DD298267A5 - PROCESS FOR IMMOBILIZING LIPASE, BETA-GALACTOSIDASE OR INVERTASE - Google Patents
PROCESS FOR IMMOBILIZING LIPASE, BETA-GALACTOSIDASE OR INVERTASE Download PDFInfo
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Landscapes
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipase, b-Galactosidase oder Invertase. Anwendungsgebiet ist die Biotechnologie. Erfindungsgemaesz werden Lipase, b-Galactosidase oder Invertase direkt oder ueber eine Ankersubstanz an ein schwerloesliches Traegermaterial gebunden, das mehrwertige Metallionen an der Oberflaeche enthaelt. Die Bindung erfolgt ueber heterobifunktionelle Verbindungen, in denen eine Gruppe direkt oder nach Aktivierung mit Lipase, b-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls einer Ankersubstanz und eine zweite Gruppe unter Chelatbildung mit den Metallionen des Traegermaterials reagiert. Durch eventuelle Nachbehandlung des Immobilisates mit anderen bifunktionellen Verbindungen wird die Oberflaeche weiterhin modifiziert.{Immobilisierung; Lipase, b-Galactosidase; Invertase; Traeger; Ankersubstanz; Metallionen; Chelatbildner; Reagenzien, bifunktionell; Nachbehandlung}The invention relates to a method for the immobilization of lipase, b-galactosidase or invertase. Field of application is biotechnology. According to the invention, lipase, b-galactosidase or invertase are bound directly or via an anchor substance to a non-soluble carrier material which contains polyvalent metal ions on the surface. The binding takes place via heterobifunctional compounds in which a group reacts directly or after activation with lipase, b-galactosidase or invertase or optionally an anchor substance and a second group with chelation with the metal ions of the carrier material. Any subsequent treatment of the immobilizate with other bifunctional compounds further modifies the surface {immobilization; Lipase, b-galactosidase; invertase; Carrier; Anchor substance; Metal ions; chelating agents; Reagents, bifunctional; aftertreatment}
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase an schwerlösliche Trägermaterialien. Anwendungsgebiet der Erfindung ist die Herstellung von Immobilisaten, die in der Biotechnologie (Stoffwandlung und Festphasendiagnostik) eingesetzt werden.The invention relates to a method for the immobilization of lipase, β-galactosidase or invertase to poorly soluble carrier materials. The field of application of the invention is the production of immobilizates used in biotechnology (metabolism and solid phase diagnostics).
Es ist bekannt, daß Biomakromoleküle an schwerlösliche Feststoffe durch Adsorption, Ionenaustausch oder kovalente Bindung immobilisiert werden. Die letztere Methode ist besonders gut zur Erzeugung stabiler Bindungen geeignet. Kovalente Bindung erfolgt nach einer chemischen Modifizierung (Aktivierung) des Feststoffes und/oder der zu immobilisierenden Verbindung. Als Feststoffe werden natürliche Stoffe (Mineralien, Chitin, Zellulose u.a.) und synthetische anorganische Stoffe (Glas, Silikate u. a.) oder organische Polymere eingesetzt. Für kontinuierliche technisch durchgeführte Prozesse werden anorganische Feststoffe als Trägermaterialien aufgrund ihrer guten mechanischen Eigenschaften bevorzugt. Sie erfordern jedoch als ersten Schritt der Immobilisierung in der Regel eine Funktionalisierung durch reaktionsfähige Überzüge.It is known that biomacromolecules are immobilized on sparingly soluble solids by adsorption, ion exchange or covalent bonding. The latter method is particularly well suited to the generation of stable bonds. Covalent bonding occurs after a chemical modification (activation) of the solid and / or the compound to be immobilized. As solids, natural substances (minerals, chitin, cellulose, etc.) and synthetic inorganic substances (glass, silicates, etc.) or organic polymers are used. For continuous technical processes, inorganic solids are preferred as support materials because of their good mechanical properties. However, as a first step of immobilization they usually require functionalization by reactive coatings.
Es sind Verfahren zum Aufbringen organischer Beschichtungen auf organische oder anorganische Feststoffe bekannt, die unter Verwendung von bifunktionellen Silanen zu einer Funktionalisierung führen. Dabei wird ein Silan der allgemeinen Formel (RiO)3SiR2 (mit Ri einem Alkyl-, Rj einem Vinyl-, γ-Aminopropyl-, Epoxi-, Alkyl-, SH- oder anderem Rest) in organischer oder waßrig-organischer Lösung eingesetzt und das Primäprodukt unter Bildung von C-O-Si, Metall-O-Si- und/oder Si-O-Si-Bindungen bei erhöhter Temperatur kondensiert. Beides, die Verwendung organischer Lösungsmittel und Kondensation bei erhöhter Temperatur sind relativ kostenaufwendig ebenso wie die Herstellung der Silane (U. Deschler, P. Kleinschmh* und P.Panster, Angew. Chem. 98 [1986] 237-253).Methods are known for applying organic coatings to organic or inorganic solids which result in functionalization using bifunctional silanes. In this case, a silane of the general formula (RiO) 3 SiR 2 (with Ri is an alkyl, Rj is a vinyl, γ-aminopropyl, epoxy, alkyl, SH or other radical) used in organic or aqueous-organic solution and condensing the primary product to form CO-Si, metal-O-Si and / or Si-O-Si bonds at elevated temperature. Both, the use of organic solvents and condensation at elevated temperature are relatively expensive as well as the production of silanes (U. Deschler, P. Kleinschmh * and P. Panster, Angew Chem 98 (1986) 237-253).
Die Immobilisierung von Biomakromolekülen an derart silanisierte Träger erfolgt durch direkte Kopplung (z. B. Reaktion vonImmobilization of biomacromolecules to such silanized supports is accomplished by direct coupling (eg, reaction of
Aminogruppen des Biomakromoleküls mit Epoxisilan), nach Modifizierung der Überzugsschicht (z. B. γ-Aminopropylsilan durch bifunktionelle Verbindungen wie Dialdehyde, Carbodiimide, Chinone u.a.) oder nach Modifizierung des Biomakromoleküls (z. B.Amino groups of the biomacromolecule with epoxysilane), after modification of the coating layer (eg γ-aminopropylsilane by bifunctional compounds such as dialdehydes, carbodiimides, quinones, etc.) or after modification of the biomacromolecule (eg.
Perjodatoxidation von Qlycoproteinen zu aldehydhaltigen Proteinen, Einführung von polymerisierbaren DoppelbindungenPeriodate oxidation of Qlycoproteins to aldehyde-containing proteins, introduction of polymerizable double bonds
Nachteil dieses Verfahrens ist der mehrstufige Prozeß der Silanisierung und Kondensation.Disadvantage of this method is the multi-stage process of silanization and condensation.
Weiterhin sind seit einigen Jahren Verfahren zum Patent angemeldet worden, in denen die Silanisierung durch Anwendung heterobifunktioneller Verbindungen ersetzt wird (EP 218506, EP 273756). Diese heterobifunktionellen Verbindungen enthalten im Molekül mindestens eine reaktive Gruppe, die direkt oder nach Aktivierung mit Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase reagiert sowie eine oder mehrere phosphorhaltige Gruppen, die mit einem metallionenhaltigen Trägermaterial wenig dissoziierende Verbindungen ergeben (Chelate). Mit diesem Verfahren sind gute Immobilisierungsausbeuten erzielt worden. Die Auswaschstabilität der immobilisierten Lipase, ß-Gaiactosidase oder Invertase ist aber nicht ausreichend.Furthermore, patent applications have been filed for some years in which the silanization is replaced by the use of heterobifunctional compounds (EP 218506, EP 273756). These heterobifunctional compounds contain in the molecule at least one reactive group which reacts directly or after activation with lipase, .beta.-galactosidase or invertase, and one or more phosphorus-containing groups which give chelates with a metal ion-containing carrier material little dissociating compounds. Good immobilization yields have been achieved with this process. However, the washout stability of the immobilized lipase, β-galactosidase or invertase is not sufficient.
Darüber hinaus ist es gelungen (EP 273756), durch kurzkettige Phosphorsäurederivate einen nachträglichen Oberflächenschutz von oxidischen Oberflächen zu erzielen, der die Auflösung von Trägermaterialien bei niedrigen und hohen pH-Werten weitgehend unterdrückt.In addition, it has been possible (EP 273756), by short-chain phosphoric acid derivatives to achieve a subsequent surface protection of oxidic surfaces, which largely suppresses the dissolution of support materials at low and high pH.
Bei Chelatbildnern, die keinen Phosphor enthalten, ist bekannt, daß besonders stabile Komplexe entstehen, wenn die Bildung der Komplexe unter Ausbildung von 5- und 6-Ringstrukturen verläuft. Dieser Effekt wird in der Färberei genutzt, wo durch Nachbehandlung gefärbter Textilien mit Metallsalzen, vorwiegend Aluminiumsalzen, schwerlösliche und stabile „Farblacke" erzeugt werden. Zur Immobilisierung von Biokatalysatoren wurden derartige Verbindungen nicht eingesetzt.In the case of chelating agents which do not contain phosphorus, it is known that particularly stable complexes are formed when the formation of the complexes proceeds to form 5- and 6-ring structures. This effect is used in dyeing, where after-treatment of dyed textiles with metal salts, predominantly aluminum salts, produces sparingly soluble and stable "lakes." Such compounds were not used to immobilize biocatalysts.
Ziel der ErfindungObject of the invention
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren zur Immobilisierung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase zu entwickeln, das zu wiederverwendbaren Biokatalysatoren mit hohen Fixierungsai/sbeuten und Auswaschstabilitäten führt.The object of the invention is to develop a method for the immobilization of lipase, β-galactosidase or invertase which leads to reusable biocatalysts with high fixation yields and washout stabilities.
Darlegung dos Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention
Auigabe der Erfindung ist es, die Auswaschbeständigkeit der immobilisierten Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase durch geeignete Kombination chelatbildender Gruppen im Kopplungsreagenz bei gleichzeitig hohen Immobilisierungsausbeulen zu verbessern. Erfindungsgemäß werden Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls eine Ankersubstanz zur nachträglichen Bindung des Enzyms, über heterobifi nktionelle Verbindungen an schwerlösliche Trägermaterialien gebunden, die an inneren oder äußeren Oberflächen Ionen mehrwertiger Metalle enthalten. Als heterobifunktionelle Verbindungen werden Verbindungen benutzt, bei denen eine funktioneile Gruppe, gegebenenfalls unter Verwendung eines Aktivierungsreagenz, mit der zu immobilisierenden Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz und eine zweite Gruppierung mit den Metallionen der Matrix reagiert.The object of the invention is to improve the washout stability of the immobilized lipase, β-galactosidase or invertase by suitable combination of chelating groups in the coupling reagent with simultaneously high immobilization bulges. According to the invention, lipase, .beta.-galactosidase or invertase or optionally an anchor substance for subsequent binding of the enzyme are bonded via heterobifunctional compounds to sparingly soluble support materials which contain ions of polyvalent metals on inner or outer surfaces. Heterobifunctional compounds used are compounds in which a functional group, if appropriate using an activating reagent, reacts with the lipase to be immobilized, .beta.-galactosidase or invertase or optionally the anchor substance and a second moiety with the metal ions of the matrix.
Gegebenenfalls wird die Oberfläche des Trägers durch Nachbehandlung mit einer weiteren bifunktionellen Verbindung modifiziert. Als Trägermaterialien werden anorganische Materialien, organische Materialion oder Composite aus beiden verwandt, bei denen sich an der äußeren Oberfläche und/oder an der Oberfläche von Poren im Innern des Materials, gegebenenfalls als nachträglich aufgebrachte Überzugsschicht, Ionen mehrwertiger Metalle befinden.Optionally, the surface of the support is modified by post-treatment with another bifunctional compound. The carrier materials used are inorganic materials, organic material ions or composites of both, in which ions of polyvalent metals are present on the outer surface and / or on the surface of pores in the interior of the material, optionally as a subsequently applied coating layer.
Metallionenhaltige Überzugsschichten auf dem Trägermaterial werden durch dessen Umsetzung mit einer metallorganischen Verbindung (z.B. Tetraethoxyzirkonat), einem Metallsalz (z.B. Ammoniummolybdat), einem Metallkomplex (z.B. Eisen-(lll)-hexacyanoferrat-(ll)), einem Metailhalogenid (z. B. Titantetrachlorid), einem Oxy- oder Hydroxysalz (z. B. Zirkonoxychlorid) erzeugt.Metal ion-containing coating layers on the support material are formed by reacting it with an organometallic compound (eg, tetraethoxyzirconate), a metal salt (eg, ammonium molybdate), a metal complex (eg, iron (III) hexacyanoferrate (II)), a metal halide (eg, titanium tetrachloride ), an oxy or hydroxy salt (eg zirconium oxychloride).
Anorganische Trägermaterialien sind schwer lösliche natürliche oder synthetisch hergestellte Oxide, Salze, Mineralien, Gläser oder Keramiken, die gegebenenfalls aus einem ferromagnetischen Material bestehen oder ferromagnetische Bereiche enthalten.Inorganic carrier materials are sparingly soluble natural or synthetically produced oxides, salts, minerals, glasses or ceramics, which optionally consist of a ferromagnetic material or contain ferromagnetic regions.
Als organische Trägermaterialien werden Polymere eingesetzt, die mit den beschriebenen Metallverbindungen unter Bildung einer metallionenhaltigen Überzugsschicht reagieren.As organic support materials, polymers are used which react with the described metal compounds to form a metal ion-containing coating layer.
Bei Trägermaterialien aus anorganisch-organischen Compositen werden erstens Composite benutzt, bei denen die Eigenschaften der anorganischen Träger, wie Abriebfestigkeit oder \ erformbarkeit durch das organische Material verbessert werden, wobei dieses organische Material einen metallionenhaltigen Überzug zur Immobilisierung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertasen besitzt oder ein nicht reaktives Material ist, das lediglich als Füllstoff dient oder ein Material ist, in (Jem oder an dem nach bekannten Verfahren Enzyme oder andere Biomaterialien (z. B. Zellen, Proteine, Polysaccharide u.a.) immobilisiertIn support materials of inorganic-organic composites, composites are first used, in which the properties of the inorganic support, such as abrasion resistance or \ erformbarkeit be improved by the organic material, said organic material having a metal ion-containing coating for immobilizing lipase, beta-galactosidase or invertases or a non-reactive material serving merely as a filler or being a material is immobilized in or on the enzyme or other biomaterials (eg, cells, proteins, polysaccharides, etc.) by known methods
Als Trägermateriaüen werden zweitens anorganisch-organische Composite benutzt, in denen ein organisches Material einen Metallionenüberzug erhält, der zur Immobilisierung von Lipase, ß-Gahctosidase oder Invertase benutzt wird. Durch Zusatz der anorganischen Komponente wird der Composit in seinen Eigenschaften, zum Beispiel der Druckfestigkeit, verbessert.Secondly, inorganic-organic composites are used as support materials in which an organic material obtains a metal ion coating which is used for the immobilization of lipase, β-galactosidase or invertase. By adding the inorganic component, the composite is improved in its properties, for example the compressive strength.
Metallionen an der Oberfläche der Trägermaterialien sind Ionen von Elementen der zweiten bis fünften Haupt- oder der Nebengruppen des Periodensystems, einschließlich der Lanthaniden.Metal ions on the surface of the support materials are ions of elements of the second to fifth major or minor groups of the periodic table, including the lanthanides.
Das heterobifunktioneile Reagenz enthält als funktioneile Gruppe, die mit Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder der Ankersubstanz direkt reagiert, eine Säureazld-, eine Säurehalogenid-, eine Säureanhydrid-, eine Isocyanat-, eine Isothiocyanate eine aktivierte Ester-, eine Disulfid-, eine Aldehyd- oder eine Diazogruppe.The heterobifunctional reagent contains, as a functional group which reacts directly with lipase, β-galactosidase or invertase or the anchor substance, an acid aide, an acid halide, an acid anhydride, an isocyanate, an isothiocyanate an activated ester, a disulfide, an aldehyde or a diazo group.
Das heterobifunktioneile Reagenz enthält als funktioneile Gruppe, die nach Reaktion mit einem Aktivierungsreagenz mit Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder gegebenenfalls der Ankersubstanz reagiert, eine Amino-, Hydrazino-, Säureamid-, hydrazid-, -halogenid-, -anhydrid-, -thioamid-, -imid-, Ester-, Lactam-, Lacton-, Carboxyl-, Carbonyl-, Nitril-, Oxim-, Hydroxyl-, Sulfhydryl-, Halogen-, Alken-, Alkin- oder eine CH-acide Gruppe.The heterobifunctional reagent contains, as a functional group which reacts after reaction with an activating reagent with lipase, β-galactosidase or invertase or optionally the anchor substance, an amino, hydrazino, acid amide, hydrazide, halide, anhydride, thioamide, imide, ester, lactam, lactone, carboxyl, carbonyl, nitrile, oxime, hydroxyl, sulfhydryl, halogen, alkene, alkyne, or a CH-acid group.
Das heterobifunktioneile Reagenz enthält als zweite funktionell Gruppierung eine cheiatbiidende Gruppierung, die aus einer oder mehreren Gruppen mit der Fähigkeit zur Bildung von Hauptvalenzbindungen und mindestens einer Gruppe mit der Fähigkeit zur Bildung von Nebenvalenzbindungen besteht. Derartige cheiatbiidende Gruppierungen enthalten Moiekülbereiche mit Strukturen nach Formel 1—XXII der folgenden Abbildung:The heterobifunctional reagent contains, as a second functional moiety, a chewing moiety consisting of one or more groups capable of forming major valence bonds and at least one group having the ability to form secondary valence bonds. Such chiliating groups contain moieties with structures according to formula 1-XXII of the following figure:
Y XZ XX Z / III Il Il Y XZ XX Z / III Il Il
R-C-X R-N-Y R-C-Y R-C-C-Y R-C-C1-C2=ZRCX RNY RCY RCCY RCC 1 -C 2 = Z
Y YY Y
(I) (ID (IU) (IV) (V)(I) (ID (IU) (IV) (V)
X XY ZZ XXYX XY ZZ XXY
R-C-C1-C2=Zi-) R-C-C1-C2- .R2-C-C-C-R2 R-C-C1-C-C2-Co=RCC 1 -C 2 = Zi-) RCC 1 -C 2 - .R 2 -CCCR 2 RCC 1 -CC 2 -Co =
(VI) (VII) (VIII) (IX)(VI) (VII) (VIII) (IX)
X YX Y YYXYX Y YY
R-N R-N R-N+-X U-C-Y R-C-Co-C-Co-RN RN RN + -X UCY RC-Co-C-Co
X Y XYX Y XY
(X) (XI) (XII) (XIII) (XIV)(X) (XI) (XII) (XIII) (XIV)
ZX XX XXX Y γZX XX XXX Y γ
HI Il I I I Il IHI II I I I Il
R-C-C1-C-C2- R-C-C1-C2- R-C-C-C- R-C-C2-C1-R5-C1-C2-RCC 1 -CC 2 - RCC 1 -C 2 - RCCC-RCC 2 -C 1 -R 5 -C 1 -C 2 -
(XV) (XVI) (XVII) (XVIII)(XV) (XVI) (XVII) (XVIII)
x Y ζζχ.γx Y ζζχ.γ
11---C1=N- R-NH-N-C-R5-C1-C2- R-C-C-NH-C- R-C-C-C-N11 --- C 1 = N-R-NH-NCR 5 -C 1 -C 2 - RCC-NH-C-RCCCN
(XIX) (XX) (XXI) (XXII)(XIX) (XX) (XXI) (XXII)
wobei R den Molekülteil darstellt, an dem sich über aliphatische, aromatische oder heterocyclische, gegebenenfalls substituierte oder Heteroatome enthaltende Gruppierungen gebunden, die zur kovalenten Enzymbindung notwendige funktionelle Gruppe befindet, undwherein R represents the moiety bonded to aliphatic, aromatic or heterocyclic, optionally substituted or heteroatom-containing moieties, the functional group necessary for covalent enzyme bonding, and
X: -ORn-SRw-NR1R2, NO,-NR1OH,-R4OH,X: -ORn-SRw-NR 1 R 2 , NO, -NR 1 OH, -R 4 OH,
Y: -COORI1-R4-COOR11-O-R4-COORW-NH-R4-COOR11-S-R4-COORW-CONR1R21-CONHOH1-PO3H21-R4-PO3H21-NHOh, -SO3^-OH1-H,Y: -COORI 1 -R 4 -COOR 11 -OR 4 -COORW-NH-R 4 -COOR 11 -SR 4 -COORW-CONR 1 R 21 -CONHOH 1 -PO 3 H 21 -R 4 -PO 3 H 21 -NHOh, -SO 3 ^ -OH 1 -H,
Z: =0, =S, =NH, =NOH, =N-in einem heterocyclischen Ring, R1: -H.einAlkylrest,Z: = 0, = S, = NH, = NOH, = N-in a heterocyclic ring, R 1 : -H.einAlkylrest,
R2: -H, -NH2, ein Alkylrest, ein cyclischer Molekülrest, R3: ein aromatischer oder heterocyclischen Molekülrest, R4: einAlkylen-.Arylen-oderAralkylenrest, Re: eine-N=N-odereine-CH=N-Gruppeund C1 'jnd Cj Teile eines Kettenmoleküls, eines Ringes oder Ringsystems sein können.R 2 : -H, -NH 2 , an alkyl radical, a cyclic molecule radical, R 3 : an aromatic or heterocyclic molecule radical, R 4 : an alkylene-.Arylen or aralkylene radical, Re: a-N = N-or -CH = N- Group and C 1 'and C j may be parts of a chain molecule, a ring or a ring system.
Wesentlich Ist, daß als chelatbildende Gruppierungen Molekülstrukturen genutzt werden, bei denen die Ausbildung von Haupt- und Nebenvalenzen zwischen derchelatbildenden Gruppierung im heterobifunktionellen Reagenz, gegebenenfalls chelatbildender Gruppen im Enzymmolekül und Metaliionen des Trägers zu einer fünf- oder sechsgliedrigen Ringstruktur führt.It is essential that molecular structures are used as chelating groups in which the formation of major and minor valences between the chelating group in the heterobifunctional reagent, optionally chelating groups in the enzyme molecule and metal ions of the carrier leads to a five- or six-membered ring structure.
Bevorzugt werden als chelatbildende Gruppierungen eingesetzt: 1 -Hydroxy- oder 1 -Amino-1,1 -bisphosphonsäuren, Malonsäurederivate (I), Sideramine (II), Alphaketocarbonsäuren, Dithiocarbamate (III), 2-Hydroxy-, 2-Sulfhydryl- oder 2-Aminosäuren nach Formel (I), (IV), Diketone oder Bis-chinone, deren Mono- oder Dioxime (V), Alphahydroxyketone, -ketoxime, Heterocyclen mit zum Ringstickstoff benachbarten Hydroxylgruppen, z.B. 8-Hydroxychinolin (Vl), 2-Nitrosonaphtol, Salicylate, Sulfosalicylate, Aluminon, Eriochromcyanin R (VII), Acetessigester-, Acetylaceton- oder Malonesterderivate (VIU),Preference is given to using chelating groups: 1-hydroxy or 1-amino-1,1-bisphosphonic acids, malonic acid derivatives (I), sideramines (II), alphaketocarboxylic acids, dithiocarbamates (III), 2-hydroxy, 2-sulfhydryl or 2 -Aminosäuren according to formula (I), (IV), diketones or bis-quinones, their mono- or dioximes (V), alphahydroxyketones, -ketoxime, heterocycles having adjacent to the ring nitrogen hydroxyl groups, eg 8-hydroxyquinoline (VI), 2-nitrosonaphthol, salicylates, sulfosalicylates, aluminon, eriochrome cyanine R (VII), acetoacetic ester, acetylacetone or malonate derivatives (VIU),
^otropsäure, Hydroxynaphtoesäure, Eriochromschwarz T (IX), Aminoalkohole (X: -R4OH) (X), Iminoessigsäuren oder Iminobispliosphonsäuren (Xl), quartäre Ammoniumverbindungen (XiI), Tricarbon- oder Triphosphonsäurederivato, gegebenenfalls über Ether- oder Thioetherbrücken gebunden (XIII), aromatische Dicarbonsäuren, 2. B. 2-Nitro-4,3',5'-diphenylethertricarbonsäure (XIV), Alizarin S, Gallocyanin (XV), Brenzkatechin, -violett, Pyrogallol oder -rot (XVI), BAL- (Britisch Anti Lewisit) derivate (XVII), Benztriazol, 2-(o-Hydroxyphenyl)benzoxazol, o-substituierte Diazoverbindungen oder Schiffsche Basen (XVIII), Mercaptobenzthiazol, Mercaptophenylthiodiazolon oder Cyanursäurederivate (XiX), Formazane, Dithizon- oder Cyanessigsäurederivate (XX), p-Dimethylaminobenzylidenrhodanin (XXI) oder o-Hydroxybenzyliminodiessigsäurederivate (XXII).^ otropic acid, hydroxynaphthoic acid, eriochrome black T (IX), amino alcohols (X: -R 4 OH) (X), iminoacetic acids or iminobispliosphonic acids (XI), quaternary ammonium compounds (XiI), tricarboxylic or triphosphonic acid derivato, optionally linked via ether or thioether bridges ( XIII), aromatic dicarboxylic acids, 2. B. 2-nitro-4,3 ', 5'-diphenylethertricarboxylic acid (XIV), alizarin S, gallocyanine (XV), catechol, -violet, pyrogallol or -red (XVI), BAL- (British anti Lewisite) derivatives (XVII), benzotriazole, 2- (o-hydroxyphenyl) benzoxazole, o-substituted diazo compounds or Schiff bases (XVIII), mercaptobenzothiazole, mercaptophenylthiodiazolone or cyanuric acid derivatives (XiX), formazans, dithizonic or cyanoacetic acid derivatives (XX) , p-Dimethylaminobenzylidenrhodanin (XXI) or o-Hydroxybenzyliminodiessigsäurederivate (XXII).
Die Durchführung der Immobilisierung der Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase der gegebenenfalls einer Ankersubstanz erfolgt entweder in der Weise, daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst mi dem Träger reagiert und dann mit dem Enzym oder der Ankersubstanz zur Reaktion gebracht wird oder daß das heterobifunktionelle Reagenz zunächst an Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase oder die Ankersubstanz gebunden wird und anschließend durch Inberührungbringen des Trägers mit dem so modifizierten Enzym oder der Ankersubstanz die Immobilisierung vollzogen wird. Wenn zunächst Ankermoleküle an den Träger immobilisiert werden, lassen sich die Enzymmoleküle anschließend in bekannter Weise durch intermolekulare Wechselwirkungen oder kovalente Bindung an diese Ankermoleküle binden. Als Ankermoleküle für die Enzymbindung über intermolekulare Wechselwirkungen werden Moleküle von Substanzen benutzt, die in affinitätschromatographischen Trennprozessen, an Festphasen gebunden, zur Isolierung oder Reinigung von Lipase, ß-Galactosidase oder Invertase eingesetzt werden.The immobilization of the lipase, β-galactosidase or invertase optionally an anchor substance is carried out either in such a way that the heterobifunctional reagent first reacts with the carrier and then reacted with the enzyme or the anchor substance or that the heterobifunctional reagent first Lipase, ß-galactosidase or invertase or the anchor substance is bound and then the immobilization is carried out by contacting the carrier with the thus modified enzyme or the anchor substance. If anchor molecules are first immobilized on the support, the enzyme molecules can then be bound to these anchor molecules in known manner by intermolecular interactions or covalent bonding. As anchor molecules for enzyme binding via intermolecular interactions molecules of substances are used, which are used in affinity chromatographic separation processes, bound to solid phases, for the isolation or purification of lipase, ß-galactosidase or invertase.
Bevorzugt werden Lektine für Glycoenzyme und hydrophobe Moleküle für Lipase eingesetzt. Weiterhin werden als Ankermoleküle natürliche oder synthetische Polymere eingesetzt, die gegebenenfalls durch Wechselwirkung mit Substraten oder dem Enzym die Reaktionsgeschwindigkeit erhöhen und/oder durch Wechselwirkung mit dem Reaktionsmedium zu einer bevorzugten Anreicherung des Biokatalysators in einer Phase flüssiger Mehrphasensysteme führen. Als bifunktionelle Verbindungen zur Nachbehandlung des Trägers werden Substanzen eingesetzt, die eine chelatbildende Gruppierung und eine Gruppierung enthalten, die die Löslichkeit des Trägers im Reaktionsmedium verringern, die das Verteilungsgleichgewicht feinverteilter Trägerpartikel in flüssigen Zweiphasensystemen beeinflussen und/oder durch Wechselwirkungen mit dem Enzym oder mit Substratmolekülen die Reaktionsgeschwindigkeit und/oder Selektivität des Biokatalysators beeinflussen. Derartige Gruppierungen sind aliphatische oder aromatische Kohlenwasserstoffreste, heterocyclische Reste, ionenaustauschende Gruppen, chelatbildende Gruppen, optisch aktive Gruppen, Fettsäureester oder Kohlehydratreste.Preferably, lectins are used for glycoenzymes and hydrophobic molecules for lipase. Furthermore, the anchor molecules used are natural or synthetic polymers which, if appropriate, increase the reaction rate by interaction with substrates or the enzyme and / or lead to preferential accumulation of the biocatalyst in a phase of liquid multiphase systems by interaction with the reaction medium. As bifunctional compounds for post-treatment of the carrier substances are used which contain a chelating grouping and a grouping, which reduce the solubility of the carrier in the reaction medium, which influence the distribution equilibrium of finely divided carrier particles in liquid two-phase systems and / or by interactions with the enzyme or with substrate molecules Reaction rate and / or selectivity of the biocatalyst influence. Such moieties are aliphatic or aromatic hydrocarbon radicals, heterocyclic radicals, ion-exchanging groups, chelating groups, optically active groups, fatty acid esters or carbohydrate radicals.
Die erfindungsgemäß hergestellten Enzymimmobilisate werden in sehr guten Ausbeuten (bei eingesetzten Enzymmengen die unterhalb der Grenze für eine monomolekulare Belegung der zur Verfugung stehenden Trägeroberfläche liegen: 100%) und bei hoher Auswaschstabilität in den gebräuchlichen Substratlösungen (abhängig von der Komplexbildungskonstante zwischen Chelatgruppe und Metallion des Trägers) erhalten.The enzyme immobilizates prepared according to the invention are in very good yields (with the amount of enzyme used below the limit for a monomolecular occupancy of the available support surface: 100%) and high leaching stability in the conventional substrate solutions (depending on the complex formation constant between chelate and metal ion of the support ) receive.
Sie werden in der präparativen Biotransformation, z. B. bei der Saccharose- und Lactosespaltung oder bei Umesterungen und in der Analytik, z. B. in Durchflußreaktoren zur Bestimmung von Disacchariden mit immobilisierter Invertase oder ß-Galactosidase eingesetztThey are used in preparative biotransformation, eg. As in the sucrose and lactose cleavage or transesterification and in the analysis, for. B. in flow reactors for the determination of disaccharides with immobilized invertase or ß-galactosidase used
Nachfolgend soli die beanspruchte Erfindung anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert werden. In the following, the claimed invention will be explained in greater detail on the basis of exemplary embodiments.
Ausführungsbeispieleembodiments
10g einer makroporösen Zirkondioxid enthaltenden Keramik werden mit 50ml einer wäßrigen Lösung von 6-Amino-1-hydroxy-1,1-bis-phosphonsäure (5OmM, Formel I, Y: -PO3H2, X:-OH) 1 h in einem rotierenden Gefäß behandelt. Das Produkt wird solange mit Wasser gewaschen, bis die Leitfähigkeit in der Waschlösung konstant bleibt. Danach werden 20 ml einer 5%igen Glutaraldehydlösung in Natriumhydrogenkarbonatpuffer (pH = 7,5) zu dem abfiltrierten Träger gegeben und 48 h bei10 g of macroporous zirconia-containing ceramic with 50 ml of an aqueous solution of 6-amino-1-hydroxy-1,1-bis-phosphonic acid (5OmM, formula I, Y: -PO 3 H 2 , X: -OH) for 1 h treated a rotating vessel. The product is washed with water until the conductivity in the wash solution remains constant. Thereafter, 20 ml of a 5% glutaraldehyde solution in sodium bicarbonate buffer (pH = 7.5) are added to the filtered carrier and 48 h at
Raumtemperatur (unter Rotation) gehalten. Der aktivierte Träger wird gründlich mit Wasser gewaschen und dann zu 30ml einer Lösung von Invertase (100IE/ml = 100 internationale Einheiten/ml) in Karbonatpuffer (pH = 7,5) gegeben. Nach 24stündiger Rotation wird das Produkt gewaschen und zur kontinuierlichen Rübenzuckerhydrolyse eingesetzt. Die Fixierungsausbeute beträgt 30%.Room temperature (under rotation) held. The activated carrier is washed thoroughly with water and then added to 30 ml of a solution of invertase (100 IU / ml = 100 international units / ml) in carbonate buffer (pH = 7.5). After 24 hours of rotation, the product is washed and used for continuous beet sugar hydrolysis. The fixation yield is 30%.
Technische Einzelheiten, wie sorgfältige Entgasung der Träger unter Vakuum, nach Möglichkeit im Ultraschallfeld, sowie Behandlungsschritte unter „Überkopfrotation" und intensive Waschvorgänge, d.h. mindestens 10 χ 20 min, gelten für alle Beispiele gemeinsam,Technical details, such as careful degassing of the supports under vacuum, if possible in the ultrasonic field, as well as treatment steps under "overhead rotation" and intensive washing operations, i.e. at least 10 χ 20 min, are common to all examples,
500mg Invertase werden in Acetatpuffer (50 mM, pH 4,5) mit Perjodat oxydiert (s. M. Marek et al., Biotech. Bioeng. 261223 (1 üd<l]) und dialysiert. Der Rückstand wird mit 20 mg Desferrioxamin B (Formel II, X: -OH1Y: -COR1, R enthält eine primäre Aminogruppe) versetzt und über 48h bei 4° zur Reaktion gebracht. Gleichzeitig wird aus äquimolaren Mengen von Eisen-Il- und Eisen-lll-sulfat in einer 1%igen Dextranlösung mit Ammoniaküberschuß ein magnetisches Eisenoxid (Fe3O4) gefällt, das durch Dextran als Schutzkolloid stabilisiert ist. Dieses Eisenoxidsol wird mit dem modifizierten Enzym versetzt und 1 h bei Zimmertemperatur gerührt. Nach mehreren Waschungen mit magnetischer Abtrennung wird das Produkt in einem wäßrigen 2-Phasensystem (Stärke-Polyethylenglycol) zur Zuckerhydrolyse eingesetzt, wobei sich der Katalysator in der Stärkelösung anreichert und die entstehenden Monosaccharide in beiden Phasen gleich verteilt sind und aus der PEG-Phase durch Ultrafiltration abgetrennt werden können.500mg of invertase are oxidized with acetate in buffered buffer (50mM, pH 4.5) (see M. Marek et al., Biotech Bioeng 261223 (1 üd <l)) and dialyzed to 20mg of desferrioxamine B (Formula II, X: -OH 1 Y: -COR 1 , R contains a primary amino group) and reacted for 48h at 4 ° C. At the same time from equimolar amounts of iron-Il and ferric sulfate in a 1% dextran solution with ammonia excess precipitated by a magnetic iron oxide (Fe 3 O 4 ) stabilized by dextran as a protective colloid This iron oxide sol is added with the modified enzyme and stirred for 1 h at room temperature After several washes with magnetic separation, the product is dissolved in an aqueous 2-phase system (starch polyethylene glycol) used for sugar hydrolysis, wherein the catalyst is concentrated in the starch solution and the resulting monosaccharides are equally distributed in both phases and from the PEG phase by ultrafiltration can be separated.
500mg N-(4-Hydroxyphenyl)-dithiocarbamat (Formel III, X: -SH, Z: =S) werden in wäßriger Lösung mit 10g einer Eisen-lll-oxid enthaltenden Keramik geschüttelt. Das Produkt wird gewaschen und sorgfältig getrocknet. Anschließend wird es mit 30 ml einer 2%igen Lösung von Toluendiisocyanat in trockenem Toluen aktiviert und mit getrockneten Lösungsmitteln (Toluen, Aceton) reagenzienfrei gewaschen und getrocknet. Die abschließende Enzymkopplung erfolgt durch Eintragen des aktivierten Trägers in eine wäßrige Lösung von Lipase (3000IE/30 ml).500 mg of N- (4-hydroxyphenyl) -dithiocarbamate (formula III, X: -SH, Z: = S) are shaken in aqueous solution with 10 g of a ceramic containing iron-III oxide. The product is washed and dried thoroughly. It is then activated with 30 ml of a 2% solution of toluene diisocyanate in dry toluene and washed with dried solvents (toluene, acetone) reagent-free and dried. The final enzyme coupling is carried out by introducing the activated carrier into an aqueous solution of lipase (3000 U / 30 ml).
400mg 3,4-Epoxy-1,2-dihydroxybutan-1,1-bisphosphonsäure werden an 10g Aluminiumsilikat absorbiert und anschließend mit einer Lösung von ß-Galactosidase (300IE/50ml Karbonatpuffer, lOOmmol/l, pH: 8,5) umgesetzt. Nach 5h bei 40C wird die Immobilisierung abgebrochen, das Produkt gewaschen und für die Lactosespaltung genutzt.400 mg of 3,4-epoxy-1,2-dihydroxybutane-1,1-bisphosphonic acid are absorbed on 10 g of aluminum silicate and then reacted with a solution of β-galactosidase (300 U / 50 ml of carbonate buffer, 100 mmol / l, pH: 8.5). After 5 h at 4 0 C, the immobilization is stopped, washed the product and used for the lactose cleavage.
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10g einer porösen Keramik mit 20% Nickeloxid werden mit 200ml einer Lösung von 20mmol/l Cyclohexan-1,2-diondioxim-4-essigsäure (Formel V, Z: =NOH) in Citratpuffer (lOmmol/l, pH: 6,0) 1 h geschüttelt. Danach werden 3000IE ß-Galactosidase in 50ml salzsaure Natriumchloridlösung (0,1 mol/l, pH: 4,5) zu dem abfiltrierten Träger gegeben. Nach 24 h werden 200mg N-Ethyl-N'-(3-dimethyl-aminopropyl)-carbodiimid zugegeben und 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt. Das Produkt wird zur Spaltung von Lactose in Enzymreaktoren eingesetzt.10 g of a porous ceramic with 20% nickel oxide are mixed with 200 ml of a solution of 20 mmol / l cyclohexane-1,2-dione dioxime-4-acetic acid (formula V, Z: = NOH) in citrate buffer (10 mmol / l, pH: 6.0). Shaken for 1 hour. Thereafter, 3000 L β-galactosidase in 50 mL hydrochloric acid sodium chloride solution (0.1 mol / L, pH: 4.5) is added to the filtered carrier. After 24 h, 200 mg of N-ethyl-N '- (3-dimethyl-aminopropyl) -carbodiimide are added and shaken at room temperature for 2 h. The product is used to cleave lactose in enzyme reactors.
5ml Invertase in einer Glycerol-Acetatpuffermischung (20% Glycerol, 0,1 mol/1 Acetatpuffer, pH: 4,5) werden mit 30ml einer wäßrigen Lösung von 5-Diazo-8-hydroxychinolin (10mmo!/l) umgesetzt und der Reagenzüberschuß in einer Epidexsäule abgetrennt. 10g makroporöses Aluminiumoxidpulver werden mit dem aktivierten Enzym 2 h bei Raumtemperatur geschüttelt, abfiltriert und gewaschen. Dann werden 2g Bäckerhefe in 20ml 3%iger Natriumalginatlösung suspendiert, mit dem feuchten Trägermaterial versetzt und die Mischung tropfenweise in eine Calciumchloridlösung gepreßt. Die entstehenden Kugeln werden vorsichtig getrocknet und anschließend in einem Säulenreaktor zur kontinuierlichen Vergärung von Saccharose eingesetzt.5 ml of invertase in a glycerol-acetate buffer mixture (20% glycerol, 0.1 mol / 1 acetate buffer, pH: 4.5) are reacted with 30 ml of an aqueous solution of 5-diazo-8-hydroxyquinoline (10 mmol / l) and the reagent excess separated in an epidex column. 10 g macroporous alumina powder are shaken with the activated enzyme for 2 h at room temperature, filtered off and washed. Then 2 g of baker's yeast are suspended in 20 ml of 3% sodium alginate solution, mixed with the moist carrier material and the mixture is pressed dropwise into a calcium chloride solution. The resulting beads are carefully dried and then used in a column reactor for the continuous fermentation of sucrose.
10g Schaumbeton werden nacheinander mit Lösungen von Eisen-lll-hexacyanoferrat und Eisen-ll-ammoniumsulfat (jeweils 20mmol/l, pH: 6,5) behandelt. Das tiefblaue Produkt wird gewaschen und anschließend mit 30ml einer Lösung von 3-Hydroxy-4-carboxy-benzoesäureazid (10mg/ml, pH: 4,0, Formel VII, Y: -COOH, X: -OH) 10min bei O0C geschüttelt und anschließend sofort mit einer Lösung von ß-Galactosidase in Acetatpuffer (3000IE Enzym, lonenstärke: 0,1 mol/l, pH: 4,5) versetzt. Nach 2h wird der Träger gewaschen und bis zur Verwendung in o.g. Puffer aufbewahrt.10 g of foam concrete are treated in succession with solutions of ferric hexacyanoferrate and ferrous ammonium sulfate (20 mmol / l each, pH: 6.5). The deep blue product is washed and then washed with 30 ml of a solution of 3-hydroxy-4-carboxy-benzoic acid azide (10 mg / ml, pH: 4.0, formula VII, Y: -COOH, X: -OH) at 0 ° C. for 10 min shaken and then immediately with a solution of ß-galactosidase in acetate buffer (3000IE enzyme, ionic strength: 0.1 mol / l, pH: 4.5). After 2 hours, the carrier is washed and stored in the above-mentioned buffer until use.
10g Schaumglas werden mit einer 5%igen Lösung von Acrylamid-Methylenbisacrylamid-Riboflavin (zur Gelherstellung) getränkt und durch UV-Bestrahlung mit einem Überzug von Polyacrylamid versehen. Das getrocknete Produkt wird mit einer Lösung von Titantetrachlorid in Tetrachlorkohlenstoff 2 h geschüttelt, mit Aceton und Wasser gewaschen und anschließend mit einer Lösung von 50mg N-(2-Hydroxyethyl)aminoma!onsäure (Formel VIII, Z: =0, R2: -OH) in 30ml Wasser versetzt. Nach 2stündiger Rotation der Mischur g wird der funktionalisiei e Träger mit Wasser gewaschen, unter Vakuum getrocknet und mit Chlorameisensäurenorbornylester in bekannter Weise die endständige Hydroxylgruppe in den aktivierten Ester überführt. Abschließend wird die Kopplung von Lipase (3000IE in Karbonatpuffer, 50mmol/l, pH: 8,0) durch Zugabe von 30ml Enzymlösung zu dem getrockneten Träger vollzogen. Das Produkt wird in Durchflußreaktoren eingesetzt.10 g of foam glass are impregnated with a 5% solution of acrylamide-methylenebisacrylamide-riboflavin (for gel production) and provided by UV irradiation with a coating of polyacrylamide. The dried product is shaken with a solution of titanium tetrachloride in carbon tetrachloride for 2 h, washed with acetone and water and then treated with a solution of 50 mg of N- (2-hydroxyethyl) aminonomonic acid (formula VIII, Z: = O, R 2 : OH) in 30 ml of water. After two hours of rotation of Mischur g the funktionalisiei e carrier is washed with water, dried under vacuum and converted with chloroformate in a known manner, the terminal hydroxyl group in the activated ester. Finally, the coupling of lipase (3000 U in carbonate buffer, 50 mmol / L, pH: 8.0) is performed by adding 30 ml of enzyme solution to the dried support. The product is used in flow reactors.
300mg Invertase und 50mg 1,8-Dihydroxynaphtalin-3,6-disulfonsäure werden bei pH8,5 in Karbonatpuffer mit 25mg Bisdiazobenzidinhydrochlorid versetzt und unter schwacher Rührung 1 h bei Raumtemperatur gehalten. Das entstehende Enzymderivat (Formel IX, X: -OH, Y: -N=N-) wird mit 5ml 10%iger Polyacrylsäure und 3g fein verteiltem Eisen-ll,lll-oxid versetzt und in eine Lösung von 2g Chromammoniumalaun in 30 ml Wasser getropft. Das Produkt wird getrocknet und bei 4°C bis zur Verwendung aufbewahrt.300 mg of invertase and 50 mg of 1,8-dihydroxynaphthalene-3,6-disulfonic acid are mixed at pH 8.5 in carbonate buffer with 25 mg of bis-diazobenzidine hydrochloride and kept under gentle stirring for 1 h at room temperature. The resulting enzyme derivative (formula IX, X: -OH, Y: -N = N-) is mixed with 5 ml of 10% polyacrylic acid and 3 g of finely divided iron-II, lll-oxide and in a solution of 2g Chromammoniumalaun in 30 ml of water dripped. The product is dried and stored at 4 ° C until use.
10g Poly-vinylalkohol-divinylbenzen (98:2) werden mit einer wäßrigen Lösung von Zirkonoxychlorid (2 g in 50ml, pH: 3,5) 1 h auf 6O0C erwärmt, anschließend gründlich gewaschen und mit einer Lösung von 200mg Triethanolamin in 50 ml Wasser weitere 3 h auf 60°C orwärmt. Das Produkt (Formel X, R = X: -CH1-CHr-OH) wird mit Cyanurchlorid (50ml, 2mmol/l, Karbonatpuffer, 50mmol/l, pH8) und anschließend mit überschüssiger Glucose in schwach alkalischer Lösung als Ankersubstanz umgesetzt (4h, 2O0C, Rotation), gewaschen und zur Immobilisierung von ß-Galactosidaso eingesetzt, die an den modifizierten Träger ohne weitere Reagentien koppelt.10 g polyvinyl alcohol divinylbenzene (98: 2) are heated to 6O 0 C with an aqueous solution of zirconium oxychloride (2 g in 50 ml, pH: 3.5) for 1 h, then washed thoroughly and with a solution of 200 mg triethanolamine in 50 ml of water at 60 ° C for a further 3 h. The product (formula X, R = X: -CH 1 -CHr-OH) is reacted with cyanuric chloride (50 ml, 2 mmol / l, carbonate buffer, 50 mmol / l, pH 8) and then with excess glucose in weakly alkaline solution as anchor substance (4 h , 2O 0 C, rotation), washed and used for the immobilization of ß-galactosidaso, which couples to the modified support without further reagents.
10g poröses Gias („Trisoperl") werden 5h unter Rückfluß in einer Ammoniummolybdatlösung (IOmmol/1, pH = 5,0) gekocht. Danach wird abfiltriert und mit 100ml einer 1%igen Lösung von 2-(N,N-diethylphosphonsäure)-aminoacetaldehyd (R: -CH: -CHO, Y: -CH2-CHj-PO3H2, Formel Xl) in Karbonatpuffei (pH = 7,5) versetzt. Nach 1 h wird abfiltriert und gewaschen. Der Träger wird dann mit 30ml einer Lösung von Invertase (100IE/ml) in Acetatpuffer (10mmol/l, pH = 5,6) 24h bei Raumtemperatur behandelt, anschließend gewaschen und in Acetatpuffer aufbewahrt.10 g of porous gias ("Trisoperl") are refluxed for 5 hours in an ammonium molybdate solution (10 mmol / l, pH = 5.0), which is filtered off and washed with 100 ml of a 1% solution of 2- (N, N-diethylphosphonic acid). aminoacetaldehyde (R: -CH: -CHO, Y: -CH 2 -CHj-PO 3 H 2 , formula XI) in carbonate buffer (pH = 7.5) After 1 h, the mixture is filtered off and washed 30 ml of a solution of invertase (100 IU / ml) in acetate buffer (10 mmol / l, pH = 5.6) for 24 h at room temperature, then washed and stored in acetate buffer.
10g eines Composites aus 8g Ton und 2g Polyethylen werden mit 50ml einer neutralen wäßrigen Lösung von 500mg Cetyltrimethylammoniumbromid (Formel XII, X: -CH3) 48h unter Rotation bei 450C inkubiert. Die Cetylkette wirkt als Ankersubstanz für hydrophobe Enzyme. Die Immobilisierung von Lipase erfolgt durch Behandlung des Trägers mit einer neutralen Lösung von 3000IE Pankreaslipase in verdünntem Karbonatpuffer (1 mmol/l, pH: 8,0) bei 300C über 48 h sowie nachfolgenden Waschschritten.10g of a composite sound from 8g and 2g polyethylene with 50 ml of a neutral aqueous solution of 500 mg cetyltrimethylammonium bromide: 48h incubated under rotation at 45 0 C (Formula XII, X is -CH 3). The cetyl chain acts as an anchor substance for hydrophobic enzymes. The immobilization of lipase is carried out by treating the carrier with a neutral solution of 3000IE pancreatic lipase in dilute carbonate buffer (1 mmol / l, pH: 8.0) at 30 0 C for 48 h and subsequent washing steps.
10g poröses Titandioxid werden mit 20ml einer Lösung von 1OmM N,N',N"-Trie-(2-phosphonatoethylamino)-acetaldehyd (Formel XIII, Y: -N-CHr-CH2-PO3Hj) in destilliertem Wasser 1 h rotiert, gewaschen und in die Lösung von 3 000IE Lipase in 30ml Karbonatpuffer (0,1 mol/l, pH: 8,0) gebracht. Nach 2stündiger Rotation ist die Immobilisierung beendet und das Produkt wird abfiltriert, in Hexan überführt und in dieser Lösung zur Hydrolyse von Fettsäureestern eingesetzt.10 g of porous titanium dioxide are treated with 20 ml of a solution of 10 mM N, N ', N "-tri- (2-phosphonatoethylamino) -acetaldehyde (formula XIII, Y: -N-CHr-CH 2 -PO 3 Hj) in distilled water for 1 h rotated, washed and placed in the solution of 3,000 IU lipase in 30 ml of carbonate buffer (0.1 mol / l, pH 8.0) After 2 hours of rotation, the immobilization is complete and the product is filtered off, converted into hexane and in this solution used for the hydrolysis of fatty acid esters.
10g poröse Pericellulose werden 4h mit einer alkoholischen Lösung von Zirkontetraethylat (2g in 50ml) unter Rückfluß auf Siedetemperatur erhitzt, anschließend mit Ethanol und Wasser gewaschen. Zu dem feuchten Träger werden 200 mg 2-Aminodiphenylether-4,3', 5'-tricarbonsäure (Formel XIV, Y: -COOH) in neutraler wäßriger Lösung gegeben und unter Rotation im Verlauf einer Stunde absorbiert. 50mg Linsenlektin als Ankersubstanz werden wie in Beispiel 2 mit Perjodat oxidiert und anschließend bei pH7,0 (neutralisiert mit Hydrogenkarbonat) an den funktionalisierten Träger gebunden. Abschließend werden 30mg Invertase in 20ml Wasser gelöst und zu dem Lektinimmobilisat gegeben. Nach den üblichen Waschschritten ist das Produkt zum Einsatz in analytischen Enzymreaktoren geeignet.10 g of porous pericellulose are heated for 4 h with an alcoholic solution of zirconium tetraethylate (2 g in 50 ml) under reflux to boiling temperature, then washed with ethanol and water. To the wet carrier is added 200 mg of 2-aminodiphenyl ether-4,3 ', 5'-tricarboxylic acid (Formula XIV, Y: -COOH) in neutral aqueous solution and absorbed with rotation over one hour. 50 mg of lentil lectin as an anchor substance are oxidized with periodate as in Example 2 and then bound to the functionalized support at pH 7.0 (neutralized with bicarbonate). Finally, 30mg invertase are dissolved in 20ml of water and added to the lectin immobilizate. After the usual washing steps, the product is suitable for use in analytical enzyme reactors.
10g Aluminiumsilikat werden mit einer Lösung von 2g Alizarin S in 30ml Natronlauge (1 mmol/l) 2 h unter Rotation umgesetzt, der Träger gewaschen und getrocknet. Zu dem trockenen Träger wird eine Mischung von 20mmol Terephtaloylchlorid und 20mmol Pyridin in 30ml Toluen gegeben und innerhalb von 2h bei 500C die ß-OH-Gruppe des Alizarins verestert. Der funktionalisierte Träger wird mit Toluen, Aceton und Wassergewaschen und sofort danach mit 3000IE Lipase in Karbonatpuffer (10mmol/l, pH: 8,0) versetzt.10 g of aluminum silicate are reacted with a solution of 2 g of Alizarin S in 30 ml of sodium hydroxide solution (1 mmol / l) under rotation for 2 h, the support is washed and dried. To the dry carrier, a mixture of 20mmol terephthaloyl chloride and 20mmol pyridine in 30ml toluene is added and esterified within 2h at 50 0 C, the ß-OH group of alizarin. The functionalized support is washed with toluene, acetone and water and then immediately mixed with 3000IE lipase in carbonate buffer (10mmol / l, pH 8.0).
Nach 3h ist die Immobilisierung beendet.After 3 hours immobilization is complete.
p-Galactosidase (3000IE) wird in Karbonatpuffer (s.o.) mit 20ml o-Chinon (3mmol/l) und nach 4h mit 10ml Hydrazinsulfat (10mmol/l, pH6,5) umgesetzt, wobei ein Brenzkatechinderivat (Formel XVI, X: -OH) entsteht. 10g poröses Aluminiumoxid werden 4h mit der Reaktionslösung behandelt, gewaschen und zur Spaltung von Lactose eingesetzt.p-galactosidase (3000IE) is reacted in carbonate buffer (see above) with 20 ml o-quinone (3 mmol / l) and after 4 h with 10 ml hydrazine sulfate (10 mmol / l, pH 6.5) to give a pyrocatechol derivative (Formula XVI, X: -OH ) arises. 10 g of porous alumina are treated with the reaction solution for 4 h, washed and used to cleave lactose.
10g poröses Nickeloxid werden mit einem Überschuß von 2,3-Dimercaptopropanol in Form einer 2%igen wäßrigen Lösung umgesetzt (Formel XVII, X: -SH, -OH). Nach Auswaschen des Überschusses werden 30ml einer Lösung von Dipyridin-2,2'-disulfid (3mmol/l) in Wasser zugegeben und damit ein Teil der SH-Gruppen am Träger in Disulfidgruppen umgewandelt. Nach Entfernen des Reagenzüberschusses wird der aktivierte Träger mit der Lösung von 500mg ß-Galactosidase in 30ml Karbonatpuffer nach Beispiel 154h behandelt und abschließend gewaschen. Das Produkt wird in der Analytik eingesetzt.10 g of porous nickel oxide are reacted with an excess of 2,3-dimercaptopropanol in the form of a 2% aqueous solution (formula XVII, X: -SH, -OH). After washing off the excess, 30 ml of a solution of dipyridine-2,2'-disulphide (3 mmol / l) in water are added and thus a part of the SH groups on the support are converted into disulphide groups. After removing the reagent excess, the activated carrier is treated with the solution of 500 mg β-galactosidase in 30 ml of carbonate buffer according to Example 154h and finally washed. The product is used in analytics.
lOOmmol o-Phenylenbisdiazoniumchlorid werden bei pH9,0 mit 200mmol p-Aminophenol gekuppelt up.·' das Produkt (Formel XVIII, Y: -OH, R6: -N=N-C6H4-N=N-) wird erneut diazotiert, danach an 10g poröses Aluminiumsilikat absorbiert und sofort mit einer Lösung von 3000IE Invertase in o.g. Karbonatpuffer umgesetzt.100 mmol of o-phenylenebisdiazonium chloride are coupled at pH 9.0 with 200 mmol of p-aminophenol. The product (Formula XVIII, Y: -OH, R 6 : -N = NC 6 H 4 -N = N-) is diazotized again, then absorbed on 10 g of porous aluminum silicate and immediately reacted with a solution of 3000IE invertase in the above-mentioned carbonate buffer.
500mg Lipase aus Candida Cylindracea werden mit einer Lösung von 20mmol Cyanursäurechlorid in 3ml Aceion umgesetzt, danach wird das Produkt getrocknet und in Wasser aufgenommen. Die restlichen Chloridatome werden in Karbonatpuffer abhydrolysiert und das Produkt (Formel XIX, X: -OH) wird an 10g eines porösen Titansilikates adsorbiert. Der entstandene Katalysator wird zur Fettsynthese eingesetzt.500mg lipase from Candida Cylindracea are reacted with a solution of 20mmol cyanuric chloride in 3ml acetic acid, after which the product is dried and taken up in water. The residual chloride atoms are hydrolyzed in carbonate buffer and the product (Formula XIX, X: -OH) is adsorbed on 10 g of a porous titanium silicate. The resulting catalyst is used for fat synthesis.
Aus o-Hydrazinobenzoesäure und p-Chlormethylbenzaldehyd wird ein Formazan hergestellt (Formel XX, R6: -N= N-, Y: -COOH), an ein Eisen-lll-silikat adsorbiert und das Chlor durch NH4OH in eine Aminogruppe überführt. Der Träger wird dann durch Behandlung mit einem Überschuß von Benzochinon in Karbonatpuffer (3mmol/l) aktiviert. Die abschließende Enzymimmobilisierung erfolgt durch Zugabe von 3000IE ß-Galactosidase in 25ml Acetatpuffer, pH: 5.6.From o-hydrazinobenzoic acid and p-chloromethylbenzaldehyde, a formazan is prepared (formula XX, R 6 : -N = N-, Y: -COOH), adsorbed on an iron-lll-silicate and the chlorine is converted by NH4OH in an amino group. The carrier is then activated by treatment with an excess of benzoquinone in carbonate buffer (3 mmol / L). The final enzyme immobilization is carried out by adding 3000IE β-galactosidase in 25 ml acetate buffer, pH 5.6.
e-Chlorchinolin-S-carbonsäuremethylester wird mit Glycin zu der N-substituiertin Aminoessigsäure umgesetzt und anschließend mit Hydrazin und Nitrit in das Azid überführt. 0,1 g dieser Verbindung (Formel XXI, Z: =N- im Ring, =0) werden mit 1 g ß-Galactosidase bei pH8,0 in Karbonatpuffer umgesetzt und anschließend an 10g Zirkondioxid absorbiert.e-chloroquinoline-S-carboxylic acid methyl ester is reacted with glycine to give the N-substituted in aminoacetic acid and then converted to the azide with hydrazine and nitrite. 0.1 g of this compound (formula XXI, Z: = N- in the ring, = 0) are reacted with 1 g of β-galactosidase at pH 8.0 in carbonate buffer and then absorbed on 10 g of zirconium dioxide.
200mg N-(2-Hydroxy-5-aminobenzyl)iminodiessigsäure (Formel XXII, X: -OH, Y: -CHr-COOH) werden diazotiert und nach Neutralisation zu einer Mischung aus invertase und Glucoseoxidase (jeweils 3000IE) in 20ml Karbonatpuffer pH: 8,0 gegeben. Nach 4h bei 0°C ist die Kopplung beendet und das Produkt wird mit 10g Eisen-ll.lll-oxid versetzt. Unter Rotation werden die modifizierten Enzyme adsorbiert (12 h), das Produkt wird gewaschen und magnetisch abgetrennt. Der Katalysator wird mit 10 ml einer 10%igen Polyvinylalkohollösung vermischt uno auf einer Glasplatte zu einer Membran ausgestrichen. Nach Trocknung wird die Membran vor die Platinspitze einer amperometrischen Elektrode gespannt. Die entstehende Enzymelektrode ist zur Bestimmung von Glucose und Saccharose einsetzbar.200mg of N- (2-hydroxy-5-aminobenzyl) iminodiacetic acid (Formula XXII, X: -OH, Y: -CHR-COOH) are diazotised and, after neutralization, added to a mixture of invertase and glucose oxidase (each 3000I) in 20ml carbonate buffer pH: 8.0 given. After 4 h at 0 ° C, the coupling is complete and the product is mixed with 10 g of iron-ll.lll-oxide. Under rotation, the modified enzymes are adsorbed (12 h), the product is washed and separated magnetically. The catalyst is mixed with 10 ml of a 10% polyvinyl alcohol solution and spread on a glass plate to form a membrane. After drying, the membrane is stretched in front of the platinum tip of an amperometric electrode. The resulting enzyme electrode can be used for the determination of glucose and sucrose.
Claims (21)
R3: ein aromatischer oder heterocyclischer Molekülrest, R4: ein Alkylen-, Arylen- oder Aralkylenrest,
R5: eine-N=N-odereine-CH=N-Gruppeund
C1 und C2 Teile eines Kettenmoleküls, eines Ringes oder Ringsystems sein können.R 2 is -H, -NH 2 , an alkyl radical, a cyclic moiety,
R 3 : an aromatic or heterocyclic molecule radical, R 4 : an alkylene, arylene or aralkylene radical,
R 5 : an -N = N-or -CH = N-group and
C 1 and C 2 may be parts of a chain molecule, a ring or ring system.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD32527989A DD298267A5 (en) | 1989-01-27 | 1989-01-27 | PROCESS FOR IMMOBILIZING LIPASE, BETA-GALACTOSIDASE OR INVERTASE |
Applications Claiming Priority (1)
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Family Applications (1)
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|---|---|---|---|---|
| WO2017131127A1 (en) * | 2016-01-29 | 2017-08-03 | 株式会社富士薬品 | Novel bisphosphonic acid compound |
-
1989
- 1989-01-27 DD DD32527989A patent/DD298267A5/en unknown
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2017131127A1 (en) * | 2016-01-29 | 2017-08-03 | 株式会社富士薬品 | Novel bisphosphonic acid compound |
| US10689408B2 (en) | 2016-01-29 | 2020-06-23 | Fujiyakuhin Co., Ltd. | Bisphosphonic acid compound |
| RU2731615C2 (en) * | 2016-01-29 | 2020-09-07 | Фудзиякухин Ко., Лтд. | Novel bisphosphonic acid compound |
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