DD264939A5

DD264939A5 - Verfahren zur Herstellung einer Nucleinsäure

Info

Publication number: DD264939A5
Application number: DD31055486A
Authority: DD
Inventors: Michael Blaber; Herbert L Heyneker; Gordon A Vehar
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1985-04-22
Filing date: 1986-04-21
Publication date: 1989-02-15
Also published as: DE3689386T2; PT82428B; ES554249A0; HUT40696A; GR861036B; EP0200451B1; ATE98686T1; EP0200451A1; US5219569A; DK181386A; HU202586B; DK181386D0; DK175304B1; PT82428A; DE3689386D1; DD251791A5; ES8800347A1

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer Nucleinsaeure, die fuer eine Protease-resistente Aminosaeuresequenzvariante von einkettiger Urokinase kodiert, das dadurch gekennzeichnet ist, dass man an der fuer einkettige Urokinase kodierenden DNA-Sequenz entsprechende Mutationen vornimmt. Mit der erhaltenen Nucleinsaeure koennen Wirtszellen transformiert werden. Durch Zuechtung der transformierten Wirtszellen kann Protease-resistente Urokinase gewonnen werden, die gegen proteolytische Umwandlung in zweikettige Urokinase weniger empfindlich ist als native einkettige Urokinase.

Description

Titel der Erfindung:

Verfahren zur Herstellung einer \wc leinsaure

Anwendungsgebiet der Erfindung: 25 Die Anwendung der vorliegenden Erfindung erfolgt auf dem Gebiet der Arzneimittel mit thrombolytischer Wirkung.

Charakteristik dos bekannten Standes der Technik:

Urokinase (E.C. 3.4.21.3O i3t eine Serinprotease, die Plasminogen unter Bildung von Plasmin aktiviert. Das Protein wird in verschiedenen Geweben, einschl. Endothel und Nieren, synthetisiert und in Spurenmengen in den Urinausgeschieden. Gereinigte Urokinase liegt in zwei aktiven Foimen vor, einer hochmolekularen Form (HUK; etwa 50 K) und einer niedarmolekularen Form (LUK; etwa 30 K). Die ge-

samte Aminosäuresequenz von beiden humanen Formen wurde ermittelt (1, 2, 3). Von LUK wurde gezeigt, dass es sich von HUK durch Spaltung nach Lysin 135 ableitet. Durch diese Spaltung werden die ersten 135 Aminosäuren von HUK freigesetzt (1). Allgemein wird angenommen, dass HUK oder LUK in proteolyti3ch nktive Formen durch proteolytische Hydrolyse eines einkettigen Vorläufers, auch als Prourokinase bezeichnet, zwischen Lysin 158 und Isoleucin 159 unter Bildung einer zweikettigen aktivierten Form (die weiterhin entweder HUK oder LUK entspricht) übergeführt werden müssen. Die durch diese hydrolytische Spaltung gebildeten proteolytisch aktiven Urokinasearten enthalten zwei Aminosäureketten, die durch eine einzige rUsulfidbindung zusammengehalten werden. Die beiden durch die aktivierende Spaltung gebildeten Ketten werden als A- oder A^Ketten (HUK bzw. LUK) oder als B-Kette, die den Proteasebereich'des Moleküls enthält, bezeichnet.

Urokinase stellt ein wirksames thrombolytisches Mittel dar.

Ea es in der Natur nur in Spurenmengen gebildet wird, sind die Kosten für eine wirksame Dosierung des Enzyruö sehr hoch. L.-okinase wurde in rekombinanten Zellkulturen gebildet. Für Urokinase kodierende DNA sowie geeignete Vektoren und Wirtsor',anismen 3ind bekannt (3. 8).

Wie vorstehend erwähnt, wird angenommen, dass Plasminogenaktivatoren als proteolytisch inaktive Zymogene vorliegen, die durch Proteolyse "aktiviert" werden müssen, bevor das Enzym auf Plasminogen unter Einleitung der fibrinolytisehen Kaskade wirken kann (¹J, 5). Obgleich beobachtet wurde, dass einkettiges Urokinase-Proenzym eine hohe Aktivität bei zymographischen una fibrinolytischen Verfahren aufweist (¹J, 6), hat die Tatsache, dass das Proenzym ferner nur eine geringe amidolytische Aktivität auf niedermolekulare synthetische Polypeptidsubstrate ausübt, zu dem Schluss geführt, dass Spuren an verunreinigender aktiver (zweikettiger) Urokinase in Proenzympräparaten oder Spuren

an Plasmin im verwendeten Plasminogen bei Fibrinplattentests für die fibrinolytische Aktivität von Prourokinase verantwortlich sind (U). Dies führt wiederum zwangsläufig zu dem Schluss, dass einkettige Urokinase ii die zweikettige Form übergeführt werden muss, um in vivo Plasminogen zu spalten und die Fibrinolyse einzuleiten.

Die Rolle von Urokinase bei der in vivo-Gerinnselauflösung ist kompliziert. Es wird 2.Zt. angenommen, dass Prourokinase in Wechselwirkung Mit einem Inhibitor im Plasma steht. Es wird postuliert, dass Fibrin diesen Inhibitor freisetze, während Prourokinase zur Einwirkung auf Plasminogen freigesetzt wird (7). Es ist unklar, ob die Entfernung des Inhibitors allein ausreicht, um die Plasminogenhydrolyse einzuleiten, oder ob die Freisetzung vom Inhibitor einfach die herkömmliche Urokinaseaktivierung \r\ die zweikettige Form erleichtert. Der vom Inhibitor gebundene Urokinasebereich sowie der Bincungsmechanismus sind unbekannt. Eine den Sachverhalt noch komp¹izierter gestaltete Hypothese schreibt der KUK-Spezies eine fibrinbmdende Fähigkeit zu, insbesondere einem als "Kringel" bezeichneten Bereich, der sich etwa innerhalb der Reste ^J-t9 bis 132 befindet (8). Der Zusammenhang r.wischen .,ieser Hypethese und dem Inhibitorpostulat sowie die Bedeutungen dieser Theorien stellen ungelöste Probleme dar.

Ein Haupthinderungsgrund zur Verwendung von zweikettiger Urokinase zur Behandlung von Blutgerinnsein besteht darin, dass die zweikettige Form offensichtlich nicht durch den mutmasslichen Inhibitor von Prourokinase gebunden wird. Wird jweikettige Urokinase peripher verabreicht, so ist sie i;i der !.age, Plasminogen an beliebigen Stellen des Kreis Laufsystems zu aktivieren, was zu unerwünschten Nebenwirkungen führt. Durch Piasminhydrolyse aus einkettißer Urokinase an der Gerinnselstelle erzeugte zweikettiße Urokinase tritt in den Kreislauf ein und erzeugt die gleichen nachteiligen Nebenwirkungen, insbesondere

systemische Fibrogenolyse und Verbrauch anc*2-Antiplasmin. Diese Nebenwirkungen behindern eine einwandfreie in vivo-Thrombogenese.

Ziel der Erfindung:

Ziel der Erfindung ist es, neue Arzneistoffe mit thrombolytiseher· Wirkung bereitzustellen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, eine Nucleinsäu·· re bereitzustellen, die Cür eine Aminosäuresequenzvariante· von einke-ttiger Urokinase kodiert, welche (a) zur Bindung entweder mit Fibrin oder dem postulierten Inhibitor fähig ist, d.h. oei der die End funkt ionen in bezug auf Plasminogenuktivierung an den Gerinnselstellen im wesentlichen die gleichen wie bei nativer Prourokinaso sind; (b) gegen proteolyt is.-:he Verdauung, insbesondere gegen eine Umwundlung in die zweikettige Form, beständig ist; und (c) bei Patienten, denen sie verabreicht wird, eine minimale oder gar keine antigene Wirkung aufweist.

Erfindungsgemaß wird eine Nucleinsüure, die for eine Protease-res is ten te Aminosauresequenzvariante von einkettiger Urokinase kodiert, dadurch hergestellt, daß man an der Cür einkottige Urokinase kodierenden DNA-Sequenz entsprechende Mutationen vornimmt,

Hierbei wird die einkettige Urokinase an den Proteolysestellen kovalent modifiziert,so dass die Urokinase an diesen Stellen nicht mehr länger gegenüber einer Proteasehydrolyse empfindlich ist. Die Zielstellen umfassen Arg.^ bis Lys.j-g und insbesondere die Reste Lys..,^ Dis Lys..,,.. Kovalente Modifikationen werden durch Umsetzung von nativer Urokinase mit derivatisierenden Reagentien oder durch

rekombinante Synthese von Mutanten mit stellenspeziTischen Substitutionen, Insertionen oder Deletionen von Aminosäureresten an der oder den Zielstellen erreicht.

Alle diese Urokinasepräparate sind dazu bestimmt, die Neigung von Proteasen zur Spaltung an den Zielstellen zu verringern oder auszuschliessen. Die Umwandlung von einkettiger Urokinase in zweikettige Urokinase durch Plasmin, bakterielle Proteasen, Trypsin oder andere Proteasen wird durch derartige stellenspezifische Mutationen behindert, wodurch unerwünschte in vivo-Nebenreaktionen vermindert werden, ohne dass die Fähigkeit der mutierten Urokinaseart zur vollen Ausübung ihrer übrigen Wirkungen, die bei nativer einkettiger Urokinase gegeben sind, behindert wird. Insbesondere ist es nient erforderlich, dass die einkettige Urokinase in vivo in zweikettige Urokinase übergeführt wird, um Plasminogen zu aktivieren. Die erfindungsgemäss bereitgestellten Mutanten sind beim Menschen im wesentlichen nicht-immunogen, bleiben letztendlieh fibrinspezifisch und sind zur Aktivierung von Plasminogen ohne Freisetzung von zweikettiger Urokinase in das Gefässystem fähig.

2g Fig. 1 zeigt die Aminosäure- und Nucleotidsequenz von humaner Urokinase. Die Aminosäuresequenz ergibt sich aus der oberen Zeile, während die Nucleotidsequenz darunter angegeben ist. Ferner sind auch nicht-translatierte 5¹- und 3'-Bereiche gezeigt.

Einkettige Urokinase ist definiert als Protein mit der

Aminosäuresequenz von humaner Urokinase gemäss Fig. 1A und 1B in der hochmolekularen Form (etwa 54 000 Dalton, GIn₂ Glu^-Ende) oder in der niedermolekularen

Form (etwa 33 000 Dalton, NH₃-LyS₁ ^PrO₁-,,SeT₁ .._g-Ende) oder mit von dieser Aminosäuresequenz abgeleiteten Variationen und Derivaten unter Einschluss von natürlichen

-δι Allelen, wobei das Molekül aus einer einzelnen Amino-säurekette besteht, die an der Proteolysestelle unter Einschluss der Reste Arg_1(rg bis Lys_ie.g (nachstehend als "Kettenumwandlungsstelle" bezeichnet) ungespalten verbleibt. Protease-resistente einkettige Urokinase ist ein Urokinasederivat mit einer einzelnen Aminosäurekette, die gegenüber proteolytischer Hydrolyse weniger empfindlich als die underivatisierte, native Form von Urokinase ist. Insbesondere ist ; -^otease-resistente Urokinase gegenüberder Umwandlung in zweikettige Urokinase durch Proteolyse an der Kettenumwandlungsstelle beständig. Typischerweise wird dies bestimmt, indem man das mutmasslich proteaseresistente Urokinasederivat mit Humanplasmin inkubiert und die Aktivität des behandelten Produkts gegenübereinem chromogenen Substrat, wie S-S^^^.mit nativer einkettiger Urokinase bei gleicher B-:^andli>ng und gleichen Testbedingungen vergleicht. Beträft die Geschwindigkeit der Pla3minumwandlung des zu untersuchenden Urokinasederivats in die zweikettige Form (bestimmt durch Anstiegder hydrolytischen S-2UUH-Aktivität) weniger als etwa 50 % und im allgemeinen weniger als 10 % der Geschwindigkeit der Umwandlung der vergleichbaren nativen Urokinase in die zweikettige Form, so wird das zu untersuchende Produkt als proteolyseresistent bezeichnet. Dieses Testver-

fahren wird in den AusführungsbeisDielen näher beschrieben

Gegenüber Proteolyse resistente einkettige Urokinase umfasst auch einkettige Urokinasederivate, die im wesentlichen nicht zur proteolytischen Spaltung an der Stelle '"- · — ,< (nachstehend als "LUK"-Stelle bezeichnet)fähig sind. Diese Derivate sind als Produkte definiert, bei denen die Umwandlung von HUK zu LUK bei gegenüber Proteol/se beständiger Urokinase mit geringerer Geschwindigkeit als bei nativer einkettiger Urokinase verläuft. Beträgt die Geschwindigkeit der Trypsinumwandlung des in Frage stehenden Urikinasederivats zur LUK-Form (bestimmt

durch Gelelektrophorese, Gelfiltration, Immunoassay oder dergl.) weniger als etwa 50 % und im au ι gemeinen weniger als etwa 10 % der Umwandlungsgeschwindigkeit der vergleichbaren Urikinasespezies zu LUK, so wird das in Frage stehende Produkt als gegenüber Proteolyse resistent bezeichnet.

Die Proteolyseresistenz wird ggf. auch als Resistenz gegenüber anderen Proteasen, deren Anwesenheit in der Umgebung von einkettiger Urokinase zu erwarten ist, d->finiert. Als Wirte für die rekombinante Synthese von einkettiger Urokinase verwendete Mikroorganismen enthalten Proteasen, wie Endo- und Exopeptidasen, sowie einige Esterasen oder Amidasen mit proteolytischer Aktivität. Einige dieser zufällig vorhandenen Proteasen spalten einkettige Urokinase. Der Umgang mit diesen Proteasen bei der Reinigung ist besonders schwierig, wenn die rekombinante Urokinase löslich ist und erhöhten Konzentrationen an diesen Proteasen ausgesetzt wird. Früher wurden zur Lösung dieser Schwierigkeit Proteolyseinhibitoren, z.B.

1 tn Guanidin.HCl in den Reinigungslösungsmitteln verwendet (3). Ferner wurde ein als einkettige Urokinase identifiziertes Enzym aus natürlichen Quellen durch rasche Trennverfahren (6), die zur Verhinderung der Umwandlung in die zweikettige Form bestimmt waren, isoliert.

Die protease-resistente einkettige Urokinase wird nach an sich üblichen Verfahren hergestellt. Die Kettenumwandlungsstelle und verzugsweise auch die LUK-Stelle werden kovalent modifiziert, so dass sie: gegenüber einer proteolytischen Spaltung weniger empfindlich sind.

Eine bevorzugte Ausführungsform zur Herstellung von protease-resistenter einkettiger Urokinase besteht in der Einführung einer Aminosäuresequenzvariation in die Kettenumwardlungs- oder LUK-3tellen durch rekombinante Methoden. Eine DNA-Sequenz, die für einkettige Urokinase kodiert, ist bekannt. Ebenso sind Verfahren zu deren Expression in rekombinanten Wirtszellen bekannt (3, 8). Methoden, die zur Einführung von Mutationen in diese DHA, die als ge?·· ,

-ΙΟΙ über Proteolyse beständige Aminosäuresequenzvarianten exprimie werden, verwendet werden können, sind an sich bekannt. Z.B. werden DNA-Segmente, die für die Kettenumwandlungs- und LUK-Stellen (sowie ggf. für flankierende Bereiche) kodieren, aus der für die Urokinase kodierenden DNA herausgeschnitten, indem man sequentiell mit Restriktionsendonucleasen, die an den flankierenden DNA-Bereichen, die für die Froteolysestellen kodieren, einwirken (bestimmt durch DNA-Sequenzanalyse), verdaut, die entsprechend gespaltene DNA (bestimmt durch Gelfiltration) gewinnt, das für die gewünschte Amino3äureseqL!enz und die flankierenden Bereiche kodierende Oligonucleotid synthetisiert, mit den Restriktionsenzymen, die auch zum Herausschneiden aes unerwünschten Fragments verwendet werden, abbaut, dadurch kohäsive Enden schafft und die synthetische DNA in das restliche Strukturgen der einkettigen Urokinase durch Ligation .einbaut. Die Cür die LUK-Stelle kodierende CNA wird beispielsweise herausgeschnitten, indem man pUK54trp207-1 (3) mit Mstl und Ball partiell abbaut, das Vektorfragment gewinnt und der. Vektor durch Ligation des Fragments mit einem synthetischen Oligonucleotid mit der gewünschten Sequenz rekonstituiert. Bei dieser Ausführungsform wird für DNA kodierende l_ Lys ..,,-"* A_/-Huir,anurokinase bereitgestellt, indem man an den Mstl- und Ball-Enden ein Oligonucleotid der Sequenz

pGCAGATC&AAAGCCCTCCTCTCCTC^

530 562

einsetzt, wobei die unter der Sequenz angegebenen Nummern mit FJg. 1 übereinstimmen.

In ähnlicher Weise wird die für die Kettenumwandlungsstelle kodierende DNA beispielsweise herausgeschnitten, indem man die Urokinase-DNA mit Ball und EcoRI auf gleiche Weise abbaut und mit dem geöffneten Gen ein Oligonucleotid mit der Basensequenz, die für die gewünschten Aminosäure-

reste kodiert, verknüp. , Ein Beispiel für ein entsprechendes Oligonucleotid bei der Herstellung ¹On l_ His; Lys_1c-g-> A_7-Humanurokinase ist

-HisPhelle-

p GGTTTTCTGA^GACrcCGGGGTGAMTTATAACCCCCTCTTAAp.

583 627

Weitere Sequenzvarianten können auf analoge Weise durch Synthese und Insertion von entsprechenden Oligonucleotiden hergestellt werden.

Zweckmässiger ist es jedoch, die Urokinase-DNA zu mutieren, indem man das M12-Phagen-Mutageneseverfahren (9) anwendet. Dieses Verfahren ist an sich bekannt.

Die erfindungsgemässen Aminosäure.sequenzmutanten sind durch Deletion oder Substitution der in den Proteasestellen vorkommenden basischen Reste (Arginin und/oder Lysin) oder durch die Insertion von Resten, die es den basischen Resten im wesentlichen unmöglich machen, an der proteolytischen Spaltung teilzunehmen, charakterisiert. Kombinationen von Insertionen, Deletionen oder Substitutionen worden angewandt. Bevorzugte Mutationen sind in der nachstehenden Tabelle zusammengestellt. Diese Tabelle soll keine abschiiessende Aufzählung von geeigneten Mutationen darstellen.

Urokinase -Rest(e)

i gni η

1. 2.

3.

Δ; OCeO^yS₁₃₅-*His, SeroderTyr Ä;oderLys

is, ϊ et, \pt

His Ser Tyr, GIu or lGly J

Sly ;·,

Δ pier LyS₁₅₈-HiS, Ser, TyrcrierGly

Giu,

or bly J

158

Wenn LyS₁-,- unverändert ist oder zu Arginin mutiert ist, soll Lys.-,β zu Prolin mutiert werden oder wegfallen. Ferner soll, wenn Lyr._1c-n unverändert oder zu Argir.in mutiert ist, Prolin zwischen Lys._cQ und He₁₁.-. insertiert oder He.^q durch Prolin ersetzt werden. Bei den besonders bevorzugten Ausführungsfcrmen handelt es sich um die DeIetionsmutanten, insbesondere in bezug auf Lyn,,,, Arg.^- und Lys.po, knapp gefolgt, von Mist id inylsubst ι tut ionen , da bei diesen Mutationen die Wahrscheinlichkeit Jer Bildung von Autoantikorpern bei den Patienten an geringsten ist. Eine bevorzugte Ausführungsform besteht in der DeIetion von Lys.-_r oder Lys , kombiniert mit einer Deletion

von 'Phe

. „Lys. _t

Diese Mutante hat den Vorteil, dass,

selbst wenn eine begrenzte Prot.eolyse im Anschluss an Arg.ri stattfindet, bei der proteolytischen Umwandlung in die zweikettige Form das gebildete Molekül in beiden Urokinaseketten die gleichen C- und N-Enden aufweist, wie sie in zweikettiger Urokinase vorliegen (die normale Proteolyse von Prourokinase setzt in vivo das Phe-Lys-Dipep- tid frei). Ferner verbleibt bei dieser bevorzugten Mutante

- 13 das Molekül in der HUK-Form.

Die für die protease-resister.te Variante kodierende Nucleinsäure wird in einen Expressionsvektor insertiert, der Vektor wird zur Transformation einer Wirtszelle verwendet, die Trnnsformante wird gezüchtet, bis sich die Urokinasevariante in der Kultur anreichert, und die Variante wird sodann aus der Kultur gewonnen. Die Methoden zur rekombinaten Urok^naseherstellung, die in der Literatur (3) beschrieben .sind und auf die hier ausdrücklich Bezug genommen wird, .sind alle zur Herstellung der Varianten geeignet

Ausführungsbeispiele: Beispiel 1

^c

Aufbau der LyS ₁ ^, -=» Δ -Mutante

Plasmid pUK54trp2O7*TX wurde als Ausgangsplasmid verwendet. Dieses Plasmid entnält DNA, die für das vollständige HUK-Gen unter der Kontrolle des E. coli trp-Promotors kodiert.

Dieses Plasmid ist identisch mit pUK5Utrp207-i (3.), mit der Ausnahme, dass es nur eine EcoRI-Stelle in der Nähe des 3'-Endes des trp-Promotors enthält und die 6Ui bp (Basenpaare) zwischen den Aval-und PvuII-Stellen der pBR322-Vektorkomponente deletiert worden ist (sog. "XAP"-Deletion) (1U).

Das Plasmid pUK5Utrp207-1*TX wird nach einem bekannten Verfahrer. (3) hergestellt, mit aer Ausnahme, dass bei diesem Verfahren als Ausgangsplasmid pHGH207-1*XAP anstelle von pHGH2C7-1 verwendet wird. pHGH207-1*XAP wurde durch partielle EcoRI-Verdauung von pHGH207-1 zur Öffnung des Plasmids gebildet, die kohasiven Enden wurden unter Verwendung ces Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I gefüllt, das Plaemid wurde unter Verwendung von TU-Ligase rezirkularisiert und anschliessend zur Transformation von E. coli verwendet. Ein Plasmid, pHGH207-1*, wurde gewählt, in dem nur die EcoRI-Stelle am 3'-Ende des trp-Promotors er-

halten blieb, wie durch Restriktionsenzymanalyse festgestellt wurde.

Zur Erzielung der XAP-Deletion wurde pHGH207-1* mit Aval und PvuII verdaut, das grosse Vektorfragment wurde gewonnen, die köhäsiven Enden wurden unter Verwendung des Klenow-Fragments von DNA-Polymerase I gefüllt, das Plasmid wurde stumpfendig unter Verwendui.g von TU-Ligase verknüpft und E. coil wurde unter Verwendung des Ligationsgemisches transformiert. pHGH207-1·ΧΑΡ wurde gewonnen und g^nässdem bekannten Verfahren zur Bildung von pUK5Hrp207*TX ver wendet.

ρϋΚ5^Γρ2Ο7-1·ΤΧ wurde mit Fstl und Bell verdaut, und das

Fragment, das in etwa die Basen 139 bis 732 umfasst, wurde

gewonnen. Doppelsträngiges M13mp10 (die äquivalente Phage M13mpi8 wird von Bethesda Research Laboratories vertrieben) wurde m t Pstl und BamHI verdaut und an das Pstl-Bcll-Urokinase-DNA-Fragmenfc unter Bildung von M13mp10UK1 verschweisst. E. coli JM101-Zellen (ATCC Nr. 33876) wurden mit der doppelsträngigen replikativen Form (RF) von MI3mp10UK1 transformiert. Das einzelsträngige und RF-MI3mp10UK1 vurde aus infizierten E. coli JM101-Zellen auf bekannte Weise isoliert. Es ist anzumerken, dass Bell und BamHI kohäsive Enden bilden, so dass die M13mp10-Phage zur Rezirkularisierung mit dem Urokinaseinsert in der Lage war. Die einzelsträngige Form wurde für die stellenspezifische Mutagenese von Urokinase an der Lys.-g-Stelle verwendet.

Ein synthetisches Oligonucleotid wurde nach dem Fest-

phasen-Phosphotriesterverfahren (16) zur Verwendung als Mutageneseprimer hergestellt. Der folgende Primer wurde für die Deletion von Lys.»^ eingesetzt:

5'PGCACATGGAMACCCTCCICICCr.

530 556

Dies ist der Bereich von Urokinase, der für den ^₆ flankierenden Strang kodiert, mit der Abänderung, dass das AAG-Codon für Lys^, deletiert war.

Das nachstehend beschriebene Verfahren wurde zur Erzeugung eines Urokinaseklons mit einem Gehalt an cer mutierten Sequenz des synthetischen Primers eingesetzt. Dieses Verfahren ist an sich bekannt (9).

50 ng des synthetischen Oligonucleotids wurden 30 Minuten bei 37 ⁰C in 10 ^l eines Gemisches mit einem Gehalt an50 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert 7,5, 10 millimolar MgCl₂, 10 millimolar Dithiothreit, 1 millimolar ATP und8 ü TU-Polynucleotidkinase phosphoryliert. Als Tracer

wurden UOO ng synthetisches Oligonucleotid auf die vorstehend beschriebene Weise phosphoryliert, mit der Abänderung, dass das ATP durch 60 mCi /~/³²P7-ATP (3000 Ci/mMol) ersetzt wurden, was etwa 50 bis 60 χ 10 cpm/UOO ngdes 2U-meren ergab. Zur Keteroduplexbildung wurden 100 ng einzelsträngiges M13mp10UK1 10 Minuten auf 95 ⁰C erwärmt una innerhalb von 30 Minuten in UO /il eines Gemisches mit einem Gehalt an 10 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert 7,5, 10 millimolar MgCl₃₁ 1 millimolar Dithiothreit und 10 ngphosphoryliertem Primer und 500 ng grossem Fragment vonmit EcoRI verdautem M13mp10UK1 langsam auf Raumtemperatur abgekühlt. Die Primerextension wurde durch Zugabe von 10 ul Puffer mit einem Gehalt an 50 millimolar Tris-HCl vom pH-Wert 7,5, 10 millimolar MgCl₂ und 1 millimolar

Dithiothreit, 2 millimolar ATP, jeweils 0,25 millimolar

dGTP, dTTP, dCTP und dATP, 5 U groseem Fragment von E. coli-DNA-Pclymerase I und UOO U TU-DNA-Ligase gestartit. Nach 1 h bei 12 ⁰C wurde das Reaktionsgemisch zur Transformation von E. COÜ-JM101-Zellen verwendet.

Die Transformation wurde durch Vermischen von Ί0 ul des Ligationsgemisches mit 200 ,ul an kompetenten JM101-Zellen

und anschliessende 30-minütige Inkubation auf Eis und 5-minütige Inkubation bei 37 ⁰C erreicht. Sodann wurden 3,5 ml 2YT-Topagar bei 55 ⁰C mit 300 ^l gesättigtenJM101-Zellen, 1O₇Ul IPTG (200 millimolar) und 50 μΐ Xgal vermischt und nach Zugabe der transformierten Zellen wurde auf 9 cm-Petrischalen Mit einem Gehalt au LB ohne Arzneistoffe ausgestrichen.

Zwei farblose Plaques (B2 und G12) wurden aufgenommen und auf eine Mikrotiterplatte mit einem Gehalt an 100 ,ul2YT-Medium übertragen. Die inokulierten Mikrotiterflüssigkeiten wurden auf LB-Agarplatten von 15 cm Durchmesser, die mit einem Rasen von 6OO ,ul JM101-Zellen in 8 ml 2YT-^Topagar Uberschichtet waren, aufgedrückt und über Nacht bei 37 ⁰C inkubiert. Die gebildeten Plaques wurden durch

1-minütigen physikalischen Kontakt auf eine Nitrocellulosescheibe übertragen. Die Nitrocellulosescheibe wurde mit 0,5 m NaOH, 1,5 m NaCl 3 Minuten behandelt und 2 mal

mit 3 m NaCl-O,5 m TrisHCl vom pH-Wert 7,5 15 Minuten ge-20

waechen und sodann 15 Minuten mit 2X SSC gewaschen. DasPrähybridierungsgemisch enthält 10 millimolar Tris vom pH-Wert 7,5, 5 millimolar EDTA, 0,9 m NaCl, 1X Denhardt, 0,5 % NP¹JO, 100 mikromolar ATP, 1 millimolar Natriutnpyrophosphf.t, 1 millimolar Natriumphosphat und 50 ^ig/ml E. coil

tRNA. IX Denhardt enthält pro Liter 200 mg Ficoll, 200 mg Polyvinylpyrrolidon und 200 mg Rinderserumalbumin (BSA, Fraktion V). Die Scheibe wurde 90 Minuten unter vermindertem Druck auf 80 ⁰C erwärmt und sodann 3 Stunden mit 6 ml Prähybridisierungsflüssigkeit in einer Petrischale inkubiert, wonach 5 χ 10 cpm markierter Primer zugesetztund über Nacht hybridisiert wurde. Ein selektiver Waschvorgang der Scheibe wurde mit 0,UX SSC bei 49 ⁰C durchgeführt. Nach Trocknen an der Luft liess man die Scheibe auf einen Röntgenfilm einwirken. Die positiv hybridisierenden

³^ Klone wurden weiter durch Didesoxysequenzierung anrlysiert. Beim B2-Klon wurde die richtige Sequenz mit der LyS₁^g-Deletion bestätigt.

Das Expressionsplasmid wurde durch Ligation von Xbal-Bcl- und Xbal-Pstl-Fragmenten aus pUK5^trp2O7-1*TX mit dem Sau3A-PstI-Insertionsfragment aus Plaque B2 und Transformation des Ligationsge.nischrs in E. coli rekonstituiert Eine Transformante wurde ausgewählt, die ein Plasmid enthielt, das die Genmutante (pUK5UB2) trug. Die Fragmente wurden durch herkö-nmliche Behandlung (Verdauung) mit Restriktionsenzym und Gewinnung des gewünschten Fragments erhalten. Dabei w irden die Bell- und BamHI-Stellen beide zerstört. Das M13-Urokinaseinsert wurde am gleichen Punkt wie die BcLI- und BamHI-Ligation durch Sau3A, das die zentralen vier Basen von Bell-, BamHI- oder BclI-BamHI-Ligationsstellen erkennt, herausgeschnitten.

pUK5^B2 wurde zur Transformation von E. coli verwendet.

Der gegenwärtig bevorzugte Stamm von E. coli ist W3110fhuA", Dieser Stamm ist für die Herstellung der erfindungsgemässen Urokinasemutanten nicht wesentlich, erweist sich jedochals besonders zweckmässig, da er gegenüber kontaminierenden

Phagen sehr resistent und für grosstechnische Herstellungsverfahren praktischer ist.

E. coli W3110fhuA~ ist ein TI-Phagen-resistentes Bakterium, das durch eine Deletion oder Inversion der mit dem fhuA-Gen assoziierten DNA-Sequenzen assoziiert ist.

Kurz zusammengefasst, wird E. coli W3110 (ATCC 27325) mit Λ-Bakteriophagen mit einem Gehalt am transponierbaren Element TnIO, das Tetracyclin-Resisterz verle.ht, trans-

** duziert. Stämme von mit TnIO transduzio: tem W311C werden in bezug auf Resistenz gegen Phageninfektion ausgewählt. Phagen-resistente Stämme werden vereinigt und mit Bakteriophagen Pl infiziert. Das erhaltene Lysat wird zur Trar.sduktion von E. coli AT982 (17) verwendet. Der Stamm AT982enthält eine DAP-Mutation, die sich in der Nähe des fhuA -Gens befindet. Demzufolge zeigt die Transduktion des

Stamms AT982 durch das Pl-Lysat und die Wahl von Transduktanten, die gegen Tetracyclin resistent sind und die die DAP-Funktion regenerieren, dass das Transposon Tn10 sich innerhalb des fhuA-Gens befindet. Stämme, die gegen Tetracyclin resistent sind und eine regenerierte EAP-Funktion aufweisen, stellen die DNA-Quelle für die Bakteriophagen Pl-Transduktion von E. coli W3110 dar. Transduzierte W3110-Stämme, die die Tetracyclinresistenz und Phagenresistenz exprimieren, werden ausgewählt. Diese Stämmewerden sodann auf der Basis der Resistenz gegen Phageninfektion und Reversion zur Tetracyclinempfindlichkeit (18) ausgewählt. Eine Reversion zur Tetracyclinempfindlichkeit, die mit der Beibehaltung der Resistenz gegen T1-Phageninfektion gekoppelt ist, zeigt, dass die mit demfhuA-Gen assoziierte DNA-Sequenz entweder deletiert oder

irreversibel invertiert worden ist. Die so hergestellten Stämme werden als E. coli W3110fhuA~ bezeichnet.

Die das transponierbare Element Tn10 enthaltenden Phagen,

die zur Insertion von Tn10 in W3110 verwendet wurden, wurden folgendermassen aufgebaut. Beim Ausgangsmaterial handelte es sich um Λ-^c1857b 2210am29. Diese Phage ist dem Fachmann geläufig (19) und wurde aus drei bekannten Mutanten von /1-Phagen nach üblichen Verfahren hergestellt.

Ein Lysat dieser /\-Phage wurde am amber-Suppressor E. coli

C600 (ATCC 237214), das nach üblichen Verfahren so manipuliert worden war, dass es ebenfalls das Tn10-Transposon enthielt (19). hergestellt. Dieses Lysat wurde zur Infektion von E. coli C600 ( X -C1857), das einen amber-Suppressor und eine /\-Prophage mit dem ci857-Genotyp enthält, verwendet. Lysate von gegen Tetracyclin resistenten Kolonien wurden durch Wärmeinduktion unter Züchten der TetracyclLn-resistenten Kolonien zunächst in Gärbrühe von 32 ⁰C und anschliessend 90 Minuten bei U2 ⁰C hergestellt.

Das Lysat wurde sodann auf E. coj.i C600 ausgestrichen und der Replikaplattierung bei 32 ⁰C an E. coli C600 und

E. coli W3102 sup+ ( A-immU34), das die heteroimmune Prophage ^-imrnU34 enthält (20), unterworfen. Am heteroimmunen Stamm auftretende Plaques wurde auf Tetracyclinplatten ausgestrichen. Auf diesen Platten auftretende Plaques sind

δ zur Transduktion der Tetracyclinresistenz in der Lage und werden beil vorerwähnten Verfahren zur Erzeugung von E. coli W3110fhuA~ verwendet.

Rekombinante native und ./"IyS₁₃₆-> δ_7 humane Urokinase wurden aus 1 Liter-Kulturen von W3110- oder W3110fhuA~- Zellen, dio mit dem entsprechenden Plasmid transformiert sind, erhalten. Die Expression wurde ferner durch Zugabe von Indolacrylsäure induziert.

Beispiel 2

Aufbau von /~Lys.. -,-> Δ, ; Phe.C₇ LyS ₁ ,a·» ^7-Humanurokinase

Es wurde im wesentlichen das gleiche Verfahren zur Erzeugung von Expressionsplasmiden, die andere oder zusätzliehe Mutanten tragen, durchgeführt. In einigen Fällen i3t es zweckmässig, die M13-Phage, die bereits eine oder mehrere Mutanten trägt, zur Herstellung von an zusätzlichen Steilen mutierter DNA zu verwenden. Das folgende Verfahren wurde zur Herstellung von £~Phe._c.-Lys._c.n-) Δ> ; LyS₁ .,£-»Λ_7-Humanurokinase angewandt. M13mp10UK1 wurde als Schablone für einen Primer mit der folgenden Sequenz verwendet:

5' pCTGAGGCCCCGCATEATTGGGGGA. 593 621

Unter Anwendung des vorstehend beschriebenen Verfahrens wurde die Plaque 2F3 identifiziert. Phagen von der Plaque 2F3 wurden ermittelt, die ein Urokinase-DNA-Fragment mit der Phe^yLys.CQ-^ AMutation enthielten. Das Expressionsplasmid für diese Mutation, das auch die LyS₁ .,, -Deletionsmutation (Beispiel 1) enthielt, wurde durch Ligation des Ve'Ktorfragments aus einem Ball-Bcll-Abbau von pUK5'JB2 mit

dem BalI-Sau3A-Insertionsfragment des Phagen 2F3, Transformation und Züchten von E. coli W3110 oder W3110fhuA~ rekonstituiert. Transformierte Zellen wurden über Nacht auf Minimalraedien bis zu einer optischen Dichte bei 550 nm von 1,2 gezüchtet. Zusätzliche Medien wurden zugesetzt. Indolacrylsäure, eine Verbindung, die die Expression der durch das Tryptophanoperon kontrollierten Gene weiter induziert, wurde in einer Konzentration von 10 ^g/ml zugesetzt. Die Zellen wurden 2 Stunden inkubiert und so-¹^ dann geerntet.

Während pUK5itrp207-1*TX ,das bei der Herstellung der hier beschriebenen protease-resistenten Urokinase-Sequenzvarianten tatsächlich verwendete Plasmid war, ist es für ¹^ den Fachmann klar, dass auch andere Expressionsvektoren geeignet sind. Es ist lediglich für Urokinase kodierende

klonierte DNA erforderlich. Diese DNA wird durch Synthese oder durch Bereitstellung von mRNA aus geeigneten Zellen,z.B. Detroit 562-Zellen (ATCC CCL 138), und Herstellenvon cDNA daraus, erhalten (3). Diese DNA wird durch eine zumindest wesentliche DNA- und Aminosäuresequenz-Homologie mit der in Fig. 1 gezeigten Sequenz von nativer Urokinase identifiziert. Geeignete Restriktionsenzymstellen werden

«β aus der DNA-Sequenz identifiziert und angewandt, zusammen mit erforderlichen Adaptoren oder Linkern, um eine zur Insertion in den ausgewählten Expressionsvektor geeignete DNA zu erhalten. Die Anwendung von anderen Plasmidkonstruktionen und Wirt-Vektor-Systemen liegt im Bereich des

Wissens des Fachmanns.

Claims

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Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung einer Nucleirisäure, die für eine Protease-resistente Aminosäuresequenzvariante von

einkettiger Urokinase kodiert, dadurch gekennzeichnet, 5

dass man an der für einkettige Urokinase kodierenden DNA-Sequenz entsprechende Mutationen vornimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Variante um eine DeIetionsmutante des Urokinase-Gens handelt.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der Urokinase um Humanurokinase handelt und die Variation eine mutierte Aminosäuresequenz etwa im Bereich der Reste Arg.-,- bis Lys ._p umfasst.

Ί. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Humanurokinase ausgewählt ist unter: ^^-PlIe_{1 57} Lys ₁₅q-> _Δ_7-Humanurokinase, _/~Phe ₁ cyLys , ^g-LyS₁ ,j--* 4_7-Humanurokinase , £~brg_} ,-g_7-Humanurokinase , l_ His JCg_- /-Human urokinase , ^GIy ₁ ^ g__7-Human urokinase , i~Ser ^ _Cg_7-Humanurokinase , £~Tyr _{1 {}-g_7-Humanurok ina.se , _e^·^ His; Lys ₁ ^g -^ Str_7-Humanurok inase , ^.

,-> a /-Humanurokinase, / Arg, _cC Phe . _c_Lys, ^₀V λ / · j — — — ibo ι b ί 15 ο *-* —

Humanurokinase, £~lys _]C.nlle _]C;(.-> lys _]C-nPrG Ile_ic._q_7~ Humanurokinase, /_ Phe ₁ cyLys , ^g^» _Δ; ATg₁ ,-^ His_7-Humanurokinase und l_ ATg_{1 c}^Fhe ₁ „₇-> ^; Lys_iqg-^ Gly_7-Humanurokinase.
5. Verfahren nach Anspruch Ί, dadurch gekennzeichnet, dass es i^ich bei der Humanurokinase um /Phe. c^Lys . j. o-> 4 J-Urokinase handelt.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Variation ferner eine mutierte Aminosäuresequenz etwa im Bereich der Roste Lys..,- bis Lys ^, umfasst.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Mutante /Lys, -,c -->A/-Humanurokinase ist.