DD206563A5

DD206563A5 - Verfahren zur herstellung von makroliden

Info

Publication number: DD206563A5
Application number: DD81232149A
Authority: DD
Inventors: Eugene Th Seno; Richard H Baltz; Robert L Hamill; Gene M Wild
Original assignee: Lilly Co Eli
Priority date: 1980-07-29
Filing date: 1981-07-28
Publication date: 1984-02-01
Also published as: DK337181A; AU550721B2; IL63447A; FI812361A7; AR225532A1; IE811707L; GB2080807A; IE51746B1; AU7350481A; GB2080807B; BG36790A3; RO81015A; YU186381A; DE3166479D1; GR74290B; IL63447A0; ES504379A0; FI812361L; KR840001194B1; EP0045205B1

Abstract

DIE ERFINDUNG BETRIFFT EIN VERFAHREN ZUR HERSTELLUNG VON NEUEN MAKROLIDEN, NAEMLICH 5-O-MYCAROSYL-20-DIHYDRO-20,23-DIDEOXYTYLONOLID,WELCHES DER EINFACHHEIT HALBER AUCH ALS MYCAROSYLTYLACTON BEZEICHNET WIRD, VON IN DEN STELLUNGEN 3 UND/ODER 4' VERESTERTEN MYCAROSYLTYLACTONDERIVATEN HIERVON ODER VON 3-0-ACYLTYLACTONDERIVATEN, DURCH ZUECHTUNG VON STREPTOMYCES FRADIAE NRRL 12201 UNTER SUBMERSEN AEROBEN FERMENTATIONSBEDINGUNGEN IN EINEM KULTURMEDIUM, DAS ASSIMILIERBARE QUELLEN FUER KOHLENSTOFF, STICKSTOFF UND ANORGANISCHE SALZE ENTHAELT, UNTER BILDUNG VON MYCAROSYLTYLACTON UND DURCH EVENTUELLE ACYLIERUNG UND/ODER HYDROLYSE UNTER MILDEN BEDINGUNGEN DER DABEI JEWEILS ERHALTENEN VERBINDUNG. DIE HIERDURCH ERHALTENEN MAKROLIDE STELLEN WERTVOLLE ZWISCHENPRODUKTE DAR, AUS DENEN SICH INTERESSANTE 16-GLIEDRIGE MAKROLIDANTIBIOTIKA ERZEUGEN LASSEN.

Description

23 2 U 9 3 -<-

Aktenzeichen: X-5659

Vertreter; Patentanwaltsbüro Berlin

Titel der Erfindung; Verfahren zur Herstellung von Makroliden Anwendungsgebiet der Erfindung;

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Makroliden, die wertvolle Arzneimittel sind und sich vor allem durch eine besonders interessante antibiotische Wirksamkeit auszeichnen.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen;

Die vorliegenden Makrolide ähneln in ihrer Struktur dem als therapeutisches Mittel bekannten Tylosin, das beispielsweise in Tetrahedron Letters 2339 (1970) beschrie-

ben wird. Tylosin stellt ein sehr bedeutendes Antibiotikum dar.

Aufgabe der Erfindung:

Infolge der interessanten Wirksamkeit von Tylosin und des ständigen Bedarfs an neuen Antibiotika wegen der sich im Laufe der Zeit ergebenden Resistenzbildung hat sich die Erfindung nun die Aufgabe gestellt, antibiotisch wirksame und tylosinähnliche Makrolide zu schaffen, die sich durch eine besonders interessante pharmakologische Wirksamkeit, und insbesondere eine wertvolle antibiotische Wirksamkeit, auszeichnen. In diesem Zusammenhang sollen vor allem auch neue Zwischenprodukte und Verfahren zur ihrer Herstellung geschaffen werden, über die sich dann Makrolide mit entsprechender pharmakodynamischer Wirksamkeit erzeugen lassen.

Darlegung des Wesens der Erfindung:

Die obige Aufgabe wird nun erfindungsgemäß unter anderem gelöst durch das neue 5-0-Mycarosyl-20-dihydro-20,23-dideoxytylonolid, welches im folgenden der Einfachheit halber auch einfach als Mycarosyltylacton bezeichnet wird. Dieses Mycarosyltylacton hat die Struktur I

(T)

CHC5-«14 ₄ »4

Chs-CHa-i.15 .JL y*~°^H ^^Ha

232U 9 3

Für die vorliegenden Verbindungen der verschiedenen Struk turen und Verbindungen ist zwar keine stereochemische Kon figuration angegeben, doch ist diese selbstverständlich identisch mit der stereochemischen Konfiguration von TyIo sin. Wie der Name bereits sagt, ist der Zucker der obigen Struktur I Mycarose.

Damit verwandte Mycarosyltylactonderivate haben die allgemeine Struktur II

worin R und R für Acylreste stehen.

Zur Erfindung gehören weiter auch 3-0-Acyltylactonderivate, die sich aus den Mycarosyltylactonderivaten der obigen Struktur II herstellen lassen. Ferner gehört zur Erfindung auch ein Verfahren zur Herstellung von Tylacton oder den entsprechenden 3-0-Acyltylactonderivaten, indem man Mycarosyltylacton oder ein Mycarosyltylactonderivat der obigen Struktur II einer schwach sauren Hydrolyse unterzieht.

Die erfindungsgemäßen 3-0-Acyltylactonderivate haben die Struktur III

ί. Ο ί. I "ι J J _ ₄ _

CH₃-* f-CHa-CHü

I iiii)

CH3-CH2-

Die Verbindungen der Strukturen I, II und III stellen wertvolle Zwischenprodukte dar, aus denen sich 16-gliedrige Makrolidantibiotika herstellen lassen. Die Erfindung ist daher beispielsweise auch auf ein neues Verfahren zur Bildung von Derivaten der Verbindung der obigen Formel III durch entsprechende chemische Umsetzung gerichtet, wodurch man zum entsprechenden antibiotisch wirksamen 16-gliedrigen Makrolid gelangt, das in Stellung 3 monoacylsubstituiert ist.

Ein wichtiges Anwendungsgebiet von Mycarosyltylacton ist die Verwendung als Zwischenprodukt zur Herstellung von Tylacton und Tylactonderivaten. Tylacton hat die folgende Formel IV

j-CHa

CHa-Jf MJHa-CHa

• Cn₃ U)H (IV)

vsv'^Lh

2 3 2 U 9 3

Mycarosyltylacton läßt sich von Tylacton und Tylosin durch Dünnschichtchromatographie mittels Silicagel unterscheiden. Die Detektion kann durch Besprühen mit Schwefelsäure durchgeführt werden, und zwar entweder konzentrierter oder verdünnter (50 %-iger) Schwefelsäure. Unter Verwendung dieses Detektionssystems erscheint Tylacton zuerst in Form eines gelben bis braunen Flecks, während Mycarosyltylacton als blauer bis purpurfarbener Fleck auftritt. Verwendet man zur Chromatographie Silicagelplatten mit einem fluoreszierenden Untergrund, dann bietet sich eine UV-Detektion an. Die ungefähren Rf-Werte von Mycarosyltylacton gehen aus der folgenden Tabelle I hervor.

Tabelle I Dünnschichtchromatogramm von Mycarosyltylacton^a Verbindung

Mycarosyltylacton Tylacton Tylosin

^aMedium: Silicagel

Lösungsmittel: A = Benzol:Ethylacetat (4:1)

B = BenzoltEthylacetat (3:2)

Mycarosyltylacton läßt sich herstellen, indem man einen Stamm von Streptomyces fradiae, der diese Verbindung bildet, unter submersen aeroben Bedingungen in einem geeigneten Kulturmedium solange züchtet, bis eine wesentliche Menge dieser Verbindung produziert ist.

	Rf-Werte	B	44
A^b		o,	62
o,	17	o,	0
0,	50	o,
0,	0

2321 49 3

Zum Wachsenlassen von Streptomyces fradiae läßt sich irgendeines der verschiedenen Kulturmedien verwenden. Aus Gründen einer wirtschaftlichen Produktion, optimalen Ausbeute und leichten Isolierbarkeit des gewünschten Produkts werden jedoch bestimmte Kulturmedien bevorzugt. Zu bevorzugten Kohlenstoffquellen für eine großtechnische Fermentation gehören beispielsweise Kohlehydrate, wie Dextrin, Glucose, Stärke oder Maismehl, oder auch öle, wie Sojabohnenöl. Zu bevorzugten Stickstoffquellen gehören Maismehl, Sojabohnenmehl, Fischmehl oder Aminosäuren. Zu den anorganischen Nährsalzen, die dein Kulturmedien einverleibt sein können, gehören die üblichen löslichen Salze, welche beispielsweise Ionen von Eisen, Kalium, Natrium, Magnesium, Calcium, Ammonium, Chlorid, Carbonat, Sulfat oder Nitrat liefern.

Im Kulturmedium sollen ferner auch essentielle Spurenelemente vorhanden sein, die für ein Wachstum und eine Entwicklung des Mikroorganismus erforderlich sind. Solche Spurenelemente kommen gewöhnlich als Verunreinigungen in anderen Bestandteilen des Mediums in einer für ein Wachsen des Mikroorganismus ausreichend hohen Menge vor. Bei großtechnischen Fermentationsmedien kann es beispielsweise zu einer zu starken Schaumbildung kommen, so daß man erforderlichenfalls kleine Mengen (nämlich Mengen von etwa 0,2 ml/1) eines Antischaummittels, wie Polypropylenglykol (mit einem Molekulargewicht von etwa 2000) zusetzen muß.

Zur Bildung wesentlicher Mengen an Mycarosyltylacton wird eine submerse aerobe Fermentation in Tanks bevorzugt. Kleine Mengen Mycarosyltylacton lassen sich auch durch Züchtung in Schüttelkolben erreichen. Infolge der verzögerten Bildung von Mycarosyltylacton bei einer Beimpfung großtechnischer Tanks mit der Sporenform des Organismus wird vorzugsweise ein vegetatives Impfgut verwendet. Die Herstellung eines solchen vegetativen Inoculums erfolgt durch Beimpfen

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eines kleinen Volumens an Kulturmedium mit der Sporenform oder mit Mycelbruchstücken des Organismus, wodurch man zu einer frischen und aktiv wachsenden Kultur des Organismus gelangt. Das hierdurch erhaltene vegetative Inoculum läßt sich dann in einen größeren Tank übertragen. Das für das vegetative Inoculum verwendete Medium kann das gleiche sein wie es auch für größere Fermentationen verwendet wird/ es lassen sich hierfür jedoch auch andere Medien einsetzen.

Der beim erfindungsgemäßen Verfahren zu verwendende Mikroorganismus wird erhalten durch chemische Mutagenese eines tylosinproduzierenden Stammes von Streptomyces fradiae. Der durch Mutagenese erhaltene Mikroorganismus produziert lediglich minimale Mengen Tylosin, bildet Mycarosyltylacton und Tylacton jedoch als überwiegende Komponenten.

Der neue Mikroorganismus, welcher Mycarosyltylacton produziert, ist als ein Stamm von Streptomyces fradiae klassifiziert worden. Eine Kultur dieses Mikroorganismus ist in der Kulturensammlung von Northern Regional Research Center, Agricultural Research, North Central Region, 1815 North University Street, Peoria, Illinois, 61604, hinterlegt und kann von dort unter der Nummer NRRL 12201 frei bezogen werden.

Der Mikroorganismus Streptomyces fradiae NRRIj 12201 ist genauso wie andere Organismen einer Variation zugänglich. So lassen sich beispielsweise Rekombinanten, Mutanten oder künstliche Varianten des Stammes NRRL 12201 herstellen, indem man diesen Stamm mit verschiedenen bekannten physikalischen und chemischen mutagenen Mitteln behandelt, wie beispielsweise Ultraviolettlicht, Röntgenstrahlen, Gammastrahlen oder N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin. Alle natürlichen und künstlich induzierten Varianten, Mutanten und Rekombinanten von Streptomyces fradiae NRRL 12201, die die charakteristische Bildung von Mycarosyltylacton beibe-

halten, können erfindungsgemäß verwendet werden.

Streptomyces fradiae NRRL 12201 kann bei Temperaturen zwischen etwa 10 und 40⁰C wachsen. Zu einer optimalen Bildung an Mycarosyltylacton scheint es bei einer Temperatur von etwa 28⁰C zu kommen.

Wie bei aeroben submersen Züchtungsverfahren üblich, wird auch beim vorliegenden Verfahren durch das Kulturmedium sterile Luft geblasen. Für eine entsprechende wirksame Bildung an Antibiotikum soll die prozentuale Luftsättigung bei einer Tankproduktion etwa 30 % oder darüber betragen (bei 28°C und 1 bar Druck).

Die Bildung an Mycarosyltylacton und Tylacton läßt sich während der Fermentation verfolgen, indem man Proben der Brühe durch Dünnschichtchromatographie oder Hochieistungsflüssigkeitschromatographie unter Verwendung eines UV-Detektionssystems untersucht.

Nach erfolgter Bildung unter submersen aeroben Fermentationsbedingungen kann man Mycarosyltylacton unter Anwendung von in der Fermentationstechnxk üblichen Methoden aus dem Fermentationsmedium gewinnen. Mycarosyltylacton ist in Wasser nur begrenzt löslich, so daß es sich in dem Medium, in welchem es gebildet wird, gegebenenfalls nicht insgesamt lösen kann. Die Gewinnung von Mycarosyltylacton erfolgt daher entweder (1) durch Extraktion der Fermentationsbrühe oder (2) Filtration der Fermentationsbrühe und Extraktion von sowohl der filtrierten Brühe als auch dem Mycelkuchen. Die Extraktionsverfahren können unter Anwendung der verschiedensten Techniken durchgeführt werden. Ein bevorzugtes Reinigungsverfahren für die filtrierte Brühe besteht darin, daß man die Brühe (im allgemeinen ohne Einstellung des pH-Werts) mit einem geeigneten Lösungsmittel extrahiert, wie Amylacetat oder Petrolether, und die dabei

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anfallende organische Schicht dann unter Vakuum konzentriert, wodurch man zu Kristallen oder einem öl gelangt. Zur Reinigung kann man die hierdurch erhaltenen Kristalle oder das öl einer Adsorptionschromatographie unterziehen, wodurch man zu Mycarosyltylacton und Tylacton gelangt.

Mycarosyltylacton läßt sich durch Behandlung mit Acylierungsmitteln in bekannter Weise an den in den Stellungen 3 und 4¹ befindlichen Hydroxylgruppen verestern, wodurch man die Acylesterderivate der eingangs genannten Formel II erhält. Die Acylesterderivate von Mycarosyltylacton sind wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung neuer Makrolidantibiotika.

Als Acylierungsmittel eignen sich hierzu beispielsweise Anhydride, Halogenide (gewöhnlich in Kombination mit einer Base oder einem sonstigen Säurefänger) und aktive Ester organischer Säuren. Ferner läßt sich die Acylierung auch unter Einsatz eines Gemisches aus einer organischen Säure und einem Dehydratisierungsmittel erreichen, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid.

Die Herstellung der entsprechenden Derivate erfolgt durch Anwendung der hierzu bekannten Veresterungstechniken, beispielsweise durch Behandlung der Verbindung mit einer stöchiometrischen Menge (oder einer leicht überschüssigen Menge) eines Acylierungsmittels, wie eines Acylanhydrids, in einem organischen Lösungsmittel, wie Pyridin, bei etwa 0⁰C bis Raumtemperatur über eine Zeitdauer von etwa 1 bis 24 Stunden bis zur praktischen Beendigung der Veresterung. Das erhaltene Esterderivat läßt sich aus dem Reaktionsgemisch durch übliche Verfahren isolieren, beispielsweise durch Extraktion, Chromatographie oder Kristallisation.

_ IQ -

Brauchbare Acylester sind solche organischer Säuren unter Einschluß aliphatischen cycloaliphatischer, arylischer, aralkylischer oder heterocyclischer Carbonsäuren, Sulfonsäuren und Alkoxycarbonsäuren, die jeweils 1 bis 18 Kohlenstoffatome enthalten, sowie solche anorganischer Säuren, wie Schwefelsäure oder Phosphorsäure.

Bevorzugt sind die Ester, bei denen R ein von einer Monocarbonsäure oder einer Dicarbonsäure mit jeweils 1 bis Kohlenstoffatomen abgeleiteter Acylrest ist.

Zu Beispielen für geeignete Ester gehören Ester von Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Chloressigsäure, Propionsäure, Buttersäure, Isovaleriansäure, Glucuronsäure, Alkoxycarbonsäure, Stearinsäure, Cyclopropancarbonsäure, Cyclohexancarbonsäure, ß-Cyclohexylpropionsäure, 1-Adamantancarbonsäure, Benzoesäure, Phenylessigsäure, Phenoxyessigsäure, Mandelsäure oder 2-Thienylessigsäure, oder von Alkylsulfonsäuren, Arylsulfonsäuren oder Aralkylsulfonsäuren, wobei die Arylsulfonsäuren und Aralky!sulfonsäuren an ihrem aromatischen Rest gegebenenfalls Substituenten enthalten können, wie Halogen, Nitro oder Niederalkoxy. Zu geeigneten Estern gehören ferner auch die Halbester von Dicarbonsäuren, wie Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Malonsäure oder Phthalsäure.

Die Verbindungen der Strukturen I, II und III sind wertvolle Zwischenprodukte, aus denen sich 16-gliedrige Makrolidantibiotika herstellen lassen. Durch Hydrolyse von Mycarosyltylacton (I) unter schwach sauren Bedingungen gelangt man beispielsweise zu Tylacton (IV). In ähnlicher Weise ergibt die Hydrolyse eines Mycarosyltylactonderivats der Formel II das entsprechende 3-0-Acyltylactonderivat der Formel III.

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Die für solche schwach saure Hydrolysen anzuwendenden Bedingungen sind allgemein bekannt. Zur Durchführung dieser Hydrolyse lassen sich entsprechende Lösungen mit einem pH-Wert von etwa 4 oder darunter verwenden. Zweckmäßigerweise wird in Gegenwart eines polaren organischen Colösungsmittels gearbeitet, beispielsweise eines Alkohols, wie Ethanol, um die Reaktanten in Lösung zu halten. Es können Temperaturen von etwa 20 bis 100⁰C angewandt werden. Die zur Durchführung dieser Hydrolyse erforderliche Umsetzungszeit ist beispielsweise abhängig vom pH-Wert des Reaktionsgemisches und der angewandten Temperatur. Bei höheren pH-Werten ist die Reaktionsgeschwindigkeit langsamer, während die Umsetzung bei höheren Temperaturen rascher abläuft. Die Reaktion wird durchgeführt, indem man entweder Mycarosyltylacton oder ein 3-O-Acylmycarosyltylactonderivat solange mit einer schwach sauren Lösung behandelt, bis die Mycarosylgruppe entfernt und das gewünschte Tylacton oder 3-O-Acyltylacton entstanden ist.

Tylacton läßt sich auf biochemischem Wege in Tylosin oder mit Tylosin verwandte Verbindungen überführen. Eine solche Bioumwandlung kann durchgeführt werden, indem man Tylacton zu einer wachsenden Kultur eines bioumwandelnden Mikroorganismus gibt. Der bioumwandelnde Mikroorganismus kann ein Stamm von Streptomyces sein, der entweder selbst Tylosin produziert oder zu einer Produktion von Tylosin befähigt ist, wenn er bezüglich seiner Bildung von Tylacton blockiert ist.

Ein Stamm, der zur Bildung von Tylosin befähigt ist, wenn er bezüglich seiner Bildungsfähigkeit für Tylacton blokkiert ist, läßt sich erhalten, indem man einen tylosinproduzierenden Stamm mit einem Mutagen behandelt und durch ein Screening diejenigen überlebenden Mikroorganismen aussortiert, die kein Tylosin bilden können. Die nicht zu

IJ L \ 4 ^ J

einer Bildung von Tylosin befähigten überlebenden Mikroorganismen werden dann einem weiteren Screening mit dem Ziel unterzogen, diejenigen Stämme zu ermitteln, die kein Tylacton bilden können, sich jedoch immer noch für eine Bioumwandlung von Tylacton zu Tylosin eignen. Die Identifizierung dieser Stämme erfolgt durch Zugabe von Tylacton zu kleinen Schüttelkolbenkulturen der jeweils ausgewählten überlebenden Mikroorganismen, um hierdurch zu bestimmen, ob sie zu einer Bioumwandlung von Tylacton zu Tylosin befähigt sind.

Zu Beispielen für Stämme von Streptomyces, die Tylosin produzieren können, gehören die Stämme NRRL 2702 und NRRL 2703 von Streptomyces fradiae. Ein typisches mutagenes Mittel, das sich zur Bildung der ausgewählten Stämme verwenden läßt, ist N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin.

Tylacton und die 3-O-Acyltylactonderivate eignen sich insbesondere zur Herstellung markierter Verbindungen für biosynthetische oder metabolische Untersuchungen. Durch Markierung entweder des Tylactonanteils oder der angehängten Zuckerreste erhält man insbesondere markiertes Tylosin, welches sich für biosynthetische oder metabolische Untersuchungen verwenden läßt. Der Acylrest der 3-0-Acyltylactonderivate stellt eine zur Markierung geeignete zusätzliche Stelle dar.

Ausführungsbeispiele;

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele weiter erläutert.

2 U 9 3

Beispiel 1 ^Α· Schüttelkolbenfermentätion von Mycarosyltylacton

Ein lyophilisiertes Pellet von Streptomyces fradiae NRRL 12201 wird in 1 bis 2 ml sterilem Wasser dispergiert. Mit einer Teilmenge der hierdurch erhaltenen Lösung (0,5 ml) beimpft man dann ein vegetatives Medium (150 ml) folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Maisquellwasser 1,0

Hefeextrakt 0,5

Sojabohnenschrot 0,5

CaCO₃ 0,3

Sojabohnenöl (roh) 0,45

Deionisiertes Wasser 97,25

Statt dessen kann man auch eine in flüssigem Stickstoff aufbewahrte vegetative Kultur von Streptomyces fradiae NRRL 12201 in jeweils einem Volumen von 1 ml verwenden, rasch auftauen und zum Beimpfen des vegetativen Mediums verwenden.

Das inokulierte vegetative Medium wird in einem 500 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben bei 29⁰C über eine Zeitdauer von etwa 48 Stunden in einem verschlossenen Schüttelkasten bei einer Geschwindigkeit von etwa 300 UpM bebrütet.

Mit dem hierdurch erhaltenen bebrüteten vegetativen Medium (0,5 ml) beimpft man dann 7 ml eines Produktionsmediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Rübenmelasse 2,0

Maismehl 1,5

Fischmehl 0,9

Maisgluten 0,9

NaCl 0,1

0,04

CaCO₃ 0,2

Sojabohnenöl (roh) 3,0

Deionisiertes Wasser 91,36

Das inokulierte Fermentationsmedium wird in einem 50 ml fassenden Kolben bei 29⁰C über eine Zeitdauer von etwa 6 Tagen in einem verschlossenen Schüttelkasten bei einer Geschwindigkeit von 300 UpM bebrütet.

^B· Tankfermentation von Mycarosyltylacton

Zur Bildung eines größeren Volumens an Inoöulum verwendet man 60 ml einer in ähnlicher Weise wie oben unter Abschnitt A. beschrieben hergestellten vegetativen Kultur und beimpft damit 38 1 eines vegetativen Wachstumsmediums der zweiten Stufe mit folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Maisquellwasser 1,0

Sojabohnenmehl 0,5

Hefeextrakt 0,5

CaCO₃ 0,3

Sojabohnenöl (roh) 0,5

Lecithin (roh) 0,015

Wasser 97,185

23 2U9 3

Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 8,5 eingestellt.

Dieses vegetative Medium der zweiten Stufe wird in einem 68 1 fassenden Tank etwa 47 Stunden bei 29⁰C bebrütet.

Mit der auf diese Weise erzeugten inkubierten Kultur der zweiten Stufe (4 1) beimpft man hierauf 40 1 eines sterilen Produktionsmediums folgender Zusammensetzung:

Bestandteile Menge (%)

Fischmehl 0,92

Maismehl 1,57

Maisgluten 0,92

CaCO₃ 0,21

NaCl 0,10

(NH₄)₂HPO₄ 0,04

Rübenmelasse 2,10

Sojabohnenöl (roh) 3,15

Lecithin 0,09

Wasser 90,90

Der pH-Wert wird mit 50 %-iger Natriumhydroxidlösung auf 7,2 eingestellt.

Man läßt das inokulierte Produktionsmedium in einem 68 fassenden Tank etwa 5 Tage bei 28⁰C fermentieren. Das Fermentationsmediura wird derart mit steriler Luft belüftet, daß die Menge an gelöstem Sauerstoff zwischen etwa 30 und 50 % bleibt, und es wird mittels herkömmlicher Rührer bei einer Geschwindigkeit von etwa 300 UpM gerührt.

4L. \J *- I *♦ *S *J

Beispiel 2 Isolierung von Mycarosyltylactoh und Tylacton

Die nach Beispiel 1, Abschnitt A., erhaltene Fermentationsbrühe (900 ml) wird mit Pretolether (900 ml) extrahiert. Der Petroletherextrakt wird unter einem Luftstrom zu einem öl konzentriert. Das öl wird in einer kleinen Menge Ethylacetat (etwa 15 ml) gelöst. Sodann gibt man Heptan (etwa 15 bis 20 ml) zu. Im Anschluß daran läßt man das Ethylacetat zur Kristallisation langsam verdampfen. Durch nachfolgendes Abtrennen der Kristalle gelangt man zu 450 mg eines kristallinen Gemisches aus Tylacton und Mycarosyltylacton.

Weiteres Material erhält man, indem man die zurückbleibende Gesamtbrühe mit einem gleichen Volumen Methanol versetzt, die erhaltene Lösung filtriert und das Filtrat mit Methylenchlorid extrahiert.

Zur Abtrennung löst man das kristalline Gemisch (400 mg) in Benzol. Die Benzollösung wird über eine mit Silicagel gefüllte Säule (Woelm) chromatographiert, die in Benzol gepackt ist. Die Elution wird mittels Silicageldünnschichtchromatographie unter Verwendung eines Gemisches aus Benzol und Ethylacetat (3:2) als Lösungsmittelsystem und durch Besprühen mit konzentrierter Schwefelsäure zur Detektion überwacht. Die Säule wird zur Entfernung von Lipidsubstanzen zuerst mit Benzol eluiert, worauf man sie mit 1 1 eines Gemisches aus Benzol und Ethylacetat (9:1), 1400 ml eines Gemisches aus Benzol und Ethylacetat (6:1) und 900 ml eines Gemisches aus Benzol und Ethylacetat (3:1) eluiert, um hierdurch Tylacton und Mycarosyltylacton abzutrennen und zu isolieren. Es werden Fraktionen mit einem Volumen von etwa 150 ml aufgefangen. Tylacton wird

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zuerst eluiert (Fraktionen 14 bis 19), während Mycarosyltylacton (Fraktionen 22 bis 26) später folgt. Die die jeweilige Verbindung enthaltenden Fraktionen werden vereinigt/ unter Vakuum eingedampft und aus Heptan umkristallisiert, wodurch man zu 160 mg Tylacton und zu 120 mg Mycarosyltylacton gelangt.

Mycarosyltylacton ist ein weißer Feststoff, der aus Heptan, Hexan oder Ethylacetat-Hexan kristallisiert und bei etwa 182 bis 184⁰C schmilzt. Eine Elementaranalyse ergibt folgende ungefähre prozentuale Zusammensetzung; Kohlenstoff = 67 %, Wasserstoff = 9 % und Sauerstoff = 24 %. Mycarosyltylacton hat eine empirische Formel von C₃QH₅₀Og und ein Molekulargewicht von etwa 538.

Das Infrarotspektrum von Mycarosyltylacton in Chloroform geht aus der beiliegenden Zeichnung hervor. Es lassen sich Absorptionsmaxima bei folgenden Frequenzen (cm" ) beobachten: 3640 (mittel), 2941 und 2907 /Doublett(stark)/, 2421 (sehr schmal), 1712 (stark), 1678 (mittel), 1623 (schmal), 1590 (stark), 1456 (mittel), 1404 (schmal), 1374 (schmal), 1359 (Schulter), 1314 (schmal), 1284 (schmal), 1263 (sehr schmal), 1229 (schmal), 1178 (stark), 1157 (mittel), 1134 (sehr schmal), 1109 (schmal), 1078 (sehr schmal), 1050 (mittel), 1025 (sehr schmal), 1000 (stark), 984 (stark), 962 (mittel), 920 (sehr schmal), 911 (sehr schmal), 887 (schmal), 867 (schmal), 848 (Schulter), 836 (schmal) und 799 (schmal).

Das Ultraviolettabsorptionsspektrum von Mycarosyltylacton in neutralem Ethanol zeigt ein Absorptionsmaximum bei etwa 282 nm (e] *_m = 568).

Mycarosyltylacton hat folgenden spezifischen Drehwert: *J^ =-46,4° (c = 1, CH₃OH). .

Mycarosyltylacton ist in Wasser nahezu unlöslich, löst sich jedoch in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Chloroform, Diethylether, Petrolether, Benzol und Dimethylsulfoxid.

Beispiel 3 3,4*-Di-O-acetyl-S-O-mycarosyltylacton

Das nach Beispiel 2 hergestellte Mycarosyltylacton (20 mg) wird in Pyridin (0,5 ml) gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit Essigsäureanhydrid (0,25 ml) versetzt. Die Lösung wird 15 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann unter Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird erneut aus einem Gemisch aus Methanol und Cyclohexan verdampft, wodurch man zu 3,4'-Di-O-acetyl-S-O-mycarosyltylacton gelangt .

Beispiele 4 bis 7

Zur Herstellung von 3,4'-Di-O-propionyl-S-O-mycarosyltylacton geht man wie in Beispiel 3 beschrieben vor, verwendet jedoch PropionSäureanhydrid.

Zur Herstellung von 3,4'-Di-O-isovaleryl-S-O-mycarosyltylacton geht man wie in Beispiel 3 beschrieben vor, verwendet jedoch Isovaleriansäureanhydrid.

Zur Herstellung von 3,4'-Di-O-benzoyl-S-O-mycarosyltylacton geht man wie in Beispiel 3 beschrieben vor, verwendet jedoch Benzoesäureanhydrid.

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Zur Herstellung von 3,4'-Di-O-(n-butyryl)-5-0-mycarosyltylacton geht man wie in Beispiel 3 beschrieben vor, verwendet jedoch η-ButterSäureanhydrid.

Beispiel8 Herstellung von Tylacton aus Mycarosyltylacton

Das nach Beispiel 2 hergestellte Mycarosyltylacton wird in einem Gemisch aus Methanol und wäßriger Chlorwasserstoff säurelösung (pH 1,8) gelöst. Die Lösung läßt man bis zur vollständigen Beendigung der Hydrolyse (Erwärmen auf einem Wasserbad über eine Zeitdauer von etwa 30 Minuten) stehen und stellt sie dann durch Zugabe von Natriumhydroxid auf pH 7,0 ein. Anschließend wird die Lösung mit Ethylacetat, Dichlormethan oder Chloroform extrahiert. Der Extrakt wird getrocknet und unter Vakuum eingedampft, wodurch man zu Tylacton gelangt.

Tylacton ist ein weißer Feststoff, der aus Heptan, Hexan oder Ethylacetat-Hexan kristallisiert und bei etwa 162 bis 163⁰C schmilzt. Er hat folgende ungefähre prozentuale Elementarzusammensetzung: Kohlenstoff = 70 %, Wasserstoff = 9,7 %, Sauerstoff = 20,3 %. Tylacton weist eine empirische Formel von ^C23^H3ß°5 ^au^ ^un(^ verfügt über ein Molekulargewicht von etwa 394.

Das Infrarotabsorptionsspektrum von Tylacton in Chloroform verfügt bei folgenden Frequenzen (cm" ) über beobachtbare Absorptionsmaxima: 3534 (mittel), 2924 (stark), 2398 (schwach), 2353 (schwach), 1709 (sehr stark), 1678 (sehr stark), 1626 (schmal), 1592 (sehr stark), 1458 (stark), 1441 (Schulter), 1404 (stark), 1379 (schmal), 1316 (stark), 1284 (mittel), 1181 (sehr stark), 1143 (stark), 1103 (mittel), 1078 (mittel), 1049 (sehr schmal), 1025 (mittel),

984 (sehr stark), 958 (stark), 923 (mittel), 911 (Schulter), 859 (schmal), 868 (mittel), 840 (mittel), 820 (sehr schmal) und 661 (schmal).

Das ültraviolettabsorptionsSpektrum von Tylacton in neutralem Ethanol zeigt ein Absorptxonsmaximum bei etwa 282

™ <^Εί cm^{s 560}>·

Tylacton hat folgenden spezifischen Drehwert:

/ÖL/q⁵ ="55,23° (c = 1, CH₃OH).

Eine elektrometrische Titration von Tylacton in 66 %-igem wäßrigem Dimethylformamid zeigt, daß es keine titrierbaren Gruppen gibt.

Tylacton ist in Wasser nahezu unlöslich, löst sich jedoch in organischen Lösungsmitteln, wie Aceton, Methanol, Ethanol, Dimethylformamid, Chloroform, Diethylether, Petrolether, Benzol oder Dimethylsulfoxid.

Beispiel 9 Herstellung von 3-O-Acetyltylacton

Das nach Beispiel 3 hergestellte 3,4'-Di-O-acetyl-5-0-mycarosyltylacton hydrolysiert man nach dem in Beispiel 8 beschriebenen Verfahren unter Verwendung eines Gemisches aus Methanol und 0,1-normaler Chlorwasserstoffsäure (1:1, pH 1,5), wodurch man zu 3-O-Acetyltylacton gelangt.

2 1 4 9 3

Beispiele 10 bis 13

Zur Herstellung von 3-O-Propionyltylacton setzt man das nach Beispiel 4 erzeugte 3,4'-Di-O-propionyl-S-O-mycarosyltylacton nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren um.

Zur Herstellung von 3-O-Isovaleryltylacton setzt man das nach Beispiel 5 erzeugte 3,4'-Di-O-isovaleryl-5-O-mycarosyltylacton nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren um.

Zur Herstellung von 3-O-Benzoyltylacton setzt man das nach Beispiel 6 erzeugte 3,4'-Di-O-benzoyl-S-O-mycarosyltylacton nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren um.

Zur Herstellung von 3-0-(n-Butyryl)tylacton setzt man das nach Beispiel 7 erzeugte 3,4'-Di-O-(n-butyryl)-5-0-mycarosyltylacton nach dem in Beispiel 9 beschriebenen Verfahren um.

Beispiel 14 Herstellung von Tylosin aus Tylacton

Unter Anwendung des in Beispiel 1, Abschnitt A., beschriebenen Verfahrens fermentiert man einen Stamm von Streptomyces fradiae, der vorher Tylosin produziert hat, jedoch bezüglich seines Makrolidringschlußvermögens blockiert ist. Es wird bei einer Temperatur von 28⁰C gearbeitet. 48 Stunden nach erfolgter Inoculation versetzt man das Fermentationsgemisch mit Tylacton. Sodann wird solange weiter fermentiert, bis eine wesentliche Menge an Tylosin produziert ist, was etwa 3 weitere Tage dauert. Zur Ermittlung der Gegenwart von Tylosin untersucht man Proben der Brühe ge-

genüber Mikroorganismen, von denen man weiß, daß sie auf Tylosin ansprechen. Ein hierzu geeigneter Mikroorganismus ist Staphylococcus aureus ATCC 9144. Dieser Bioversuch wird zweckmäßigerweise unter Anwendung einer automatisierten turbidometrischen Methode durchgeführt. Andere Untersuchungsmethoden bestehen in einer Dünnschichtchromatographie oder einer Hochleistungsflüssigkeitschromatographie unter UV-Detektion.

Beispiel 15 Herstellung von markiertem Tylosin

Zur Herstellung von Mycarosyltylacton geht man wie in den Beispielen 1 und 2 beschrieben vor, wobei man dem Fermentationsmedium abweichend davon jedoch markiertes Acetat, Propionat oder Butyrat zusetzt. Aus dem auf diese Weise erzeugten markierten Mycarosyltylacton stellt man dann unter Anwendung des in Beispiel 8 beschriebenen Verfahrens markiertes Tylacton her. Aus dem hierdurch erhaltenen markierten Tylacton bildet man dann nach dem in Beispiel 14 beschriebenen Verfahren Tylosin. Auf diese Weise gelangt man zu Tylosin, welches am Makrolidring markiert ist.

Beispiel 16 Herstellung von 3-0-Acetyl-5-O-ß-desosaminyltylacton

Das nach Beispiel 10 hergestellte 3-0-Acetyltylacton vermischt man in Gegenwart von Quecksilbercyanid in Nitromethan (20⁰C, 10 Stunden) mit i-alpha-Brom-2-O-acetyldesosaminhydrobromid (5 Äquivalent). Im Anschluß daran isoliert man das erhaltene S^'-O-Diacetyl-S-O-ß-desosaminyltylacton durch Silicagelsäulerichromatographie. Sodann

23 2 Τ Λ 9 3

entfernt man von dieser Verbindung die 2'-Acetylgruppe, indem man sie bei Raumtemperatur in Methanol stehen läßt. Auf diese Weise gelangt man zu 3-0-Acetyl-5-0-ß-desosaminyltylacton, nämlich dem 3-0-Acetylderivat des Antibiotikums M-4365 G₁.

Claims

Erf indungsansprüche

1. Verfahren zur Herstellung eines Makrolids der allgemeinen Formel I

ii

22 y

CHs-*14 ₁ f4
CH₃-CH₂-^s /ft. .M)R (i)

VK

worin R Wasserstoff oder Acyl ist und worin Q für Wasser stoff oder eine Mycarosylgruppe der allgemeinen Formel

.CKs

OH,CK

CHa

steht, worin R Wasserstoff oder Acyl bedeutet, mit der Maßgabe, daß R für Acyl steht, falls Q Wasserstoff ist,

dadurch gekennzeichnet, daß man einen Stamm von Streptomyces fradiae NRRL 12201 unter submersen aeroben Bedingungen in einem Kulturmedium, das assimilierbare Quellen für Kohlenstoff, Stickstoff und anorganische Salze enthält, bis zur Bildung einer Verbindung der Formel (I), worin R Wasserstoff ist und Q für einen Mycarosylrest steht, worin R Wasserstoff ist, züchtet und gegebenenfalls

2U9 3

(a) eine hierdurch erhaltene Verbindung der allgemeinen Formel (I), worin einer oder beide Reste R und Q Acyl bedeuten, acyliert oder

(b) eine gemäß obiger Stufe (a) hergestellte Verbindung der Formel (I) durch Hydrolyse unter milden Bedingungen in ein Makrolid der Formel (I) überführt, worin Q Wasserstoff ist und R für Acyl steht.
2. Verfahren nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Mycarosyltylacton herstellt.

Hierzu 1 Blatt Zeichnung