DD239407A5

DD239407A5 - Verfahren zur herstellung von statin oder derivate hiervon enthaltenden renin-inhibitoren

Info

Publication number: DD239407A5
Application number: DD85274895A
Authority: DD
Inventors: Jasjit S Bindra; Edward F Kleinman; Robert L Rosati
Original assignee: ��@��Kk��
Priority date: 1984-03-12
Filing date: 1985-04-04
Publication date: 1986-09-24
Also published as: FI850948A0; JPS60252495A; DK110285D0; FI850948L; EP0155809A2; PT80094B; AU3974485A; CA1254699A; EP0155809A3; PT80094A; EP0155809B1; US4749687A; DK110285A; FI850948A7; AU557123B2

Abstract

Eine Reihe neuer Polypeptide und Polypeptid-Derivate, die Statin oder Derivate hiervon (z. B. Aminostatin, Cyclostatin) enthalten, werden offenbart, die zur Hemmung der Angiotensinogen-spaltenden Wirkung des Enzyms Renin brauchbar sind. Von besonderem Interesse sind Verbindungen, die die N-terminale Sequenz -Pro-Phe-His-Cyclostatine-Lys- besitzen, wobei der terminale Prolin-Stickstoff an einen Amino-schuetzenden Acylrest gebunden ist.

Description

-A-

Anwendungsgebiet der Erfindung

Das proteolytische Enzym Renin, das ein Molekulargewicht von etwa 40 000 hat, wird in der Niere gebildet und von ihr in das Blut abgesondert. Es ist als in vivo das natürlich vorkommende Plasma-Glykoprotein Angiotensinogen, im Falle menschlichen Angiotensinogens an der Bindung zwischen dem Leucin (10.) und Valin (11.)-Aminosäurerest am N-terminalen Ende des Angiotensinogens als spaltend aktiv:

Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-His-Leu-Val-Ile-His-Ser-Glu-12 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

Das umgebende N-terminale Decapeptid (Angiotensin I), gebildet durch die obige Spaltungswirkung von Renin, wird

anschließend vom Körper zu einem als Angiotensin II bekannten Octapeptid gespalten. Angiotensin II ist als starke Pressorsubstanz bekannt, d.h. als eine Substanz, die eine erhebliche Erhöhung des Blutdrucks zu induzieren vermag, und wirkt vermutlich dadurch, daß sie die Zusammenziehung von Blutgefäßen und die Freisetzung des Natrium zurückhaltenden Hormons Aldosteron aus der Nebennierendrüse verursacht. So ist das Renin-Angiotensinogen-System als verursachender Faktor bei bestimmten Formen von Hypertension in Zusammenhang gebracht worden.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Eine Maßnahme zur Linderung der nachteiligen Einflüsse der Wirkung des Renin-Angiotensinogen-Systems ist die Verabreichung einer Substanz, die die Angiotensinogen-spaltende Wirkung von Renin zu hemmen vermag. Eine Anzahl solcher Substanzen ist bekannt, einschließlich Antirenin-Antikörper, Pepstatin und natürlich vorkommende Phospholipid-Verbindungen. Die Europäische Patentanmeldung Nr. 45 6 65 (veröffentlicht 2. Februar 19 82) offenbart eine Reihe von Renin-hemmenden Polypeptid-Derivaten der Formel

X-Y-Pro-Phe-His-A-B-Z-W, '

worin X Wasserstoff oder eine Aminoschutzgruppe sein kann, Y fehlen kann, B ein lipophiler Aminosäurerest ist, Z ein aromatischer Aminosäurerest ist, W Hydroxyl und A u.a.

R¹	R²	O
ι	ι	Il
-NH-CH-CH-CH. ι ·*	,-CH-	-C -

OH

1 2 sein kann, wobei jeder der Reste R und R eine lipophile oder aromatische Seitenkette ist. Entsprechend den in dieser ver öffentlichten Patentanmeldung aufgeführten Definitionen kommt nicht in Betracht, daß entweder A oder Z Statin oder daß B Lysin sein könnte.

Die Europäische Patentanmeldung Nr. 77 O28 (veröffentlicht am 20. April 1983) offenbart eine Reihe Renin-hemmender Polypeptid-Verbindungen mit einem nicht-terminalen Statin- oder Statin-Derivat-Rest. In diese Reihe eingeschlossen sind Verbindungen mit einer Phenylalanin-Histidin-Statin-Sequenz. Diese veröffentlichte Patentanmeldung jedoch offenbart nicht die Anordnung von Lysin unmittelbar hinter der -Phe-His-Sta-Sequenz.

Ziel und Darlegung des Wesens der Erfindung

Wir haben nun gefunden, daß bestimmte neue Verbindungen als Renin-Hemmer brauchbar sind. Diese Reihe neuer Verbindungen besteht aus Polypeptiden und Polypeptid-Derivaten der Formel

R²

R-W-W¹-NH-CH-CH-CH₀-COR¹ I

R^{3 2}

und deren pharmazeutisch akzeptablen Salzen, worin

W Phenylalanin, Histidin, Leucin, Tyrosin, 1-Naphthylalanin oder 2-Phenylmethyl-propionylen ist,

W Phenylalanin, Histidin, Leucin, Tyrosin oder Norleucin ist, wobei die Peptidbindung zwischen W und W gegebenenfalls ersetzt ist durch -CH(Alkyl mit 1 bis 4 Kohl« ist,

Kohlenstoffatomen)-NH-, wenn W Phenylalanin und W Histidin

R Wasserstoff, ein Amino-schützender Acylrest mit einem Molekulargewicht von weniger als 500, Prolin, Aminogeschütztes Prolin, Pyroglutaminsäure oder Amino-geschützte Pyroglutaminsäure ist,

R Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,

Phenyl, Cycloalkyl mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen, Phenylalkyl mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl(alkylen) mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist,

R³ Hydroxyl, Amino, -NHR⁹, -NHCOR⁹, -OR⁹ oder -OCOR ist, wobei R^y Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, und

R¹

(a) -A-E-B ist,

wobei A Lysin oder Prolin oder zusätzlich, nur wenn R Amino ist, Isoleucin ist, E Phenylalanin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Ornithin, Arginin, Asparaginsäure, X -veresterte Asparaginsäure, Glutaminsäure oder ζ -veresterte Glutaminsäure ist, B -OR , -NR R , -glutaminsäure(-0R )~,

4 4 5 4 5

-glutaminsäure(-0R )(-NR R ) oder -glutaminsäure(-NR R )₂

4 5 ist und wobei R und R jeweils Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Phenylalkyl mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl-(alkyl) mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen sind,

Z Z¹

(b) -X-NH-CH-(CH₂J_n-Q-CH-(CH₂)_m-Y,

wobei X fehlt oder Alanin, Isoleucin, Lysin, Prolin, Ornithin, Arginin, N-(Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)-lysin, N,N-Di(alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)-lysin, N-(Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)-ornithin oder N ,N-Di(alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)-ornithin ist, Z und Z jeweils Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl(alkylen) mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Phenylalkyl mit 7 bis Kohlenstoffatomen sind, η und m jeweils ganze Zahlen von 0 bis 6 sind, Q _{0H 0} .

-CH₂-, -CH=CH-, -0-, -NH-, -CH- oder -C-

Y Methyl, Phenyl, -COOR , -CONR R⁷, -NH₉, (Benzyloxy)carbon-

fi 6

ylamino, -C0-Glutaminsäure(0R )₂, -C0-Glutaminsäure(-0R )-

( -NR⁶R⁷) oder -CO-Glutaminsäure(-NR⁶R⁷)₂ ist und R⁶ und R⁷ jeweils Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,

Phenylalkyl mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl-(alkylen) mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen sind,

(c) -NH₂,

(d) -Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,

(e) 4-Benzylpiperazino-1-yl,

(f) 1,2,3,4-Tetrahydrochinolin-i-yl,

(g) 1,2,3,4-Tetrahydroisochinolin-2-yl,

(h) 1,2,3,4-Tetrahydro-3-aminocarbonyl-isochinolin-

2-yl, (i) 1,2,3^-Tetrahydro-S-methoxycarbonyl-isochinol-

in-2-yl, (j) 1,2,3,4,5,6 , 7,8-Decahydro-3-methoxycarbonyl-

isochinolin-2-yl,

(k) 2-Methoxycarbonyl-pyrrolidin-1-yl, (1.) 2-Aminocarbonyl-pyrrolidin-1 -yl, (m) 4-Phenylmethyl-piperidin-1-yl

(n) -prolin-B, wobei B wie oben definiert ist, oder (o) -lysin-B, wobei B wie oben definiert ist, ist.

Von besonderem Interesse sind jene Verbindungen, worin R ein Amino-schützender Acylrest oder Amino-geschütztes Prolin ist, W Phenlyalanin ist, W an W in einer Peptidbindung gebundenes

2 3

Histidin ist, R Isobutyl oder Cyclohexyl(methylen) ist, R Hydroxy und R (a), (b) oder (n) wie oben ist, wobei A Lysin ist, wenn R^ (a) ist und X Lysin oder Prolin ist, wenn R¹ (b) ist.

Die erfindungsgemäßen. Verbindungen zeigen antihypertensive Aktivität in vivo in Säugern, Menschen eingeschlossen. Zumindest ein erheb-licher Anteil dieser Aktivität resultiert aus ihrem Vermögen zur Hemmung der Spaltung von Angiotensinogen durch Renin. Wenngleich wir durch die folgende Theorie des Mechanismus nicht beschränkt sein wollen, ist es wahrscheinlich, daß der Mechanismus der Renin-Hemmaktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen ihre selektive Bindung (verglichen mit Angiotensinogen) an Renin ist. Aufgrund ihrer geringen Molekulargewichte zeigen die erfindungsgemässen Verbindungen günstige Flüssigkeitseigenschaften in wäss-

rigen Medien, was orale Verabreichung ermöglicht, und sie können zu wirtschaftlich realistischen Kosten synthetisiert werden. Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch als Diuretika brauchbar.

Mit "pharmazeutisch akzeptablen" Salzen sind jene Salze gemeint, die bei den verabreichten Dosierungen nicht-toxisch sind. Da erfindungsgemäße Verbindungen sowohl basische als auch saure Gruppen enthalten können, sind sowohl Säureadditionssalze als auch Basenadditionssalze möglich. Pharmazeutisch akzeptable Säureadditionssalze umfassen z.B. die Hydrochloride, Hydrobromide, Hydrojodide, Sulfate, Bisulfate, Phosphate, saure Phosphate, Acetate, Lactate, Maleate, Mesylate, Fumarate, Citrate, saure Citrate, Tartrate, Bitartrate, Succinate, Gluconate und Saccharate. Pharmazeutisch akzeptable Basenadditionssalze umfassen z.B. die Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze. Herkömmliche Methoden zur Bildung von Säureadditions- und Basenadditionssalzen können angewandt werden.

Die Gruppe R am N-terminalen Ende der Formel I, die an den «!-Stickstoff des Restes W gebunden ist, ist ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Wasserstoff, Amino-schützenden Acylresten mit einem Molekulargewicht von weniger als 500, Prolin, Amino-geschütztem Prolin, Pyroglutaminsäure und Amino-geschützter Pyroglutaminsäure. Es sollte klar sein, daß die Aminoschutzgruppe von Amino-geschütztem Prolin oder Amino-geschützter Pyroglutaminsäure auch ein Amino-schützender Acylrest mit einem Molekulargewicht unter 500 ist. Der Ausdruck "Amino-schützende Acylreste" bezieht sich auf jene Acylgruppen, die die Reaktion am «^-Stickstoff von W (oder Prolin oder Pyroglutaminsäure) in vivo nach oraler Verabreichung wesentlich zu hemmen vermögen. R hat ein Molekulargewicht von weniger als 500, um einen zu starken nachteiligen Einfluß auf die Löslichkeitseigenschaften zu verhindern. Beispiele für geeignete Amino-schützende Acylreste sind dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt, z.B. der t-Butyloxycarbonyl-, t-Butylacetyl-, Benzyloxycarbonyl-, t-Butyl-

ureido-, (Tris-hydroxy)-(t-butylureido)- und Phenoxyacetyl Rest. Vorzugsweise ist R von der Formel

O O

R⁸-M-C- oder R⁸-M-C-Pro- ,

wobei M -0-, -CH₂-, -NH- oder -SO₂NH- ist und R Alkyl mit

1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl, Phenylalkyl mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl-(alkylen) mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.

4 4 5 Die Ausdrücke -Glutaminsäure-(-0R)(-NR R ) und -CO-Glutaminsäure(-0R )(-NR R), wie hier verwendet, beziehen sich sowohl auf C-terminale Gruppen, die am cT-Kohlenstoff von Glutaminsäure amidiert sind, als auch auf C-terminale Gruppen, die am i-Kohlenstoff von Glutaminsäure verestert sind.

Wie früher angegeben, besteht eine bevorzugte Gruppe der er-

3 findungsgemäßen Verbindungen aus denen, worin R Hydroxyl und R Isobutyl oder Cyclohexyl(methylen) ist, noch bevorzugter letztere, so daß

R² -NH-CH-CH-CH₀-CO-

R³

-Statin- oder -Cyclostatin- wird, R ein Amino-schützender Acylrest mit einem Molekulargewicht von weniger als 500 oder

Amino-geschütztes Prolin ist, W Phenylalanin ist, W Histidin, an W in einer Peptidbindung gebunden, ist und R -Lys-E-

B, -Pro-B oder Z Z¹

-(Lys oder Pro)-NH-CH-(CH₀) -Q-CH-(CH₀) -Y

ist. Das Anordnen eines Lysin-Restes (anstelle von z.B. einem Leucin-, Isoleucin-, Valin- oder Alanin-Rest) unmittelbar hinter -phenylalanin-histidin-(Statin oder Cyclostatin)-führt überraschenderweise zu einer dramatischen Verlängerung der in vivo-Renin-Hemmaktivität.

Eine weitere bevorzugte Gruppe von erfindungsgemäßen Verbindungen besteht aus jenen, worin R ein Amino-schützender Acylrest mit einem Molekulargewicht von weniger als 500 oder Amino-geschütztes Prolin ist, W Phenylalanin ist, W

3 an W in einer Peptidbindung gebundenes Histidin ist, R

Hydroxyl ist, R Isobutyl oder Cyclohexyl(methylen), bevorzugter letzteres, ist und R

Z Z¹

-X-NH-CH-(CH₀) -Q-CH-(CH₉) -Y

ist. Reduktion der peptidischen Natur der Molekülstruktur nahe dem C-terminalen Ende neigt zur Verbesserung der Absorption in den Blutstrom nach oraler Verabreichung. Zu beachten ist, daß, wenn η und m jeweils Null sind, Z Isobutyl,

•^9H 1 1

Q -CH-, Z' Wasserstoff und Y Carboxyl ist, R -X-Statin wird.

Besonders wertvoll sind die folgenden Verbindungen und deren pharmazeutisch akzeptable Salze:

[N-(t-Eutyloxycarbonyl)-prolin -]-phenylalanin -histidin -cyclostatin -lysin -phenylalanin ;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin ]-histidin cyclostatin -lysin -phenylalanin ;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin ]-histidin statin .-lysin -phenylalanin^;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin ]-histidin statin -alanin -statin -glutaminsäure;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin ]-histidin statin -isoleucin -[amino(η-buttersäure )];

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin ]-histidin cyclostatin -[amino(2-sec-butyl-ethylen )!-phenylalanin ; [N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin ]-histidin -

statin -[amino(2-sec.~buty1-ethylen )]-phenylalanin ;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin ]-histidin -

cyclostatin -l,2,3,4-tetrahydro-2-isochinolin ;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-prolin !-phenylalanin histidin -cyclostatin -l,2,3,4-tetrahydro-2-isochinolin ;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin !-histidin cyclostatin -prolin - [amino (n_-pentylen )amin ];

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin !-histidin cyclostatin -prolin -methyl-ester;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin ]-histidin cyclostatin -ethyl-ester;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin !-histidin cyclostatin -prolin -NH^;

[N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin !-histidin cyclostatin -NH ; und

[N-(t-Sutyloxycarbonyl)-phenylalanin !-histidin cyclostatin -lysin -statin .

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können nach dem Fachmann auf dem Gebiet vertrauten Methoden hergestellt werden. Die grundlegende Untereinheit der bevorzugten chemischen Synthese ist die Acylierung der ungeschützten öC-Aminogruppe eines Aminosäurerestes mit einer Aminosäure mit (für Acylierungszwecke) aktivierter Carboxylfunktion und einer geeigneten Schutzgruppe, die an den eigenen o^-Stickstoff gebunden ist, um eine Peptidbindung zwischen den Aminosäureresten zu bilden, gefolgt von der Entfernung der Schutzgruppe. Diese Synthese-Untereinheit des Kuppeins - Schutzgruppen-entfernens wird wiederholt durchgeführt, um das PoIypeptid aufzubauen, ausgehend von dem C-terminalen Ende der Molekülstruktur und Durcharbeiten bis zum N-terminalen Ende. Die zum Synthetisieren der erfindungsgemäßen Verbindungen verwendeten ^-Aminosäuren sind im Handel erhältlich (als freie Säuren, Salze oder Ester usw.) sowohl in <x-Aminogeschützter als auch oc-Amino-ungeschützter Form. Statin ist im Handel als N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin erhältlich; außerdem kann Statin (als freie Säure oder Ester) sowohl in der y-Amino-geschützten als auch ^-Amino-ungeschützten Form nach in der Literatur angegebenen Methoden hergestellt werden (siehe z.B. US-PS 4 397 786 und Rieh, D.H. et al., Jour. Org. Chem. 4_3, S. 3624 ff. (1978). Wenn gewünscht, wird ein geeignetes N-ungeschütztes Aminosäure-Analogon (freie Säure, Salz oder Ester usw.), wie 4-Aminobuttersäure, 4-Amino-

valeriansäure oder 4-Amino-4-sec.-butyl-buttersäure, als Reaktionskomponente in der ersten Kupplungsstufe verwendet Geeignete Derivate von Statin können nach herkömmlichen Synthesemethoden hergestellt werden. So kann z.B. die Verbindung

Isobutyl H₂N-CH-CH-CH₂COOH ,

die hier als Aminostatin bezeichnet wird, in einer Form hergestellt werden, bei der beide Aminogruppen geschützt sind, durch Umsetzen eines Amino-geschützten Statinesters mit einem Sulfonylchlorid zur Bildung eines Sulfonatesters, Umsetzen des Sulfonatesters mit Natriumazid zu einem Amino-geschützten 4-Isobutyl-2-butensäureester und einem Amino-geschützten 4-Isobutyl-3-azido-buttersäureester, Umsetzen der Alkenverbindung mit einem primären Amin und/oder Hydrieren der Azidoverbindung und dann Reduzieren der anfallenden Zwischenstufenverbindung mit einem Alkaliitietallhydrid in Gegenwart eines Aldehyds (in beiden Fällen) zu einem 4-Isobutyl-3-sec.-äminoderivat der Buttersäure, Hydrieren dieses 4-Isobutyl-3-secaminoderivats der Buttersäure und dann Umsetzen der anfallenden Verbindung mit einem Acylhalogenid unter basischen Bedingungen. N-geschützte Verbindungen

Cyclohexyl

CH₂ Schutzgruppe -NH-CH-CH-CH2-COOH ,

OH

die hier als N-geschützte Cyclostatin-Verbindungen bezeichnet werden, können durch Hydrieren der entsprechenden N-geschützten 4-Amino-4-phenylmethy1-3-hydroxybuttersäure-Verbindung hergestellt werden, die wiederum in der von Rieh, D.H. et al., Jour. Med. Chem. 23(1) , S. 27-33 (1980) angegebenen Weise hergestellt werden kann.

Die reduzierte Peptidbindung (-C0- ersetzt durch -CH₉-)

in einer Verbindung der Erfindung, worin R

Z Z¹

-X-NH-CH-(CH₉) -Q-CH-(CHo) -Y ,

^ Ti ^- III

η wenigstens 1 und Q -NH- ist, kann durch Reduzieren eines Aldehyds der Formel

Z Schutzgruppe-NH-CH- (CH₂) _n_., -COH

in Gegenwart eines Aminosäureesters der Formel

Z¹

COOR⁶

XLL

H₉N-CH-(CH₉) -COOR

worin R eine andere Bedeutung als Wasserstoff hat, gebil det werden.

Die Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindungen als Inhibitoren der Angiotensinogen —spaltenden Aktivität von Renin kann bestimmt werden durch Untersuchung von (1) ihrem Vermögen zur Hemmung der Angiotensinogen-spaltenden Aktivität von Renin in vitro und (2) ihrem Antagonismus-Vermögen der exogenen Renin-induzierten Pressor-Reaktion in vivo.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als antihypertensive Mittel auf entweder oralem oder parenteralem Verabreichungswege gegeben werden, wobei ersterer aus Gründen der Bequemlichkeit und des Komforts für den Patienten bevorzugt wird. Im allgemeinen werden diese antihypertensiven Verbindungen normalerweise oral in Dosierungen im Bereich von etwa 0,1 mg bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag verabreicht; Schwankungen treten notwendigerweise in Abhängigkeit vom Zustand des zu Behandelnden und der. speziell verabreichten Verbindung auf. Typischerweise wird eine Behandlung mit einer niedrigen Tagesdosierung begonnen und, nur wenn nötig, vom Arzt gesteigert. Zu bemerken ist, daß diese. Verbindungen

239 40

in Kombination mit pharmazeutisch akzeptablen Trägern auf jedem der zuvor angegebenen Wege verabreicht werden können/ und daß eine solche Verabreichung sowohl in Einzel- als auch Mehrfachdosierungen erfolgen kann.

Die neuen Verbindungen der Erfindung können oral in einer großen Vielfalt verschiedener Dosierungsformen verabreicht werden, d.h. , sie können mit verschiedenen pharmazeutisch akzeptablen inerten Trägern in Form von Tabletten, Kapseln, Rund- und Rautenpastillen, Bonbons, Pulvern, Sprays, wässrigen Suspensionen, Elixieren, Sirups und dergleichen formuliert werden. Solche Träger umfassen feste Verdünnungsmittel oder Füllstoffe, sterile wässrige Medien und verschiedene nicht-toxische organische Lösungsmittel usw. Weiter können solche oralen pharmazeutischen Formulierungen mit Hilfe verschiedener Mittel des gewöhnlich für solche Zwecke verwendeten Typs geeignet gesüßt und/oder aromatisiert sein. Im allgemeinen liegen die erfindungsgemäßen Verbindungen in solchen oralen Dosierungsformen mit Konzentrationswerten im Bereich von etwa 0,5 bis etwa 90 Gew.-% der Gesamtzusammensetzung vor, in Mengen, die ausreichen, die gewünschte Einheitsdosierung zu liefern.

Für Zwecke oraler Verabreichung können Tabletten, die verschiedene Exzipientien, wie Natriumeitrat, Calciumcarbonat und Calciumphosphat enthalten, zusammen mit verschiedenen den Zerfall fördernden Mitteln, wie Stärke und bevorzugt Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure und bestimmten komplexen Silicaten, zusammen mit Bindemitteln, wie Polyvinylpyrrolidon, Saccharose, Gelatine und Akazienharz, verwendet werden. Außerdem sind Gleitmittel, wie Magnesiumstearat, Natriumlaurylsulfat und Talkum, oft sehr brauchbar für Tablettierungszwecke. Feste Zusammensetzungen ähnlichen Typs können auch als Füllstoffe in weich- und hartgefüllten Gelatinekapseln verwendet werden; in diesem Zusammenhang bevorzugte Materialien würden auch Lactose oder Milchzucker sowie hochmolekulare Polyethylenglykole einschließen. Wenn wässrige Suspensionen und/oder Elixiere für orale Verabreichung ge·

wünscht sind, kann der essentielle, aktive Bestandteil darin mit verschiedenen Süßungs- oder Aromatisxerungsmitteln, färbendem Material oder Farbstoffen und, wenn gewünscht, emulgierenden und/oder suspendierenden Mitteln, sowie zusammen mit solchen Verdünnungsmitteln, wie Wasser, Ethanol, Propylenglykol, Glycerin und verschiedenen ähnlichen Kombinationen daraus kombiniert sein.

Ausführungsbeispiele

Die folgenden Beispiele veranschaulichen die Erfindung, sind aber diese nicht als beschränkend anzusehen.

Beispiel 1

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-Phe7-His-Sta-Lys-Phe

A. /N-oC-(t-Butyloxycarbonyl)-N- ^.-benzyloxycarbonyl-lysin./-phenylalanin-benzy !ester '

N-Hydroxybenzotriazol (162 mg, 1,2 mMol), N-Methyl-morpholin (101,2 mg, 1 mMol), L-Phenylalanin-benzylester-p-toluolsulfonat (428 mg, 1 mMol), N- oc-(t-Butyloxycarbonyl)-N- <£-benzyloxycarbonyl-L-lysin (456 mg, 1,2 mMol) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat(635 mg, 80 % rein, 1,2 mMol) wurden nacheinander in Methylenchlorid (50 ml) bei O⁰C gelöst und die anfallende Lösung 19 h bei 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann aufeinanderfolgend mit 75 ml 5,5 %iger wässriger HCl, 75 ml gesättigter wässriger NaHCOg und 75 ml Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Nach Filtrieren und Eindampfen wurden 669 mg Rohprodukt als Schaum erhalten ( H NMR, CDCl₃, 1 ,5S , 9Hs /BOC/). Dieses Rohprodukt wurde ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.

B. (N- <fL-Benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid - '

/N-06- (t-Butyloxycarbonyl)-N- £--benzyloxycarbonyl-lysin7-phen-

239 40

ylalanin-benzylester aus Stufe A (650 mg, 1 mMol) wurde in 7 ml 3,7 η HCl/Dioxan gelöst und konnte 1 h bei 2O°C stehen. Die Lösung wurde dann zur Trockne eingedampft, um 58 3 mg Rohprodukt als öl zu liefern, das ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde (H NMR, CD₃OD, 5,2 £, 2H s /Benzyl-CH₂7).

C. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin/-(N- ^-benzyloxycarbonyllysin)-phenylalanin-benzylester

(N- -έ-Benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid aus Stufe B (583 mg, 1 mMol), N-Methylmorpholin (101,2 mg, 1 mMol), N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin (330 mg, 1,2 mMol), N-Hydroxybenzotriazol (162 mg, 1,2 mMol) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (635 mg, 80 % rein, 1,2 mMol) wurden nacheinander in 50 ml Methylenchlorid bei 0°C gelöst und die anfallende Lösung 19h bei 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde wie in Stufe A aufgearbeitet, um 760 mg Rohprodukt zu ergeben, das ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde (¹H NMR, CDCl₃, Λ ,5 6, 9H s/B0C7)·

D. Statin-(N- £-benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid ^^^^

/N- (t-Butyloxycarbonyl) -statin/- (N- ε.-benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalanin-benzylester aus Stufe C (760 mg, 1 mMol) wurde in 10 ml 3,7 η HCl/Dioxan gelöst und konnte 1 h bei 20°C stehen. Dieses Reaktionsgemisch wurde wie in Stufe B aufgearbeitet, um 620 mg Rohprodukt als Schaum zu liefern (¹H NMR, CD₃OD, 5,2 J, 2H s/Benzyl-CH^Z)/ der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.

E. /N-oL-(t-Butyloxycarbonyl)-N-im-(t-butyloxycarbonyl)-histidin./-statin-(N-£-benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalanin-benzylester '.'''

Statin-(N- £-benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid aus Stufe D (600 mg, 0,857 mMol), N-

Methyl-morpholin (86,7 mg, 0,857 mMol) , N- ac -(t-Butyloxycarbonyl)-N-im-(t-butyloxycarbonyl)-L-histidin (365 mg, 1,03 mMol), N-Hydroxybenzotriazol (135 mg, 1,03 mMol) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (545 mg, 1,03 mMol) wurden nacheinander in 50 ml Methylenchlorid bei O⁰C gelöst und 19 h bei 20°C gerührt. Dieses Reaktionsgemisch wurde wie in Stufe A aufgearbeitet, um 770 mg Rohprodukt als Schaum zu ergeben ( H NMR, CDCI3, 1,5 <Γ , 2H s/BOC/ und 1,6 S , 9H s [BOCj), der in der nächsten Stufe ohne weitere Reinigung umgesetzt wurde.

F. Histidin-statin-(N- ^-benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalanin-benzylester-Dihydrochlorid

/N- oc-(t-Butyloxycarbonyl)-N-im-(t-butyloxycarbonyl)-histi-. din/-statin-(N- <£-benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalaninbenzylester aus Stufe E (770 mg, 0,85 mMol) wurde in 10 ml 3,7 η HCl/Dioxan gelöst und konnte 1,5 h bei 20°C stehen. Das Reaktionsgemisch wurde wie in Stufe B aufgearbeitet, um 602 mg Rohprodukt als Schaum zu liefern (H NMR, CD₃OD, 5,2 S, 2H s /Benzyl-CH-^/) / der ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.

G. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin_7-histidin-statin-(N- £-benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalanin-benzylester

Histidin-statin-(N- £-benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalanin-benzylester-Dihydrochlorid aus Stufe F (602 mg, 0,689 mMol), N-Methyl-morpholin (139 mg, 1,38 mMol), N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-phenylalanin (219 mg, 0,827 mMol), N-Hydroxybenzotriazol (112 mg, 0,827 mMol) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (438 mg, 0,827 mMol) wurden nacheinander in 50 ml Methylenchlorid bei 0°C gelöst und die anfallende Lösung wurde 19 h bei 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde wie in Stufe A aufgearbeitet, um 555 mg eines Schaums zu ergeben, der durch Chromatographie (Siliciumdioxidgel,

95:5 CH₉Cl„/Me0H) gereinigt wurde, um 136 mg gereiniqtes

1 Produkt als Schaum zu liefern (H NMR, CDCl₃, 1,5 S₁ 9H s /BOC7)·

H. Titelverbindung

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalaniny-histidin-statin-(N-ε-benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalalnin-benzylester (136 mg, 0,17 mMol) und 70.mg 20 % Pd(OH)₂/C-Katalysator wurden nach und nach zu 15 ml Methanol gegeben und das anfallende Gemisch 4 h bei 3,45 bar (50 psi) H₂ und 20⁰C hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde dann durch Super-Cel filtriert und zur Trockne eingedampft, um 76 mg eines Glases zu ergeben, das mit Ether verrieben wurde, um 63 mg gereinigtes /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalaniny-histidinstatin-lysin-phenylalanin als Pulver zu liefern (NMR, CD₃OD, 1,5 <f, 9H s [BOCj).

Beispiel 2

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-Phey-His-Sta-Ile-Sta-(Natriumsalz)

A. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-isoleucin/-stätin-ethylester

Statin-ethylester-Hydrochlorid (717 mg, 3 mMol), N-Methylmorpholin (304 mg, 3 mMol), N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-isoleucin 1/2 H₂O (865 mg, 3,6 mMol), N-Hydroxybenzotriazol (486 mg, 3,6 mMol) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (1,91 g, 80 % rein, 3,6 mMol) wurden nacheinander zu 100 ml Methylenchlorid bei 0°C gegeben und die anfallende Lösung 19 h bei 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann nacheinander mit 75 ml 5,5 %iger wässriger HCl, 75 ml gesättigter wässriger NaHCO₃ und.75 ml Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem MgSO^ getrocknet. Nach Filtrieren und Eindampfen wurden 1,39 g Rohprodukt als Schaum erhalten VNMR, CDCl₃, 1,5 S, 9H s /BOQ/)', der in der nächsten Stufe ohne weitere Reini-

gung eingesetzt wurde.

B. bis G. /N- (t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/-histidinstatin-isoleucin-statin-ethy!ester

Ähnlich wie in Stufe B bis G von Beispiel 1 beschrieben, wurde /N-(t-Butyloxycarbonyl)-isoleucinj-statin-ethylester aus Stufe A (1,37 g) in gereinigtes Titelprodukt (121 mg, Schaum, H NMR, CDCl₃, 1,5 S , 9Hs [BOCj) umgewandelt. 95:5 CHClo/MeOH wurde als Gradient in der chromatographischen Reinigung der Stufe G eingesetzt.

H. Titelverbindung

Eine Lösung von /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/-histidin-statin-isoleucin-statin-ethylester aus Stufe G (120 mg, 0,14 mMol) in 2 ml Dimethoxyethan wurde mit 0,17 ml-1 η wässriger NaOH behandelt. Nach 2,5 h Rühren bei 20⁰C wurden weitere 0,17 ml 1 η wässrige NaOH zugesetzt. Nach weiteren 2 h Rühren wurde das Reaktionsgemisch in einem Rotationsverdampfer verarbeitet, um das Dimethoxyethan zu entfernen, mit 5 ml H^O verdünnt und nach Einstellen des pH auf 7,8 gefriergetrocknet. Der gefriergetrocknete Rückstand wurde in Ether aufgeschlämmt. Der Überstand wurde zur Trockne eingedampft, um 88 mg eines Schaums zu ergeben, der beim Verreiben mit einem kleinen Volumen Ether gereinigtes /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenyIaIanin/-histidin-statin-isoleucinstatin (Natriumsalz) als gelbliches Pulver lieferte(65 mg, ¹H NMR, CDCl₃, 1,56, 9Hs £&OCj)·

Beispiel 3

/N- (t-Butyloxycarbonyl) -Phe7-His-Sta-Ile-/"ämirio (n-buttersäure)J

A. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-isoleuciny-r/amino(η-buttersäure)]- benzylester '·

N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-isoleucin (2,4 g, 10 mMol), N-

— ι ο —

4 υ /

Methyl-morpholin (1,0 g, 10 mMol), Benzyl-4-aminobutyrat-Hydrochlorid (1,93 g, 10 mMol), N-Hydroxybenzotriazol (1,35 g, 10 mMol) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat (4,23 g, 80 % rein, 10 mMol) wurden nacheinander in 60 ml Methylenchlorid bei 0°C gelöst und die anfallende Lösung 19 h bei 20 ⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockne eingedampft und der Rückstand in Ethylacetat gelöst. Diese Lösung wurde zweimal mit 50 ml 5%iger wässriger HCl, zweimal mit 50 ml 1 η wässriger NaOH, einmal mit H₂O und einmal mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem MgSO. getrocknet und filtriert und am Rotationsverdampfer zu 2,87 g Rohprodukt als Schaum eingeengt ("¹H NMR, CDCl₃, 1,5 S , 9H s /BOC/), der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.

B. Isoleucin-/amino(n-buttersäure)7-benzylester-Hydrochlorid

/N- (t-Butyloxycarbonyl) -isoleucin/-/"amino (n-buttersäure)_7-benzylester aus Stufe A (2,87 g, 7,1 mMol) wurde in 10 ml 3,7 η HCl/Dioxan gelöst und die anfallende Lösung eine Stunde bei 20°C stehen gelassen. Die Reaktionslösung wurde dann zur Trockne eingedampft, um nach Verreiben 2,4 g Rohprodukt als weißen Feststoff zu liefern (¹H NMR, CD₃OD, 5,2 <Γ, 2H s /Benzyl-CH.^), der ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.

C. /lsi- (t-Butyloxycarbonyl) -statin/- isoleucin-/amino (nbutter säure ).7-benzylester

N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin (275,35 mg, 1 mMol), N-Methylmorpholin (101 mg, 1,0 mMol), Isoleucin-/amino(n-buttersäure)./-benzylester-Hydrochlorid aus Stufe B (342 mg, 1 mMol), N-Hydroxybenzotriazol (135 mg, 1,0 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (206 mg, 1,0 mMol) wurden nacheinander zu 20 ml Methylenchlorid bei O⁰C gegeben,und die anfallende Lösung wurde 19h bei 20°C gerührt. Die Reaktionslösung wurde dann filtriert und zu einem Rückstand eingedampft, der in Ethylacetat aufgeschlämmt wurde. Die Aufschlämmung wurde filtriert

und das Filtrat zur Trockne eingedampft. Nach Chromatographie des anfallenden Rückstands (Siliciumdioxidgel, CHCl₃ZEtOAc-Gradient) wurden 464 mg gereinigtes Produkt erhalten (H NMR, CDCI3, 1,5/, 9H s /BOC7).

D. Statin-isoleucin-/amino(n-buttersäure)7~benzylester-Hydrochlorid

Ähnlich wie in Stufe B beschrieben, wurde /N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin7-isöleucin-/amino(n-buttersäure)7~benzylester aus Stufe C (464 mg, 0,82 mMol) von der Schutzgruppe befreit, um 416 mg Rohprodukt als weißen Feststoff zu ergeben, der in der nächsten Stufe ohne Reinigung eingesetzt wurde (¹H NMR, CD₃OD, 5,2 δ, 2H s /Benzyl-CH₂7)-

E. /N- oL-(t-Butyloxycarbony1)-N-im-(t-butyloxycarbony1)-histidin7-statin-isoleucin-/amino(n-buttersäure)7-benzylester

Ähnlich wie in Stufe C beschrieben, wurde Statin-isoleucin-/amino(n-buttersäure)7-benzylester-Hydrochlorid aus Stufe D (416 mg, 0,83 mMol) mit N-<*- (t-Butyloxycarbonyl) -N-im.- (tbutyloxycarbony1)-L-histidin (295 mg, 0,82 mMol) gekuppelt, um 391 mg gereinigtes Produkt zu liefern (H NMR, CDCl₃, 1,5 <£, 9H s /BOCj und 1,6 £, 9H s /B0C7) .

F. Histidin-statin-isoleucin-/amino(n-buttersäure)7~benzyl- ester-Dihydrochlorid

Ähnlich wie in Stufe B beschrieben, wurde /N-06- (t-Butyloxycarbonyl)-N-im(t-butyloxycarbony1)-histidin7-statin-isoleucin-/"amino (n-buttersäure)7~benzylester aus Stufe E (391 mg, 0,49 mMol) von der Schutzgruppe befreit, um 328 mg Rohprodukt als weißen Feststoff zu ergeben (H NMR, CD₃OD, 5,2 ei", 2H s /Benzyl-CH27) / der ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.

G. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/-histidin-statini so leucin-/amino (η-butter säurej7~benzy !ester

Histidin-statin-isoleucin-/amino-(η-buttersäure )J -benzylester-Dihydrochlorid aus Stufe F (328 mg, 0,487 mMol), N-Methylmorpholin (0,128 ml, 1,17 mMol), N-(t-Butyloxycarbonyl) -L-phenylalanin (155 mg, 0,585 mMol), N-Hydroxybenzotriazol (79 mg, 0,585 mMol) und Dicyclohexylcarbodiimid (121 mg, 0,585 mMol) wurden nacheinander in 20 ml Methylenchlorid bei 0°C gelöst und die anfallende Lösung für 19 h bei 20⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann aufgearbeitet und wie in Stufe C chromatographiert, um 324 mg gereinigtes Produkt zu liefern (¹H NMR, CDCl₃, 1,5 <f, 9H s [¹BOCj) .

H. Titelverbindung

Eine Lösung von /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/~ histidin-statin-isoleucin-/amino(n-buttersäure)7~benzylester aus Stufe G (324 mg, 0,38 mMol) in 5 ml Methanol wurde bei Raumtemperatur und 3,45 bar (50 psi) H2 eine Stunde mit 20 % Pd(OH)₂/C-Katalysator hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und der Überstand wurde zur Trockne eingedampft. Nach Verreiben des anfallenden Rückstands mit Ether wurden 190 mg reines /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin./-histidin-statin-isoleucin-/amino (η-buttersäure)_7 als weißes Pulver erhalten (¹H NMR, CDCl₃, 1,5 S, 9H s fBOCj) .

Beispiel 4

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-Phe7-His-Sta-/amino(4-sec.butylbuttersäurejj⁷

A. N-(t-Butyloxycarbonyl)-isoleucinal

Eine Lösung N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-isoleucin-methylester (10,0 g, 40,7 mMol) in 100 ml Toluol wurde auf -75°C gekühlt und dann tropfenweise mit 102 ml 1 m Diisobutylalu-

miniumhydrid in Toluol so behandelt, daß die Temperatur der Reaktion bei unter -65°C gehalten wurde. Nach vollständiger Zugabe wurde die Reaktion 10 min bei -75°C gerührt und dann langsam mit 10 ml Methanol abgeschreckt, wobei die Temperatur unter -65⁰C gehalten wurde. Die Reaktionslösung wurde dann in 200 ml kalte gesättigte Rochelle-Salzlösung gegossen. Das anfallende Gemisch wurde mit Ether überlagert und eine Stunde gerührt, worauf die organische Schicht abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen, über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet, filtriert und zur Trockne eingedampft wurde, um 7,0 g Rohprodukt zu ergeben (¹H NMR, CDCl₃, 1,5 <f, 9H s [BOCj), das ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde.

B. Ethyl-L-(4-amino-4-sec.-butyl-butyrat)-Hydrochlorid

N-(t-Butyloxycarbony1)-isoleucinal aus Stufe A (1 g, 4,6 mMol) und Carbethoxymethylen-triphenylphosphoran (1,93 g, 5,56 mMol) wurden in 50 ml Chloroform gelöst und die anfallende Lösung 48 h bei 20°C stehen gelassen. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockne eingedampft und durch Chromatographie (Siliciumdioxidgel, CHCI3) gereinigt, um 1 g gereinigtes Ethyl-L-/4-(t-butyloxycarbonylamino)-4-secbutyl-cf-2-butyrat7 als öl zu liefern (¹H NMR, CDCl₃, 4,2 S, 2H s /Ethyl-CH₂7). Das Ethyl-L-/4-(t-butyloxycarbonylamino)-4-sec.-butyl-5-2-butyrat_7 (300 mg, 1,05 mMol) wurde dann etwa 2 h bei 3,45 bar (50 psi) H2 und 20°C in Methanol mit 20% Pd(OH)2/C-Katalysator hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat wurde in einem Rotationsverdampfer eingeengt, um 300 mg rohes Ethyl-L-/"4-(t-butyloxycarbonylamino)-4-sec.-butyl-butyrat7 als öl zu ergeben (H NMR, CDCl₃, 4,2«?, 2H s. /Ethyl-CH-7) . Das Ethyl-L-/4-(t-butyloxycarbonylamino)-4-sec.-butyl-butyrat/ (300 mg) wurde dann in 4 ml 3,7 η HCl/Dioxan gelöst und die anfallende Lösung eine Stunde bei 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann zur Trockne eingedampft, um 2.31 mg Rohprodukt als Schaum zu

liefern, der ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde (¹H NMR, CDCl₃, 4,2 S , 2H s /Ethyl-CH^) .

C. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-statinZ-Zamino(4-sec.butylbutt er säure )_7~e thy le st er

N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin (286 mg, 1,04 mMol), Ethyl-L-(4-amino-4-sec.-butyl-butyrat)-Hydro—chlorid aus Stufe B (232 mg, 1,04 mMol), N-Hydroxybenzotriazol (141 mg, 1,04 mMol), N-Methyl-morpholin (105 mg, 1,04 mMol) und Dicyclohexyl-carbodiimid (215 mg, 1,04 mMol) wurden nacheinander zu 15 ml Methylenchlorid bei 0°C gegeben, und die anfallende Lösung wurde 19 h bei 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert und der Überstand zur Trockne eingedampft. Chromatographie dieses Rückstands (Siliciumdioxidgel, CHCl₃/EtOAc-Gradient) lieferte 400 mg-gereinigtes Produkt (¹H NMR, CDCl₃, 1,5 S, 9H S /B0C7).

D. bis G. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin.7-histidinstatin-/amino(4-sec.-butyl-buttersäure)7-ethy!ester

Ähnlich wie in· den Stufen D bis G von Beispiel 3 beschrieben wurde /N-(t-Butyloxycarbonyl)-stain/-/amino(4-sec.-butylbuttersäure)_/-ethylester aus Stufe C (400 mg, 0,94 mMol) in gereinigten /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/-histidinstatin-/amino(4-see.-butyl-buttersäure )_7-ethylester (211 mg, ¹H NMR, CDCl₃, 1,5 £, 9H s /BOQ/) umgewandelt.

H. Titelverbindung

Eine Lösung von /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalaninj- histidin-statin-/amino(4-sec.-butyl-buttersäure)J- ethylester aus Stufe G (200 mg, 0,274 mMol) in 5 ml Dimethoxyethan wurde mit 0,3 ml 1 η wässriger NaOH behandelt und das anfallende Gemisch 3 h bei 20°C gerührt. Weitere 0,3 ml 1 η wässrige NaOH wurden dann zugegeben und das Reaktionsgemisch eine weitere Stunde bei 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann in einem Rotationsverdampfer eingeengt,

um das Dimethoxyethan zu entfernen, mit Ethylacetat behandelt und dann mit 5%iger wässriger HCl auf pH 2 eingestellt. Die organische Schicht wurde abgetrennt, mit Salzlösung gewaschen, filtriert, über wasserfreiem MgSO, getrocknet und zu einem weißen Feststoff eingeengt, der beim Verreiben mit Ether 35 mg gereinigte /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/-histidin-statin-/amino(4-see.-buty!-buttersäure)/ lieferte (.¹H NMR, .GDCl₃).- L, 5S , 9 H s /BOC/) .

Beispiel 5

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-PheZ-His-aminostatin-Ile-Phe-diacetat

A. Ethyl-4(S) -(t-butyloxycarbonylamino)-3-(S)-azido-6-methylheptanoat und Ethyl-4(S) -(t-butyloxycarbonylamino)-6-methyl-trans-2-heptenoat

Ein Gemisch aus 3-Epi-N-(t-butyloxycarbonyl)-statin (7,6 g, 25,05 mMol) und Triethylamin (2,78 g, 27,55 mMol) in Methylenchlorid (200 ml) wurde bei O⁰C mit 3,15g (27,55 mMol) Methansulfonylchlorid unter tropfenweiser Zugabe behandelt. Das anfallende Gemisch wurde 1 h bei O⁰C gerührt, konnte sich im Verlauf 1 h auf Raumtemperatur erwärmen und wurde dann mit 1 η wässriger HCl-Lösuna (2x200 ml) und gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (1x200 ml) gewaschen. Die organische Schicht wurde über MgSÜ4 getrocknet und zu 9,75 g eines gelben Öls eingedampft. Eine Lösung dieses Öls in N,N-Dimethylformamid (150 ml) wurde mit Natriumazid (2,45 g, 37,7 mMol) behandelt und das anfallende Gemisch 4 h bei 6O⁰C erwärmt. Das Lösunasmittel wurde dann unter Hochvakuum entfernt und der Rückstand mit 500 ml H₂O verdünnt und mit Ether (2x150 ml) extrahiert. Der vereinigte Etherextrakt wurde mit Salzlösung (1x100 ml) gewaschen, (über MqSO.) getrocknet und zu 6,6 g eines hellgelben Öls eingedampft. Trennen des Öls durch Blitzchromatoqraphie unter Verwenduna von 25 bis 30% Ether in Hexan als Elutionsmittel ergab 334 mg. (4% Ausbeute) Ethyl-4(S)-(t-butvloxycarbonylamino)-3-(S)-azido-6-methylheptanoat als Öl /R_f =0,62 in Ether/Hexan, 1:1;

- 24 - - 2 39 40

¹H-NMR (CDCI3): S 0,95 (d, J=6,6H), 1,30 (t, J=7,3H), 1,47 (s, 9H), 2,58 (d. J=7,2H), 4,17 (q. J=7,2H), 4,53 (breites d, 1H); ¹³C-NMR (CDCl₃): £ 1 4 , 2 , 22,2, 23,0, 24,9, 28,4, 37,2, 42,4, 51,6, 61,1, 62,8, 79,6, 155,8, 171,0; IR (CHCl,,) :

—1 34 73, 2102 cm J und in der polareren chromatographischen Fraktion 4,9 g eines klaren Öls (R_f = 0,55 in Ether/Hexan, 1:1) das beim Stehen kristallisierte. Verreiben in eiskaltem Hexan ergab 3,78 g (53 % Ausbeute) Ethyl-4(S) -(t-butyloxycarbonylamino)-6-methyl-trans-2-heptenoat als flauschigen, weißen Feststoff /Schmp. 56-58°C; ¹ _R_

_R__NMR

(d, J=6,6H), 1,30 (t, J=7, 3H), 1.47 (s, 9H), 4,18 (q, J= 7,2H), 5,9 (dd. J=15,1, 1H), 6,83 (dd, J=15,5, 1H); IR (KBr): 3350, 3307, 1720, 1701, 1684, 1659 ^-1

B(1). Ethyl-3-benzylamino-4-(t-butyloxycarbonyl-amino)-3,4 (S₇S)-6-methylheptanoat aus Ethyl-(4S) -(t-butyloxycarbonylamino)-6-methyl-traris-2-heptenoat

Ein Gemisch aus Ethyl-4(S) -(t-butyloxycarbonylamino)-6-methyl-trans-2-heptenoat (3,52 g, 12,35 mMol), Benzylamin (3,97 g, 37, 0 mMol) und abs. EtOH (90 ml) wurde 7 Tage auf » 58⁰C erwärmt. Das Reaktionsgemisch wurde dann eingedampft und durch Blitzchromatographie mit 10 bis 15 % Ethylacetat in Hexan als Elutionsmittel aetrennt. Die weniger polaren Fraktionen ergaben 963 mg (20 % Ausbeute) Produkt als öl /R_f = 0,32 in 25 % EtOAc in Hexan; ¹H-NMR (CDCl₃): <f 0,97 (d, J=5,6H), 1,25 (t, 3H. J=7), 1,45 (s, 9H), 2,43 (m, 2H), 3,32 d (m, 1H), 3,77 (s, 2H), 4,10 (q, 2H, J=7), 4,65 (d. 1H, J=9), 7,22 (s_# 5H); IR (CHCI3): 3433, 1720 (Schulter), 1709 cm"¹; ] peak) , 91_7·

1709 cm"¹; Massenspektrum m/e 393 (M⁺+1), 319, 206 (Basis-

B(2). Ethyl-3-benzylamino-4-(t-butyloxycarbonyl-amino)-3,4-(S,S)-6-methylheptanoat aus Ethyl-4(S) -(t-butyloxycärbonylamino)-3(S)-azido-6-methvl·heptanoat

20 mg 10% Pd/C-Katalysator wurden zu einer Lösung von Ethyl-4 (S) -(t-butyloxycarbonylamino)-3(S)-azido-6-methylheptanoat

(120 mg, 0,36 mMol) in 5 ml Essigsäure/Ethanol, 1:1, gegeben und das anfallende Gemisch 3 h bei Raumtemperatur und 1 bar (1 at) H₂ hydriert. Nach Entfernen des Katalysators durch Filtrieren wurde das Reaktionsgemisch zu einem zurückbleibenden öl unter vermindertem Druck unter Verwendung eines Ethanol-Azeotrops eingedampft. Dieses öl (136 mg) wurde dann in 3 ml Methanol gelöst und nacheinander mit 37 μΐ (38,2 mg, 0,36 mMol) Benzaldehyd bei Raumtemperatur und 24mg (54 mMol) NaCNBH₃ bei 0°C behandelt. Das Reaktionsgemisch wurde 0,5 h bei O⁰C gerührt und konnte sich dann auf Raumtemperatur erwärmen, bevor mit H^O und gesättigter wässriger NaHCO^-Lösung verdünnt wurde. Es bildete sich ein öliger Niederschlag, der mit Methylenchlorid extrahiert wurde. Die anfallende organische Schicht wurde (über MgSO^) getrocknet und zu einem öligen Rückstand eingedampft. DC des öligen Rückstands zeigte nur ein Epimer, entsprechend Ethyl-3-benzylamino-4-(t-butyloxycarbonylamino)-3,4(S,S)-6-methylheptanoat. Reinigung des öligen Rückstands durch Blitzchromatographie mit 10 bis 15 % Ethylacetat/Hexan lieferte 6 8 mg Produkt, das nach NMR und DC mit dem in Stufe B(1) hergestellten Material identisch war.

C. 3-Benzyloxycarbonylamino-4-(t-butyloxycarbonyl-amino)-3,4(S,S)-6-methylheptansäure . '

6Ömg 10 % Pd/C-Katalysator wurden zu einer Lösung von Ethyl-3-benzylamino-4-(t-butyloxycarbonylamino)-3,4(S,S)-6-methylheptanoat aus Stufe B(1) (530 mg, 1,35 mMol) in 12 ml Essigsäure/Ethanol 1:1, gegeben und das anfallende Gemisch 3 h bei Raumtemperatur und 3,4 5 bar (50 psi) H₂hydriert. Der Katalysator wurde durch Filtrieren entfernt und das Filtrat zu einem öl eingeengt, das in einem Gemisch aus 10ml Dioxan und 10 ml H₂O aufgenommen wurde. Festes NaHCO, wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt (pH 7,8),gefolgt von 289 μΐ (345 mg, 2,025 mMol) Benzyloxycarbonylchlorid (Chemalog) .Das anfallende Gemisch wurde 1,5 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei der pH mit festem NaHCO- bei 8 gehalten wurde. Dann wurde das Gemisch weitere 4 h bei pH 12,5 durch Zugabe von 4 ml

4 υ 7

wässriger 1 η NaOH-Lösung und H„0/Dioxan, wenn nötig, um irgend einen Niederschlag zu lösen, gerührt. Das Gemisch wurde dann mit 1 η wässriger HCl bei O⁰C neutralisiert und das Dioxan unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wurde mit 50 ml H₂O verdünnt und mit Ethylacetat (2x50 ml) extrahiert. Der vereinigte Ethylacetatextrakt wurde (über MgSO.) getrocknet und zu 588 mg eines Öls eingedampft, das durch Blitzchromatographie mit 3 % MeOH in CHCl₃ als EIutionsmittel gereinigt wurde, um 288 mg (41 % Ausbeute) Produkt als Öl zu ergeben /"¹H-NMR (DMSO d⁶, 250 MHz): £ 0,81 (d, J=7,3H), 0,86 (d, J=7,3H), 1,38 (s,9H), 2,2-2,4 (m, 2H), 5,02 (Schwerpunkt des AB-Musters, J=13, 2H), 6,48 (d, J=9, 1H), 7,05 (d, J=9,1H), 7,30 (s, 9H); Massenspektrum: m/e 186, 130, 91, 86 (Basispeak)J.

D. Isoleucin-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid

Eine Lösung von 14,05 g (58,5 mMol) N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-isoleucin-Hemihydrat (Chemalog) in 500 ml Methylenchlorid wurde (über MgSO^) getrocknet, filtriert und mit 6,43 ml (5,92 g, 58,5 mMol) N-Methyl-morpholin behandelt. Das anfallende Gemisch wurde auf -16°C abgeschreckt und dann mit 7,59 ml (7,99 g, 58,5 mMol) Isobutylchlorformiat mit solcher Geschwindigkeit behandelt, daß die Temperatur der exothermen Reaktion nicht über -10°C hinausging. Nach 10 min weiterem Rühren nach beendeter Zugabe wurde eine Lösung von 24,8 g (58,0 mMol) L-Phenylalanin-benzylester-p-toluolsulfonat und 6,43 ml (5,92 g, 58,5 mMol) N-Methyl-morpholin in 50 ml Methylenchlorid mit solcher Geschwindigkeit zum Reaktionsgemisch getropft, daß die Temperatur der exothermen Reaktion nicht über -10°C hinausging. Wenn diese Zugabe beendet war, konnte sich das Reaktionsgemisch im Verlauf einer Stunde auf Raumtemperatur erwärmen und wurde dann mit 5%iger wässriger HCl-LÖsung (2 χ 300 ml) und 10%iger wässriger K₂CO3-Lösung (2 χ 300 ml) gewaschen. Die anfallende organische Schicht wurde (über MgSO^) getrocknet und eingedampft, um 27,40 g eines weißen Feststoffs zu liefern.

Verreiben in Hexan ergab 24,9 7 g gereinigten /N-(t-Butyloxycarbonyl) -L-isoleuc in/ -L-phenylalanin-benzylester /42 % Ausbeute, Schmp. 131-132°C, R_f = O,43 in Ether/Ethylacetat, 1:1; ¹H-NMR (CDCl₃) S : 0,78-0,9 (breites d, 6H), 1,43 (s, 9H), 3,08 (d, J=6), 3,87 (dd, J=5,9,1H), 4,75-5,1 (m, 1H), 5,06 (s, 2H), 6,3 (d,J=9,1H), 7,0-7,3 (m, 11H)7. Eine Lösung von 12,50 g (25,7 mMol) /N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-isoleucinJ-L-phenylalanin-benzylester in 125 ml 4 η HCl in Dixoan wurde 2 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei vor Atmosphärenfeuchtigkeit mit einem CaCl2~Rohr geschützt wurde. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in Ether verrieben, um 11,16 g Produkt als weißen Feststoff zu liefern /"Schmp. 178-179,5⁰C (Zers.); R_f =0,73 in BuOH-H₂O-AcOH, 4:1:1; (¹H-NMR (CD₃OD) £ ζ 0,9-1,1 (m, 6H), 3,1-3,0 (m, 2H), 3,73 (d, J=5,1H), 5,08 (s, 1H), 7,18 (s, 5H), 7,24 (s, 5H)J.

E. /N-y-(t-Butyloxycarbonyl)-benzyloxycarbonyl-aminostatin/- isoleucin-phenylalanin-benzylester '^&

Eine Lösung von Isoleucin-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid (412 mg, 1,02 mMol) in 10ml Methylenchlorid wurde bei 0°C mit 142 μΐ Triethylamin (103 mg, 1,02 mMol) neutralisiert. 3-Benzyloxy-carbonylamino-4-(t-butyloxycarbonylamino)-3,4(S₇S)-6-methylheptansäure (416 mg, 1,02 mMol) und N-Hydroxybenzotriazol (205 mg, 1,52 mMol) wurden dann zu der Lösung bei 0°C gegeben. Schließlich wurde eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (210 mg, 1,02 mMol) in 5 ml Methylenchlorid bei O⁰C gegeben. Das Reaktionsgemisch wurde dann 3 h bei O⁰C und weitere 16h unter Erwärmen auf Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 75 ml Ethylacetat gerührt. Das anfallende Gemisch wurde filtriert, um eine Feststoffmenge zu entfernen, und das Filtrat mit 10%iger wässriger Citronensäure (1 χ 75 ml) und gesättigter wässriger NaHCO₃~Lösung (1 χ 75 ml) gewaschen, (über MgSO₄) getrocknet und zu einen Feststoff (217 mg) eingedampft. Dieser Feststoff wurde mit den Feststoffen vereinigt, die aus dem Ethyl-

acetatgemisch abfiltriert wurden (siehe vorhergehender Satz). Die vereinigten Feststoffe (1,043 g), ein Gemisch aus Produkt und Dicyclohexylharnstoff, wurde ohne Reinigung in der nächstenStufe eingesetzt.

F. Benzyloxycarbonylaminostatin-isoleucin-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid

Der rohe /N- / -(t-Butyloxycarbony1)-benzyloxycarbonylaminostatin/-isoleucin-phenylalanin-benzylester aus Stufe E (1,043g) wurde in 25 ml 4 η HCl in Dioxan eine Stunde bei Raumtemperatur gerührt, wobei gegen atmosphärische Feuchtigkeit mit einem CaCl₂~Rohr geschützt wurde. Entfernen des Lösungsmittels unter vermindertem Druck (mit einem Methylenchlorid plus Ether-Azeotrop) und Verreiben in Ether ergab 96 3 mg eines rohen Feststoffs, der ein Gemisch aus Produkt und Dicyclohexylharnstoff war. Dieser rohe Feststoff wurde ohne Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt.

G. /iSf-ot- (t-Butyloxycarbonyl) -N-im- (t-butyloxycarbonyl) -

hi st idin_7 -benzy loxycarbony lamino- stat in-isoleuc in-phenylalanin-benzy !ester ' *

Eine Suspension des rohen Benzyloxycarbonylamino-statin-isoleucin-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorids aus Stufe F (963 mg) in 20 ml Methylenchlorid wurde bei O⁰C mit 177 μΐ Triethylamin (128 mg, 1,02 mMol) neutralisiert. N- oc-(t-Butyloxycarbonyl)-N-im-(t-butyloxycarbonyl)-L-histidin (542 mg, 1,53 mMol) und N-Hydroxybenzotriazol (206 mg, 1,53 mMol) wurden dann zu der Suspension bei O⁰C gegeben. Schließlich wurde eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (315 mg, 1,53 mMol) in 1 ml Methylenchlorid bei 0⁰C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 3 h bei 0⁰C und weitere 16h bei Raumtemperatur gerührt. Etwa die Hälfte des Lösungsmittels wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand in 125 ml Ethylacetat gerührt. Das anfallende Gemisch wurde filtriert, um eine Feststoffmenge zu entfernen, und das Filtrat

mit wässriger 10%iger Citronensäurelösung (2 χ 100 ml) und wässriger gesättigter NaHCO^-Lösung (1 χ 100 ml) gewaschen, (über MgSO^) getrocknet und zu 920 mg eines Feststoffs eingedampft. Dieser Feststoff wurde durch Blitzchromatographie mit 0,5 bis 0,75% MeOH in CHCl₃ als Elutionsmittel gereinigt, um 221 mg gereinigtes Produkt als Feststoff zu liefern. Die Feststoffe, die aus dem Ethylacetatgemisch abfiltriert worden waren (siehe zwei Sätze weiter oben), enthielten eine beträchtliche Menge Produkt, zusammen mit Dicyclohexylharnstoff. Das meistedes DicyclohexylharnStoffs in den Feststoffen wurde vom Produkt durch Filtrieren nach Verreiben der Feststoffe (unter kräftigem Rühren) in 100 ml Methylenchlorid getrennt. Das Filtrat wurde eingeengt (1,1 g) und in identischer Weise wie oben chromatographiert, um weitere 401 mg Produkt zu liefern. Die vereinigten gereinigten Feststoffprodukte wurden in Ether verrieben, um 592 mg eines flockigen, weißen Feststoffs zu liefern (58 % Ausbeute, Schmp. 229-231⁰C; R_f. - 0,22 in 2,5' % MeOH in CHCl₃; ¹H-NMR (CDCl₃, 250 MHz): £ 0,6-0,85 (m, 12 H), 1,42 (s, 9H), 1,58 (s, 9H), 2,42 (Schwerpunkt des AB-Musters von ABX, 2H, 14, J_M =5, J_BX =10), 2,94 (d, J = 5, 2H), 3,13 (d, J = 6, 2H), 3,55-3,7 (m, 1H), 4,1-4,3 (m, 3H), 4,98' (q, J = 7, 1H), 5,2-5,5 (m, 4H), 6,10 (d, J =7, 1H), 6,37 (breites d, 1H), 6,80 (d, 1H, J= 8), 7,0-7,4 (m, 17H), 7,5 (breit , 1H), 8,00 (s, 1H)7.

H. Histidin-benzyloxycarbonylaminostatin-isoleucin-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid

Eine Lösung von 204 mg £n-oC- (t-Butyloxycarbonyl)-N-im-(tbutyloxycarbonyl)-histidin_7-benzyloxycarbonylaminostatinisoleucin-phenylalanin-benzylester in 7 ml 4 η HCl in Dioxan wurde 5 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei vor atmosphärischer Feuchtigkeit mit einem CaC^-Rohr geschützt wurde. Das Lösungsmittel wurde unter vermindertem Druck (mit einem Methylenchlorid plus Ether-Azeotrop) entfernt, um 153 mg Produkt als weißes Pulver zu liefern /86% Ausbeute, Schmp. 154-157⁰C, R_f = 0,55 in Butylalkohol:H₃O:Essigsäure (4 :1:1);

¹H-NMR (CD₃OD): £"1,05-1,1 (m, 12H), 2,3-2,5 (m, 2H), 3,1 (d, J = 8, 2H), 5,08 (s, 4H), 7,18 (s, 5H), 7,30 (s, 1OH), 7,53 (s, 1H), 8,83 (s, 1H)7.

I. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/-histidin-benzyloxycarbonylaminostatin-isoleucin-phenylalanin-benzylester

Eine Lösung von Histidin-benzyloxycarbonylamino-statin-isoleucin-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid (306 mg, 0,352 mMol) in 5 ml Dimethylformamid wurde bei 0°C mit 123 μΐ Triethylamin (88 mg, 0,879 mMol) neutralisiert. N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-pheny!alanin (103 mg, 0,38 7 mMol) und N-Hydroxybenzotriazol (79 mg, 0,580 mMol) wurden dann zu der Lösung bei O⁰C gegeben. Schließlich wurde eine Lösung von Dicyclohexylcarbodiimid (980 mg, 0,387 mMol) in 1,5 ml Dimethylformamid bei O⁰C zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wurde dann 3 h bei O⁰C und weitere 16h bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wurde, unter Hochvakuum entfernt, der Rückstand in 50 ml Ethylacetat gerührt und das anfallende Gemisch filtriert, um eine Feststoffmenge zu entfernen. Das Lösungsmittel wurde aus dem Filtrat entfernt und der Rückstand in Methylenchlorid (50 ml) gerührt und das anfallende Gemisch filtriert, um eine zweite Feststoffmenge zu entfernen. Das Filtrat aus der ersten Filtration wurde eingeengt, der Rückstand in 50 ml Ethylacetat gelöst und die anfallende Lösung mit 10%iger wässriger Citronensäure (2 χ 40 ml) und gesättigter wässriger NaHCO.,-Lösung (2 χ 40 ml) gewaschen. Die anfallende organische Schicht wurde (über MgSO₄) getrocknet und zu einem Feststoff (153 ml) eingeengt. Dieser Feststoff und die Feststoffe aus den Ethylacetat- und Methylenchlorid-Verreibungen wurden vereinigt und durch Blitzchromatographie mit 2 bis 3 % Ethanol in Chloroform als Elutionsmittel gereinigt, um 261 mg Feststoff zu ergeben.. Verreiben dieses Feststoffs in Ether lieferte .218 mg Produkt als glasartigen Feststoff (59 % Ausbeute, Schmp. 228-229°C, R_f = 0,25 in 5 % MeOH in Chloroform; ¹H-NMR (CDCl₃, 250 MHz): <fo,6-O,8 (m, 12H), 1,26 (s, 9H), 2,38 (breites d, 2H), 2,8-3,0 (m,. 2H), 3,15-3,4 (m,

4H), 4,1-4,0 (m, 1H), 4,1-4,2 (m, 1H), 4,2-4,4 (m, 2H), 4,6 (breites d, 1H), 4,9-5,2 (m, 6H), 5,9-6,1 (m, 1H), 6,78 (s, 1H), 7,2-7,4 (m, 22H), 7,49 (s, 1H)7-

J. Titelverbindung

10% Pd/C-Katalysator (12 mg) wurde zu einer Lösung von /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin_7 -histidin-benzyloxycarbonylaminostatin-isoleucin-phenylalanin-benzylester (24 mg, 0,023 mMol) in 5 ml Essigsäure/Ethanol (1:1) gegeben und das anfallende Gemisch 3 h bei Raumtemperatur und 2,76 bar (40 psi) H» hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat zu einem Rückstand eingeengt. Verreiben des Rückstands in Ether lieferte 17 mg /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/-histidin-aminostatin-isoleucin-phenylalanin-diacetat als weißes Pulver /"Schmp. 155-159°C; R_f = 0,58 in n-Butylalkohol/H₂0/Essigsäure (4:1:1); ¹H-NMR (CD₃CO₂D 250 MH2): 0,7-1,0 (m, 12H), 1,33 (s, 9H), 2,7-2,9 (m, 2H), 3,0-3,6 (m, 6H), 3,6-3,9 (m, 1H), 4,15-4,30 (m, 1H), 4,35-4,55 (m, 2H), 4,8-4,95 (m, 2H), 7,1-7,4 (m, 10H), 7,38 (s, 1H), 8,78 (s, 1H)7-

Beispiel 6

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-Phey-His-Sta-Ala-Sta-Glu-dibenzylester

A. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-alaninZ-statin-glutaminsäuredibenzylester ·

N-Hydroxybenzotriazol (324 mg, 2,4 mMol), N-Methyl-morpholin (202 mg, 2 mMol), L-Glutaminsäure-dibenzylester-p-toluolsulfonat (995 mg, 2 mMol), N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin (660 mg, 2,4 mMol) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimid-metho-p-toluolsulfonat (1271 mg, 80 % rein, 2,4 mMol) wurden nacheinander in Methylenchlorid (100 ml) bei O⁰C gelöst und die anfallende Lösung 19 h bei 20⁰C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann aufeinanderfolgend

mit 5,5 % wässriger HCl, gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung und Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Nach Filtrieren und Eindampfen wurden 1269 g roher /N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin_/-glutaminsäure-dibenzylester als öl erhalten (¹H-NMR, CDCl₃, 5,2 6, 2H s /Benzyl-CH₂7). Dieses öl (1269 g) wurde in 10 ml 3,7 η HCl/ Dioxan gelöst und die anfallende Lösung eine Stunde bei Raumtemperatur stehen gelassen. Die Lösung wurde dann unter Hochvakuum zu einem Rückstand eingedampft, der in Ether verrieben und mit Stickstoff getrocknet wurde, um 900 mg Statin-glutaminsäure-dibenzylester-Hydrochlorid als Schaum zu ergeben (¹H-NMR, CDCl.,, 5,2 S₁ 2H s /Benzyl-CH-/) . N-Hydroxybenzotriazol (186 mg, 1,38 mMol), N-Methyl-morpholin (116 mg, 1,15 mMol), eine Menge des oben gebildeten Statinglutaminsäure-dibenzylester-Hydrochlorid-Schaums (600 mg, 1,15 mMol), N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-alanin (261 mg, 1,38 mMol) und 1-Cyclohexyl-3-(2-morpholinoethyl)-carbodiimidmetho-p-toluolsulfonat (732 mg, 80 % rein, 1,38 mMol) wurden nacheinander in Methylenchlorid (60 ml) bei O⁰C gelöst und die anfallende Lösung 19h bei 20°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde dann nacheinander mit 5,5%iger wässriger HCl, gesättigter wässriger NaHCO^-Lösung und Salzlösung gewaschen und über wasserfreiem MgSO₄ getrocknet. Nach Filtrieren und Eindampfen wurden 743 mg Rohprodukt als Schaum erhalten (¹H-NMR, CDCl₃, 5,2 «£, 2H s /Benzyl-CH^/)·

B. bis G. Titelverbindung

Ähnlich wie in den Stufen B bis G von Beispiel 1 beschrieben wurde /N-(t-Butyloxycarbonyl)-alaninZ-statin-glutaminsäure-dibenzylester aus Stufe A (743 mg) in /N-(t-Butyloxycarbonyl) -phenylalaninJ-histidin-statin-alanin-statinglutaminsäure-dibenzylester (300 mg, Schaum, H-NMR, CDCl₃, 5,2S, 2H s /Benzyl-CH^) umgewandelt. Bei jeder Schutzgruppenabspaltung folgte auf das Eindampfen zur Trockne ein. Verreiben mit Ether. Am Ende der.. Stufe E wurde der Rohproduktschaum durch Chromatographie gereinigt (Siliciumdioxidgel,

95:5 CHCl-D/Methanol) , um einen gereinigten Schaum zu ergeben. Am Ende der Stufe G wurde keine chromatographische Reinigung durchgeführt.

Beispiel 7

/fr-(t-Butyloxycarbonyl)-Phe7-His-Sta-Ala-Sta-Glu

Ein Gemisch aus /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/-histidin-statin-alanin-statin-glutaminsäure-dibenzylester (90 mg, 0,077 mMol), 20 % Pd(OH)₂/C-Katalysator (45 mg) und Methanol (10 ml) wurde 2 h bei Raumtemperatur und 3,45 bar (50 psi)H₂ hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert, um den Katalysator zu entfernen, und das Filtrat eingedampft, um einen Schaum (72 mg) zu ergeben. Dieser Schaum wurde mit Ether verrieben und getrocknet, um einen gereinigten /fr-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin_/-histidin-statin-alaninstatin-glutaminsäure-Schaum zu ergeben (51 mg, 72 % Ausbeute, ¹H-NMR, CDCl₃, 1,5 S, 9H s /BOC/).

Beispiel 8

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-Phe_7-His-Sta-/amino(2-sec.-butyl- ethylen)_7-Phe-Essigsäuresalz

A. N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-isoleucirial

Ein Gemisch aus L-Isoleucin-methylester (24,3 g, 0,134 mMol) und Triethylamin (13,5 g, 0,134 mMol) in Methylenchlorid (210 ml) wurde hergestellt, und eine Lösung von Di-tert.-butyldicarbonat (Aldrich, 29,1 g, 0,134 mMol) in Methylenchlorid (25 ml) wurde zu diesem Gemisch bei 0°C getropft. Nach dem Ende dieser Zugabe konnte sich das Gemisch auf Raumtemperatur über Nacht erwärmen und wurde dann filtriert. Das Filtrat wurde nacheinander mit H2O (3 χ 75 ml), wässriger 0,1 η HCl-Lösung, H₃O (1 χ 100 ml) und gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung (1 χ 75.ml) gewaschen, (über MgSO₄.) getrocknet und eingedampft, um N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-iso-

leucinmethylester als öl zu ergeben /"30,7 g; 9 3 % Ausbeute; ¹H-NMR (CDCl₃): <£Ό,92 (d, J=7,6H), 1,43 (s,9H), 3,70 (s, 3H), 4,17 (dd, J=5, 9,1H), 5,03 (d, J=9,1H))_7. Eine Lösung des N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-isoleucinmethylester-öls (15,0 g, 61,1 mMol) in trockenem Toluol (260 ml) wurde auf -78⁰C gekühlt, und eine 1 m Lösung von Diisobutylaluminiumhydrid in Hexan (153 ml) wurde mit solcher Geschwindigkeit zugetropft, daß die Temperatur der exothermen Reaktion nicht über -65°C hinausging. Nach 15 min weiteren Rührens bei -78⁰C nach dem Ende dieser Zugabe wurde das Gemisch sorgfältig mit 15 ml Methanol (Temperatur des Gemischs durfte -65⁰C nicht überschreiten) , gefolgt von 200 ml Rochelle-Salzlösung,abgeschreckt. Nach Erwärmen auf Raumtemperatur wurde die organische Schicht abgetrennt und mit Ether (3 χ 200 ml) extrahiert; weitere Rochelle-Salzlösung wurde, wenn nötig, zugesetzt, um die Aluminiumsalze zu lösen. Der vereinigte organische Extrakt wurde (über Na-SO.) getrocknet und eingedampft, um ein Rohprodukt, ein Öl, zu liefern. Das öl wurde dann bei -78°C gelagert, um mögliche Racemisierung zu vermeiden, und wurde in der nächsten Stufe ohne Reinigung eingesetzt /"132 g, 98 % Ausbeute; R_f = 0,32 in 35 % Ether in Hexan; ¹H-NMR (CDCl₃): S 1,00 Cd, J=7,6H), 1,46 (s, 9H), 9,65 (s, 1H)7-

B. /Amino(2-sec.-butyl-ethylen)./-phenylalanin-benzylester-Dihydrochlorid

Ein Gemisch aus N-(t-Butyloxycarbonyl)-L-isoleucinal (2,00 g, 9,29 mMol) und L-Phenylalaninbenzylester-p-tosylat (Chemalog, 3,78 g, 8,84 mMol) in Methanol (150 ml) wurde 35 min in Gegenwart von 3 ^-Molekularsieben (Ventron) bei Raumtemperatur gerührt. 0,73 g (11,6 mMol) NaCNBH₃ wurden dann zugegeben und das Gemisch eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Siebe wurden dann abfiltriert und das Filtrat zu einem öligen Rückstand eingeengt, der mit gesättigter wässriger NaHCO^-Lösung. verdünnt und zweimal mit Ether extrahiert wurde. Der vereinigte Etherextrakt wurde (über Na₃SO^) getrocknet und zu einem öl eingeengt, das durch

Blitzchromatographie mit 12 % Ethylacetat in Hexan als Elutionsmittel gereinigt wurde, um 1,69 g /(t-Butyloxycarbonyl) amino (2-sec . -butyl-ethylen)_/-phenylalanin-benzylester als öl zu liefern (40 % Ausbeute; R_f = 0,28 in 25 % Ethylacetat in Hexan). Das Öl kristallisierte beim Stehen /Schmp. 53-55⁰C; ¹H-NMR (CDCl₃):<£0,6-1,0 (m, 6H), 1,48 (s, 9H), 2,92 (d, J=7,2H), 5,07 (s, 2H) 7,17 (s, 5H), 7,25 (s, 5H)7- Eine Lösung von /(t-Butyloxycarbonyl)amino(2-sec.-butyl-ethylen)J-phenylalanin-benzylester (2,94 g, 6,47 mMol) in 4 η HCl/Dioxan (110 ml) wurde gebildet und 2 h bei Raumtemperatur gerührt, wobei mit einem CaCl^-Rohr vor der Atmosphäre geschützt wurde. Das Lösungsmittel wurde dann unter vermindertem Druck mit einem Ether-Azeotrop entfernt und der Rückstand mit Ether verrieben, um einen weißen Feststoff zu liefern /2,65 g; 95 % Ausbeute der Schützgruppenabspaltung, Schmp. 18 3-184⁰C; R_f = 0,73 in BuOH/H₂O/Essigsäure (4:1:1); ¹H-NMR (C 7,1-7,5 (m, 1OH)J

(4:1:1); ¹H-NMR (CD₃OD): £1,0 (breites d, 6H), 5,13 (s, 2H),

C. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-statinj-/amino(2-sec.-butyl-

ethylen)J-(N-benzyloxycarbonyl-phenylalanin)-benzy!ester

Eine Suspension von /Amino(2-sec.-butyl-ethylen)7-phenylälanin-benzylester-Dihydrochlorid (1,55 g, 3,63 mMol) in Methylenchlorid (40 ml) wurde auf 0°C abgekühlt und bei dieser Temperatur mit Triethylamin (0,808 g, 7,99 mMol) neutralisiert. N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin (1,00 g, 3,63 mMol) und N-Hydroxybenzotriazol (0,74 g, 5,45 mMol) wurden dann bei O⁰C zu der Suspension gegeben. Schließlich wurde Dicyclohexylcarbodiimid (0,75 g, 3,63 mMol) in Methylenchlorid (2 ml) bei O⁰C zu der Suspension gegeben und das anfallende Gemisch 3 h bei CPc und dann weitere 16 h bei Raumtemperatur gerührt. Ein Niederschlag, der sich gebildet hatte, wurde dann abfiltriert,' und das Filtrat wurde eingeengt und in 125 ml Ethylacetat gerührt. Nach dem Abfiltrieren ungelöster Feststoffe wurde wieder die Ethylacetatschicht mit gesättigter wässriger. NaHCO₃~Lösung (135 ml) gewaschen _f (über Na^SO^) getrocknet und zu einem

Schaum eingedampft. Der Schaum wurde durch Blitzchromatographie mit 35 % Ethylacetat in Hexan als Elutionsmittel gereinigt, um ein gereinigtes /N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin/-/amino(2-sec.-butyl-ethylen)7-phenylalanin-benzylester-Produkt als Schaum zu liefern /1/96 g; 88 % Ausbeute; R_f=O,58 in Ethylacetat/Hexan, 1:1); ¹H-NMR (CDCl₃): SO,6-1,1 (m, 12H), 1,5 (s, 9H), 4,88 (d, J=9,1H), 5,06 (s, 2H), 7,15 (s, 5H), 7,25 (s, 5H)_7· Eine Lösung dieses gereinigten /N-(t-Butyloxycarbonyl)-statinZ-Zamino(2-sec.-butyl-ethylen)_7-phenylalanin-benzylester-Schaums (1,91 g, 3,12 mMol) in Dioxan (16 ml) wurde mit Benzyloxycarbonylchlorid (Chemalog, 67 μΐ, 0,80 g, 4,68 mMol) unter Verwendung gesättigter wässriger NaHCO₃-Lösung, um den pH bei 8 zu halten, acyliert. Wenn das gesamte Ausgangsmaterial verbraucht war (angezeigt durch DC), wurde das Dioxan unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand mit ^O verdünnt und mit Ethylacetat extrahiert. Der Ethylacetatextrakt wurde (über MgSO₄) getrocknet und zu einem Schaum eingedampft, der durch Blitzchromatographie gereinigt wurde, um einen weißen Schaum zu ergeben /"2,06 g; R_f = 0,7 in Ethylacetat/Hexan, (1:1); ¹H-NMR (CDCl₃): <f0,6-1,0 (m, 12H), 1,48 (s, 9H), 7,0-7,4 (m, 15H)7·

D. bis G. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalaninZ-histidinstatin-/amino(2-sec.-butyl-ethylen)7-/N-benzyloxycarbonyl-phenylalanin/-benzy!ester

Ähnlich wie in den Stufen F bis I von Beispiel 5 beschrieben, wurde der gereinigte /"Ν- (t-Butyloxycarbonyl) -statin/-/amino(2-sec.-butyl-ethylen)7~(N-benzyloxycarbonyl-phenylalanin)-benzylester aus Stufe C (2,03 g, 2,72 mMol) in gereinigten /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenyl-alaninZ-histidinstatin-/amino(2-sec.-butyl-ethylen)7-(N-benzyloxycarbonylphenylalanin) -benzylester umgewandelt /0,595 g, Schaum; R_f=O,36 in 5 % Methanol in Chloroform; H-NMR (CDCl₃): <fo,6-1,0 (m, 12H), 1,38 (s, 9H), 6,75 (s, 1H), 7,1-7,3 (m, 20H), 7,38 (s, 1H)7.

239 40 J

H. Titelverbindung

10 % Pd/C-Katalysator (18 mg) wurde zu einer Lösung von /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin^-histidin-statin/amino-(2-sec.-butyl-ethylen)/-(N-benzyloxycarbonyl-phenylalanin/-benzylester (150 mg, 0,150 mMol) in 4 ml Ethanol/Essigsäure (1:1)gegeben und das anfallende Gemisch 12 h bei Raumtemperatur und 2,76 bar (40 psi) H₂ hydriert. Das Gemisch wurde dann filtriert und das Filtrat zu einem Feststoff (128 mg) eingeengt, der mit Ether verrieben wurde, um ein gereinigtes Festprodukt, /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin/-histidin-statin-/amino(2-sec.-butyl-ethylen)_/-phenylalanin - Essigsäuresalz,zu ergeben /109 mg, 84 % Ausbeute, Schmp. 117-126⁰C, R_f =0,57 in BuOH-H₂O-AcOH (4:1:1); ¹H-NMR (CD₃OD, 250 MHz): £ 0,8-1,0 (m, 12H), 1,36 (s, 9H), 1,92 (s, 6H), 2,2-2,45 (m, 2H), 4,28 (dd, J=9,4,1H), 3,54 (breites t, 1H), 6,92 (s, 1H), 7,2-7,4 (m, 10H), 7,63 (S,1H)7.

Beispiel 9

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-Phey-His-cyclostatin-Lys-Phe

A. N-(t-Butyloxycarbonyl)-cyclostatin

Cyclohexyl CH₂

(t-butyloxycarbonyl)-Nh-CH-CH-CH₉-COOH

OH

Eisessig (6,5 ml) und 10 % Rh/C-Katalysator (1,5 g) wurden zu einer Lösung von N-(t-Butyloxycarbonyl)-4(S)-amino-3(S) hydroxy-5-phenyl-pentansäure (10,02 g, 9,70 mMol) in Methanol (200 ml) gegeben, und das anfallende Gemisch wurde 8 h bei Raumtemperatur und 3,1 bar (45 psi) H₂ hydriert. Das Reaktionsgemisch wurde dann filtriert und das Filtrat zu einem weißen Feststoff eingeengt, der in Hexan, verrieben wurde, um ein gereinigtes Produkt zu ergeben /8,46 g, 83 % Ausbeute, Schmp. 1O9-11O°C; R_f=O,72 in CHCl₃: MeOH: Essigsäure, 18:2:1; ¹H-NMR (CDCl₃): 1,45 (s, 9H), 2,55 (d, J=6,

B. Titelverbindung

Ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben, aber unter Verwendung von N-(t-Butyloxycarbony1)-cyclostatin anstelle von N-(t-Butyloxycarbony1)-statin,wurde die Titelverbindung hergestellt (¹NMR, CD₃OD, 1,50<£, 9H s /BOC/).

Beispiel 10

/N-(t-Butyloxycarbony1)-Proy-Phe-His-cyclostatin-Lys-Phe

Ähnlich wie in den Stufen A bis F von Beispiel 1 beschrieben, aber unter Verwendung von N-(t-Butyloxycarbony1)-cyclostatin anstelle von N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin,wurde die Verbindung Histidin-cyclostatin-(N- £-benzyloxycarbonyllysin)-phenylalanin-benzylester-Dihydrochlorid hergestellt. Ähnlich wie in den Stufen G und H von Beispiel 1 beschrieben,aber unter Verwendung von /N-(t-Butyloxycarbonyl)-proliny-phenylalanin (das im Handel erhältlich ist) anstelle von N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin und unter Verwendung von 95:5 CHCl₃/ MeOH als Elutionsmittel bei der Siliciumdioxidgel-Chromatographie wurde die Titelverbindung als gereinigtes festes Produkt hergestellt (¹NMR, CD₃OD, 1,49 £, 9H s /ßOCj).

Beispiel .11

/N-Xt-Butyloxycarbonyl) -Phe_7-His-cyclostatin-^amino (2-secbutyl-ethylen)7-Phe-Essigsäuresalz "

Ähnlich wie in Beispiel 8 beschrieben, aber unter Verwendung von N-(t-Butyloxycarbonyl)-cyclostatin anstelle von N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin,wurde die Titelverbindung hergestellt fSchmp. 15O-163°C. (Zers.); R_f=Ö,50 in Butanol/Essigsäure/Wasser, 4:1:1 (Ninhydrin); ¹H-NMR (CD₃OD): 0,6-2,4 (m, 23H), 1,37 (s, 9H), 7,1-7,4 (.11,H), 6,95 (s, 1H), 7,70 (s, 1H)J.

Beispiel 12

/N- (t-Butyloxycarbonyl) -Phey-His-cyclostatin-Lys-Sta

Ähnlich wie in Beispiel 1 beschrieben, aber unter Verwendung von Statin-benzylester-Hydrochlorid anstelle von L-Phenylalanin-benzylester-p-toluolsulfonat und N-(t-Butyloxycarbonyl)-cyclostatin anstelle von N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin,wurde die Titelverbindung hergestellt ( H-NMR, CD^OD, 1,5 S, 9H s /B0C7).

Beispiel 13

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-PheZ-His-cyclostatin-(3-methoxycarbonyl-1,2,3,4-tetrahydro-2-isochinolin)

A. /N-(t-Butyloxycarbonyl)-cyclostatin/-(3-methoxycarbonyl-1,2,3,4-tetrahydro-2-isochinolin)

Ähnlich wie in Stufe C von Beispiel 1 beschrieben, aber unter Verwendung von N-(t-Butyloxycarbonyl)-cyclostatin (190 mg, 0,6.0 mMol) anstelle von N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin und 3-Methoxycarbonyl-1,2,3,4,-tetrahydroisochinolin-Hydrochlorid (137 mg, 0,60 mMol) anstelle von (N- <£-Benzyloxycarbonyllysin)-phenylalanin-benzylester-Hydrochlorid wurde die Verbindung £tü- (t-Butyloxycarbonyl) -cyclostatin/- (3-methoxycarbonyl-1,2,3,4-tetrahydro-2-isochinolin) als Schaum hergestellt, der ohne weitere Reinigung in der nächsten Stufe eingesetzt wurde (301 mg, ¹H-NMR, CDCl₃, 1,5 S₁ 9H s /BOCj).

B. Titelverbindung

Ähnlich wie in den Stufen D bis H von Beispiel 1 beschrieben, wurden 391 mg der Verbindung /K-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalaniny-histidin-cyclostatin-O^-methoxycarbonyl-i ,2,3, 4-tetrahydro-2-isochinolin) als Schaum hergestellt. Dieser Schaum wurde durch Chromatographie (Siliciumdioxidgel, Chloroform/Methanol-Gradient) gereinigt, um 138 mg gerei-

nigtes Produkt als weißen Feststoff zu ergeben ( H-NMR, CDCl₃, 1,5 £, 9H s /BOQ/).

Beispiele 14 bis 18

Ähnlich wie in Beispiel 13 beschrieben, aber unter Verwendung des geeigneten Derivats von Isochinolin, Chinolin oder Piperidin anstelle von 3-Methoxycarbonyl-1,2,3,4-tetrahydro-isochinolin, wurden die folgenden Verbindungen hergestellt:

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-PheZ-His-cyclostatin-R Beispiel R

14 1 ,2 ,3,4-Tetrahydro-2-isochinolinyl

15 3-Aminocarbonyl-1,2,3,4-tetrahydro-

2-isochinolinyl

16 1,2,3,4-Tetrahydro-i-chinolinyl

17 4-Phenylmethyl-1-piperidinyl

18 3-Methoxycarbonyl-1,2,3,4,5,6,7,8-

decahydro-2-isochinolinyl

Beispiel 19

/N-(t-Butyloxycarbony1)-ProJ-Phe-His-cyclostatin-(1,2,3,4,- tetrahydro-2-isochinolin)

Ähnlich wie in Beispiel 14 beschrieben, aber unter Verwendung von /N-(t-Butyloxycarbonyl)-prolin/-phenylalanin anstelle von N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalanin, wurde die Titelverbindung hergestellt.

Beispiel 20

/N-(t-Butyloxycarbonyl)-PheZ-His-cyclostatin-Pro-methylester \

A. /N-(t-Butylöxycarbonyl)-eyelöstätim/-prolin-methy!ester Ähnlich wie in Stufe C von Beispiel 1 beschrieben, aber un-

ter Verwendung von N-(t-Butyloxycarbonyl)-cyclostatin (3,15 g, 10 mMol) anstelle von N-(t-Butyloxycarbonyl)-statin und Prolin-methylester-Hydrochlorid (1,65 g, 10 mMol) anstelle von N- C-Benzyloxycarbonyl-lysin)-phenylalaninbenzylester-Hydrochlorid wurde die Verbindung /"N- (t-Butyloxycarbonyl) -cyclostatinZ-prolin-methylester als weißer Feststoff hergestellt (3,945 g).

B. Tite!verbindung

Ähnlich wie in den Stufen D bis H von Beispiel 1 beschrieben, wurde die Verbindung /N-(t-Butyloxycarbonyl)-phenylalaniny-histidin-cyclostatin-prolin-methylester hergestellt.

Beispiel 21

Hemmung der Angiotensinogen-spaltenden Aktivität von Renin in vitro _: '

Blutplasma wurde von gesundem Laborpersonal erhalten, gesammelt und gefroren aufbewahrt, bis benötigt. Vor Verwendung wurde eine Menge dieses Plasma aufgetaut und zentrifugiert, und der Überstand mit Protease-Inhibitoren gemischt und auf pH 7,4 gepuffert. Renin-Inhibitoren wurden zu verschiedenen Gehalten verschiedenen Teilmengen des Plasma-Überstands zugesetzt, und die anfallenden Gemische (310 λ) 3 h bei 37°C inkubiert, zusammen mit Renin-Inhibitor-freien Kontrollgemischen. Nach Inkubation wurden die Gemische in Eiswasser abgeschreckt und jeweils auf Angiotensin I unter Verwendung eines Angiotensin I-Antikörpers getestet. Die Produktion von Angiotensin I in Gegenwart eines Renin-Inhibitors wurde mit der in Abwesenheit des Inhibitors verglichen, und ein Prozentsatz der Hemmung wurde errechnet. Unter Verwendung von Daten, die aus gedoppelten Inkubationen bei jeder von verschiedenen unterschiedlichen Inhibitorkonzentrationen erhalten wurden,, wurde die Inhibitor-Konzentration des Inkubationsgemischs, die erforderlich ist, um eine 50%ige

Hemmung der Angiotensinogen-spaltenden Aktivität von Renin hervorzurufen, d.h. den ICc_o~Wert des Inhibitors, für verschiedene, unterschiedliche Inhibitoren errechnet.

Das Angiotensin I in den abgeschreckten Inkubationsgemischen wurde mit Hilfe eines Radioimmunoassays getestet, unter Verwendung von Bestandteilen eines Renin-Radioimmunoassay-Satzes, geliefert von Becton Dickinson and Co. (Orangeburg, N.Y.). Dieser Radioimmunoassay basierte auf dem von Haber et al., J.Clin. Endocrinol., 29_, S. 1349-1355 (1969) entwickelten.

Unter Anwendung der vorstehenden Arbeitsweise wurden Renin-Hemmkoeffizienten für die in jedem der Beispiel 1 bis 5 und 7 bis 20 hergestellten Verbindungen bestimmt. In jedem Falle war der experimentelle IC- -Wert kleiner als 5 μΜοΙ/1.

Beispiel 22

Antagonismus von exogener Renin-induzierter Pressor-Reaktion in vivo _i

Männliche Sprague - Dawley-Ratten (230 bis 300 g Körpergewicht) werden mit Natriumpentobarbital (65 mg/kg Körpergewicht, intraperitoneal) anästhesiert, worauf Femoralvenen- und Carotis-Arterien-Katheter in jedes Tier implantiert werden. Nach beendeter Operation werden die Tiere in vornübergebeugte Stellung gebracht und die Rektaltemperatur kontinuierlich aufgezeichnet. Der mittlere arterielle Blutdruck (MAP) wird über den Carotis-Arterien-Katheter mit einem Statham P2 3 ID-Drucktransducer und einem Physiographen aufgezeichnet. Nach einer Stabilisierungsperiode werden Kontroll-Renin-Pressor-Reaktionen (dP). von 20 bis 30 mm Hg durch Verabreichung von Schweinerenin (30 bis 80 mE/kg Körpergewicht, intravenös) erhalten. Nachdem der MAP auf die Grundlinie zurückkehrt, wird ein Renin-Inhibitor verabreicht (10 mg/kg Körpergewicht, intravenös), die Tiere werden wieder mit Schweine-

Renin (gleiche Dosierung wie für die Kontrollreaktion) 5, 15 und 30 min nach der Renin-Inhibitor-Verabreichung belastet und die entsprechenden Renin-Pressor-Reaktionen (dP) gemessen. Der Prozentsatz der Gegenwirkung wird berechnet als

(Kontroll-dP - experimenteller dP) χ 100 %

Kontroll-dP

wobei Kontroll-dP und experimenteller dP die Pressoränderungen in MAP vor bzw. nach Renin-Inhibitor-Verabreichung sind. Vorzugsweise werden wenigstens 3 Tiere bei jedem Test verwendet und die Ergebnisse gemittelt.

Unter Anwendung der obigen Arbeitsweise können die Prozentsätze der Renin-induzierten Pressor-Reaktion-Gegenwirkungen für die erfindungsgemäßen Verbindungen bestimmt werden.

Claims

Erfindungsanspruch

1 1

W Phenylalanin, W Histidin ist und W und W in einer Peptidbindung gebunden sind.

1 3

den reaktiven Gruppen in R und R und

(C) wenn gewünscht, Umwandeln der anfallenden Verbindung der Formel I in ein pharmazeutisch akzeptables Salz.

1 3
reaktiven Gruppen in R und Έτ geschützt sind, mit einer

Verbindung der Formel R-W-OX, worin -OX einen für Acylierungszwecke aktivierten Carboxyrest bezeichnet;

(B) Entfernens der Schutzgruppen, wenn vorhanden, aus

1 2 oder eines Säureadditionssalzes hiervon, worin R , R ,

R und W wie oben definiert sind und irgendwelche

1. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

R²
R-W-W¹-NH-CH-CH-CH₀-COR¹ I

und deren pharmazeutisch akzeptabler Salze , worin

W Phenylalanin, Histidin, Leucin, Tyrosin oder Norleucin ist, wobei die Peptidbindung zwischen W und W gegebenenfalls ersetzt ist durch -CH(Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)-NH-, wenn W Phenylalanin und W Histidin ist,

R Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,

R³ Hydroxyl, Amino, -NHR⁹, -NHCOR⁹, -OR⁹ oder -OCOR⁹ ist, wobei R⁹ Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen ist, und

R¹

(a) -A-E-B ist,

wobei A Lysin oder Prolin oder zusätzlich, nur wenn R Amino ist, Isoleucin ist, E Phenylalanin, Glycin, Alanin, Valin, Leucin, Isoleucin, Lysin, Ornithin, Arginin, Asparaginsäure, J" -veresterte Asparaginsäure, Glutaminsäure oder S -verester-

2 3 9 4 0?

β. Verfahren nach Punkt 5, gekennzeichnet dadurch, daß B Phenylalanin und B Hydroxyl ist.

2 3

R Cyclohexyl(methylen) und R Hydroxyl ist.

2 3

R Isobutyl und R Hydroxyl ist.

2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß R

ein Amino-schützender Acylrest mit einem Molekulargewicht von weniger als 500 oder ein Amino-geschützfes Prolin ist,

2-yl,
(i) 1,2,3 ^-Tetrahydro-S-methoxycarbonyl-isochinol-

in-2-yl,
(j) 1,2,3,4,5,6,7,e-Decahydro-S-methoxycarbonyl-

isochinolin-2-yl,

(k) 2-Methoxycarbonyl-pyrrolidin-1-yl, (1) 2-Aminocarbonyl-pyrrolidin-i-yl, (m) 4-Phenylmethyl-piperidin-1-yl

(n) -prolin-B, wobei B wie oben definiert ist, oder (o) -lysin-B, wobei B wie oben definiert ist, ist,

3· Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß

4· Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß

- 4?-
gekennzeichnet durch die Schritte des

(A) Acylierens einer Verbindung der Formel

E²

HW¹-IH-CH-CH-CH₉COR¹ (II)

R³

4 5
ist und wobei R und R jeweils Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Phenylalkyl mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl-(alkyl) mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen s ind,

Z Z¹

(b) -X-NH-CH-(CH₂J_n-Q-CH-(CH₂)_m-Y,

wobei X fehlt oder Alanin, Isoleucin, Lysin, Prolin, Ornithin, Arginin, N-(Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)-lysin, N,N-Di(alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)-lysin, N-(Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)-ornithin oder N,N-Di(alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen)-ornithin ist, Z und Z jeweils Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen, Cycloalkyl(alkylen)

mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen oder Phenylalkyl mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen sind, η und m jeweils ganze Zahlen von O bis 6 sind, Q OH 0

-CH₂-, -CH=CH-, -0-, -NH-, -CH- oder -C-

Y Methyl, Phenyl, -COOR , -CONR R , -NH₂/ (Benzyloxy)carbonylamino, -CO-Glutaminsäure(OR )₂, -CO-Glutaminsäure(-0R )-( -NR⁶R⁷) oder -CO-Glutaminsäure(-NR⁶R⁷)₂ ist und R und R jeweils Wasserstoff, Alkyl mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen, Phenylalkyl mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl-(alkylen) mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen sind,

(c) -NH₂,

(d) -Alkoxy mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen,

(e) 4-Benzylpiperazino-1-yl,

(f) 1,2,3,4-Tetrahydrochinolin-i-yl,

(g) 1,2,3 ^-Tetrahydroisochinolin^-yl,

(h) 1,2,3,4-Tetrahydro-3-aminocarbonyl-isochinolin-

4 4 5 4

te Glutaminsäure ist, B -OR , -NR R , -glutaminsäure(-0R )₂, -glutaminsäure(-0R )(-NR R ) oder -glutaminsäure(-NR R )₂

5. Verfahren nach Punkt 3 oder 4, gekennzeichnet dadurch, daß R¹ -Itfsin-E-B ist.

- 6 - W

7. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß R t-Butyloxycarbonyl ist.

8. Verfahren nach Punkt 6, gekennzeichnet dadurch, daß R I-(t-butyloxycarbonyl)-prolin ist.

9· Verfahren nach Punkt 3 oder 4» gekennzeichnet dadurch, daß R¹

,1

Z Z

-X-IH-CH-(CH₂) -Q-CH-(CH₂)_m~Y

ist.

10. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß X nicht fehlt.

11. Verfahren nach Punkt 10, gekennzeichnet dadurch, daß X ausgewählt ist ais der Gruppe bestehend aus Alanin, Prolin, Isoleucin und Lysin.

12. Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß Z Isobutyl ist, Q OH , Z Wasserstoff ist und η und m

-CH-

jeweils Null sind.

13. Verfahren nach Punkt 12, gekennzeichnet dadurch, daß Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -COOR , -COKR R^, -C0-Glutaminsäure(-0R )₂, -CO-Glutaminsäure-(OR⁶X-HR⁶R⁷) und -C0-Glutaminsäure(-KR⁶R⁷)₂.

14· Verfahren nach Punkt 11, gekennzeichnet dadurch, daß Z und Z jäareils Wasserstoff, Q -GH- ist, die Summe von η und m von O bis 3 ist und Y -GOOR⁶ oder -GOlIR⁶R⁷ ist.

15· Verfahren nach Punkt 12, 13 oder 14, gekennzeichnet dadurch, daS X Lysin ist.

16. Verfahren nach Punkt 9, gekennzeichnet dadurch, daß X fehlt.

17· Verfahren nach Punkt 16, gekennzeichnet dadurch, daß Z¹ Wasserstoff ist, Q -CH₂-, Y -COOR⁶, -COM⁶R⁷, -CO-Glutaminsäure (-0R⁶ )₂, -C0-Glutaminsäure(-0R⁶)(-IiR⁶R⁷) oder -C0-Glutaminsäure-(-KR R⁷)₂ ist, Z Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist und die Summe von η und m 0 bis 3 ist.

18. Verfahren nach Punkt 16, gekennzeichnet dadurch, daß Q -MH-,,m Null, η 0 oder 1, Y -COOR⁶, -COHR⁶R⁷, -CO-Glutaminsäure(-0R⁶)₂, -CO-Glutaminsäure(-0R^) (-HR⁶R⁷) oder -CO-Glutaminsäure-(-HR⁶R⁷)₂ und Z Alkyl mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen ist.

19· Verfahren nach Punkt 17 oder 18, gekennzeichnet dadurch, daß Y -COOR⁶ oder -COHR⁶R⁷ ist.

20. Verfahren nach Punkt 18, gekennzeichnet dadurch, daß Z¹ Benzyl ist.

21. Verfahren nach Punkt 17 oder 18, gekennzeichnet dadurch, daß Z sec.-Butyl ist.

22. Verfahren nach Punkt 2, gekennzeichnet dadurch, daß R

von der Formel _ß ?,' « Q'

R-M-C oder R -M-C-Prolin- ist, wobei

M -0-, -CH₂-, -MH- oder -SO₂HH- ist und R⁸ Alkyl mit

mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, Phenyl, Phenylalkyl mit 7 bis 9 Kohlenstoffatomen oder Cycloalkyl(alkyl) mit 5 bis 10 Kohlenstoffatomen ist.

23· Verfahren nach Punkt 22, gekennzeichnet dadurch, daß R U-(t-Butyl-oxycarbonyl)-prolin ist.