DD288094A5 - Verwendung von gamma-interferon zur behandlung von gefaessverengungen - Google Patents
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Abstract
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Verwendung von Gamma-Interferon zur Herstellung eines pharmazeutischen Praeparates fuer die Behandlung von vaskulaerer Stenose, die z. B. durch Intimahyperplasie, einschlieszlich der Behandlung von Restenose nach der Behandlung von arterieller Stenose oder eines Verschlusses verursacht wird. In einer bevorzugten Ausfuehrungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf die Verwendung von Gamma-Interferon zur Behandlung von arterieller Stenose nach Gefaeszchirurgie und/oder Angioplastik.{Gamma-Interferon-Verwendung; Behandlung Stenose vaskulaer}
Description
Hierzu 4 Seiten Zeichnungen
Die vorliegende Erfindung zielt auf die Verwendung von Gamma-Interferon für die Zubereitung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung von vaskulärer Stenose, die beispielsweise durch Intimahyperplasie verursacht worden Ist, einschließlich der Behandlung von Restenose als Ergebnis von Angioplastik und/oder Gefäßchirurgie. Die vorliegende Erfindung zielt speziell auf die Behandlung von arterieller Stenose als Ergebnis von Angioplastik und/oder Gefäßchirurgie.
Der Fortschritt in der kardiovaskulären Forschung hat es möglich gemacht, und zwar hauptsächlich durch Verringerung der Risikofaktoren für Arteriosklorose wie etwa Hypercholesterinämie, Rauchen und Hypertonie, das Auftreten von Herzanfällen bei Patienten zu verringern. Es ist bekannt, daß die Entwicklung eines Herzanfalls durch Verabreichung eines Gewebe-Plasminogenaktivators (t-PA), der den Thrombus in der Koronararterie auflöst, gestoppt werden kann. Vor kurzem hat die Klonierung und Produktion von t-PA mit Hilfe von Verfahren mit rekombinanter DNS es ermöglicht, t-PA in unbegrenzten Mengen herzustellen.
Zur Verhinderung von Herzanfällen bei Patienten, die Koronararteriosklerose entwickelt haben, stehen jedoch zur Zeit nur chirurgische Methoden zur Verfügung. Es sind mehrere wichtige neue Verfahren für die chirurgische Therapie entwickelt worden. Besonders angioplastische Verfahren, bei denen Ballonkatheter und seit noch kürzerer Zeit Laser Anwendung finden, haben es ermöglicht, Patienten mit weniger ernsten Symptomen sowie solche, bei denen koronare Bypass-Chirurgie nicht gerechtfertigt ist, und ebenso Patienten, deren Allgemeinzustand für einen schweren ctiirurgischen Eingriff zu schlecht ist, zu behandeln.
Alle Manipulationen an den größeren Blutgefäßen, entweder durch herkömmliche Chirurgie oder angioplastische Verfahren, werden jedoch durch das häufige Auftreten von Intimahyperplasie behindert, was zu einer Restenose der Arterie führt. So entwickeln zum Beispiel ungefähr 30% aller Patienten, die sich im Sahlgren's Hospital, Gothenburg in Schweden einer perkutanten transluminalen Koronarangioplastik unterziehen, Intimaläsionen, die ischämische Symptome hervorrufen. Dieses Problem wird auch nach herkömmlicher Gefäßchirurgie beobachtet. Der Wiederherstellungschirurgie an den Arterien, die die unteren Extremitäten mit Blut versorgen, schließt sich in 50% der Fälle aufgrund von Intimaläsionen ein Rezidiv der ischämischen Symptome an (siehe Rutherford, R. [Red.) Vaskular Surgery [Gefäßchirurgie]. Ch. 58.2. Ausgabe, Saunders, 1984). Auf ähnliche Weise entwickeln etwa 20% aller Patienten, die sich einer Karotisendarteriektomie unterziehen, Intimahyperplasie. Verschiedene andere Behandlungszentren berichten von ähnlichen Ergebnissen. Intimahyperplasie wird auch oft im Zusammenhang mit der koronaren Bypass-Chirurgie beobachtet. Postoperative und „postangioplastische" Intimahyperplasie ist daher heute ein Hauptproblem in der klinischen Kardiologie sowie in der Herz- und Gefäßchirurgie. Viele Patienten mit Angina pectoris müssen sich beispielsweise wiederholten angioplastischen Verfahren unterziehen, und es ist durchaus möglich, daß schließlich zur koronaren Bypass-Chirurgie gegriffen werden muß. Es ist offenkundig, daß - wenn die Entwicklung von Intimahyperplasie gestoppt werden könnte-es möglich wäre, den Patienten viel Schmerz und Leid zu ersparen und auch die Behandlungskosten beträchtlich zu verringern.
Die der Intima-Zellproliferation zugrunde liegenden Mechanismen sind von Vaskularbiologen au/ das sorgfältigste untersucht worden. Es ist bekannt, daß eine mechanische Verletzung der Arterie zur Migration von medialen glatten Muskelzellen in die Intima führt. Sobald sie dort sind, beginnen diese Zellen zu proliferieren und bilden eine Intimaläsion, die sich über Monate
hinweg hält (siehe Srhwartz.S. M., Campell, G. R., Campbell, J. H., Clrc Res. 58:427,1986). Reendothellallslerung der Oberfläche scheint für die Regression der Läsion wichtig zu sein, und sowohl der betroffene Endothelberelch als auch das Ausmaß des Schadens an den eubendotheliaten Strukturen sind wichtig für die Progression der Läsion.
Die Proliferation vaskulärer glatter Muskelzellen wird wahrscheinlich durch Wachstumsfaktoren gesteuert, die entweder im Blut zirkulieren, wie das Insulin, oder von Zellen freigesetzt werden, wie der von den Thrombozyten stammende Wachstumsfaktor. Letzterer Faktor wird nicht nur von Megakaryozyten, sondern auch von Monozyten und Endothelzellen synthetisiert (siehe Ross, R., NewEngl. J. Med. 314:488,1986 und Ross, R., Raines, E.W., Bowen-Pope, D.F., Cell 1986:46:155-169), und dies bedeutet, daß Entzündungszellen teilnehmen könnten an der Wachstumsregulierung der Gefäßwand.
Weitaus weniger Ist über wachstumshemmende Faktoren fürglatte Muskelzellen bekannt. Pharmakologisch appliziertes Heparin hemmt die Proliferation glatter Muskeln (siehe Clowes, A. W., Kamovsky, M. J., Nature 165:625,1977), und es ist darauf hingewiesen worden, daß endogene Heparin-artige Substanzen an der physiologischen Wachstumssteuerung beteiligt sein könnten. Es sollte jedoch angemerkt werden, daß alle Patienten, die sich einer angioplastischen und chirurgischen Behandlung unterziehen, unter Heparin-Therapie stehen und dennoch eine bedeutsame Intimastenose entwickeln. Neue immunozytochemische Studien unter Verwendung von zelltypenspezifischen monoklonalen Antikörpern haben gezeigt, daß von Monozyten stammende Makrophagen im Arterioskleroseherd In großer Zahl vorhanden sind (siehe Vedeler, CA., Nyland, H., Matre, R.: In situ characterization of the foam cells in early human atherosclerotic lesions. Acta Pathol Microbiol Immunol Scand [C] 1984:92:133-137, Agel, N. M., Ball, R.Y, Waldman, H., Mitcheinson, M. J.: Monocytic origin of foam cells in human atherosclerotic plaques. Atherosclerosis 1964:53:265-271, Jonasson, L., Holm, J., Skolli, Ο., Bondjers, G., Hansson, G.K.: Regional accumulations of T cells, macrophages and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque. Atherosclerosis 1986:6:131-140 und Gown, A.M., Tsukada, T., Ross, R.: Human atherosclerosis, ll.lmmunocytochemical analysis of the cellular composition of human atherosclerotic lesions. Am J. Pathol. 1986:125:191-207). Sie sind jedoch nicht die einzigen hämatogenen Zellen, die unter pathologischen Verhältnissen In der Arterienwand zu finden sind. T-Lymphozyten bilden ein Fünftel der Zellenpopulation in der fibrösen Decke des menschlichen Arterioskleroseherdes (siehe Jonasson et al., Atherosclerosis 1986:6:131-140), und sie können auch in Versuchsmodellen von Gefäßverletzungen beobachtet werden (siehe Jonasson, L., Holm, J., Hannson, G.K.: Smooth muscle cells express la antigens during arterial response to injury. Lab Invest 1988:58:310-315).
Immunozytochemische Daten deuten darauf hin, daß T-Lymphozyten die Wachstumseigenschaften und andere Funktionen von glatten Muskelzellen anpassen bzw. regulieren können. In Arterioskleroseherden, wo T-Lymphozyten in großer Zahl vorhanden sind, pressen viele glatte Muskelzellen komplizierte, zusammengesetzte Histokompatibilitätsantigene der Klasse Il Major (I a-Antigene) aus. Andererseits fehlt es in nichtarteriosklerotischen, normalen Arterien den glatten Muskelzellen an I a-Antigenen (siehe Jonasson, L., Holm, J., Skalli, O., Gabbiani, G., Hansson, G. K.: Expression of class Il transplantation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis. J. Clin. Invest. 1985:76:125-131 und Hansson, G. K., Jonasson, L., Holm, J., Claesson-Welsh, L. Clas Il MHC antigen expression in the atherosclerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ, and the invariant gamma chain. Clin exp. Immunol. 1986:64:261-268). Es ist gezeigt worden, daß I a-Antigene auf glatten Muskelzeilen während der arteriellen Reaktion auf Verletzung bei Ratten erscheinen, aber es gibt keine frühere Arbeit, die eine Beziehung zwischen I a-Antigenen und vasculärer Stenose zeigt oder darauf hindeutet.
Diese Antigene spielen eine fundamentale Rolle bei dem Vorgang, in dem fremde Antigene den T-Lymphozyten präsentiert werden. Ihre Expression durch Makrophagen, Endothelzellen und verschiedene andere Zelltypen wird durch Gamma-Interferon induziert, das von aktivierten T-Lymphozyten abgesondert wird (siehe Pober, J. S., Gimbrone, M. A., Cotran, R. S, Reiss, C. S., Burkhoff, S. J., Fiera, W., AuIt, K.A.: la expression by vascular endothelium is inducible by activated T cells and by human gamma-interferon.J. Exp. Med. 1983:157:1139-1353 und Unanue.E.R., Allen, P. M.: Comment on the finding of la expression in non-lymphoid cells. Lab. Invest. 1986:55:123-125).
Von Alpha- und Beta-lnterferonen, die von Leukozyten, Fibroblasten und anderen Zelltypen produziert werden, ist bekannt, daß sie die Proliferation von bestimmten Zelltypen hemmen. Gamma-Interferon wird von aktivierten T-Lymphozyten freigesetzt, und es hat sich auch gezeigt, daß es die Proliferation hemmt, wenn konditionierte Stoffe oder gereinigte Präparate verschiedenen Typen von Kulturzellen wie etwa Brustdrüsenzellen und Fibroblasten beigemengt werden (siehe Rubin, B. Y., Gupta, S.L.: Differential efficacies of human type I and type Il interferons as antiviral and antiproliferative agents. Proc Natl. Acad Sei USA 1980:77:5928-5932, Blalock, J. E., Georgiades, J. A., Langford, N. F., Johnson, H. M.: Purified human immune Interferon has more potent anticellular activity than fibroblast or leukocyte Interferon. Cell Immunol. 1980:49:390-401 and Wahl, S. M., Galtely, C. L.: Modulation of fibroblast growth by a Lymphokine of human T cell and continuous Tcell line origin. J. Immunol. 1983:130:1226-1230). Es wurde jedoch diskutiert, ob diese Wirkung eventuell auf Verunreinigung der Präparate durch Lymphotoxin (Tumornekrosefaktor), anstatt auf eine hemmende Wirkung von Gamma-Interferon selbst zurückzuführen ist. Abschließend kann gesagt werden, daß es von Vorteil wäre, vaskuläre Stenose und damit verwandte Störungen durch Verwendung von Präparaten, die das Wachstum von glatten Muskelzellen hemmen, behandeln zu können.
Durch die vorliegende Erfindung wird Gamma-Interferon zur Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung vaskulärer Stenose zur Verfügung gestellt.
Der vorliegenden Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, Wirkstoffe zur Behandlung vaskulärer Stenose aufzufinden und als pharmazeutische Präparate zur Verfugung zu stellen.
Es ist jetzt überraschenderweise entdeckt worden, und dies bildet auch die Grundlage für die vorliegende Erfindung, daß Gamma-Interferon ein wichtiger Wachstumshemmer für glatte Muskelzellen in Intimaläsionen und bei Arterieosklerose ist.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht die Verwendung von Gamma-Interferon für die Zubereitung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung von vaskulärer Stenose vor, die beispielsweise durch Intimahyperplasie verursacht wurde.
In einer Verkörperung dieses Aspekts der Erfindung ist die Behandlung von vaskulärer Stenose die Behandlung von Restenose im Ergebnis der Behandlung von arterieller Stenose oder Okklusion.
In einer bevorzugten Verkörperung dieses Aspekts der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von vaskulärer Stenose die Behandlung von arterieller Stenose im Ergebnis einer Angioplastik und/oder Gefäßchirurgie.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung sieht ein Verfahren zur Verwendung von Gamma-Interferon für die Behandlung von vaskuiärer Stenose vor, die beispielsweise durch Intimahyperplasie verursacht wurde, wobei einem Patienten Gamma-Interferon in einem pharmazeutischen Präparat verabreicht wird, das besagtes Interferon in einer ausreichenden Menge enthält, um einen therapeutischen Effekt zu erzielen.
in einer Verkörperung des besagten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von vaskulärer Stenose die. Behandlung einer Restenose im Ergebnis der Behandlung von arterieller Stenose oder Okklusion.
In einer bevorzugten Verkörperung des besagten Aspekts der vorliegenden Erfindung ist die Behandlung von vaskulärer Stenose die Behandlung von arterieller Stenose im Ergebnis einer Angioplastik und/oder Gefäßchirurgie.
Die Quelle des verwendeten Gamma-Interferons ist nicht entscheidend und kann synthetisches, natürliches oder rekombinantes Gamma-Interferon sein, das durch DNS-Rekombinationst&chnik hergestellt wurde. Das vorliegende pharmazeutische Präparat wird den Patienten vorzugsweise in Form einer parenteralen Applikation verabreicht, d.h. durch subkutane, intravenöse oder intramuskuläre Injektion.
Die Verdünr ungsmittel und Trägerstoffo sind jene, die auf herkömmliche Weise in der Pharmazie verwendet werden, zum Beispiel eine physiologische Kochsalzlösung.
von Kulturen glatter Muskelzellen zeigt.
von Wachstum bei Kulturen glatter Muskelzellen zeigt.
frühen Phase des Zellzyklus zeigt.
bei unterschiedlichen Konzentrationen von Gamma-Interferon zeigt.
die Hemmung der Proliferation von glatten Muskelzellen verwendet werden.
von l-A-negativen Zellen dieser Art zeigt.
Es wurde die Wirkung von rekombinanten Gamma-Interferon aufgezüchtete Zellen des glatten arteriellen Muskels untersucht und entdeckt, daß dieses Lymphokin Zeilproliferation hemmt. Parallel zu dieser Wirkung erfolgt eine Induktion von I a-Antigenen. Es wurden daher die la-Expression und die Zellenreduplikation bei der arteriellen Reaktion auf Verletzung in der aufgeblähten Karotis von Ratten untersucht. Es wurden Beweise für einen Zusammenhang zwischen I a-Expression und einem Mangel an Proliferation gefunden.
Es wurden Anstrengungen unternommen, die Zellpopulationen, die den Arterioskleroseherd bilden, zu identifizieren. Daher wurden monoklonal Antikörper zu Zelltyp-spezifischen Antigenen bei Teilen von Endarteriektomid-Proben angewendet. Es erwies sich, daß die meisten Zellen in der Lipid-reichen Kernregion sich bei Kontakt mit Antikörpern zu Makrophagen-Antigen verfärben. Viele Zellen der fibrösen Kappe waren oft durch Antikörper zu anti-glatten Muskeln gefärbt (siehe Jonasson, L., Holm, J., Skalli, 0., Bondjers, G., Hansson, G. K. Arteriosclerosis 6:131,1986). Zusätzlich und noch überraschender wurden beträchtliche Mengen an T-Lymphozyten, besonders in der fibrösen Kappe, beobachtet. Viele von ihnen wiesen Anzeichen von Aktivierung, d. h. Expression von HLA-DR, VLA-1 und den lnterleukin-2-Rezeptor auf (siehe z. B. Jonasson, L., Holm, J., Skalli, 0., Gabbiani, G., Hansson, G.K., J. Clin. Invest. 76:125,1985 und Hansson, G.K., Jonasson, L., Holm, J., Glaesson-Welsh, L Clin. exp. Immunol. 64:261,1986).
Viele glatte Muskelzellen in diesen an T-Zellen reichen Zonen preßten HLA-DR (I a-Antigene) aus, wohingegen solche Antigene in glatten Muskelzellen der normalen Arterienwand niemals gefunden wurden. Die Expression von HLA-DR wird durch aktivierte T-Zellen über die Freisetzung von Gamma-Interferon eingeleitet (siehe Pober, J. S. et al. Nature 305:726,1983 und Unanue, E. R., Allen, P. M. Lab. Invest. 55:123,1983). Die Entdeckungen auf dem Gebiet der Arteriosklerose deuten daher darauf hin, daß Gamma-Interferon an einer parakrinen Regulierung der Gen-Expression im Arterioskleroseherd beteiligt ist. Des weiteren wurde unlängst auch ein direkter immunohistochemischer Beweis für die Anwesenheit von Gamma-Interferon im Arterioskleroseherd erbracht.
Zur Analyse der Rolle von T-Lymphozyten bei der Regulierung der Proliferation von arteriellen glatten Muskelzellen und der Gen-Expression wurde ein experimentelles Tiermodell verwendet. Zu diesem Zweck bediente man sich des von Baumgartner entwickelten und von Clowes und Reidy verbesserten Ballonkatheter-Modells. Mit einem Fogarty-Bailonkatheter wurden an der Karotis von Ratten Intimaläsionen herbeigeführt, und die Infiltration verschiedener Arten von Leukozyten sowie die Expression von I a-Antigenen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Verletzung mit Hilfe der Immunohistochemie analysiert.
In zwei Wochen wurde eine kleine, aber bedeutsame Menge von T-Zellen-Infiltration festgestellt, und man fand auch heraus, daß glatte Muskelzellen in der Intima mit der Expression von Ia-Antigenen begannen. In vitro konnte die I a-Expression durch rekombinantes Gamma-Interferon eingeleitet werden. Diese Erkenntnisse deuten darauf hin, daß bei den Intimaläsionen Gamma-Interferon freigesetzt wird und die Expression von Genen glatter Muskelzellen beeinflußt.
In vitro ist Gamma-Interferon ein wirksamer Hemmer für die Proliferation glatter Muskelzellen, und es wird daher angenommen, daß es als ein endogener Hemmer für die Proliferation glatter Muskelzellen bei einer Intimaläsion nach Verletzung dienen könnte. Die Analyse der Reduplikation glatter Muskelzellen in der Läsion lieferte eine Indirekte Unterstützung für diese Hypothese. Man fand heraus, daß I a-positive glatte Muskelzellen während eines 24-Stunden-Pulses 14 Tage nach der Verletzung kein 3H-Thymidin aufnahmen.
In eineranderen Versuchsserie wurden alle reduplizierenden glatten Muskelzellen über eine osmotische Pumpe, die zum Zeitpunkt der Aufblähung eingeführt wurde, mit 3H-Thyrnidin markiert. Durch kombinierte 3H-Autoradiographie und immunohistochemlsche Färbung auf I a fand man, daß Zellen, die zum Zeitpunkt der Tötung des Versuchstieres, d. h. am 14. Tag nach der Aufblähung, bedeutend weniger Zyklen von Reduplikationen durchlaufen haben als la-negative glatte Muskelzellen. Dies erhärtete die Annahme, daß Gamma-Interferon ein endogener Hemmer für die Reduplikation von glatten Muskelzellen bei Intimahyperpla.sie ist. Durch diese Ergebnisse ermutigt, beschloß man, diese Arbeit fortzusetzen, indem die Wirkung von parenteral verabreichtem Gamma-Interferon auf die arterielle Reaktion auf Verletzung untersucht wurde.
(SMCs) Isoliert und in einem Medium mit der Bezelchnungg RPMM 640 gezüchtet, das durch fötales Serum vom Kalb (FCS), 100 Einheiten/ml Penizillin G, ΙΟΟμρ/ΓηΙ Streptomyzin um150pg/ml Askorbinsäure ergänzt wurde. Für die Versuche wurden
96 Bohrlöchern (Nunc, Roskilde, Dänemark), oder zwecks Analyse der DNS-Synthese in 10cm2 großen Petrischalen ausgestiichen.
SMCs wuchsen entweder exponentiell oder wurden durch Zugabe von 10%igem FCS nach 48 Stunden Serumkarenz in 0,5%igem FCS veranlaßt, in die Phase der Spalte 1 (G1) des Zellzyklus einzutreten. Die Kulturen wurden rekombinantem Gamma-Interferon von Mäusen ausgesetzt (Genentechn. Sourh San Francisco, California), das dem Medium zusammen mit 10%igem FCS beigegeben wurde. Zu verschiedenen Zeiten wurden sie mit 4%igem Formaldehyd In einem Azetatpuffer von 0 1M, pH 3,1 fixiert und mit Amidoschwarz B bebrütet, um die Zelleiweiße zu färben. Ungebundener Farbstoff wurde mit destilliertem Wasser abgespült, und die Farbstoffaufnahme wurde in einem EIA-Mikrotiter-Photometer bei einer Wellenlänge von 620 nm ermittelt. Die Farbstoffbindung pro Zelle wurde berechnet, indem die Farbstoffextinktion pro Kultur (AeM-Einheiten) durch die Zellenzahl pro Kultur dividiert wurde, die wiederum durch hämozytometrische Zählung von trypsinierten Zellen in parallelen Kulturen ermittelt wurde. Da es in diesen Kulturen nur eine sehr geringe Variabilität bei der Farbstoffextinktion pro Zelle gab (< 2%), konnte die Anzahl der Zellen durch Division derA^-Extinktion einer gegebenen Kultur durch den Koeffizienten von A620ZZeIIo geschätzt werden. Es gab keinen bedeutsamen Unterschied bei A620ZZeIIe zwischen Kulturen, die mit Gamma-Interferon behandelt wurden, und unbehandelten Kulturen. Die Korrelation zwischen der mikroskopischen Auszählung und dor auf Farbstoffbindung basierenden Analyse zur Ermittlung der Zellzahlen war ausgezeichnet (r = 0,98).
Die DNS-Synthese wurde im wesentlichen wie von Raines und Ross bestimmt. Kurz, SMCs wurden-wie zuvor beschrieben- in der Phase der Spalte 0 (G0) synchronisiert und dann durch Zugabe von 10%igem FCS in Gegenwart oder Abwesenheit von Garnma-Interferon, das gleichzeitig oder zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Zugabe von Serum veranlaßt, in den Zellzyklus einzutreten. 3H-Thymidin (Bohrloch 10pCi/cm') wurde zusammen mit FCS zugesetzt, und die Zellen wurden nach 24 Stunden durch Trypsinierung geerntet. Sie wurden auf 0,23 pm-Millipore-Filtern (Bedford, Massachusetts) gesammelt, und die in Trichloresslgsäure unlösliche Radioaktivität wurde nach Löslichmachen in Insta-gel (gesetzlich geschütztes Warenzeichen) in einem Szintillationszähler bzw. Strahlungsdetektor analysiert.
SMC in Mikrotiter-Platten mit 96 Bohrlöchern (Nunc) wurden, wie im folgenden beschrieben, dem Gamma-Interferon ausgesetzt. Anschließend wurden die Zellen dreimal mit PBS (phosphatgepufferte physiologische Kochsalzlösung), 15OmM NaCI, 15mM Phosphatpuffer, pH7,2) gespült und 15 ί linuten lang bei 4°C mit 1%igem Formaldehyd in 10OmM Natriumphosphatpuffsr, pH 7,2 fixiert. Sie wurden dann dreimal mit PBS gespült, das mit 100 mM Glyzin in PBS mit 0,1 % Serumalbumin vom Rind (BSA; RIA-Sorte, Sigma Chemical, St. Louis, Missouri) 30 Minuten lang bei 370C zur Reaktion gebracht wurde. Nachdem die Zellen zweimal in PBS gespült worden waren, wurden sie 60 Minuten lang bei 370C mit 0,5%lgem normalen Pferdeserum in PBS, das 0,1 % BSA enthielt, vorinkubiert, dreimal mit PBS mit 0,05% Tween-20 gespült und mit den monoklonalen Antikörpern 0X6 und OX17 (Seralab, Crawle Down, Sussex, UK/GB), die die Antigene I-A bzw. I-E ermitteln, 60 Minuten lang bei 370C und bei optimalen Verdünnungen, die durch Schachbrett-Titration ermittelt wurden, inkubiert. Überschüssige Antikörper wurden durch dreimaliges Spülen mit PBS/Tween abgewaschen, und die Zellen wurden 30 Minuten lang mit affinitätsgereinlgten Anti-Mäuse-Immunoglobulin-G-Antikörpern von Ziegen (Jackson Lab, Avondale, Pennsylvania), die mit alkalischer Phosphatase markiert und 1:1000 in PBS/BSA verdünnt waren, inkubiert. Nach den PBS/Tween-Waschungen wurden die Proben 60 Minuten lang bei 370C in einer Substratlösung, die 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat-Substrat in 10%igem Diethanolamin und 0,5mM MgCI2, pH 9,8 enthielt, inkubiert. Durch Zugabe von 2 M NaOH wurde die Reaktion gestoppt, und die Extinktion bei einer Wellenlänge von 405nm wurde im Mikrotiter-Photometer ermittelt.
Fünfzehn fünf Monate alte Sprague-Dawley-Ratten wurde- wie schon zuvor beschrieben - eine Verletzung der Karotis beigebracht. Kurz gesagt, betäubte Ratten wurden mit einem Fogarty-2F-Ballonkatheter über die linke äußere Karotis katheterisiort. Der Ballon wurde im proximalen Teil der Arteria carotls communis aufgebläht, und dar Katheter wurde in Richtung der Karotis-Gabelung zurückgenommen. Dieser Vorgang wurde dreimal wiederholt, und dann wurde der Katheter entfernt und sowohl die Karotis als auch die oberflächliche Wunde wurden geschlossen. Es ist gezeigt worden, daß dieses Verfahren alle Endothelzellen des verwundeten Bereiches entfernt und einigen Verlust an medialen glatten Muskelzellen erzeugt. Vom Tage der Operation an erhielten fünf Ratten über eine intraperitoneale osmotische Minipumpe (siehe Clowos, A. W., Schwartz, S. M.: Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res 1985:50:139-145) eine kontinuierliche Infusion mit 3H-Thymidin (6,7Ci/mmol; New England Nuclear, Boston, Massachussets). Die übrigen 10 Ratten erhielten am 14.Tag in 24 Stunden dreimal eine 3H-Thymidin-lnjektion (siehe Jonasson, K., Holm, J., Hansson, G.K.: Smooth muscle cells express la antigens during arterial response to injuriy, Lab. Invest. 1988:58:310-315).
14 Tage nach der Operation wurden die Ratten betäubt, und die Halsschlagadern wurden durch Pe, fusion mit 1 % Formaldehyd im Phosphatpuffer, pH7,2 fixiert. Segmente, die die verletzte linke und die unverletzte rechte Karotis enthielten, wurden in flüssigem Stickstoff schnell eingefroren, und 8 pm dünne Schnitte wurden auf einem Kryomikrotom hergestellt. Das la-Antigen I-A wurde durch Inkubation mit dem Anti-Ratten-monoklonalen Antikörper 0X6 von Mäusen, gefolgt von biotinyliertem Anti-Mäuse-Immunoglobulin G von Pferden und einem alkalischen Biotin-Avidin-Phosphatasekomplex (Vector, Burlingame, California) sichtbar gemacht. Die Schnitte wurden dann in Formaldehyd fixiert und in die Kernspurenemulsion NTB 2 (Kodak, Rochester, New York) getaucht. Nach zwei Wochen wurden sie entwickelt, mit Hematoxylin gefärbt und unter dem Lichtmikroskop untersucht. Für jedesTier wurden 200 Zellen in entsprechenden Gebieten der Intimaverdickung gezählt, und die Proportionen von I a-positiven und 3H-Thymidin-positiven Zellen wurden ermittelt.
Die Mittelwerte wurden mit dem T-Test nach Student verglichen. Im Falle von mehrfachen Vergleichen wurde die Schöffe-Korrektur, wie von Armitage beschrieben (siehe Armitage, P.: Statistical Methodes in Medical Research. Oxford, England, Blackwell, 1971), verwendet. Bei ρ < 0,05 wurden die Unterschiede als bedeutungsvoll angesehen. Die Regressionslinien wurden mit Hilfe der Methode der kleinsten Abweichungsquadrate angepaßt.
Die Proliferation von exponential wachsenden glatten Muskelzellen von Ratten wurde durch die Gegenwart von rekombinantem Gamma-Intorferon im Kulturmedium gehemmt. In Bezugnahme auf Abb. 1 wird gezeigt, daß die Proliferation glatter Muskelzellen durch Gamma-Interferon gehemmt wird. Exponential wachsende arterielle glatte Muskelzellen in Mikrotiter-Platten mit 96 Bohrlöchern wurden unterschiedlichen Dosen von rekombinantem Mäuse-Gamma-Interferon (Gamma-IFN) im Kulturmedium ausgesetzt. A, B, C, D und E entsprechen den Konzentrationen von Gamma-Interferon in Einheiten (u)/ml von 0,1, 10,50 bzw. 100. Eine bedeutsame Hemmung wurde mit 10 Einheiten/ml nach 4 Tagen Behandlung und mit 50 oder 100 Einheiten/ml 2 Tage nach dem Zusatz von Interferon erreicht. Es gab eine Dosis-Reaktion-Beziehung zwischen der Gamma-Interferon-Dosis und der Proliferationshemmung bis zu 50 Einheiten/ml, wo ein Piateau erreicht wurde. Die Wachstumshemmung war sogar noch stärker betont, wenn die Zellen zuerst durch Serumkarenz wachstumsgehemmt wurde t, und ihnen erst danach durch Zusatz von FCS gestattet wurde, in den Zellenzyklus einzutreten. Dies wird in Abb. 2 demonstriert, die aufzeigt, daß die Einleitung von Wachstum in synchronisierten glatten Muskelkulturen durch Gamma-Interferon gehemmt wird. A, B, C, D und E entsprechen den gleichen Gamma-Interferon-Konzentrationen wie A-E in Abb. 1. In diesem Falle resultierten 10 Einheiten/ml Gamma-Interferon im Medium in 50%iger Wachstumshemmung, und eine bedeutsame Hemmung wurde mit lediglich einer Einheit/ml nach 9 Tagen des Ausgesetztseins erreicht. Eine bedeutsame Hemmung wurde nach 4 Tagen mit 10 Einheiten/ml, und maximale Hemmung wurde mit 50 Einheiten/ml erreicht. Die Wirkung von Gamma-Intorferon auf die Reduplikation von glatten Muskelzbllen wurde weiter aufgehellt durch die Analyse der 3H-Thymidin-Aufnahme durch synchronisierte Zellen während und nach Eintritt in den Zellenzyklus (siehe Abb.3). Zuerst wurde die Dauer der G,-Phase des Zellenzyklus ermittelt. Zellen in 10cm2 großen Petrischalen wurden durch Serumkarenz zum Wachstumsstillstand gebracht und anschließend durch Zugabe von 10% fötalem Kälberserum veranlaßt, bei 0 Stunden in den Zollenzyklus einzutreten. Zusammen mit dem fötalen Kälberserum wurde 3H-Thymidin zugegeben, die Zellen wurden zu verschiedenen Zeitpunkten geerntet, und die in Trichloressigsäure unlösliche Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung von Dreifachkulturen ermittelt. Die Zeit von der Serumzugabe bis zum Beginn der 3H-Thymidin-Aufnahme (d. h. der Wendepunkt der Kurve in Abb. 3) wurde ermittelt. Die GfPhase betrug annähernd 20 Stunden.
Mit Bezug auf Abb. 4 wird gezeigt, daß, wenn Gamma-Interferon zusammen mit Serum zugesetzt wird, die 3H-Thymidin-Aufnahme um 70% reduziert wird. Gamma-Interferon hemmt die Reduplikation von glatten Muskelzellen, indem es bei einem Ereignis in der frühen G,-Phase des Zellenzyklus wirkt. Zellen in 10cm2 großen Petrischalen wurden zum Wachstumsstillstand gebracht und dann durch Zugabe von FCS veranlaßt, in den Zellenzyklus einzutreten. Von diesem Zeitpunkt an wurden sie kontinuierlich dem 3H-Thymidin ausgesetzt. Gamma-Interferon wurde zusammen mit FCS oder aber 3,6,9,12 oder 15 Stunden später zugegeben. Alle Zellen wurden nach 24 Stunden geerntet, und die in Trichloressigsäure unlösliche Radioaktivität wurde durch Szintillationszählung von Vierfachkulturen ermittelt.
Die x-Achse zeigt die Zeit von der Zugabe von FCS bis zur Zugabe von Gamma-Interferon, wobei „0 Stunden" diejenigen Kulturen darstellt, die FCS und Gamma-Interferon gleichzeitig'erhielten, und ,15 Stunden" für die Kulturen steht, die Gamma-Interferon 15 Stunden nach der Zugabo von fötalem Kälberserum erhielten. Auf der y-Achse stehen die 100% für die 3H-Radioaktivität in solchen Kulturen, die dem Gamma-Interferon niemals ausgeset; waren, und die Radioaktivität in solchen Kulturen, die mit Gamma-Interferon behandelt wurden, wird in Prozenten von diesem Wert (Mittel ± SD) angegeben. Wenn jedoch die Zugabe von Gamma-Interferon um mehr als 9 Stunden nach der Zugabe von Serum verzögert wurde, war keine Hemmung sichtbar (siehe Abb.4). Diese Daten deuten daher darauf hin, daß Gamma-Interferon durch Blockierung des Übergangs von G0 nach G, oder zu einem frühen Ereignis während der G,-Phase des Zellenzyklus in vaskulären glatten Muskelzellen wirkt.
Gamma-Interferon bewirkt die Expression von la-A0ntigenen durch eine Vielfalt von Targetzellen, einschließlich der Endothelzellen und der Fibroblasten. Es wurde beobachtet, daß glatte Muskelzellen diese Antigene auspressen (siehe Jenasson, L., Holm, J., Skalli, O., Gabbiani, G., Hansson, G.K : Exression of class Il transplantation antigen on vascular smooth muscle
cells in human atherosclerosis. J. din. Invest. 1985:76:125-131), und das Vorhandensein von aktivierten T-Lymphozyten in Arterloskleroseherden deutete darauf hin, daß von den T-Lymphozyten freigesetztes Gamma-Interferon die Expression dieses Antigens bewirken könnte (siehe Jonasson, L., Holm, J„ Skalli, O., Gabbianl, Q„ Hansson, G. K.: Expression of class Il transplantation antigen on vascular smooth muscle cells in human atherosclerosis, J. Clin. Invest. 1985:76:125-131 und Hansson, G.K., Jonasson, L., Holm, J., Claesson-Welsh, L.: Class Il MHO antigen expression in the atherosclerotic plaque; smooth muscle cells express HLA-DR, HLA-DQ, and the invariant gamma chain. Clin. Exp. Immunol. 1986:64:261-268). Diese Möglichkeit wurde jetzt untersucht, indem gezüchtete glatte Muskelzellen dem Gamma-Interforon ausgesetzt wurden. Abb.5 zeigt, daß Gamma-Interferon (Gamma-IFN) die I-A-Expression an der Zellenoberfläche bei glatten Muskelzellen auf eine Art und Weise bewirkt, die von der Dosis abhängt. Zellen In Mikrotiter-Platten mit 96 Bohrlöchern wurden mit rekombinantem Mäuse-Gamma-Interferon mit unterschiedlichen Konzentrationen drei Tage lang behandelt, und dann mit Hilfe des enzymgebundenen Immunproben-Verfahrens auf I-A-Expression untersucht. Die I-A-Expression pro Zelle wurde durch Division des gesamten I-A-Wertes in jeder Kultur (Extinktionseinheiten bei einer Wellenlänge von 405 nm) durch die Anzahl der Zellen pro Kultur, wie sie durch Farbstoffbindung ermittelt wurde, berechnet. Es werden die Mittelwerte der Kulturen (n = 16) gezeigt; die Variationskoeffizienten lagen zu jeder Zeit unter 2%.
In Abb.6wird der Zeitverlauf derdurch Gamma-Interferon ausgelösten I-A-Expression durch glatte Muskelzellen demonstriert. Zellen in Mikrotiter-Platten mit 96 Bohrlöchern (n = 16) wurden mit Gamma-Interferon (Gamma-IFN-Stim; 100 Einheiten/ml) behandelt, und die I-A-Expression an der Zellenoberfläche wurde mit Hilfe des enzymgebundenen Immunproben-Verfahrens zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Zugabe von Gamma-Interferon (A) analysiert. Die I-A-Expression pro Zelle wurde durch Division der I-A-Expression pro Loch (A^-Einheiten) durch die Anzahl der Zellen pro Loch ermittelt. Kontrollwerte (B) werden von unsimulierten Zellen abgeleitet. Die Standardabweichungen waren unter 2% von den Mittelwerten. Nachdem die Zellen dem Gamma-Interferon 40 Stunden lang ausgesetzt waren, konnte eine Auslösung nachgewiesen werden, und nach 60 Stunden der Stimulierung wurde ein Plateau erreicht. Der Zeitrahmen für die Auslösung der I-A-Expression verlief mit derdurch Gamma-Interferon ausgelösten Wachstumshemmung eindeutig parallel.
Mit Bezug auf Abb.7 wird gezeigt, daß die Auswirkungen von Gamma-Interferon auf Wachstum und I-A-Expression nicht auf kontaminierende Endotoxine zurückzuführer sind, da eine Endotoxinhemmung durch Polymyxin B, Das zusammen mit Gamma-Interferon zugesetzt wurde, die Ergebnisse nicM beeinflußt hat. Wachstumssynchronisierte Zellen wurden mit rekombinantem Gamma-Interferon verschiedener Konzentration mit (B) oder ohne (A) Zugabe von Polymyxin B (50pg/ml) inkubiert. Es werden hier dio Mittelwerte on 16 parallelen Kulturen in Mikrotiter-Platten mit 96 Bohrlöchern gezeigt; der Variationskoeffizient lag unter 2%. Pm bezieht sich auf Polymyxin B. Die mit Mäuse-Gamma-Interferon (hergestellt von Genentech) erzielten Auswirkungen auf das Wachstum und die I a-Expression waren identisch mit jenen, die mit rekombinantem Ratten-Gamma-Interferon (hergestellt von Holland Biotechnology) erreicht wurden. In Gegensatz dazu löste menschliches Gamma-Interferon keine la-Expression in Rattenzellen aus.
Die In-vitro-Beobachtungen von gleichzeitig ablaufender, durch Gamma-Interferon ausgelöster Hemmung von Zeilproliferation und Expression von I-A-Antigen drängten zur Untersuchung der Hypothese, daß Wachstumshemmung und I-A-Expression auch in vivo miteinander verwandte Erscheinungen sind. Zu diesem Zweck wurde in der Karotis von Ratten durch eine Ballonkatheter-Verletzung eine Proliferation von glatten Muskelzellon ausgelöst, und alle reduplizierenden Zellen wurden vom Zeitpunkt der Verletzung an fortwährend mit 3H-Thymidin, das kontinuierlich über eine osmotische Pumpe geliefert wurde, markiert. Die Reduplikation von Zellen und die I-A-Expression wurden 14 Tage nach der Verletzung analysiert, wenn die Intimaverdickung nachgewiesen ist, aber die Proliferation sich weiter fortsetzt. Die Ergebnisse werden in der folgenden Tabelle 1 angegeben.
3H-Thymidin+ 3H-Thymidin" 1-A+ 1,3(1,4) 9,6(6,2)
!-A' 80,6(4,1) 8,5(8,9)
der Zellenreduplikation durchlaufen haben. I-A, das immunozytochemisch nachgewiesen werden kann, wurde in 10,9% der
durch Injektion von 3H-Thymidin im 24-Stunden-Takt unmittelbbar vor der Tötung der Tiare analysiert. In diesem Falle waren 25,5% der Zellen 3H-Thymidin-positiv, aber keine dieser Zellen hat I-A ausgepreßt. Die Resultate sind in Tabelle Il angegeben.
3H-Thymidin+ 3H-Thymidin"
1-A+ 0 (0) 5,8(2,2)
I-A" 25,5(4,2) 68,7(6,4)
Die umgekehrte Korrelation zwischen DNS-Reduplikation und I-A-Expression deutete darauf hin, daß der Mechanismmus, der die I-A-Expression bewirkt, auch die Proliferation hemmt. Dieser Gadanke wurde auch durch eine detaillierte Analyse der Autoradiogramme von Ratten unterstützt, die durch das 14tägige Regime mit der osmotischen Pumpe markiert wurden. Mit Bezug auf Abb.8 wird gezeigt, daß I-A auspressende glatte Muskelzellen während der Reaktion auf eine Verletzung weniger Reduplikationen als l-A-negative Zellen in der Neointima durchlaufen. Durch die Aufblähung der Karotis von Ratten wurden arterielle Verletzungen erzeugt, und reduplizierende Zellen wurden mit 3H-Thymidln markiert, das 14 Tage lang über osmotische Pumpen infundiert wurde. Die I-A-Expression wurde immunozytochemisch, und die 3H-Thymidin-Aufnahme wurde durch Autoradiographie des gleichen Abschnitts ermittelt. Die Anzahl von Silberkörnern über l-A-positiven und l-A-negativen Zellen wurde in vier Läsionen (50 l-A-positive und 50 l-A-negative Zellen pro Läsion) gezählt. Da es zwischen den Tieren keinen bedeutsamen Unterschied gab, wurden die Daten von allen fünf Läsionen für die statistische Analyse zusammengefaßt. Der Unterschied an Silberkörnern zwischen l-A-positiven und l-A-negativen Zellen ist bei ρ <0,01 anders, und in der Zahl sind die Mittelwerte ±SD angegeben. In der mit 3H-Thymidin markierten proliferierenden Zellpopulation lag die durchschnittliche Anzahl von Silberkörnern pro Nukleus - verglichen mit l-A-positiven Zellen - in l-A-negativen Zellen doppelt so hoch. Es wäre zu erwarten, daß sich mit jedem zusätzlichen Proliferationszyklus mehr3H-Thymidin in den Zellen sammelt, und die Körnerzahl pro Zelle steht in enger Beziehung zu der Radioaktivität pro Zelle. Der Unterschied zwischen l-A-positiven und l-A-negativen glatten Muskelzellen bedeutet daher, daß l-A-positive Zellen weniger Zyklen der DNS-Synthese durchlaufen haben als glatte Muskelzellen, die kein I-A ausgepreßt haben (zwecks Diskussion dieser Art von Analyse siehe Clowes, A. W., Schwartz, S. M.: Significance of quiescent smooth muscle migration in the injured rat carotid artery. Circ Res 1985:56:139-145).
2 F-Ballonkatheter wurde - wie zuvor beschrieben - eine Intimaläsion an der Arteria carotis communis vorgenommen. Vier der
vier Ratten wurden mit dem gleichen Volumen an Trägersubstanz (Kochsalzlösung) injiziert.
14 Tage nach der Aufblähung wurden alle Ratten getötet und durch Perfusion mit 1 % Paraformaldehyd in Phosphatpuffer fixiert.
Gamma-IFN 4 2,30 1,00
<0,01 Kontrolle 4 4^80 0^50
η ist die Anzahl der Ratten und a ist die Querschnittsfläche in Quadratmikrometer. Die statistische Analyse wurde nach dem T-Test nach Student vorgenommen.
Es ist eindeutig, daß die Behandlung mit Gamma-Interferon die Entwicklung der Intimaverdickung bedeutend hemmte, und es ist bemerkenswert, daß diese Hemmung eine Woche nach Beendigung der Behandlung mit Gamma-Interferon fortdauerte. Dies spricht für die Hypothese, daß mediale Zellen zu einem kritischen Zeitpunkt nach der Verletzung auf Reduplikation und Migration festgelegt sind. Die Proliferationshemmung zu diesem Zeitpunkt scheint die Größe der Läsion nachhaltig zu verringern. Die zuvor erläuterten Experimente zeigen deutlich die hemmende Wirkung von Gamma-Interferon auf die Reduplikation von glatten Muskelzellen.
Gamma-Interferon kann somit für die Behandlung von vaskulärer Stenose, die z.B. durch Intlmahyperplasie verursacht worden ist, und in einer bevorzugten Verkörperung für die Behandlung von arterieller Stenose als Ergebnis einer Gefäßoperation und/oder Angloplastik verwendet werden. Gamma-Interferon sollte einem Patienten in einem pharmazeutischen Präparat verabreicht werden, das besagtes Interferon in ausreichender Menge enthält, um eine therapeutische Wirkung zu erzielen. Die in einem bestimmten Falle erforderliche tatsächliche DosiS und Behandlungsdauer legt der behandelnde Arzt fest. Die Dosis sollte ausreichend sein, um die Expression von Antigenen der Klasse II-MHC, z. B. Keratlnozyten, an den Targetzellen zu bewirken. Gamma-Interferon wird hierin als ein Polypeptid definiert, das die Reihenfolge von natürlichem Gamma-Interferon, wie in der European Publication Nr. 77670 dargelegt wird, und alle Aminosäuresequenz- oder Varianten davon hat, die in der Lage sind, durch die hier beschriebenen Methoden oder deren analoge Verfahren unter Verwendung von Zellen von anderen Tieren Stenose zu hemmen. Beispiele solcher Varianten sind AIIeIe oder die Produkte von ortagerichteter Mutagenese, in denen Aminosäurereste deletiert, eingefügt oder substituiert sind. Siehe zum Beispiel European Publication Nr. 146354. Für die Veterinärtherapie sollte solches Gamma-Interferon ν anwendet werden, das mit dor zu behandelnden Tierart übereinstimmt oder in ihr aktiv ist. Bei der Humantherapie sollte die desCysTyrCys-Variante der in der European Publication 77670 gezeigten Reihenfolge verwendet werden; wahlweise käme auch die C-terminale Variante in Frage, in der die letzten vier Reste in posttranslationaler Verarbeitung deletiert werden. Gamma-Interferon mit natürlichen Reihenfolgen kann man von natürlichen Quellen durch Reinigung nach bekannten Verfahren erhalten. Dasselbe Molekül oder dessen Varianten kann man aus rekombinanten Quellen, ebenso nach bekannten Verfahren, erhalten.
Eine typische Formulierung enthält Gamma-Interferon (20 x 10f6) zu 1,0 oder 0,2mg/ml, 0,27mg/ml Sukzinsäure, 0,73mg/ml Dinatriumsukzinathexahydrat, 40 mg/ml Mannit, 0,1 mg/ml Polysorbat 20 quantum sufficit bis 1 g Wasser zur Injektion/ml bei einem pH-Wert von 5,0. Diese wäßrige Formulierung wird zu therapeutischen Dosen verabreichut, die niedriger liegen werden
als die maximal beim Menschen tolerierten Dosen, die der Kliniker ermittelt. Gamma-Interferon kann auch von einem rekonstituierten, lyophllislerten Präparat zugeführt werden.
Gamma-Interferon wird über irgendeine herkömmliche Routo, die eine therapeutische Dosis an den Ort der Intimaverietzung leitet, z. B. über intravenöse oder intrapulmonäre (EP 257956} Zuführungswege verabreicht. Die Verabreichung kann durch kontinuierliche Infusion oder durch Bolus-Dosierung erfolgen, die ausreichend sind, um ein therapeutisches Niveau aufrechtzuerhalten. Das Gamma-Interferon sollte, wenn möglich, zumindest im Verlaufe der Ereignisse, die zur Stenose führen, und auch für eine bestimmte Zeit danach, die ausreicht, um eine gute Heilung der Gefäßanordnung zu gestatten, normalerweise etwa von 3 bis 10 Tagen - wie vom Kliniker festgelegt - angewendet werden.
Claims (6)
1. Verwendung von Gamma-Interferon, dadurch gekennzeichnet, daß es zur Herstellung eines pharmazeutischen Präparates zur Behandlung von vaskulärer Stenose eingesetzt wird.
2. Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der vaskulären Stenose um eine Restenose als Resultat der Behandlung von arterieller Stenose oder eines Verschlusses handelt.
3. Verwendung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Restenose um arterielle Stenose als Resultat von Angioplastik und/oder Gefäßchirurgie handelt.
4. Verfahren zur Verwendung von Gamma-Interferon. zur Behandlung von vaskulärer Stenose, dadurch gekennzeichnet, daß einem Patienten Gamma-Interferon in einem pharmazeutischen Präparat verabreicht wird, das besagtes Interferon in einer Menge enthält, die zur Erzielung einer therapeutischen Wirkung ausreicht.
5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Behandlung von vaskulärer Stenose um die Behandlung von Restenose nach der Behandlung von arterieller Stenose oder einem Verschluß handelt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß es sich bei der Behandlung von Restenose um die Behandlung von arterieller Stenose nach Gefäßchirurgie und/oder Angioplastik handelt.
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Owner name: GENENTECH, INC., SOUTH SAN FRANCISCO, CA 94080 Effective date: 19941010 Owner name: JONASSON, LENA Effective date: 19941010 Owner name: HOLM, JAN Effective date: 19941010 |
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