DD287531A5

DD287531A5 - METHOD FOR THE PRODUCTION OF HUMAN GROWTH HORMONE (STH) IN ANIMAL CELLS

Info

Publication number: DD287531A5
Application number: DD31683188A
Authority: DD
Inventors: Udo Kiessling; Michael Strauss; Mathias Platzer; Bernhard Schlott
Original assignee: Akademie Der Wissenschaften,De; Adw,Zi F. Molekularbiologie,De
Priority date: 1988-06-16
Filing date: 1988-06-16
Publication date: 1991-02-28

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von humanem Wachstumshormon (STH) in tierischen Zellen. Es werden effektiv synthetisierende und sezernierende Zellinien hergestellt, die in der biotechnologischen Produktion menschlichen Wachstumshormones eingesetzt werden koennen. Die Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dasz zur Herstellung von humanem Wachstumshormon die von Maus-Zellen durch wiederholte Transfektion eines STH-Expressionsvektors pMT1GH (Abb. 1) mit einem Selektionsmarkergen im Kotransfer abgeleiteten Zellinien 211B3 und 213, hinterlegt in der ZIM-Hinterlegungsstelle unter den Nr. ZIM-0320 und ZIM-0321, eingesetzt werden. Die erfindungsgemaeszen, optimal produzierenden Zellinien besitzen eine Sekretionsleistung, die bei mindestens 18 mg/106 Zellen/24 Stunden liegt.{Humanes Wachstumshormon; Selektionsmarkergen; Maus-Zellen; Kotransfer; Zellinie; Hinterlegung; wiederholte Transfektion; Sekretionsleistung; Expressionsvektor}The invention relates to a process for the production of human growth hormone (STH) in animal cells. It synthesizes and secretes cell lines that can be used in the biotechnological production of human growth hormone. The invention is characterized in that, for the production of human growth hormone, cell lines 211B3 and 213 derived from mouse cells by repeated transfection of an STH expression vector pMT1GH (Figure 1) with a selective marker gene are deposited at the ZIM depository under No ZIM-0320 and ZIM-0321. The optimally producing cell lines of the present invention have a secretion performance of at least 18 mg / 10 6 cells / 24 hours. {Human Growth Hormone; selection marker; Mouse cells; co-transfer; cell line; Deposit; repeated transfection; secretion; Expression vector}

Description

Field of application of the invention

Die Erfindung betrifft die Herstellung von humanem Wachstumshormon mit tierischen Zellinien, die menschliches Wachstumshormon effektiv synthetisieren und sezernieren.The invention relates to the production of human growth hormone with animal cell lines that effectively synthesize and secrete human growth hormone.

Anwendungsgebiet ist die b'otechnologische Produktion menschlichen Wachstumshormones für therapeutische und diagnostische Zwecke in der Medizin.Field of application is the b'otechnological production of human growth hormone for therapeutic and diagnostic purposes in medicine.

Characteristic of the known state of the art

Genetisch veränderte tierische Zellinien finden als Wirkstoffproduzenten In der pharmazeutischen Industrie ein neues Anwendungsgebiet. Das Gen für das menschliche Wachstumshormon wurde lokalisiert und Moniert. Das Gen wird an effektive Promotoren gekoppelt, in tierische Zellen mit Methoden des Gentransfers eingebracht. Die Zellen lassen sich durch im Kotransfer aufgenommene Selektionsmarkergene Monieren. Im Folgenden werden Zeilklone auf Expression des STH getestet. Die Etablierung einer Produktionszellinie erfordert umfangreiche Untersuchungen an einer Vielzahl von Einzelkolonien. Die Expressionshärte ist abhängig vom Ort der Integration des transferierten Genes, dem Einfluß der in chromosomalor Nachbarschaft mehr oder weniger effektiv transkribierten zellulären Gene. Sie wird weiterhin wesentlich von der Kopiozahl des Fremdgenes in einem definierten Zeilklon beeinflußt.Genetically modified animal cell lines find a new field of application as active ingredient producers in the pharmaceutical industry. The gene for human growth hormone has been localized and cloned. The gene is coupled to effective promoters, introduced into animal cells by methods of gene transfer. The cells can be cloned by selection marker genes taken up in the co-transfer. In the following, cell clones are tested for expression of the STH. The establishment of a production cell line requires extensive studies on a large number of individual colonies. The expression hardness depends on the location of the integration of the transferred gene, the influence of more or less effectively transcribed cellular genes in the chromosomal neighborhood. It is also significantly influenced by the Kopiozahl the foreign gene in a defined Zeilklon.

Da die Integration nach dem Zufallsprinzip erfolgt, ist der Einfluß zellulärer Regulationsprinzipien nur durch umfangreiche Testungen zu umgehen.Since the integration takes place randomly, the influence of cellular regulatory principles can only be avoided by extensive testing.

Die Kopiezahl wird erfahrungsgemäß durch Kopplung des STH-Genes (oder anderer) an ein zweites amplifikationsfähiges Gen, oder die Nutzung repükationsfähiger viraler Vektoren, meist des Rioderpapillomviruses, erreicht (Kaufmann & Sharp [1982] J. Mol. Biol. 159,601; Sarver et. al. [1981] Mol. Cell. Bio). 1,486). Auf diese.* Basis sind bisher STH-bildende Zellinien mit einer Sekretionsleistung von 2-10pg/10^e Zeile/Tag beschrieben (Paek & Axel ,'1987] Mol. Cell. Biol. 7,1496). In der Patentschrift WO 84/02534 wird STH-Gewinnung mit einem Rinderpapillomvirus-Vektor und dem Metailothionein-Promoter beschrieben.The copy number is, according to experience, achieved by coupling the STH gene (or another) to a second amplifiable gene, or the use of repulatable viral vectors, usually the Rioderpapillomviruses (Kaufmann & Sharp [1982] J. Mol. Biol. 159,601, Sarver et. al., [1981] Mol. Cell. Bio). 1.486). On this basis * STH-forming cell lines with a secretion performance of 2-10pg / 10 ^e row / day have hitherto been described (Paek & Axel, 1987] Mol. Cell. Biol. 7.1496). WO 84/02534 describes STH recovery with a bovine papilloma virus vector and the metailothionein promoter.

Object of the invention

Ziel der Erfindung ist die Erstellung tierischer Zellinien, die optimale Expressionsparameter aufweisen und menschliches Wachstumshormon (STH) effektiv in das Zellkulturmedium sezernieren.The aim of the invention is the creation of animal cell lines which have optimal expression parameters and effectively secrete human growth hormone (STH) into the cell culture medium.

Darlegung des Wesens der ErfindungExplanation of the essence of the invention

Aufgabe der Erfindung ist es, tierische Zellinien mit genügend hoher Kopiezahl des Wachstumshormongens zur Verfügung zu stellen. Erfindungsgemäß wird ein STH-Expressionsvektor mit einem Selektionsmarkergen im Kotransfer in Maus-Zellen transfiziert, eine STH-produzierende Zellinie isoliert, diese ZeIIo zur Erhöhung der Genkopiezahl im Kotransfer von STH-Expressionsvektor und einem, vom ersten verschiedenen Selektionsmarkergen erneut transfiziert und im Ergebnis, vorzugsweise mit immunologischen Methoden, eine Zellinie isoliert, die gegenüber der vorhergehenden durch eine verbesserte Expressionsleistung charakterisiert ist. Dieser Zyklus Gentransfer-Selektion-Testung-Etablierung einer Zellinie kann mehrmals wiederholt werden und wird jeweils mit einem Selektionsmarkergen durchgeführt, das von den vorhergehendenThe object of the invention is to provide animal cell lines with sufficiently high copy number of the growth hormone gene available. According to the invention, an STH expression vector is transfected with a selection marker gene in co-transfer into mouse cells, an STH-producing cell line is isolated, this cell is re-transfected to increase the gene copy number in the co-transfer of STH expression vector and one of the first different selection marker gene and, as a result, preferably isolated by immunological methods, a cell line which is characterized by an improved expression performance over the preceding one. This cycle of gene transfer-selection-assaying-establishment of a cell line can be repeated several times and is carried out in each case with a selection marker gene, that of the preceding ones

Selection marker genes is different. As selection marker genes can be used: the Hygromycinresistenzgen in

der Rekombinente pY3 (Blochlinger & Diggelmann [19841 Mol. Cell. Biol.4,2929), das Neomycinresistenzgen in derthe recombinant pY3 (Blochlinger & Diggelmann [19841 Mol. Cell. Biol.4,2929), the neomycin resistance gene in the

Recombinant pSV2neo (Southern & Berg [1982] J. Mol. Appl. Genet., 1,327), the guanine phosphoribosyltransferase gene in

pSV2gpt(Mulligan&Berg[1981)PNAS USA 78,2076), das Thymidinkinasegen von HSV in pSK1 (Strauss etal. [1985] Mol. Gen.pSV2gpt (Mulligan & Berg [1981] PNAS USA 78, 2076), the thymidine kinase gene from HSV in pSK1 (Strauss et al. [1985] Mol.

Genet. 191, 154) and others. According to the invention, the human growth hormone gene (Seeburg [1982] DNA 1,239) is added to a heterologous promoter

gekoppelt, bevorzugt dan Maus-Metallothioneinpromoter (Brinster et al. [1982] Nature 296,39) und die Expressionseinheit mitcoupled, preferably the mouse metallothionein promoter (Brinster et al. [1982] Nature 296,39) and the expression unit

Methods of gene transfer, preferably the Ca-phosphate co-precipitation technique (Graham & van der Eb [1973] Viro1.52,456),

im Kotransfer mit dem Neomycinresistenzgen in tierische Zellen der Linie NIH3T3 oder LTA transfiziert, diese Zellen selektiertund unter den resistenten Kolonien mit Hilfe eines STH-RIA oder -ELISA Wachstumshormon - produzierende Kloneherausgefunden, isoliert und in Zellinien erweitert.in co-transfer with the neomycin resistance gene into animal cells of the line NIH3T3 or LTA transfected, these cells selected and found among the resistant colonies using an STH-RIA or -ELISA growth hormone-producing clones, isolated and expanded into cell lines.

It is essential to the invention that the cell line resulting from the immunological test, of all the clones examined, the

besten Expressionsparameter aufweist, Ausgangspunkt für einen wiederholten Gentransfer ist, im Ergebnis dessen dieas a starting point for repeated gene transfer, as a result of which

Gene copy number per cell is further increased. The STH expression vector is co-transferred with a second selection marker,

vorzugsweise» dem Maus-Metallothionein-Gen(pMT-l) (Glanville [1981 ] Nature 292,267) transfiziert, die Zellpopulation selektiertund mit immunologischen Methoden erneut der beste Produzent ermittelt, isoliert und als neue Zellinie etabliert. Dtaresultierende Zellinie unterscheidet sich von der vorhergehenden durch eine zusätzliche Zahl exprimierter STH-Genkopien.preferably the mouse metallothionein gene (pMT-1) (Glanville [1981] Nature 292, 267), selects the cell population and re-identifies by immunological methods the best producer, isolated and established as a new cell line. The resulting cell line differs from the previous one by an additional number of expressed STH gene copies.

The following essential process steps are necessary for the preparation of the STH expression vector used: The human growth hormone gene is isolated by known methods and subcloned into the vector pUC19. From the Recombinant pUCGH 1 is prepared by cleavage with the restriction enzyme BamHI the human STH gene. The Fragment is inserted into the plasmid pMKdeltaPvu prepared by Bglll / Pvull cleavage (Brinster et al. (1982) Nature 296,39)

den Metallothioneinpromoter der Maus (MT) trägt, Moniert. Im Ergebnis der Ligation und Transformation erhält man dencarries the mouse metallothionein promoter (MT), Moniert. As a result of the ligation and transformation one gets the

STH expression vector pMT1 GH (Figure 1). The STH expression vector is mixed with dom neomycin resistance gene in the form of pSV2 neo, mixed in ratio

1:10 (pSV2neo/pMT1 GH) in Maus-NIH3T3-Zellen transfiziert und diese Zellen mit Geneticin selektiert. Unter den Geneticinresistenten Kolonien wird mit Hilfe eines kommerziellen STH-RIA der Klon U10 N3 mit 8pg STH/10* Zellen/24 Stunden als derbeste Wachstumshormonproduzent ermittelt. Erfindungsgemäß wird diese Zellinie erneut-wie oben beschrieben-transfiziert,als Selektionsplasmid wird das Maus-Metallothionein-Gen pMT-l im Verhältnis 1:10 zugegeben. Die Zellpopulation wirddaraufhin mit CdSO₄ auf Schwermetallresistenz sol· iVtiert und aus der entstehenden Population schwermetallresistenter1:10 (pSV2neo / pMT1 GH) was transfected into mouse NIH3T3 cells and these cells were selected with geneticin. Among the geneticin resistant colonies, the clone U10 N3 with 8pg STH / 10 * cells / 24 hours as the best growth hormone producer is determined using a commercial STH-RIA. According to the invention, this cell line is transfected again as described above, the selection plasmid is added to the mouse metallothionein gene pMT-1 in the ratio 1:10. The cell population wirddaraufhin with CDSO ₄ on heavy metal resistance sol · iVtiert and heavy metals from the resulting resistant population

Zollklone once again determined the best producer. This is the clone 211B3. It is isolated and established as a new cell line. The

erfindungsgemäße Zellinie 211B 3 unterscheidet skh von der vorhergehenden Zellinie U10 N 3 durch eine zusätzliche Zahlexprimierter STH-Genkopien. Die Genkopiezahl ist von 3-5 nach der ersten Transfektion (U 10N3) auf 7-10 nach der zweitenCell line 211B 3 according to the invention distinguishes skh from the preceding cell line U10 N 3 by an additional number of expressed STH gene copies. The gene copy number is from 3-5 after the first transfection (U 10N3) to 7-10 after the second

Transfection (211B3) has been increased. The cell line 211B3 according to the invention has a growth hormone synthesis and

•Sekretionsleistung von ^βμg STH/10'Zellen/24 Stunden auf. Sie wurde in derZIM-Hinterlegungsstelle unter der Nr.ZIM-03020hinterlegt.• secretion performance of ^ βμg STH / 10'cells / 24 hours up. It was deposited in the ZIM depository under the number ZIM-03020.

By re-transfecting the obtained cell line 211B3 with one of the o.g. Selection marker genes, except the Neomycin resistance gene and the pMT-1 gene becomes cell line 213 deposited in the ZIM Depository under number ZIM-0321

gewonnen, die gegenüber der Zellinio 211B3 wiederum eine verbesserte Sekretionsleistung besitzt.in turn, which has an improved secretion performance compared to the Zellinio 211B3.

The cell lines produced are with their secretion performance over those previously described in the literature. The advantage of the invention consists in the already relatively targeted by repeated transfection gene copy number increase at

gut befundenen Produzenten. Damit sind bessere Voraussetzungen für die Gewinnung einer Hochleistungszellinie gegeben alsbei der Genamplifikation in der Zellpopulation. Mit Standardverfahren gewonnene Wachstumshormonproduzenten könnendurch das erfindungsgemäße Verfahren nachträglich auf eine höhere Produktionsleistung gebracht werden.well-disposed producers. This gives better conditions for obtaining a high performance cell line than for gene amplification in the cell population. Growth hormone producers obtained by standard methods can subsequently be brought to a higher production output by the method according to the invention.

embodiment

1. Das menschliche Wachstumshurmongen wird-wie beschrieben - (Kiessling et al. [1987] WP C 12 N/299,3376) isoliert und in den Vektor pUC 19 subkloniert. Aus der Rekombinante pUCGH 1 wird durch Spaltung mit dem Restriktionsenzym BamHI, nachfolgender Elektrophorese in 1 % Agarosegel und Elektroelution, das menschliche STH-Gen präpariert. Das Fragment wird in das durch Bglll/Pvull-Spaltung vorbereiteten Plssmid pMKdelta Pvu (Brinster et al. [1982] Nature 296,39), das den Metallothioneinpromoter der Maus (Ml) trägt, Moniert.1. The human growth hormone gene is isolated as described (Kiessling et al. [1987] WP C 12 N / 299,3376) and subcloned into the vector pUC19. From the recombinant pUCGH 1, the human STH gene is prepared by cleavage with the restriction enzyme BamHI, subsequent electrophoresis in 1% agarose gel and electroelution. The fragment is cloned into the BglII / Pvull cleavage plasmid pMKdelta Pvu (Brinster et al. [1982] Nature 296,39) carrying the mouse metallothionein promoter (Ml).

Im Ergebnis der Ligation und Transformation von kompetenten Escherichia coli DH1 unter Nutzung von Standardprotokollen (Maniatis et al. [1982] DNA Cloning. A Laboratory Mamial CSH Laboratory, N. Y.; Hanahan [1983] J. Mol. Bio). 166,557) erhält man die Rekombinante pMT 1 GH (Abb. 1).As a result of the ligation and transformation of competent Escherichia coli DH1 using standard protocols (Maniatis et al., [1982] DNA Cloning, A Laboratory Mamial CSH Laboratory, N.Y .; Hanahan [1983] J. Mol. 166, 557), the recombinant pMT 1 GH is obtained (FIG. 1).

2. Das STH-Expressionsplasmid wird gemeinsam mit dem Selektionsmarkergen in Form des pSV2 neo (Southern & Berg [1982] J. Mol. Appl. Genet. 1,327), gemischt im Verhältnis 1:10 (pSV2 neo/pMT 1 GH), als Ca-Phosphat/DNA-Kopräzipitat (Graham & van der Eb [1973] Virol. 52,456) in 2 x 10⁵ Maus-NIH3T3 Zellen transfiziert. Die Zellen worden 10-14 Tage mit 400pg/ml Geneticin sele',.:iert und die resultierenden Zeilklone subkloniert und auf Expression des menschlichen Wachstumshormones untersucht. _,2. The STH expression plasmid is used together with the selection marker gene in the form of the pSV2 neo (Southern & Berg [1982] J. Mol. Appl. Genet., 1,327), mixed in the ratio 1:10 (pSV2 neo / pMT 1 GH) Ca phosphate / DNA coprecipitate (Graham & van der Eb [1973] Virol 52, 466) was transfected into 2 × 10 ⁵ mouse NIH3T3 cells. Cells were blotted with 400 μg / ml genetic selenium for 10-14 days and the resulting cell clones subcloned and assayed for human growth hormone expression. _,

Im Ergebnis der immunologischen Untersuchung derZellkulturüberstände eines Experiments mit Hilfe eines kommerziellen STH-RIA erwies sich aus ca. 150 Bestimmungen der Klon U 1ON 3 mit 8\ig STH/10*Zellen/24 Stunden als der beste Wachstumshormproduzent.As a result of the immunological examination of the cell culture supernatants of an experiment using a commercial STH-RIA, out of about 150 determinations, the clone U 1ON 3 with 8 % STH / 10 * cells / 24 hours proved to be the best growth hormone producer.

3. Die Zellinie U10N3 wird-wie in Punkt 2 beschriebon-transfiziert, nur, daßzu12pg DNA pro ml PräzipitatpMT-l (Glanville et al. [1981] Nature 292,267) a,s Selektionsplasmid im Verhältnis 1:10zugegeben wurde. Nach 2 Wochen im Medium mit 20μΜ Cd/SO₄ entstehen erneut Kolonien, die subkloniert auf STH-Expression untersucht werden.3. The cell line U10N3 is described -on-transfected as described in point 2, except that to12pg DNA per ml of precipitate pMT-1 (Glanville et al. (1981) Nature 292, 267) was added to the selection plasmid in a ratio of 1:10. After 2 weeks in the medium with 20μΜ Cd / SO ₄ again colonies are formed, which are examined subcloned for STH expression.

In einem typischen Experiment wird der Klon 211B3 isoliert der mit 18μρ STH/10* Zellen/24 Stunden den Spitzenwert der Wachstumshormonsynthese und -Sekretion aufweist.In a typical experiment, clone 211B3 is isolated, peaking at 18μρ STH / 10 * cells / 24 hours in growth hormone synthesis and secretion.

4. Die Proteinwerte werden durch RNA-Werte bestätigt, die durch Filterhybridisierung, in an sich bekannter Weise (Chromcynski ÄSacchi I1987J Anal. Biochem. 162,156), gewonnen werden.4. Protein levels are confirmed by RNA levels obtained by filter hybridization, in a manner known per se (Chromcynski A Saacchi I1987J Anal., Biochem., 162, 156).

Table 1 Cell clone STH RNA / 10 ° cells RNA molecules / cell U10N3 ca.10ng 15, OxIO ³

211B3 ca.25ng 37.5X10³ 211B3 ca.25ng 37.5X10 ³

Die Differenzen zwischen den beschriebenen Klonen auf dem RNA-Niveau widerspiegeln die erhöhte Expression, verursacht durch zusätzliche Genkopien im Ergebnis der zweiten Transfektion. Die Genkopiezahl ist in diesem Fall von 3-5 nach der Neomycinsolektion auf 7-10 nach der Schwermetallselektion erhöht worden. Die Testung der biologischen Aktivität erfolgt mittels Tibia-Test in an sich bekannter Weise. Die biologische Aktivität korreliert mit dem erhöhten Syntheseniveau.The differences between the described clones at the RNA level reflect the increased expression caused by additional gene copies as a result of the second transfection. The gene copy number in this case has been increased from 3-5 after neomycin removal to 7-10 after heavy metal selection. The biological activity is tested by means of a tibia test in a manner known per se. The biological activity correlates with the increased level of synthesis.

Claims

1. A process for the production of human growth hormone (STH) in animal cells, gekennzelfchnst in that of Mi JS cells by repeated transfection of a STH expression vector with a selection marker gene in the co-transfer derived cell lines are used.

2. The method according to claim 1, characterized in that the mouse NIH 3T3 cells by double transfection of the STH expression vector pMT1 GH (Figure 1), in which the human growth hormone gene is coupled to the mouse metallothionein promoter (MT), derived cell line 211B3 deposited at the ZIM Depository under No. ZIM-0320.

3. The method according to claim 1, characterized in that the mouse NIH 3T3 cells by three transfection of the STH expression vector pMT1 Gh (Figure 1), in which the human growth hormone gene is coupled to the mouse metallothionein promoter (MT), derived cell line 213 deposited at the ZIM Depository under number ZIM-0321.

4. The method according to claim 1-3, characterized in that the repeated transfection is carried out in each case with a selection marker gene which is different from the preceding selection marker genes.

5. Process according to Claims 2, 3 and 4, characterized in that the neomycin resistance gene is used as the first selection marker gene and the mouse metallothionein gene as the second selection marker gene.