische Antibiotikum durch Reextraktion mit wäßrigen, sauren Lösungen wie Pufferlösungen oder verdünnten Säuren als Salz in die wäßrige Phase überführen. Aus den eingeengten Reextrakten wird die wirksame Substanz im alkalischen Bereich ausgefällt oder mit Halogenkohlenwasserstoffen oder Estern, vorzugsweise mit Chloroform, extrahiert. Das Antibiotikum läßt sich aus den eingeengten Chloroformextrakten mit Petroläther ausfällen. Es wurde gefunden, daß hochgereinigtes Turimycin in Form der reinen Base erhalten werden kann, wenn acetonische Lösungen der rohen Base, gegebenenfalls nach einer Behandlung mit Aktivkohle, wobei das Antibiotikum nicht adsorbiert wird, einer Säulenchromatographie an Aluminiumoxid unterworfen werden. Dabei bleiben die farbigen Verunreinigungen auf der Säule, während die aktiven Fraktionen nach Ersatz des Acetons durch Chloroform farblose Fällungsprodukte mit Petrcläther liefern.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Gewinnung des Makrolid-Antibiotikums Turimycin besteht darin, daß Turimycin aus den durch Zugabe von Oxalsäure geklärten Kulturfiltraten bei pH = 8 mit Butylacetat extrahiert und aus dem Extrakt mit 0,01 η Schwefelsäure reextrahiert wird. Anschließend können

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die neutralisierten Reextrakte eingeengt werden, und danach wird das Antibiotikum bei pH = 8 mit Chloroform extrahiert. Die konzentrierten Chloroformlösungen werden in Petroläther eingetropft, wobei die Turimycin-Base ausfällt. Rohbasen lassen sich durch Säulenchromatographie einer acetonischen Lösung an Aluminiumoxid nach Brockmann reinigen. Die biologisch aktiven Acetoneluate werden evaporiert, in Chloroform aufgenommen und das Turimycin mit Petroläther gefällt. Nach einer anderen Ausbildungsform des Verfahrens lassen sich Rohbasen außerdem reinigen durch Adsorption an Kationenaustauscher, vorteilhaft Wofatit CP300 in der H+-Form, Elution mit sauren oder basischen Pufferlösungen, besonders Ammoniak-Ammoniumchlor id -Puff er (pH = 9,5) oder Citratpuffer (pH = 4,9), nachfolgende Extraktion der Base mit Chloroform bei pH = 8 und Ausfällen des Turimycins in Petroläther. Sinngemäß läßt sich dieses Verfahren auch zur Gewinnung des Antibiotikums Turimycin aus dem Kulturfiltrat anwenden.

Turimycin bildet bei Fällung eine weiße, amorphe Substanz, bei ümkristallisation farblose Nadeln mit dem Schmelzpunkt 129 bis 34 ⁰C, der spezifischen Drehung von l^al_D = -66,0 ⁰C ± 0,2 ⁰C, (c = 2 in Methanol), dem UV-Maximum bei 232 und bis 82 nm sowie dem Molgewicht 865. Turimycin ist gut löslich in Chlorkohlenwasserstoffen, Estern, Äther, Ketonen, Methanol, Benzol, schwerlöslich in Wasser und Petroläther. Als Base bildet Turimycin mit Säuren Salze.

So kann z.B. Turimycin-Tartrat durch Gefriertrocknung einer wäßrigen Lösung von äquimolaren Mengen Turimycin-Base und Weinsäure oder durch Ausfällen des Salzes aus einer Acetonlösung von äquimolaren Mengen Base und Weinsäure mit Äther erhalten werden. Das farblose Salz mit dem Schmelzpunkt von 135 bis 38 ⁰C ist gut in Wasser, Alkoholen und Aceton löslich, schwerlöslich in Äther und Petroläther.

Mit Pikrinsäure wird ein schwerlösliches Pikrat vom Schmelzpunkt 129 bis 131 ⁰C erhalten.

Der Schmelzpunkt des Acetylderivates liegt bei 120 bis 127 ⁰C, des Thiosemicarbazons bei 138 bis 140 ⁰C und des 2,4-Dinitrophenylhydrazons bei 126 bis 130 ⁰C.

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Nach dem chemisch-physikalischen Verhalten ist Turimycin mit Leucomycin (Kitasamycin) vergleichbar, jedoch sind Unterschiede im chromatographischen Verhalten feststellbar. Turimycin und Kitasamycin lassen sich durch absteigende Papierchromatographie mit butylacetatgesättigtem Phosphatpuffer (pH = 8) als Laufmittel in 5 bis 8 Komponenten auftrennen. Dabei zeigt sich qualitativ eine Identität der einzelnen Komponenten, jedoch sind quantitativ Unterschiede zu verzeichnen.

Durch dünnschichtchromatographische Trennungen nach der Keilstreifentechnik auf Kieselgelplatten mit dem Laufmittelsystem Benzol : Essigester : Methanol =7:3:1 werden nach 3maliger Entwicklung und anschließendem Anfärben mit 5%iger Phosphorwclframsäure in 10%iger Schwefelsäure Turimycin und Kitasamycin in fünf identische Komponenten mengenmäßig unterschiedlicher Zusammensetzung aufgetrennt, wobei bei Turimycin noch eine und bei Kitasamycin noch vier zusätzliche Komponenten auftreten, die nicht identisch sind.

Auf Grund dieser chromatographischen Befunde ist Turimycin ebenso ein Komplex wie Leucomycin. Dabei zeigten sich neben qualitativen Unterschieden einzelner Komponenten auch noch quantitative Unterschiede bei den identischen Komponenten. Turimycin zeigt im Agardiffusions- bzw. Röhrchentest folgendes Wirkungsspektrum:

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Tabelle 2

Testorganismus	Kleinste Hemm
Prüfungsmethode	konzentration
	A 6599-Base
	mcg/ml

Agardxffusionstest

Bacillus subtilis ATCC 6633 8

Micrococcus pyogenes var.aureus SG 511 8

Sarcina lutea SG 125 4

Bacillus globifer OH 11 4

Bacillus globifer EH 11 (Erythromycin resistent) 16

Bacillus mycoides SG 7 56 8 Bacillus mycoides SG 7 56 TF (Oxytetracyclin resistent) 4

Mycobacterium phlei SG 346 16

Mycobacterium smegmatis SG 987 64

Rohrchenverdünnungstest

Mycoplasma gallisepticum 0,1 (bakterio-

statisch)

Mycoplasma hyorhinis 3,8 (bakterio·

statisch)

Toxizitäts-lest:

Die LD50 wurde an weißen Mäusen vom ABAF^-Hybrid-Stamm bestimmt.

Art der Verabreichung ^^50

mg Turimycin-Tartrat/kg Maus

Injektion: intraperitoneal 1050

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert, aber nicht begrenzt.

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Beispiel 1:

Für die Impfkultur werden durch lyophile Trocknung an Trägermaterial wie sterilisierte Erde oder Magermilch hergestellte Sporenkonserven des Stammes JA 6599 auf Agarnährböden folgender Zusammensetzung vermehrt:

Hafermehl 2,0%	II. Saccharose	0,3%	,0
Agar-Agar 2,0%	Dextrin	1,5%
dest.Wasser	Harnstoff	0,01%
pH 7,0	NaCl	0,05%
	KH₂PO₄	0,05%
	Hefeextrakt	0,1%
	bakt.Pepton	0,5%
	FeSO₄·7Η₂Ο	0,001
	Agar-Agar	3,0%
	dest.Wasser
	pH 6,8 bis 7

Als Vorkulturmedium für die Anzucht des Impfmaterials in Submerskultur hat sich das folgende Nährsubstrat bewährt:

Glukose 1,5%

Maisquellwasser (Trockensubstanz) 1,0%

Hefeextrakt oder Trocken-Hefe 0,5%

CaCO₃ 0,3%

Trinkwasser

pH 6,8 bis 7,0 nach Sterilisation,

Dieses Nährmedium wird zu 50 ml in 500 ml Steilbrustflaschen abgefüllt, 35 min bei 120 ⁰C sterilisiert und nach dem Erkalten mit einer Sporensuspension von Schrägagarkulturen beimpft. Diese Kölbchen werden anschließend zwei Tage bei 29 bis 30 ⁰C geschüttelt und als Submerskultur (in einer Menge von 5 Vol.-%) zur Beimpfung des nachstehend aufgeführten Fermentationsnährbodens verwendet.

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Zuckerrüben-Melasse 0,5%

Glukose 0,5%

Kartoffelstärke 4,0%

Sojabohnenmehl 2,0%

Hefeextrakt 0,1%

CaCO₃ 0,2%

Sonnenblumenöl· 0,1% Trinkwasser

pH = 6,8 bis 7,0 (nach Sterilisation).

500 ml Steilbrustflaschen werden mit 50 ml der aufgeführten Nährlösung beschickt, 35 min bei 120 ⁰C sterilisiert und nach dem Erkalten mit 5 Vol.-% der 48 h alten Vorkultur beimpft. Anschließend werden diese Kolben bei 29 bis 30 ⁰C geschüttelt. Nach 72, 96 und 120 h wird die Antibiotikumbildung mikrobiologisch bestimmt. Die Testung erfolgt im Agardiffusionsplattentest gegen Bacillus subtilis ATCC 6633. Das Maximum der Antibiotikumbildung liegt zwischen dem 3. und 5. Fermentationstag.

Beispiel 2:

Die Kultivierung in größerem Maßstab erfolgt in Fermentern. Für die Anzucht des Impfmaterials wird dasselbe Nährmedium eingesetzt wie in Beispiel 1 angegeben. Es werden 1 bis 2 Vol.-% der 48 h alten 1. Vorkultur zur Beimpfung einer 2. Vorkultur mit dem gleichen Nährmedium verwendet, das zu 400 ml in 2-1-Stehkolben abgefüllt ist und unter denselben Kulturbedingungen, wie beschrieben, geschüttelt wird. Entsprechende Impftanks z.B. mit einem Nutzvolumen von 20 1 bzw. 150 1 werden mit dem genannten Vorkulturmedium beschickt, mit 0,5% einer 2. Vorkultur beimpft und unter Belüften und Rühren 24 h kultiviert. Die so gewonnene Submerskultur wird als Impfmaterial für größere Fermentationstanks in einer Menge von 5 Vol.-% verwendet.

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Fermentationsmedium

Zuckerrüben-Melasse 0,5%

Dextrosesaft (auf Glukose berechnet) 0,5%

Kartoffelstärke 4,0%

Sojabohnenmehl 2,0%

Trockenhefe 0,3%

CaCO₃ 0,2%

Sonnenblumen-Rohöl 0,5% Trinkwasser pH 6,8 bis 7,0 nach Sterilisation.

Die Fermentation erfolgt bei 29 bis 30 ⁰C unter Belüften und Rühren. Nach einer Kulturdauer von 3 bis 4 Tagen wird die maximale Antibiotikumbildung erreicht,

Beispiel 3:

Von 1200 1 Kulturlösung mit 275 y/ml wird nach Kühlen auf 5 ⁰C und Ansäuern mit Oxalsäure auf pH = 3 das Mycel durch Separieren abgetrennt. Nach der Neutralisation der wäßrigen Lösung mit Natronlauge wird klar separiert und das Kulturfiltrat nach dem Einstellen des pH-Wertes auf 8 mit 400 Butylacetat extrahiert. Die Reextraktion des Butylacetatextraktes erfolgt mit 80 1 0,01 η Schwefelsäure. Der sofort neutralisierte Reextrakt wird auf 20 1 eingeengt und der pH-Wert mit Natronlauge auf 8 gebracht. Anschließend wird zweimal mit 5 und 2,5 1 Chloroform extrahiert und die vereinigten Chloroformextrakte auf 0,3 1 eingeengt. Durch Eintropfen des Chloroformkonzentrates unter Rühren in 5 1 Petroläther fällt die Turimycin-Base aus. Ausbeute: 110 g, Schmelzpunkt = 118 bis 122 ⁰C.

Beispiel 4:

52 g rohe Turimycin-Base werden in 200 ml Aceton gelöst, mit 20 g Aktivkohle gereinigt und über 1 kg Aluminiumoxid nach Brockmann mit Aceton als Elutionsmittel chromatographiert. 1 1 aktive Acetoneluate werden evaporiert, der Rückstand in

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150 ml Chloroform gelöst und die Chloroformlösung unter Rühren in 3 1 Petroläther getropft. Die gereinigte Base wird abgesaugt und getrocknet

Ausbeute: 41 g, Schmelzpunkt: 128 bis 134 ⁰C.

Beispiel 5:

50 g rohe Turimycin-Base werden in 150 ml Aceton gelöst,

10 g Aktivkohle zugegeben und über 500 g Aluminiumoxid nach Brockmann chromatographiert. Die aktiven Acetoneluate ergeben nach dem Evaporieren 45 g gereinigte Base als Trockenrückstand, Dieser wird in 50 ml Aceton aufgenommen und mit 13g Weinsäure in 300 ml Aceton versetzt. Unter Rühren wird dieses Gemisch in 4 1 Äther eingetropft, wobei das Turimycin-Tartrat ausfällt.

Ausbeute: 35 g, Schmelzpunkt: 134 bis 138 ⁰C. Aus der Mutterlauge lassen sich weitere 7 g gewinnen.

Beispiel 6:

51 g gereinigte Turimycin-Base werden in einer Lösung von 13,5 g Weinsäure in 1C0 ml Wasser aufgelöst, die Lösung mit 10 g Aktivkohle entfärbt und nach dem Filtrieren lyophil getrocknet.

Ausbeute: 58 g, Schmelzpunkt: 133 bis 137 ⁰C.

Claims

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Erfindungsanspruch:

Verfahren zur Gewinnung eines Makrolid-Antibiotikums durch Züchtung eines Streptomyces-Stammes unter aeroben Kulturbedingungen in einem flüssigen Nährmedium mit entsprechenden Kohlenstoff- und Stickstoffquellen sowie Mineralsalzen, dadurch gekennzeichnet,

daß als Stamm Streptomyces hygroscopicus JA 6599 oder seine Varianten oder Mutanten eingesetzt werden, die Züchtung in geeigneten Nährmedien bei einer Temperatur von 28 bis 3 2 ⁰C während 2 bis 5 Tagen unter Belüften und Rühren durchgeführt wird und schließlich das Antibiotikum nach Abtrennung der Feststoffe durch Extraktion mit Halogenkohlenwasserstoff en, Ketonen oder Estern, vorzugsweise mit Butylacetat, nachfolgende Reextraktion mit sauren Pufferlösungen oder verdünnten Säuren, erneute Extraktion mit Halogenkohlenwasserstoffen oder Estern, vorzugsweise mit Chloroform, Ausfällen der Base aus dem Chloroformkonzentrat mit Petroläther und gegebenenfalls durch Säulenchromatographie in reiner Form gewonnen wird.

Hierzu 4 Seiten Tabellen