DD145028A3 - Verfahren zur biotechnischen herst llung von cellulasen,hemicellulasen und beta-glucosidas n - Google Patents
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Description
-λ-
te9 4 03
Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Cellulasen, Hemieellulasen und ß-Glucosidasen
j Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur biotechnischen Herstellun von Zellulose-, heraizellulose- und ß-glucoside-spaltenden Enzymen im Einers- und Submersverfahren mittels selektierten und optimierte Stämmen aus der Gattung Penicillium,,
Zur biotechnischen Herstellung von Cellulasen werden verschiedene Schimmelpilze verwendet, so z» B, aktive Stämme aus den Gattungen Aspergillus, Trichoderma, Gliocladium und Penicillium. Die Produkt von Cellulase mit Hilfe von Stämmen der Gattung Penicillium wird mehrfach beschrieben*
Die von den angegebenen Stämmen produzierten Cellulasen werden, als Pest- oder Plüssigpraparät zur Spaltung von Zellulose aus verschiedeiien Pflanzenmaterialien verwendet, so z« 3# zum besseren Aufschluß von Obst und Gemüse/, zur Erhöhung der Saftausbeute, zur Herstellung von Mazeraten und Säften, für diätetische Zwecke und sum Aufschluß von Futtermitteln sowie von Holz und Stroh zur Gewinnung von Glukose zur Biomasseproduktion von Einzellereiweiß.
Der effektivere Einsatz eines Celluiasepräparates verlangt ein geeignetes Spektrum von eelIuIolytischen und hemicellulolytischen Enzymen. Zur Produktion von Biomasse mittels Hefe müssen die zellulosehaltigen Substrate bis zur Glukose abgebaut werden, so da neben einer hohen C1^, C - vor allein auch eine hohe Cellobiaseaktivität notwendig ist* Eine Anzahl von Cellixlasepräparaten besit ein für den jeweilig praktischen Einsatz nicht optimales Enzymspek da einzelne Enzymkomponenten geringere Aktivitäten aufweisen*
12NQ;¥-1975*-5ü480.G
Auch die mit Hilfe des Stammes Gliocladium produzierte Cellulase besitzt Cellobiase in nicht ausreichendem Maße· Zweck der Erfindung ist es, ein Cellulasepräparat unter produktionstechnisch rentablen Bedingungen herzustellen, das ein breites Enzymspektrum von Cellulasen und Hemicellulasen, vor allem mit hohen Aktivitäten von C1- und C- sowie Cellobiaseaktivitäten hat, bei gleichzeitig hohen hemicellulolytischen Aktivitäten, um zellulosereiche Substrate intensiv für verschiedene Verwendungszwecke abbauen zu können, .
Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde, durch Verwendung eines geeigneten Stammes unter geeigneten Kultivierungsbedingungen ein Enzympräparat zu gewinnen, das eine höhere Enzymaktivität und geeignetere Enzymzusammensetzung hat als die bisher beschriebenen Stämme.
Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß ein Stamm mit hohen cellulolytischen und hemicellulolytischen Aktivitäten durch Verwendung zellulosehaltiger Substrate isoliert und durch ein Screening ausgesucht v/ird und durch genotypische und phänotypische Optimierungen seine Enzymaktivitäten um 30 - 50 % gesteigert werden·
Isolation und Selektion des ausgewählten Organismus
Zellulosetestbeutel nach U 3ÜT G E R wurden in Ackerboden von Getreidefeldern im Raum Stendal ausgelegt und nach einem vierteljährigen Verbleib zur Aufarbeitung wieder entnommen· Die Pilze, die sich an der Zellulose der Beutel entwickelt hatten, wurden durch Verwendung geeigneter zellulosehaltiger Eährmedien mit Hilfe des Plattenverdünnungstestes isoliert. Der selektierte Organismus wurde durch ein geeignetes Screening-Verfahren auf phosphorsäuregeschwollener Zellulose (Clearing-Test nach RAUTELA) ausgewählt· Im Submersverfahren wurde seine besonders hohe Enzymproduktion nachgewiesen.
Von der reingezüchteten Kultur wurden Einkeimkolonien angelegt und die aktivste ausgewählt. Der selektierte Klon entwickelte verschiedene Varianten, die sich makroskopisch (Farbspiel, Sporulationsintensität) und enzymatisch unterschieden* Diese Varianten wurden in Hinblick auf ihre Cellulaseaktivität im " Submersverfahren selektiert» .
Der isolierte Stamm konnte nach dem gültigen Bestimmungsbuch von HAPER und THOM, A Manual of the Penicillia, Williams and Wilkins, Baltimore 1949» als eine Varietät der Art Penicillium citreo viride bestimmt werden· Er stimmt mit den in R A PE R und ΪΗ Ö M beschriebenen Fonnenvarianten dieser Art nicht überein, sondern stellt eine eigene Varietät dar.» Diese Varietät wurde daher als parvo-citreo bezeichnet. Eine Beschreibung dieser Varietät wurde in der Literatur noch nicht vorgenommen· Eine Einteilung des Stammes in die Art Penicillium citreo viride wurde deswegen vorgenommen, da aas Penicillien-Formenspektrurn. sehr groß ist und eine systematische Eingliederung in bisher beschriebene Gruppen = Arten angebracht erscheint.
Er grenzt sich von den beschriebenen Artenvarietäten wie folgt ab: Wachstum auf Würzeagar ist ausgebreitet, flach, schwach samtig, mit konzentrischer Ringbildung· Die Luftmycelfarbe ist grün bis grau-grün· Die Substratmycelfarbe variiert von schwach gelblich bis braun. Das Wachstum auf Czapek bzw. Czapek-Dox-Agar ist begrenzt, samtig bis schwach wollig mit Faltenbildung· Die Luftmycelfarbe variiert von weiß über gelblich bis hin zu rötlichviolettem Schimmer, .
Das mikroskopische Erscheinungsbild kann wie folgt beschrieben werden:
Die Sporulation ist im allgemeinen nicht sehr stark und findet im wesentlichen nur auf Würze-Agar und in geringerem Maße auf Sabouraud-Agar statt. Auf Würzeagar entspringen die Konidienträger dem Luftmycel und tragen einen charakteristischen moncverticillaten Pinsel« Die Konidienträger sind meistens unver-
zweigt, gelegentlich tritt ein Seitenzweig auf, Sie sind unterschiedlich lang von 11 μ - 26 p. und -sirtö glatt» Sie tragen 3-5 selten 7. dicht stehende Sterigmen. Die Sterigmen sind glatt und " röhrenföriaxg, die durchschnittliche Länge beträgt 5 u - 9 -u· Die Konidien bilden lockere Säulenketten, die auch eine wirre Anordnung breit auseinandergehender Ketten zeigen können» Die durchschnittliche Länge der Ketten beträgt 17/i - 45 yu. Die Sporen sind rundlich, glatt und haben einen Durchmesser von 1yU - 3yU. Die Sporen lösen sich in den Ketten nur sehr schwer voneinander*
Der beschriebene Stamm ist in der Stammsammlung der Humboldt- · Universität, Kleinmachnow b. Berlin, Bereich Mikrobiologie der Sektion FGv/ und LMT unter der Er. 2711 (Anmeldungsjähr 1973) registriert,
Die biotechnischen Verfahren zur Herstellung der Cellulasen, Hemicellulasen und ß-Glucosidasen können in Submers- und Eraerskultüren durchgeführt werden.
Die Enzymproduktion erfolgt unter Yerv/endung billiger, natürlicher Ausgangsmaterialien, wobei ein Zusatz von nativer Zellulose zum Kulturmedium die Enzymaktivitäten wesentlich erhöht· Zur Steigerung bestimmter Enzymaktivitäten können^- und/oder ß-Glukoside dem Medium zugesetzt werden· Die Enzymproduktion im Emersverfahren erfolgt auf angefeuchteten pflanzlichen Materialien, vorzugsweise Weizenkleie und/oder Grünmehl, Der sterile ITährboden wird mit Sporen bzw, vegetativen Mycelien beimpft. Die Inkubation erfolgt etwa bei 25 bis 35 0C und dauert 2 bis 8 Tage,
Bei der Enzymproduktion im Submersverfahren wird von einer Kulturenkonserve ausgegangen, wobei auf Weiζenkleie-Grünmehl oder Bierwürzeagar geimpft wird·
Nach einer Inkubation von 5 - 14 Tagen bei 25 - 35 0C wird nochmals auf die gleichen Medien abgeimpft und in gleicher Y/eise kultiviert·
Mit Sporenmycel-Gemisch wird die nachfolgende Inokulumstufe beimp (1. Vorkultur). MLt dieser ersten Vorkultur werden je nach Bedarf und Größe des Produktionsumfanges weitere Propagationsstufen (Vorkulturen) angelegt» Die Vorkulturen dienen zur Beimpfung des Produkt ionsmediums· Die erforderliche Impfmenge beläuft sich auf 0,5bis 10 %, wobei sich das Impfmaterial in der logarithmisch Y/achstümspliase befinden muß* Die Zusammensetzung der nährlösung für die Impfstufen und das Produktionsmedium sind gleich· Sie ent halten Zellulose, Grünmehl und anorganische Salze, gegebenenfalls zusätzlichoC- und ß-G-lucoside# ,
Die Enzymproduktion erfolgt entweder in Schuttelkolben, im halb- oder großtechnischen Maßstab· Die großtechnische Produktion erfol, in Tanks .mit Zwangsbelüftung und Rührung unter sterilen Bedingung Zur Bekämpfung der Schaumbildung während der Permentation werden pflanzliche oder tierische Pette und Öle oder Öle auf Silikonbasi eingesetzt.
Die Permentation ist beendet, wenn das Mycel in Autolyse übergegangen ist und/oder die Enzymaktivitäten ihre Endwerte erreicht haben·
Die lifcel- und Hährbodenbestandteile werden von der Kulturlösung abgetrennt» Aus dem Filtrat oder Zentrifugat wird in üblicher Weise entweder durch Einengen im Vakuum ein Konzentrat oder durch Pällung mit anorganischen Salzen, organischen Lösungsmitteln, durch Gefriertrocknung oder Sprühtrocknung ein festes Präparat hergestellt.
Auf Grund der hohen Aktivitäten an C.- und G -cellulolytischen Enzymen sowie ß-Glucosidasen ist es möglich, natürliche, zellulosehaltige Ausgaisgsmaterialien zu spalten»
Die Erfindung soll anhand von Beispielen näher erläutert werden: Beispiel 1 .·.... . - -
Zur Herstellung von Zellulose-, hemizellulose- und ß-giucosidespaltenden Snsymen im Labormaßstab werden Sporen bzw. das Sporen·*· . Mycel-G-emisch aus der Konserve (1/3 Luvos-Heilerde II, 1/3 Seesanc 1/3 Aktivkohle) oder einer Würzeagar-Erhaltungslcultur (2 % xmgehoi Würze, 2 % Agar, pH 5,6) auf vVeizenkleie-Grünmehl- oder Bierwürze-Agar überimpft* (Zusammensetzung des Weisenkleis-Grünmehlagara;
0,5 % Y/eizenkleie, 0,5 % Grünmehl, 2,5 % Agar in Leitungswasser)« Hach einer Inkubation von ",etwa 6 - 14 Tagen wird eine Öse Sporenmycel-Gemiseh in 100 ml Produktionsmedium eingeimpft« Di.eses hat folgende Zusammensetzung:.
0,5 % Zellulose, 1,0 % Grünmehl, alkalisch aufgeschlossen, 0,2 % M4 H2 PO4, 0,1 % K H2PO4, 0,05 % Mg SO4 · 7 H3O, Leitungswasser, pH 5,2-5,6«
Es wird auf einer Fanal-Schüttelmaschine 4-6 Tage bei einer Temperatur von 30 0C - 2 0C geschüttelt, dann wird abfiltriert.
und das Filtrat im Vakuum bei 25 - 50 0C auf etwa 1/10 eingeengt·
Folgende Aktivitäten wurden erreicht:
C1 - Aktivität: 60 - 80 E/ml KF
Cx - Aktivität: 50 - 70 g CMC/ml KF (spez. Abbau)
Cellobiase - Aktivität: 125 - 250 mU/ml KF
Xylanase τ Aktivität: 5?0 - 6,0 iag GluMosegleichwerte/ml KF
Lichenase - Aktivität: 4,5 - 5,5 mg Glukosegleichwerte/ml KF
Die Bestimmungen der Enzymaktivitäten wurden wie folgt durchgeführt:
C1-Aktivität:
Bestimmung in Anlehnung an die Filterpapiermethode nach KITAICEKADO und TOYAiIA (Hakko, Kogaku, Zasski 4J), 85 (1962) und ref« C»A· β£, 1900 (1965) unter Verwendung von FI\L-Chroraatografiepapier (Filtrak, Niederschlag) als Substrat:
Zur Ermittlung der Aktivität in Flüssigpräparaten oder Kulturlösungen wird 1 ml der Enzymlösung in 4 ml Puffer gegeben (Phosphat-Puffer nach SÖREUSEH pH 5,2) und mit 1 Stück Filterpapier von 1,5 x 1,5 cm Kantenlänge beschickt· Auf einer Schüttelmaschine (Universalschüttelmaschine Thys 1, VEB Labortechnik Ilmenau werden die Proben bei einer Schüttelfrequenz von 120 Schwingungen/Mi und einer Amplitude von 2 cm bei 38 0C im Brutschrank oder Thermoraum geschüttelt· Die Zeit, welche die völlige Zerstörung des Filterpapiers angibt, wird vermerkt.
Cx-(CMC)-Aktivität: :
Die Bestimmung der C -Aktivität erfolgt durch Messung des Viskositätsabfalles der Ka-Carboxymethylcellulose* Die C -Aktivität in
Enzympräparat en wird ausgedrückt als die Menge Ha-CMG in einer 'Untersuchungslösung, welche unter bestimmten Bedingungen durch 1 g oder 1 ml Enzym zu einem 75·, $5igen Viskositätsabfall der Aus· gangs viskosität geführt hat. Die Messung wird im Ubbelohde-Viski meter 1 durchgeführt·
Cellobiase-Aktlvität: . ·
Diese Aktivität wird durch Abbgtu von Cellobiose zu Glukose mit Hilfe des Fermognostbesteckes des AWD Dresden bestimmt. Hierbei wird die Glukose durch die Glukoseoxydase-Reaktion ermittelt.
Hemiceliulase-Äktivität
Bs wird der Abbau von Hemicellulasesubstraten (z.B* Xylan) durcl Bestimmung, der reduzierenden Zucker mit Hilfe der Dinitrosalicyl säüremethode nach 'SUMMER (J. biol. Chemistry 4£, 5 (1921) bestir
Beispiel 2 ·
Zur Herstellung von Zellulose-, hemizellulose- und ß-glucosidespaltenden ^zjiaen im großtechnischen Maßstab wird von der im Beispiel 1 dargestellten Weizenkleie-Grünmehl- oder Bierwürzeagarkultur ausgegangen·
Mit dem Sporen-llycelgemisch dieser Stufe wird die 1. Vorkultur (1 öse in 100 ral nährlösung) beimpft·
Die beimpfte Kaitür18sung: 0,5 % Zellulose, 1,0 % alkalisch aufgeschlossenes Grünmehl, 0,2 % TM, H2SO., 0,2 % KH9PO4, 0,05 % MgSO, · 7 H2O wird in Kolben auf Schüttelmaschinen bei 30 0C - 2 0C inkubiert. Der pH-Wert vor dem Beimpfen wird auf 4,0 - 5,6 eingestellt, liach 1β bis 24-stünaiger Kultur wird das Mycel zur weiteren Vermehrung unter sterilen Bedingungen zur 2a Vorkulttir überimpft· Die Vermehrung dieser Stufe erfolgt in 200 1 großen Impftanks aus nichtrostendem Stahl. In den Tanks werden 120 1 lährlösung mit gle'ieher Zusammensetzung wie bei der 1· Vorkultur zubereitet, sterilisiert und beimpft· Die Impfmenge aus der 1* Vorkultur beträgt 1,2 bis 6 1 * 16 - 2^ Stunden nach Inkubationsbeginn wird mit dem Material der 2· Vor-
kultür die.Nährlösung in-einem. 12 000 -1- Tank aus nichtrostendem Stahl beimpft. Zusammensetzung und pH-Wert der Nährlösung sind ebenso wie bei der 1. Vorkultur· Die Tankausrüstung entspricht der klassischen Antibiotika-Batch-Kul tür· Der Tankinhalt beträgt 9000 1 und wird mit 100 bis 500 1 der 2· Yorkultur beimpft. Während der Kulturdauer von 96 bis 144"Stunden (je nach Beimpfungsmenge und angestrebter Kulturdauer) wird im Verhältnis 0,3 - 0,5 : 1/Min·; d, h· 0,3 - 0»5 m3 sterile Luft auf 1 m? Kl/Min· belüftet.
Die Schaumbekämpfung erfolgt mit pflanzlichen Ölen (Rapsöl) oder mit Ölen auf Silikonbasis.
Die Fermentation wird beendet, nachdem das lycel teilweise in Lyse übergegangen ist. Der End-pH-Wert beträgt 4,0 bis 4,5· Das lycel wird durch Separation von der Flüssigkeit getrennt. Das Filtrat wird in einem Vakuum-Umlauf verdampf er auf etwa 1/10 des Ausgangsvolumens bei 30 0C eingeengt»
Die Enzymaktivitäten des Konzentrates betragen:
C1 - Aktivität: 180 - 220 E/ml
C ·- Aktivität: 400 - 600 g CMC/ml (spez. Abbau) Cellobiase - Aktivität: 500 - 700 mU/ml
lylanase - Aktivität: 50 - 55 mg Glukosegleichwerte/ml Lichenase - Aktivität: 50 - 60 mg Glukosegleichwerte/ml
Sei der Rückverdünnung des Konzentrates zeigt sich ein maximaler Aktivitätsverlust von 10 - 20 %»
Aus dem Konzentrat kann anschließend die Fällung des Enzymkomplexes nach bekannten Methoden, .wie beispielsweise mit HH.-Salzen, Aceton oder Tannin vorgenommen werden.
Claims (3)
1· Verfahren zur biotechnischen Herstellung von Cellulasen, Hemicellulasen und ß-Glucosidasen im Einers- oder Subinersverfahren mittels eines Stammes der Gattung Penicillium citreovirideä dadurch gekennzeichnet, daß ein auf zellulosehaltigen Substraten= und durch Klonselektion ausgewählter Stamm var· parvocitreo sowie seiner daraus entstehenden genetischen Varianten in.einem Medium mit Zellulose mit oder ohne Grünmehl bzv?# allein Verwendung findet«
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß durch jeweiligen Zusatz voncC- und/cder ß-glukosidisch gebundenen Kohlenhydraten eine Steigerung spezieller cellulolytischer, hemicelluloIytischer und Cellobiaseaktivitäten erreicht wird.
3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß mit Hilfe seiner Enzymaktivitäten, die während seiner Kultivierung entstehen, zellulosehaltige Substrate aufgeschlossen werden, die zur eigenen Biomassebildung oder zur Biomassebildung anderer Mikroorganismen dienen·. · *'.. ;
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD18940375A DD145028A3 (de) | 1975-11-12 | 1975-11-12 | Verfahren zur biotechnischen herst llung von cellulasen,hemicellulasen und beta-glucosidas n |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DD18940375A DD145028A3 (de) | 1975-11-12 | 1975-11-12 | Verfahren zur biotechnischen herst llung von cellulasen,hemicellulasen und beta-glucosidas n |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| DD145028A3 true DD145028A3 (de) | 1980-11-19 |
Family
ID=5502348
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| DD18940375A DD145028A3 (de) | 1975-11-12 | 1975-11-12 | Verfahren zur biotechnischen herst llung von cellulasen,hemicellulasen und beta-glucosidas n |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| DD (1) | DD145028A3 (de) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003060104A3 (en) * | 2002-01-04 | 2003-12-24 | Procter & Gamble | Cellulose-active microorganisms |
-
1975
- 1975-11-12 DD DD18940375A patent/DD145028A3/de unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2003060104A3 (en) * | 2002-01-04 | 2003-12-24 | Procter & Gamble | Cellulose-active microorganisms |
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