DD158109A1 - METHOD FOR INHIBITING THE CATALYTIC ACTIVITY OF PEPTIDE HYDROLASES - Google Patents
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Abstract
Das erfindungsgemaesse Verfahren dient zur Hemmung unerwuenschter peptidhydrolytischer Aktivitaeten bei labordiagnostischen, medizinischen und lebensmitteltechnischen Gegebenheiten oder Verfahren. Ziel der Erfindung ist ein leicht anwendbares Verfahren zur spezifischen Hemmung der Aktivitaet solcher Peptidhydrolasen, die waehrend ihrer Funktion keine C-terminal freien Carboxyl-Gruppen im Substrat benoetigen und katalytisch wirksame Serin- oder Cysteinreste enthalten. Im erfindungsgemaessen Verfahren werden Substanzen mit der Formel zur Hemmung der katalytischen Aktivitaet verwendet. Dabei bedeutet R einen Alpha-Aminosaeure-, N-geschuetzten Alpha-Aminosaeure- oder Peptidylrest, dessen Struktur voer Formel zur Hemmung der katalytischen Aktivitaet verwendet. Dabei bedeutet R einen alpha-Aminosaeure-, N-geschuetzten alpha-Aminosaeure- oder Peptidylrest, dessen Struktur voRestes in der Formel als Substrat umsetzt. R tief 1 entspricht einem Phenylrest, der in ortho-, meta- oder para-Stellung zur Carbonylgruppe keinen, einen oder in Kombination dieser Stellung zwei Substituenten, vorzugsweise F, CI, Br, NO tief 2, CH tief 3, CH tief 3 O, traegt.The process according to the invention serves to inhibit undesired peptide-hydrolytic activities in laboratory diagnostic, medical and food-technological circumstances or processes. The aim of the invention is an easily applicable method for the specific inhibition of the activity of such peptide hydrolases, which during their function do not require any C-terminally free carboxyl groups in the substrate and contain catalytically active serine or cysteine residues. In the process according to the invention, substances having the formula for inhibiting the catalytic activity are used. Here, R represents an alpha-amino acid, N-protected alpha-amino acid or peptidyl radical whose structure of the formula is used to inhibit catalytic activity. Here, R is an alpha-amino acid, N-protected alpha-amino acid or peptidyl radical, the structure of which reacts radicals in the formula as substrate. R deep 1 corresponds to a phenyl radical which in the ortho, meta or para position to the carbonyl group has no, one or in combination of this position two substituents, preferably F, Cl, Br, NO deep 2, CH deep 3, CH deep 3 O , wearing.
Description
Verfahren zur Hemmung der katalytisches! Aktivität von Peptidhydrolasen Process for inhibiting the catalytic! Eptidhydrolasen Ak tivity of P
Anwendungsgebiet der ErfindungField of application of the invention
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hemmung der katalytisehen Aktivität solcher Peptidhydrolasen, die während ihrer Funktion keine C~terminal freien Ccirboxylgruppen im Substrat benötigen.und insbesondere katalytisch wirksame Serin- oder Cysteinreste enthalten« Solche Peptidhydrolasen können unter labordiagnostischen, medizinischen und lebens=· mitteltechnischen Gegebenheiten oder bei Verfahren auf diesen Gebieten mit unerwünscht hoher Aktivität auftreten«The invention relates to a method for inhibiting the catalytic activity of such peptide hydrolases, which do not require C-terminally free ccirboxyl groups in the substrate during their function, and in particular contain catalytically active serine or cysteine residues. Such peptide hydrolases can be performed under laboratory diagnostic, medical and life-cycle conditions or occur in processes in these areas with undesirably high activity «
Inhibitoren von Peptidhydrolasen werden als Feinchemikalien in der Biochemie, Molekularbiologie, Medizin, biochemischen Genetik, Pharmazie sowie Lebensmittalwissenschaft und -industrie benötigt,,Inhibitors of peptide hydrolases are needed as fine chemicals in biochemistry, molecular biology, medicine, biochemical genetics, pharmacy, and food science and industry,
Charakteristik der bekannten technischen Lösungen Characteristic of the known technical solutions
Bisher gelingt die gezielte Hemmung einiger Peptidhydrolasen insbesondere durch die Isolierung proteinartiger Substanzen aus pflanzlichen und tierischen Organismen (Ann.Rev,Bioehem, 49_, 593-626 (198O)) oder durch synthetisch zugängliche Substanzen, vorzugsweise aus der Klasse der Peptidaldehyde, der Peptidyl-halogenmethylketone, der Azapeptide und der Peptidyl-N-nitrosoamide (Methods in Enzymology, Bd. XLVI, Academic Press, New York 1977, S.3-240),So far, the targeted inhibition of some peptide hydrolases succeeds in particular by the isolation of proteinaceous substances from plant and animal organisms (Ann.Rev, Bioehem, 49_, 593-626 (198O)) or by synthetically accessible substances, preferably from the class of peptide aldehydes, the peptidyl halomethyl ketones, the azapeptides and the peptidyl-N-nitrosoamides (Methods in Enzymology, Vol. XLVI, Academic Press, New York 1977, p.3-240),
In einem typischen Verfahren zur Gewinnung eines natürlich vorkommenden Inhibitors für die proteolytischen Enzyme Trypsin, Chymotrypsin, Plasmin und die Gruppe der Kininogenasen wird inhibitorhaltiges Material aus Helix pomatia isoliert und über aufwendige Zentrifugationsschritte und säulenchromatographische Verfahren zum aktiven Inhibitor gereinigt (CHC- PS Nr9 590063), - ' Von den synthetisch darstellbaren Inhibitoren ergeben sich für Peptid-In a typical method for obtaining a naturally occurring inhibitor of the proteolytic enzymes trypsin, chymotrypsin, plasmin and the group of kininogenases, inhibitory material is isolated from Helix pomatia and purified by complex centrifugation steps and column chromatographic methods to the active inhibitor (CH C - PS No. 9 590063 ) Of the synthetically representable inhibitors result for peptide
aldehyde-und Azapeptide, insbesondere für solche, die mehrfunktionelle Aminosäuren enthalten, langwierige Darstellungsverfahren mit niedrigen Ausbeuten. · ·aldehyde and azapeptides, especially for those containing polyfunctional amino acids, provide lengthy low yielding procedures. · ·
Peptidyl-N-nitrosoamide enthalten .die als mutagen bekannte N-Nitrosoamidgruppe, wodurch eine' Anwendung weitgehend eingeschränkt wird.Peptidyl-N-nitrosoamides contain the N-nitrosoamide group, which is known to be mutagenic, thereby greatly restricting one's use.
Die weiterhin beschriebenen Peptidyl-halogenmethylketone enthalten als Cxi, -Halocarbonylverbindungen eine für Nucleophile, wie sie in biologischen Flüssigkeiten in hohen.Konzentrationen auftreten können, leicht angreifbar Halogenmethylgruppe, Die entstehenden Reaktionsprodukte besitzen nicht mehr die typischen Inhibi.toreigenschaften der Peptidylhalogenmethylketone, so daß unter solchen Bedingungen der Gehalt an. aktiven Inhibitor am.Wirkungsort schnell absinkt (Amer.Rev.Resp.Dis. 121. 381-387 (1980)). ..The peptidyl-halomethylketones described further contain as Cxi, -Halocarbonylverbindungen one for nucleophiles, as they can occur in biological fluids in high concentrations, easily attackable halomethyl group, The resulting reaction products no longer have the typical inhibitory properties of Peptidylhalogenmethylketone, so that among such Conditions of salary. active inhibitor at the site of action decreases rapidly (Amer.Rev.Resp.Dis 121, 381-387 (1980)). ..
Außerdem hat sich gezeigt, daß Peptidyl-halogenmethylketone mit einer oder mehreren freien Aminofunktionen im Molekül, deren Zielenzyme d&mit als Aminopeptidasen gekennzeichnet sind, zusätzlich durch Cyclisierungsr.eaktionen destabilisiert werden, was ihre Verwendbarkeit weitgehend ausschließt«,In addition, it has been found that peptidyl-halomethylketones having one or more free amino functions in the molecule, whose target enzymes are also characterized as aminopeptidases, are additionally destabilized by cyclization reactions, which largely precludes their utility.
Ziel der Erfindung ·Object of the invention
Ziel der Erfindung ist ein leicht anwendbares, unter Anwendungsbedingungen genügend robustes Verfahren zur spezifischen, Hemmung der kata™ lytischen Aktivität solcher Peptidhydrolasenf die Y/ährend ihrer Funktion keine O-terminal freien Carboxylgruppen im Substrat benötigen und insbesondere katalytisch wirksame Serin- oder Cysteinreste enthalten»The aim of the invention is an easily applicable, sufficiently robust under conditions of application method for the specific, inhibition of kata ™ lytic activity of such peptide hydrolases f need the Y / hile their function no O-terminal free carboxyl groups in the substrate and contain, in particular catalytically active serine or cysteine residues "
Darlegung des Wesens der Erfindung Presentation of the essence of the invention
Der Erfindung liegt die .Aufgabe zugrunde, ein Verfahren unter Anwendung stabile?und synthetisch leicht darstellbarer Inhibitoren hoher Spezifität für eine Anzahl von Peptidhydrolasen zur Verfügung zu stellen. Erfindungsgemäß erfüllt ein Verfahren unter Verwendung von Substanzen der allgemeinen FormelThe invention is based on the object of providing a method using stable and synthetically readily representable inhibitors of high specificity for a number of peptide hydrolases. According to the invention, a process using substances of the general formula
. R-C A NH-O- C, R-C A NH-O- C
I ' I '
diese Forderungen»these demands »
In der Formel bedeutet R einen ö<<*> Aminosäure-, zum Beispiel HHp-CH (CHa)~ für L-Alanin, einen N-geschützten6c*=Aminosäure- oder einen Peptidylrest, dessen genaue Struktur vom Zielenzym für den betreffenden Inhibitor abhängt« Diese.Struktur muß so beschaffen sein, daß die betreffende Peptidhydrolase eine Substanz mit einer -CO-NH-Gruppe anstelle des -CCHNHOCO-Restes in Formel I als Substrat umsetzt,,In the formula, R represents a ö * <<> amino acid, for example, HHP-CH (CHa) ~ L-alanine, N-a geschützten6c * = amino acid or a peptidyl residue, the exact structure of the target enzyme for the relevant inhibitor depends This structure must be such that the peptide hydrolase in question converts a substance with a -CO-NH group instead of the -CCHNHOCO radical in formula I as substrate,
R.steht für einen Phenylrest, der in ortho-,meta-oder para-Stellung zur Carbonylgruppe keinen, einen oder in einer Kombination dieser Stellungen.zwei Substituenten, vorzugsweise F, Cl, Br, NOp, CEL, CH3O trägt, .R. is a phenyl radical which bears no, one or a combination of these positions in ortho, meta or para position to the carbonyl group. Two substituents, preferably F, Cl, Br, NOp, CEL, CH 3 O,.
Bei der Einwirkung der wäßrigen Lösung eines Stoffes der Formel I mit einem solchen Rest R der von der betreffenden Peptidhydrolase als Substrat erkannt wird, auf die im biologischen Material, enthaltene oder die isolierte· Peptidhydrolase unter äußeren Bedingungen, bei denon das Enzym üblicherweise seine katalytisch^ Wirkung entfaltet, koramt es zu einer zeitabhängigen irreversiblen Hemmung' der Enzymaktivität, die unter anderem von der Enzymkonzentration, der Inhibitorkonzentration und der Struktur der Reste R.und R abhängt» Das erfindungsgemäße Verfahren entfaltet dabei seine Wirkung derart, daß nach. Bindung der Inhibitoren an das Zielenzym ein Anion, im Falle der Struktur I also R-COO", abgespalten wird und das verbleibende hochreaktive Intermedia't vom Typ R-CONH selbst oder nach schnellen Umwandlungen solche chemische Gruppen im Enzym blockiert, die für das katalytisch^ Geschehen bedeutsam sind« Diesen Typ der Hemmung eines Enzyms bezeichnet man als enzymaktivierte Inhibierung» Ein wichtiger Vorteil des Verfahrens unter Verwendung von Hemmstoffen auf dieser Basis besteht darin, daß die chemisch hochreaktive Gruppe des Inhibitors sich erst nach der Einwirkung auf das Zielenzym herausbildet, so daß unspezifische Hemmeffekte auf andere Peptidhydrolasen und chemische Nebenreaktionen weitgehend vermieden werden. Inhibitoren mit der Grundstruktur I zeichnen sich durch eine hohe Spezifität aus. Eine Variation dieser Spezifität zur Hemmung der verschiedenen Peptidhydrolasen mit katalytisch wirksamen Serin- oder Cysteinresten im Molekül gelingt·in d6r Regel schon dadurch, daß zum Beispiel bei konstanten Rest R,. (4-Kitrophenyl) der Rest R der Spezifität des Enzyms angepaßt wird« Die dazu nötigen synthetischen Operationen entsprechen den üblichen Methoden der Peptidchemie.When the aqueous solution of a substance of the formula I is reacted with such a radical R which is recognized as a substrate by the peptide hydrolase in question, the enzyme usually contains its catalytic acid or the isolated peptide hydrolase under external conditions Unfolded, it results in a time-dependent irreversible inhibition 'of enzyme activity, which depends inter alia on the enzyme concentration, the inhibitor concentration and the structure of the radicals R. and R "The process of the invention develops its effect such that after. Binding of the inhibitors to the target enzyme, an anion, in the case of the structure I, ie R-COO ", cleaved off and the remaining highly reactive Intermedia't type R-CONH itself or after rapid conversions such chemical groups in the enzyme blocked for the catalytic A key advantage of the process using inhibitors on this basis is that the chemically highly reactive group of the inhibitor is formed only after exposure to the target enzyme, so it is important to note that this type of inhibition of an enzyme is an enzyme-activated inhibition inhibitors with the basic structure I are distinguished by a high specificity, a variation of this specificity for the inhibition of the different peptide hydrolases with catalytically active serine or cysteine residues in the molecule is already possible in the rule in that z for example, at constant residual R ,. (4-Kitrophenyl) the radical R is adapted to the specificity of the enzyme. "The necessary synthetic operations correspond to the usual methods of peptide chemistry.
Gemische 'von Peptidhydrolasen lassen sich durch Gemische der für- diese Hydrolasen spezifischen Inhibitoren hemmen.Mixtures of peptide hydrolases can be inhibited by mixtures of inhibitors specific for these hydrolases.
Die erfindungsgemäßen Inhibitoren können auch als Salze zum Beispiel Hydrochlorid, Tosylat vorliegen. 'The inhibitors according to the invention can also be present as salts, for example hydrochloride, tosylate. '
Au sführung sbe ispiele ' · For the sake of example, ·
Die Erfindung soll nachstehend an fünf Ausführungsbeispielen näher erläutert werden* >The invention will be explained in more detail below with reference to five exemplary embodiments
Die in den Beispielen 2 bis 5 verwendeten Inhibitoren v/erden aus den entsprechenden Peptidy!hydroxamsäuren nach folgender allgemeinen Vorschrift hergestellt,The inhibitors used in Examples 2 to 5 are prepared from the corresponding peptidyl hydroxamic acids according to the following general procedure.
2,6? eMoI N-geschützte Peptidylhydroxamsäure werden in 5 ml Wasser unter Rühren mit 3 mMol NaOH und 2,7 mMol 4-Nitrobenzoylchlorid, ge~ löst in 5 ml Tetrahydrofuran, bei 5 C versetzt. Man läßt noch eine Stunde bei Raumtemperatur stehen und gießt die Mischung anschließend in 50 bis 100 ml Eiswasser. Der'ausfallende Niederschlag wird abgesaugt und über KOH getrocknet» Die Peptidyl-N(4—Nitrobenzoyloxo)amide werden in der Regel aus Ethylacetat umkristallisiert.2.6? eMoI N-protected peptidyl hydroxamic acid are added in 5 ml of water while stirring with 3 mmol NaOH and 2.7 mmol 4-nitrobenzoyl chloride, dissolved in 5 ml of tetrahydrofuran, at 5 ° C. The mixture is allowed to stand at room temperature for an hour and then the mixture is poured into 50 to 100 ml of ice water. Der'ausfallende precipitate is filtered off with suction and dried over KOH »The peptidyl-N (4-Nitrobenzoyloxo) amides are usually recrystallized from ethyl acetate.
Beispiel 2 . ' .Example 2. '.
Dipeptidylpeptidase IV wurde unter Verwendung von Ala~Pro-N-(4~Nitro~ benzoyloxo)amid . HCl irreversibel gehemmt» Die. Reaktionslösung enthielt 1,T10 "mol/l Inhibitor, 0,037 mol/1 Natriumphosphatpuffer (pH 7»6)f KCl um die Ionenstärke auf 0,125 einzustellen und 0,3 ug Dipeptidylpeptidase IV. Die Reaktion wurde durch Zugabe des Enzyms zur Inhibitorlösung gestartet und bei 30 C durchgeführt.Dipeptidyl peptidase IV was amide using Ala-Pro-N- (4-nitrobenzoyloxo). HCl irreversibly inhibited »The. Reaction solution contained 1, T10 "mol / l inhibitor, 0.037 mol / 1 sodium phosphate buffer (pH 7" 6) f KCl to adjust the ionic strength to 0.125 and 0.3 ug dipeptidyl peptidase IV. The reaction was started by addition of the enzyme to the inhibitor solution 30 C performed.
Das Gesamtvolumen des Reaktionsansatzes betrug 2,7 ml. Im zeitlichen Abstand von 10 Minuten wuiden Proben von 0,2 ml dem Reaktionsansatz entnommen und in einem Testansatz die verbliebene Enzymaktivität im Vergleich zu einem mitgelaufenen Blindwert ohne Inhibitor vermessen. Nach 20 Minuten war die Aktivität der Dipeptidylpeptidase auf 50% der Ausgartgsaktivität gesunken, nach 120 Minuten war keine Enzymaktivität mehr nachweisbar,The total volume of the reaction mixture was 2.7 ml. At intervals of 10 minutes, samples of 0.2 ml were taken from the reaction mixture and, in a test batch, the remaining enzyme activity was measured in comparison with a blank blank value without inhibitor. After 20 minutes, the activity of dipeptidyl peptidase had fallen to 50% of Ausgartgsaktivität, after 120 minutes no enzyme activity was detectable,
Der Testansat'z 2ur Bestimmung der Enzymaktivität enthielt 0,037 mol/1 The assay for the determination of enzyme activity contained 0.037 mol / l
O L 5O L 5
Natriumphosphat hei pH 7,6 und 2,0 ., 10"^Ala-Pro-A-nitroanilid. Die Enzymaktivität wurde spektralphotometrisch anhand der Extinktionszunahme durch freigesetztes 4—llitroanilin .bei 390 nm ermittelt. Das Gesamtvolumen des Testansatzes betrug 2,7 ml« Gemessen wurde bei 30 C,The enzyme activity was determined spectrophotometrically by means of the increase in extinction by liberated 4-nitroaniline at 390 nm, the total volume of the test batch being 2.7 ml "Measured at 30 C,
Im Humanurin enthaltene Dipeptidylpeptidase IV wurde unter Verwendung von Ala--Pro~N-(4-Nitro-benzoyloxo)amid » HCl irreversibel inhibiert. Zu dem im Beispiel 1 angegebenen Reaktionsansatz wurde anstelle eines Teils der Pufferlösung 0t 5 ml Humanurin gegeben. Die Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Sinwirkungszeit wurde analog Beispiel 1 bestimmt. Nach 20 Minuten Reaktionszeit betrug die restliche Aktivität der Dipeptidylpeptidase IV noch 50%, nach 120 Minuten war. keine Aktivität mehr nachweisbar.Dipeptidyl peptidase IV contained in human urine was irreversibly inhibited using Ala-Pro-N- (4-nitrobenzoyloxo) amide.HCl. To the reaction mixture indicated in Example 1 was added 0 t 5 ml of human urine instead of a portion of the buffer solution. The enzyme activity as a function of the reaction time was determined analogously to Example 1. After a reaction time of 20 minutes, the residual activity of dipeptidyl peptidase IV was still 50%, after 120 minutes. no activity detectable.
Thermitase (eine mikrobielle Protease aus Thernioactinomyces vulgaris) wurde unter Verwendung von BOC-Ala^N-CA—nitrobenzoyloxoHnsid irreversibel inaktiviert«, . .Thermitase (a microbial protease from Thernioactinomyces vulgaris) was irreversibly inactivated using BOC-Ala ^ N-CA-nitrobenzoyloxo-hsidide. ,
Die Reaktionslösung enthielt A-,2 β 10 "mol/1 Inhibitor.und 0,033 raol/1 Tris-Puffer (pH 7,5)* Der Thermitasegohalt betrug 1,A- , 10~ mol/l| der Reaktionsansatz 1,5 ml wurde auf 300C gehalten. Im zeitlichen Ab~ stand von 2 Minuten wurden Proben von je 0,1 ml entnommen und im Testansatz auf die verbliebene Bnzymaktivität im Vergleich zu einem mitgelaufenen Blindwert ohne Inhibitorzusatz vermessen. Nach 2 Minuten betrug die Aktivität der Thermitase noch ca 50% des Ausgangswertes, nach 15 Minuten war keine Enzymaktivität mehr nachweisbar.The reaction solution contained A-, 2 β 10 'mol / 1 Inhibitor.und Raol 0.033 / 1 Tris-buffer (pH 7.5) * The Thermitasegohalt was 1, A-, 10 ~ mol / l |, the reaction mixture 1.5 ml was maintained at 30 0 C. the time from ~ was 2 minutes samples were taken from each 0.1 ml and measured in the assay mixture on the remaining Bnzymaktivität compared to a mitgelaufenen control without added inhibitor. After 2 minutes, the activity of the thermitase was still about 50% of the initial value, after 15 minutes no enzyme activity was detectable.
Der Testansatz zur Bestimmung der Enzymaktivität enthielt 0,033 raol/1 ' Tris-Puffer pH 7,5 (3O0C) und 5,3 . 1θ"Λιό1/1 BOC-Ala-Ala-A-nitroanilid. Die Enzymaktivität wurde durch, einen Sxtinktionsanstieg bei 39Onm ermittelt.The assay mixture for determination of enzyme activity contained 0.033 Raol / 1 'Tris buffer pH 7.5 (3O 0 C) and 5.3. 1θ "¹ / 1 BOC-Ala-Ala-A-nitroanilide The enzyme activity was determined by, a Suction increase at 39Onm.
Elastase aus Rinderpank'reas wurde unter Verwendung von BOC-Ala-Pro-Ala-K~(4~Nitrobenzoyloxo)amid irreversibel inhibiert. Die Reaktionslösung enthielt 2,8 . 10"'\iq1/1 Inhibitor, 0,033 .mol/1 Tris-Puffer (pH 8,0)Bovine pancreas elastase was irreversibly inhibited using BOC-Ala-Pro-Ala-K ~ (4-nitrobenzoyloxo) amide. The reaction solution contained 2.8. 10% inhibitor, 0.033 μmol / l Tris buffer (pH 8.0)
und 0,077 mol/1'NaCl. . . L· «*- «* B Der Elastasegehalt betrug 5f3 · 10*" mol/1, der Reaktionsansatz von 1,5 ml wurde bei 3O0C gehalten. Im zeitlichen Abstand von 5 bis 10 Minuten wurden Proben von je 0,1 ml entnommen und im Testansatz auf •die verbliebene Enzymaktivität im Vergleich zu einem mitgelaufenen BlindTgert ohne Inhibitorzusatz vermessen. Nach 18 Minuten betrug die Aktivität der Elastase noch 50^5 des Ausgangswertes und war nach 120 Minuten mehr nachweisbar, .and 0.077 mol / 1'NaCl. , , · L ". * -" * B The Elastasegehalt was 5 f 3 x 10 * "mol / 1, the reaction mixture of 1.5 ml was kept at 3O 0 C at intervals of 5 to 10 minutes, samples of each 0, The remaining enzyme activity was measured in comparison to a blank BlindTgert without added inhibitor: After 18 minutes the activity of the elastase was still 50% of the initial value and was detectable after 120 minutes,.
Der Testansatz enthielt 0,033 mol/1 Natriumphosphat pH 7,0 und 2,4- . 10 mol/1 BCOAla-4—nitrophenylester. Die Messung der Enzymaktivität wurde spektralphotometrisch bei 405 nm anhand des freigesetzten 4— Nitrophenols durchgeführt, .The assay contained 0.033 mol / l of sodium phosphate pH 7.0 and 2.4-. 10 mol / 1 BCOAla-4-nitrophenyl ester. The measurement of the enzyme activity was carried out spectrophotometrically at 405 nm using the liberated 4-nitrophenol,.
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