CZ67694A3 - MUTEIN OF HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF-a), PROCESS OF ITS PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED THEREON - Google Patents
MUTEIN OF HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF-a), PROCESS OF ITS PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED THEREON Download PDFInfo
- Publication number
- CZ67694A3 CZ67694A3 CZ94676A CZ67694A CZ67694A3 CZ 67694 A3 CZ67694 A3 CZ 67694A3 CZ 94676 A CZ94676 A CZ 94676A CZ 67694 A CZ67694 A CZ 67694A CZ 67694 A3 CZ67694 A3 CZ 67694A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- tnf
- human
- wild
- muteins
- mutein
- Prior art date
Links
- 101000611183 Homo sapiens Tumor necrosis factor Proteins 0.000 title claims abstract description 99
- 102000057041 human TNF Human genes 0.000 title claims abstract description 75
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 title claims description 46
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 38
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title claims description 8
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 6
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 title description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims abstract description 35
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 32
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 claims description 40
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 claims description 32
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 claims description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 18
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 11
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 4
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 claims description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 claims description 2
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 2
- 102220482769 Mitochondrial coenzyme A diphosphatase NUDT8_K65A_mutation Human genes 0.000 claims 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 claims 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 abstract description 5
- 230000006870 function Effects 0.000 abstract description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 39
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 28
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 24
- 102100040247 Tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 23
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 20
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 19
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 16
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 15
- 102100033733 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Human genes 0.000 description 14
- 101710187830 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1B Proteins 0.000 description 14
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 14
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 14
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 12
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 11
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 11
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 9
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 8
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 7
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 7
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 7
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 7
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 6
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 6
- 102000004083 Lymphotoxin-alpha Human genes 0.000 description 6
- 108090000542 Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 6
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 5
- 125000003412 L-alanyl group Chemical group [H]N([H])[C@@](C([H])([H])[H])(C(=O)[*])[H] 0.000 description 5
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 5
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 5
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 5
- SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 2-(N-morpholiniumyl)ethanesulfonate Chemical compound [O-]S(=O)(=O)CC[NH+]1CCOCC1 SXGZJKUKBWWHRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010054278 Lac Repressors Proteins 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102220582710 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1_N34Y_mutation Human genes 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 4
- 230000009137 competitive binding Effects 0.000 description 4
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 4
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 238000000159 protein binding assay Methods 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 102200083954 rs1805063 Human genes 0.000 description 4
- 102220065574 rs786205361 Human genes 0.000 description 4
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 241001596967 Escherichia coli M15 Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 125000000570 L-alpha-aspartyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[C@]([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 102220528583 Ribonuclease P/MRP protein subunit POP5_K65A_mutation Human genes 0.000 description 3
- 102220644123 Thioredoxin-related transmembrane protein 1_Q67K_mutation Human genes 0.000 description 3
- 102100033732 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 1A Human genes 0.000 description 3
- 206010054094 Tumour necrosis Diseases 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000000556 agonist Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 3
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000002287 radioligand Substances 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102200002697 rs1154510 Human genes 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 231100000057 systemic toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 3
- FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 1,3,4,6-tetrachloro-3a,6a-diphenylimidazo[4,5-d]imidazole-2,5-dione Chemical compound ClN1C(=O)N(Cl)C2(C=3C=CC=CC=3)N(Cl)C(=O)N(Cl)C12C1=CC=CC=C1 FJQZXCPWAGYPSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010006895 Cachexia Diseases 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- 125000003440 L-leucyl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])C(C([H])([H])[H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 125000002842 L-seryl group Chemical group O=C([*])[C@](N([H])[H])([H])C([H])([H])O[H] 0.000 description 2
- 206010027202 Meningitis bacterial Diseases 0.000 description 2
- 102220540461 Mitogen-activated protein kinase kinase kinase 10_Q21S_mutation Human genes 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 2
- 241000157426 Pernis Species 0.000 description 2
- 102220604901 Protein Lines homolog 1_H73Q_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220528571 Ribonuclease P/MRP protein subunit POP5_S99A_mutation Human genes 0.000 description 2
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 2
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 2
- 102220582684 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1_N34I_mutation Human genes 0.000 description 2
- 102220582711 Solute carrier family 2, facilitated glucose transporter member 1_N34S_mutation Human genes 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N Uracil Chemical group O=C1C=CNC(=O)N1 ISAKRJDGNUQOIC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 201000009904 bacterial meningitis Diseases 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 239000002962 chemical mutagen Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000012875 competitive assay Methods 0.000 description 2
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 230000000869 mutational effect Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 102200058904 rs149170494 Human genes 0.000 description 2
- 102220074273 rs180177192 Human genes 0.000 description 2
- 102220306159 rs185266383 Human genes 0.000 description 2
- 102220048271 rs587784390 Human genes 0.000 description 2
- 102200015515 rs797045155 Human genes 0.000 description 2
- 102200091604 rs863225072 Human genes 0.000 description 2
- 102220285812 rs905812561 Human genes 0.000 description 2
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000006433 tumor necrosis factor production Effects 0.000 description 2
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- JJGRJMKUOYXZRA-LPEHRKFASA-N Asn-Arg-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N)C(=O)O JJGRJMKUOYXZRA-LPEHRKFASA-N 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 208000031729 Bacteremia Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M Bisulfite Chemical compound OS([O-])=O LSNNMFCWUKXFEE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000006386 Bone Resorption Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- ZVNFONSZVUBRAV-CIUDSAMLSA-N Cys-Gln-Arg Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)N)CN=C(N)N ZVNFONSZVUBRAV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 1
- 241000724791 Filamentous phage Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 229920000084 Gum arabic Polymers 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102000006496 Immunoglobulin Heavy Chains Human genes 0.000 description 1
- 108010019476 Immunoglobulin Heavy Chains Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 206010022489 Insulin Resistance Diseases 0.000 description 1
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 1
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- HHSJMSCOLJVTCX-ZDLURKLDSA-N L-Glutaminyl-L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O HHSJMSCOLJVTCX-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000769 L-threonyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])[C@](O[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 125000003798 L-tyrosyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C1=C([H])C([H])=C(O[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 125000003580 L-valyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(C([H])([H])[H])(C([H])([H])[H])[H] 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 1
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 1
- 101100046526 Mus musculus Tnf gene Proteins 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 206010028851 Necrosis Diseases 0.000 description 1
- 239000004264 Petrolatum Substances 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 235000008331 Pinus X rigitaeda Nutrition 0.000 description 1
- 235000011613 Pinus brutia Nutrition 0.000 description 1
- 241000018646 Pinus brutia Species 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920002873 Polyethylenimine Polymers 0.000 description 1
- 102220470796 Protein MON2 homolog_S36D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220468698 Protein arginine N-methyltransferase 3_Y87E_mutation Human genes 0.000 description 1
- 102220468699 Protein arginine N-methyltransferase 3_Y87F_mutation Human genes 0.000 description 1
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 1
- 102220553420 Ral guanine nucleotide dissociation stimulator-like 2_S86D_mutation Human genes 0.000 description 1
- 206010063837 Reperfusion injury Diseases 0.000 description 1
- 108010034634 Repressor Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000009661 Repressor Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M Sodium bisulfite Chemical compound [Na+].OS([O-])=O DWAQJAXMDSEUJJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150033527 TNF gene Proteins 0.000 description 1
- 241000589500 Thermus aquaticus Species 0.000 description 1
- OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N Tyr-Phe-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OKDNSNWJEXAMSU-IRXDYDNUSA-N 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N ac1ldcw0 Chemical compound Cl.C1CN(C)CCN1C1=C(F)C=C2C(=O)C(C(O)=O)=CN3CCSC1=C32 LPQOADBMXVRBNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000205 acacia gum Substances 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 210000001789 adipocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 230000003579 anti-obesity Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N benzamidine Chemical compound NC(=N)C1=CC=CC=C1 PXXJHWLDUBFPOL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008827 biological function Effects 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000001815 biotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000024279 bone resorption Effects 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012876 carrier material Substances 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000013522 chelant Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 235000008504 concentrate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001351 cycling effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical group NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 1
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 1
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 230000009931 harmful effect Effects 0.000 description 1
- 230000011132 hemopoiesis Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000003284 homeostatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000014726 immortalization of host cell Effects 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000003978 infusion fluid Substances 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 1
- 125000001449 isopropyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 1
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 1
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 1
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 231100001231 less toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 1
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 1
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 239000003471 mutagenic agent Substances 0.000 description 1
- 231100000707 mutagenic chemical Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 1
- 230000010807 negative regulation of binding Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N nitrilotriacetic acid Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CC(O)=O MGFYIUFZLHCRTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 1
- 210000002997 osteoclast Anatomy 0.000 description 1
- 239000006201 parenteral dosage form Substances 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 229940066842 petrolatum Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000006187 pill Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 230000004983 pleiotropic effect Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001515 polyalkylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000036515 potency Effects 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002062 proliferating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 1
- 102220008913 rs33960103 Human genes 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000010267 sodium hydrogen sulphite Nutrition 0.000 description 1
- 239000008247 solid mixture Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000008174 sterile solution Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 238000009210 therapy by ultrasound Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940046728 tumor necrosis factor alpha inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000002451 tumor necrosis factor inhibitor Substances 0.000 description 1
- 208000001072 type 2 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/525—Tumour necrosis factor [TNF]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Mutein humánního faktoru-α nekróžy nádorů '(TNF-α), způsob jeho výroby a farmaceutický přípravek na jeho baží
Oblast techniky
Vynález se týká muteinu humánního faktoru-α nekrózv nádorů, způsobu jeho výroby a farmaceutického .přípravku na jeho bázi. Dále se vynález týká sekvence DNA kódující tento mutein, vektoru obsahujícího tuto sekvenci DNA, hostitelské buňky obsahující tento vektor, sekvence RNA, která je komplementární k výše uvedené sekvenci DNA a výše uvedeného muteinu pro použití při , chirurgickém nebo léčebném ošetření lidského nebo zvířecího těla nebo při diagnostické metodě.
Dosavadní stav techniky
Faktor nekrózy nádorů, nebo konkrétněji faktor a nekrózy nádorů [pro jednoduchost se v tomto popisu a nárocích pod označením faktor nekrózy nádorů (zkráceně TNF) rozumí vždy TNF-α, pokud není uvedeno jinak] je cytokin, který je především produkován stimulovanými makrofágy. Vykazuje nejen pozoruhodnou cytotoxicitu proti různým nádorovým buňkám [Carswell a další, Procd. Nat. Acad. Sci., USA 72, 3666 až 3670, ( 1975) 1, ale hraje i několikanásobnou roli jako mediátor zánětů a imunitní odpovědi [přehled viz v publikacích Beutler a Cerami, Ann. Rev. Immunol. 7, 625 až 655 (1989); Bonavista a Granger (red.) Tumor Necrosis Factor: Structure, Mechanism of Action, Role in Disease and Therapy, Karger, Basilej (1990)]. Primární struktura humánního faktoru a nekrózy nádorů (hTNF-α) byla dedukována z nukleotidové sekvence cDNA, která byla klonována a exprimována v E. coli [Pennica a další, Nátuře 312, 724 až 729 (1984); KarmenoUt a další Europ. J. Biochem. 152, 515 až .· w-AV-t-v·· .·;> i.ό: ϊ · ;í o - v
*' >
522 (1985); Wang a další, Science 228, 149 až 154 (1985);
Shirai a další, Nátuře 313, 803 až 806 (1985)]. Byla zjištěna nápadná homologie sekvence aminokyselin (30 %) mezi hTNF-α. a humánním lymfotoxinem, který bývá často označován jako humánní faktor β nekrózy nádorů (hTNF-β), což je cytokin, který je zejména produkován aktivovanými lymfocyty [Gray a další, Nátuře 312, 721 až 724 (1984 ); Fiers a další, Cold Spring Harbour Symp. 51, 587 až 595 (1986)].
hTNF-α s modifikovanými sekvencemi aminokyselin, tzv. hTNF-a-muteiny byly také popsány v různých publikacích, například v Yamagishi a další Protein Engineering 3, 713 až 719 (1990); Fiers v Tumor Necrosis Factors: Structure, Function and Mechanisms of Action; Fiers a další v Bonavista a Granger, str. 77 až 81 (viz výše); Goh a další, (1991), Structural and functional domains in human tumor necrosis factors. Prot. Engineering 4: 385 až 389;
Kircheis a další, (1992), Biological activity of mutants of human tumor necrosis factor-alpna, Immunology 76: 433 až 43.8; Van Ostade a další, (1991), Localization of the active site of human tumor necrosis factor (hTNF) by mutational analyses, EMBO J. 10: 827 až 836; Van Ostade a další, (1993), Human TNF mutants with selective activity on the p55 receptor, Nátuře 361: 266 až 269; Zhang a další, ( 1992 ) , Site-directed mutational analysis of human tumor necrosis factor-α receptor binding site and structurefunctional relationship, J. Biol. Chem. 267: 24069 až 24075; a Ito a další, (1991), Novel muteins of human tumor necrosis factor alpha, Biochim. Biophys ·. Acta .1096: 245 až
252. TNF-a-muteiny se staly také předmětem několika patentových přihlášek, například mezinárodních patentových přihlášek, publikovaných pod čísly WO 86/02381, WO 86/04606, WO 88/06625, Evropských patentových přihlášek, publikovaných pod čísly 155 549, 158 286, 168 214, 251 037 a 340 333 a německé zveřejněné patentové přihlášky DE-OS 3 843 534.
V dosavadním stavu techniky jsou také popsány muteiny lymfotoxinu, například v Evropských patentových přihláškách, publikovaných pod čísly 250 000, 314 094 a 336 383, jakož i v následujících dvou publikacích: Goh a další, (1991), Aspartic acid 50 and tyrosine 108 are essential for receptor binding and cytotoxic activity of tumor necrosis factor beta (lymphotoxin), Prot. Engineering 4: 785 až 791 a Wakabayashi a další, (1990), Deletion of lysině 89 ehnances the cytotoxicity and the receptor binding affinity of human lymphotoxin, J. Biol. Chem. 265: 7604 až 7609.
Biologické účinky TNF jsou zprostředkovány přes specifické receptory, totiž receptor se zdánlivou relativní molekulovou hmotností 55 kD, podle elektroforézy na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE) (p55-TNF-R) a receptor se zdánlivou relativní molekulovou hmotností 75 kD na SDS-PAGE (p75-TNF-R). Obě formy
TNF-receptorů byly klonovány. p55-TNF-R byl klonován
Loetscherem a dalšími [Cell 61, 351 až 359, (1990) a
P75-TNF-R, například Dembicem a dalšími [Cytokine 2, 53 až
58, (1990)] (oba receptory jsou též popsány v Evropské patentové přihlášce č. 900116707.2) a později se zjistilo, že oba receptory s vysokou afinitou nevážou pouze TNF-α, ale také TNF-β [Schónfeld a další, J. Biol. Chem. 266, 3863 až 3869 (1991)].
Je dobře známo v tomto oboru, že na základě biologických účinností může být TNF-α cennou sloučeninou pro léčbu různých poruch. Tak například, TNF-α samotný, nebo v kombinaci s interferonem, může být účinným protinádorovým činidlem [ Brouckaert a další, Int. J. Cancer 38, 763 až 769
(1986)1. Jeho širšímu terapeutickému využití však brání zejména jeho systemická toxicita [Taguchi T. a Sohmura Y., Biotherapy 3, 177 až 186 (1991)).
hTNF-α a mTNF-α se vážou s téměř stejnou afinitou k humánnímu p55-TNF-R a k humánnímu p75-TNF-R. Ukázalo se však, že u myší se humánní TNF-α (hTNF-a) váže pouze k menšímu myšímu receptoru TNF (murinní p55-TNF-R) . U myší je hTNF-a mnohem méně toxický než murinní TNF-a (mTNF-α), který se váže k oběma myším receptorům p55-TNF-R a p75-TNF-R. Tak například, u myší C57B16 činí hodnota LD5Q přibližně 10 μ9/ιηγΞ u mTNF-α a 500 μ9/πιγέ u hTNF-α [Brouckaert a další, Agents and Actions 26, 196 až 198 (1989); Everaerdt B. a další Biochem. Biophys. Res. Comm. 163, 378 až 385 (1989); Lewis M. a další, Proč. Nati. Acad. Sci. USA 88, 2830 (1991)]; Brouckaert, P., Libert, C., Everaerdt, B. a Fiers, W. (1992), Selective species specificity of tumor necrosis factor for toxicity in the mouše., Lymphokine Cytokine Res. 11, 193 až 196). Zdá se tedy, že p75-TNF-R hraje zvláštní úlohu při systemické toxicitě.
Také bylo oznámeno, že proliferativní signály mohou být zprostředkovány humánním p75-TNF-R v humánních T lymfocytech (C-ehr a další, J. Immunol. 149, 911, 1992 ; Tartaglia a další, Proč. Nati. Acad.. Sci. USA, 88, 9292, 1991 ).
Muteiny humánního faktoru nekrózy nádorů, které vykazují podstatný rozdíl mezi svou vazebnou afinitou k humánnímu receptoru p75 faktoru nekrózy nádorů (hp75-TNF-R) a k humánnímu receptoru p55 faktoru nekrózy nádorů (hp55-TNF-R), jsou popsány v Evropské patentové přihlášce, publikované pod č. 486 908. Jsou zde popsány hTNF-muteiny, které si zachovaly vazebnou aktivitu k hp55-TNF-R, ale ztratily téměř schopnost vazby k hp75-TNF-R.
Podstata vynalezu
Předmětem vynálezu je mutein humánního faktoru nekrózy nádorů, který vykazuje vyšší vazebnou afinitu k humánnímu receptorů p75 faktoru nekrózy nádorů (hp75-TNF~R) než k humánnímu receptorů p55 faktoru nekrózy nádorů (hp55-TNF-R). Do rozsahu pojmu mutein humánního faktoru nekrózy nádorů se v tomto popisu zahrnují též farmaceuticky vhodné soli muteinu faktoru nekrózy nádorů.
Sekvence aminokyselin hTNF-α (divokého typu), jak byla publikovaná ve následuj ící:
VAL VAL A.LA A.SN ?RO
0
ASM GLN LEU VAL VAL clN LEU W
0
VAL ASN LEU LEU SER
110
PRO GLU GLY ALA GLU
GLY GLY VAL ?HE GLN
140 ile'asn ARG PRO AS?
TYR PHE GLY ILE ILE výše uvedene citaci
2. u
Pennica a další, je
LYS RRO VAL ALA HIS
LEU GLN TR? LEU ASN
V.AL GLU LEU A.RG AS?
SER TYR GLN THR LY
CYS GLN ARG GLU THR
120
GLU RRO ILE TYR LEU
-, n 2. _· o
GLU SER GLY GLN VAL o fť, :u o tn
157 A L A L r. ϋ
Tuto sekvenci zveřejnili také Marmenout a další (viz výše), Wang a další (viz výše) a Shirai a další a konkrétněji je pro maturovaný TNF-α kódována nukleotidovou sekvencí vloženého plasmidu pDS5b/'R8SII, SphI-TNF-α (SEQ ID No. 1; viz obr. la a lb a příklad I; nebo obr. 3bl-3b3 EP 486 908).
Před vyvinutím tohoto vynálezu nic neukazovalo na to, že by bylo možno vyrobit hTNF-muteiny, které by se selektivně vázaly k hp75TNF-R. Muteinů podle tohoto vynálezu se může s výhodou používat pro charakterizaci hp75TNF-R a rovněž vykazují potenciální užitečné aplikace v diagnostice a léčení, jak je to popsáno dále.
Přednostně obsahují tyto muteiny přinejmenším jednu změnu aminokyseliny, vzhledem k hTNF-α divokého typu, v poloze, která odpovídá poloze 33, 34, 65, 67, 75, 143,
145 a/nebo 147 v sekvenci divokého typu, při počítání od N-terminální aminokyseliny. Výraz která odpovídá naznačuje, že muteiny podle tohoto vynálezu nemusí být přísně homologické s hTNF-α divokého typu v jiných polohách, než jsou polohy uvedené výše, poněvadž v těchto polohách mohou být, vzhledem k sekvenci aminokyselin divokého typu, přítomny delece, inserce nebo substituce, za předpokladu, že nemají podstatný vliv na vazebnou afinitu k hp75TNF-R.
Substituce aminokyselin v proteinech a polypeptidech, které podstatně nemění jejich biologickou aktivitu, jsou známy v tomto oboru a popsány například v H. Neurath a R. L. Hill, The Proteins, Academie Press, New York (1979), viz zejména obr. 6 na straně 14. Nejčastěji pozorované aminokyselinové substituce jsou: Ala/Ser,
Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn,
Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn,
Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, Asp/Gly a naopak.
Muteiny podle vynálezu přednostně obsahují přinejmenším jednu z dále uvedených změn aminokyselin v poloze, která odpovídá poloze označené v sekvenci divokého typu:
A33T
K65A
K65W
Q67K
Q67T
Q67Y
L75H
L75W
D143N
D143E
D143F
D143W
D143Y
Dl 43 V
D143V - F144L - A145S D143N - A145R D143V - A145S A145R
Podle teto nomenklatury písmena předstat^u j í aminokyseliny a používá se jich v souladu s jednopísměnovým kódem aminokyselin. Pomlček se používá pro oddělení změn aminokyselin, pokud jsou přítomny ve více než jedné poloze. U každé uvedené změny aminokyseliny představuje první písmeno aminokyselinu v hTNF-α divokého typu, zatímco druhé písmeno označuje odpovídající aminokyselinu v muteinu. Použitá čísla označují polohy v sekvenci divokého typu, v nichž se vyskytuje změna aminokyseliny.
Z výše uvedených variant se dává přednost variantám uvedeným dále, u nichž byla zjištěna obzvláště dobrá vazebná selektivita pro hp75TNF-R.
K65W
DI43N
D143E
D143F
D143W
D143Y
Dl 43 V
D143V - F144L - A145S
D143N - A145R .
D143V - A145S
A145R
A145H
A145K
A145F
A145W
A145Y
Obzvláštní přednost se dává těmto variantám:
D143N
D143E
D143F
D143W
D143Y
D143V
D143V - F144L - A145S
D143N - A145R
D143V - A145S
A145R
A145K
A145F
A145W
A145Y
Je pozoruhodné, že všechny tyto posledně uvedené alternativy vykazují změny aminokyselin v polohách, které odpovídají polohám 143 a/nebo 145 sekvence divokého typu. Změnám v těchto polohách se proto dává přednost.
hTNF muteiny podle tohoto vynálezu mohou přídavně obsahovat sekvence několika aminokyselin, které jsou kódovány sekvencemi linkeru. Tyto sekvence mohou vzniknout z expresních vektorů, použitých pro expresi hTNF muteinů, popsaných výše.
hTNF muteiny podle tohoto vynálezu mohou také obsahovat specifické sekvence, které se vážou s vysokou selektivitou k afinitnímu nosičovému materiálu, což usnadňuje purifikaci. Jako příklady takových sekvencí je možno uvést sekvence obsahující alespoň dva sousední histidinové zbytky (viz Evropská patentová přihláška, publikovaná pod číslem 282042). Tyto sekvence se selektivně vážou k pryskyřicím s niklovým chelátem nitrilotrioctové kyseliny (Hochuli a Dóbeli, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 363,
748 (1987); Evropská patentová přihláška, publikovaná pod číslem 253303). hTNF, které obsahují takovou specifickou sekvenci, mohou být vázány buď k C-konci, nebo N-konci, nebo obou těmto koncům aminokyselinové sekvence hTNF muteinu.
hTNF muteiny podle tohoto vynálezu je také možno spojovat s různými těžkými řetězci imunoglobulinu nebo lehkými řetězci polypeptidů. Tak vznikají chimérické hTNF mutein-imunoglobulinové polypeptidy, které by mohly mít zvýšený poločas životnosti in vivo. Zvýšený poločas životnosti in vivo byl například demonstrován u chimérických polypeptidů, které se skládají z prvních dvou domén konstantních oblastí těžkého řetězce nebo lehkého řetězce savčího imunoglubulinu (viz Traunecker a další, Nátuře 331, 84 až 86 [1988 ] a Evropská patentová přihláška, publikovaná pod číslem 394827). Jsou také možné chimérické proteiny muteinů hTNF fúzované s jakoukoliv jinou peptidovou sekvencí.
hTNF muteiny je také možno spojovat s polymery, například polyethylenglykolem nebo polypropylenglykolem o molekulové hmotnosti 500 až 20 000 Dalton (pegylované hTNF-muteiny) . To vede k chráněným hTNF muteinovým látkám, které by mohly být v podstatě neimunogenní. K dispozici je a bylo popsáno několik způsobů spojování polymeru s polypeptidem (viz například US patent. 4 179 337. Do rozsahu tohoto vynálezu v důsledku toho spadají i pegylované hTNF-muteiny nebo jejich farmaceuticky vhodné soli.
hTNF muteiny podle tohoto vynálezu je možno vyrábět postupy, které jsou o sobě známé v tomto oboru a které jsou například popsány v Sambrook a další [Molecular Cloning,
A Laboratory Manual, druhé vydání, Cold Spring Harbour
Laboratory, Cold Spring Harbour Laboratory Press, USA (1939)] nebo například v následujících odstavcích. Zda hTNF muteiny ještě vykazují selektivní vazebnou afinitu vůči p75-TNF-R, lze zjistit způsobem popsaným v následujících příkladech. Alternativně je také možno hTNF muteiny podle tohoto vynálezu chemicky syntetizovat standardními postupy, které jsou známé v tomto oboru, přednostně postupy v tuhém stavu, jako jsou postupy popsané v Merrifield (J. Am. Chem. Soc. 85, 2149 až 2154 [1963]). Předmětem vynálezu jsou také farmaceuticky vhodné soli těchto muteinů. Tyto soli je možno vyrábět o sobě známými způsoby.
Předpokládá se, že strategie, která spočívá v odříznutí prospěšných účinností TNF-α od nežádoucích účinností, za použití sloučenin, které se specificky vážou k jednomu nebo druhému TNF-receptoru, jako jsou hTNF muteiny podle tohoto vynálezu, je možno použít obecné u chorobných stavů, při nichž hraje TNF svou roli.
Předmětem vynálezu jsou také sekvence DNA, kódující výše popsané hTNF muteiny. Kromě toho, že tyto sekvence DNA představují meziprodukty pro získání muteinů podle tohoto vynálezu, může se jich použít (včetně jejich fragmentů) v genové terapii, při níž se existující gen modifikuje, za účelem dosažení prospěšných účinků. Těchto sekvencí (nebo jejich fragmentů) je také možno použít jako pozitivního DNA-řetězce, za účelem regulace exprese genu prostřednictvím vazby ke komplementárním mRNA-sekvencím.
Tyto sekvence DNA je možno zkonstruovat z výchozích genomových nebo cDNA-sekvencí, kódujících hTNF, jak je to posáno v dosavadním stavu techniky (viz výše), za použití známých metod nebo mutagenese in vitro (viz například Sambrook a další, 1989). RNA-sekvence, které jsou komplementární k DNA-sekvencím podle tohoto vynálezu, rovněž spadají do rozsahu tohoto vynálezu a může se jich například použít při přípravě cDNA-sekvencí.
Tato mutagenese se může provádět náhodně, za účelem získání velkého počtu mutantů, které lze potom zkoušet na požadované vlastnosti, za použití vhodných zkušebných systémů nebo místně orientovanou mutagenesí, za účelem mutace definovaných poloh dané sekvence DNA [viz například Sambrook a další, 1989, 15.51-15.113] nebo mutagenesí za použití řetězové reakce probíhající v přítomnosti polymerasy (viz například White a další, Trends in Genetics 5, 185 až 189 [1989]).
Jedním z chemických mutagenů, kterých se často používá pro náhodnou mutagenesi, je hydrogensiřičitan sodný, kterým se převádí cytosinový zbytek na uracilový zbytek, čímž dochází k přechodu C na T (standardní zkratky nukleotidů) [Tento způsob je například popsán v publikaci Shortle a Nathans, Procd. Nat. Acad. Sci. USA 75, 2170 až 2174 (1978) nebo Pine a Huang, Meth. Enzym. 154, 415 až 430 (1987)]. Tento mutagen působí výhradně na jednořetězcovou DNA, zatímco exprese mutované cílové sekvence DNA se dosahuje za použití dvouřetězcového plasmidového vektoru. Jednou možností, jak se vyhnout nutnosti provádět reklonování ve vektorech pro mutagenesi a expresi, je použití tzv. phasmidů. Phasmidy jsou vektory, které kromě plasmidového počátku replikace nesou také počátek replikace pocházející z vláknitého fágu. Jako příklady takových phasmidů je možno uvést pMa- a pMc- phasmidy, které jsou popsány v publikaci Stanssen a další (Nucleic Acids Res.
17, 4441 až 4454 (1989)]. Za použití tohoto exprimačního systému je možno zkonstruovat tzv. struktury gap-duplex [viz také Kramer a další Nucl . Acids Res. 12, 9441 až 9456 (1984)1, v nichžje pouze sekvence kódující TNF (viz výše) v jednořetězcové konfiguraci, a proto je dosažitelná pro specifický chemický mutagen. Struktury gap-duplex, kterých se má použít pro náhodnou mutagenesi, je možno konstruovat způsobem popsaným v souvislosti se specifickou mutagenesi (Stanssen á další, viz výše) pouze ,s tím rozdílem, že (-) řetězec obsahuje stejný gen aktivní odolnosti proti antibiotiku, jako (+) řetězec. Za použití různých restrikčních míst v sekvenci DNA, která kóduje hTNF-α., je možno měnit šířku mezery (gap). Jako příklady takových restrikčních míst je možno uvést místa Clal-Sall (470 nukleotidů), BstXl-BstXl (237 nukleotidů) nebo Styl-Styl (68 nukleotidů). Na takové konstrukty gap-duplex se potom může působit rostoucími koncentracemi (až do 4M) hydrogensiřičitanu, načež se provede několik dialyzačních stupňů (Shortle a Natans, viz výše). Pomocí takových phasmidových konstruktů lze potom transformovat vhodnou prokaryotickou hostitelskou buňku způsoby, které jsou o sobě známé (například Sambrook a další, viz výše uvedená publikace). Pod výrazem vhodná prokaryotická hostitelská buňka se v tomto kontextu rozumí hostitelská buňka, která nemá specifickou párovací funkci, takže uracilový zbytek zůstává v DNA zachován v průběhu replikace, přičemž tato hostitelská buňka je schopna exprimovat odpovídající mutovaný TNF. Takové specifické hostitelské kmeny jsou v tomto oboru známy; z kmenů E. coli se například jedná o E. coli BW 313 [Kunkel, T. A., Procd. Nati. Acad. Sci. USA 82, 488 až 492 (1985)). Pomocí vhodných zkušebních systémů se potom provede skríning, za účelem nalezení klonů, které exprimují požadovaný hTNF mutein. Tak například je možno každou kolonii na mikrotitrové plotně inokulovat do vhodného media obsahujícího relevantní antibiotikum. Buňky je možno podrobit lysí přídavkem lysosymu, po níž se provede několik cyklů zmrazování a tání. Po vysrážení nukleových kyselin a centrifugaci se může supernatantu každé kolonie přímo použít při vhodných zkouškách, které jsou například popsány v příkladu III tohoto popisu.
Je-li to žádoucí,' mohou se specifická místa mutace stanovit napřklad analýzou restrikčních fragmentů (viz například Sambrook a další, výše uvedená citace). Stanovením sekvence DNA těchto fragmentů je možno určit přesnou polohu mutace a pokud taková mutace vede k náhradě aminokyseliny, je možno novou aminokyselinu odvodit ze stanovené sekvence DNA. DNA-sekvenování se může provádět způsoby, které jsou o sobě známy v tomto oboru, například za použití T7 polymerasy na superhelix DNA, pomocí obchodně dostupné soupravy pro sekvenování (Pharmacia, Uppsala, Švédsko).
Jak již bylo uvedeno výše, další možností mutace dané sekvence DNA je místně orientovaná mutagenese. V širokém rozsahu používaná strategie pro tento typ mutagenese byla původně navržena Hutchinsonem a Edgellem (J. Virol. 8, 181 [1971)) a zahrnuje nybridizaci syntetického oligonukleotidu, nesoucího požadovanou substituci nukleotidu, k cílové oblasti jednořetězcové sekvence DNA, do níž má být mutace zavedena [přehled je uveden například v Smith, Annual Rev. Genet. 19, 423 (1985)]. Zlepšené metody jsou uvedeny ve druhé až šesté citaci Stanssena a dalších (1989) .
Jednou takovou přednostní metodou je metoda Stanssena a' dalších -( 1989 ), při níž se používá gapped duplex DNA, kterou původně popsali. Kramer a další roku 1984 [viz výše uvedená citace a citace Kramer a Fritz , Methods in Enzymology, (1987 ), Academie Press lne. , USA], s tím rozdílem, že se pro selekci řetězce obsahujícího mutac používá genů odolnosti proti antibiotikům místo funkčních genů M13, kromě phasmidové technologie, kterou také popsali Stanssen a další (1989) (viz výše uvedená citace). Výhodou tohoto postupu je také možnost provádět následné cykly mutagenese, aniž by bylo nutno přenášet gen do nového vektoru pro mutagenesi; druhé kolo mutagenese se liší pouze v selekci na jiný antibiotický markér (Stanssen a další, viz výše). Pro kontrolu lze použít místně specifické zpětné mutagenese mutantu na TNF divokého typu. Kromě toho, použití oligonukleotidů, který vytváří nebo ničí restrikční místo genu TNF, umožňuje kontrolovat mutant nejen hybridizací k oligonukleotidů, použitému pro místně orientovanou mutagenesi, nýbrž také na základě přítomnosti nebo nepřítomnsti restrikčního místa. Pro vytvoření série hTNF muteinů, v nichž je v definované poloze jejich aminokyselinové sekvence aminokyselina divokého typu nahrazena jakoukoliv aminokyselinou vyskytující se v přírodě, se používá série oligonukleotidů se všemi možnými kodony v definované poloze.
Jak již bylo uvedeno výše, další možností, jak mutovat danou sekvenci DNA, je mutagenese' za použití řetězové reakce s polymerasou (PCR). Základy této metody jsou popsány v publikaci White a další, (1989), přičemž zlepšené postupy jsou například popsány v publikaci Innis a další (PCR Protocols: A Guide to Methods and Applications, Academie Press, lne., (1990)).
PCR je metoda in vitro, která se hodí pro výrobu velkých množství specifických fragmentů DNA o definované délce a sekvenci z malých množství templátové DNA. PCR je založena na enzymatické amplifikaci fragmentu DNA, lemovaného dvěma oligonukleotidovými primery, které se hybridizují k opačným řetězcům cílové sekvence. Primery jsou orientovány tak, že jejich 3' konce směřují k sobě.
Opakované cykly tepelné denaturace templátu, tepelné hybridizace primerů ke komplementárním sekvencím a prodlužování hybridizovaných primerů pomocí DNA polymerasy vedou k amplifikaci segmentu mezi 5' konce primerů PCR. Vzhledem k tomu, že produkt prodlužování' každého primeru může sloužit jako templát pro další primer, v každém cyklu se v podstatě zdvojnásobí množství fragmentu DNA, produkovaného v předchozím cyklu. Vzhledem k tomu, že primery jsou fyzicky zabudovány do amplifikovaného produktu a chyby mezi 5' koncem primerů a templátem podstatně neovlivňují účinnost amplifikace, je možno pozměňovat amplifikovanou sekvenci zaváděním požadované mutace do amplifikované DNA. Za použití tepelně stálé Taq DNA polymerasy, izolované z termofilní bakterie Thermus aquaticus, je možno se vyhnout denaturaci polymerasy, která jinak vyžaduje přídavek enzymu po každém stupni tepelné denaturace. Tento vývoj vedl k automatizaci PCR za použití různých zařízení pro jednoduché cyklování teploty. Kromě toho, specifičnost amplifikační reakce se zvýší tím, že se použije vyšších teplot pro hybridizaci primerů a prodlužování. Zvýšení specifičnosti zlepšuje celkový výtěžek amplifikovaných produktů tím, že se minimalizuje konkurence necílových fragmentů o enzym a primery.
Navrhování a syntéza oligonukleotidů se mohou provádět způsobem známým v tomto oboru, který je například popsán v publikaci Sambrook a další (1989) nebo v některé z publikací, které byly uvedeny výše, v souvislosti s místně orientovanou mutagenesí.
Jakmile se vytvoří sekvence DNA kódující hTNF mutein podle tohoto vynálezu, je možno přistoupit. k expresi pomocí phasmidové technologie, popsané výše, nebo pomocí jakéhokoliv jiného vhodného pro-.nebo eukaryotického expresního systému, dobře známého v tomto oboru (viz například Sambrook a další, výše uvedená citace).
Exprese se přednostně provádí v prokaryotických buňkách, například E. coli, Bacillus subtilis apod., přičemž přednost se dává E. coli, zejména kmenům E. coli K12 například M15 [popsaným jako DZ 291, Villarejo a další v J. Bacťeriol 120, 466-474 (1974)], HB 101 [ATCC č. 33694] WK6 (Stanssen a další, viz výše) nebo E. coli SG13009 [Gottesman a další J. Bacteriol 148, 265 až 273 (1981)]. Exprese hTNF muteinů podle tohoto vynálezu se také může provádět v nižších nebo vyšších eukaryotických buňkách, jako jsou například kvasinkové buňky (jako Saccharomyces nebo Pichia atd.) vláknité houby (jako Aspergillus atd.) nebo buněčných liniích (jako jsou vaječníkové buněčné linie čínského křečka atd.), přičemž expresi v kvasinkových buňkách se dává přednost [viz Sreekrishna a další, Biochem. 28, 4117-4125 (1989); Hitzeman a další, Nátuře 293, 717 až 722 (1981); Evropská patentová přihláška publikovaná pod číslem 263311]. Exprese hTNF muteinů podle tohoto vynálezu se v takových systémech může provádět buď intracelulárně nebo po vhodné adaptaci genu také extracelulárně (viz Leemans a další, Gene 85, 99 až 108, 1989).
Vhodnými vektory pro použití při expresi v E. coli jsou například vektory, které uvádějí Sambrook a další ve výše uvedené citaci nebo Fiers a další v Procd. 8th Int. Biotechnology Symposium [Soc. Franc, de Microbiol., Paříž (Durandt a další red.), str. 680 až 697 (1988)] nebo konkrétněji vektory ze skupiny pDS [Bujard a další Methods in Enzymology, red. Wu a Grossmann, Academie Press, lne. sv. 155, 416 až 433 (1987); Stuber a další, Immunological Methods, red. Lefkovits a Pernis, Academie Press, lne. , sv. IV 121 až 152 (1990)], jako například pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(D143N, A145R) (viz příklad I) nebo pDS56/RBSII,SphI-TNF-a(mutein) (viz příklad II), kde označení mutein představuje TNF-a-mutein, uvedený v tabulce 1. Jelikož lze s těmito specifickými pDS56/RBSII-plasmidy, díky jejich specifickým regulovatelným prvkům promotor/operátor a ribosomálním vazebným místům, dosáhnout vysoké úrovně exprese, je možno tyto plasmidy udržovat v buňkách E. coli pouze za předpokladu, že je aktivita prvku promdtor/operátor potlačena vazbou lac represoru k operátoru. Aktivitu promotoru je možno restaurovat při požadované hustotě buněk přídavkem IPTG, který inaktivuje represor a uvolňuje promotor. Jelikož většina kmenu E. coli neposkytuje dostatek represorových molekul pro úplné potlačení funkce promotorových sekvencí, přítomných v těchto plasmidech s vysokým počtem kopií, takové kmeny E. coli, jako je E. coli M15 nebo SG13009, je třeba transformovat nejprve plasmidem, jako je pREP4 (viz obr. 2a a 2b), kódujícím lac represor, před tím, než se provede jejich transformace specifickými pDS56/RBSII-plasmidy podle vynálezu. Teprve potom lze tyto plasmidy stabilně udržet v buňkách E. coli. Kromě toho, že pREP4 kóduje lac represor, obsahuje také oblast plasmidu pACYC184 [Chang a Cohen, J. Bacteriol. 134, 1141 až 1155 (1978)], která obsahuje všechny informace potřebné pro replikaci a stabilní transmisi na dceřiné buňky [další informace lze také nalézt v System for high level production in E. coli and rapid purification of recombinant proteins: Application to epitope mapping, preparation of antibodies and structure function analysis Stúber a další v Immunological Methods, sv. IV, str. 121 až 152, Lefkovitz a Pernis (red. ) , Academie Press, New York (1990 )].
Transformace hostitelských buněk výše popsanými vektory se může provádět jakýmkoliv konvenčním postupem (viz například Sambrook a další, výše uvedená citace). Pokud je hostitelská buňka prokaryotická, jako například E. coli, připravují se kompetentní buňky, které jsou schopny přijmout DNA z buněk, sklizených po exponenciální fázi růstu a potom se zpracovávají známou metodou s chloridem vápenatým. Transformace se také může provést po vytvoření protoplastu hostitelské buňky nebo jinými metodami známými v tomto oboru, které jsou například popsány v publikaci Sambrook a další (viz... výše) . Předmětem vynálezu je proto také vektor, zejména pro expresi v prokaryotické nebo nižší eukaryotické hostitelské buňce, který obsahuje sekvenci DNA kódující hTNF mutein, popsanou výše a hostitelská buňka, zejména prokaryotická hostitelská buňka, například E. coli nebo nižší eukaryotická hostitelská buňka, transformovaná takovým vektorem.
Hostitelské organismy, které obsahují požadovaný expresní vektor, se obvykle nechají růst za podmínek, které jsou pro jejich růst optimální. V případě prokaryotického hostitele se na konci exponenciálního růstu, kdy poklesne nárůst počtu buněk za časovou jednotku, vyvolá exprese požadovaného hTNF muteinu, t.j. DNA, která kóduje požadovaný hTNF mutein se transkribuje a provede se translace transkribované mRNA. Indukce se může provést přidáním induceru nebo derepresoru k růstovému médiu nebo změnou fyzikálního parametru, například změnou teploty. V expresních vektorech, kterých se používá v přednostních provedení tohoto vynálezu, se exprese kontroluje lac represorem. Přídavkem isopropylβ-D-thiogalaktopyrahosidu (IPTG) dojde k derepresi sekvence kontrolující expresi a tím se indukuje syntéza požadovaného hTNF muteinu.
hTNF muteiny podle tohoto vynálezu, produkované transformovanými hostitelskými buňkami, . popsanými výše, se mohou izolovat z kultivačního media nebo po otevření buněk a/nebo extrakcí jakoukoliv vhodnou metodou, která je známá v chemii proteinů a peptidů, jako je například srážení síranem amonným, dialýza, ultrafiltrace, gelová filtrace nebo ionexová chromatografie, gelová elektroforéza, isoelektrická fokusace, afinitní chromatografie, jako je imunoafinitní chromatografie, HPLC apod. Jako konkrétní přednostní metody je možno uvést srážení síranem amonným a/nebo polyethyleniminem, dialýzu, afinitní chromatografií, například na fenylagaro.se, konkrétně fenyl-sepharose nebo ionexovou chromatografií, konkrétně na MONO-Q- a/nebo MONO-S- matrici (Pharmacia, Uppsala, Švédsko). Zvláště ‘'V* ' i·’'/*'/·/'·/ vhodnými jsou metody popsané v Tavernier a další, J. Mol. Biol. 211, 493 až 501 (1990) a metody popsané v příkladu IV.
Předmětem vynálezu je tedy také způsob výroby hTNF muteinů, definovaných výše, který se vyznačuje tím, že se transformovaná hostitelská buňka, posaná výše, zejména prokarystická hostitelská buňka, například E. coli nebo eukarystická hostitelská buňka, kultivuje ve vhodném mediu a ze supernatantu kultury nebo samotné hostitelské buňky se izoluje mutein, načež se tento mutein popřípadě pegyeuje nebo převádí na farmaceuticky vhodnou sůl způsoby, které jsou o sobě známé v tomto oboru.. Předmětem vynálezu jsou také všechny sloučeniny vyrobené takovými způsoby.
hTNF muteiny podle vynálezu jsou charakteristické tím, že vykazují selektivní vazebnou afinitu vůči humánnímu p75-TNF-R. Tuto vlastnost lze stanovit jakoukoliv zkušební metodou, známou v tomto oboru, která se hodí pro měření vazebných afinit. Tak například, vazbu samotného TNF a muteinů podle tohoto vynálezu je možno měřit za použití buněk v buněčné kultuře, které exprimují oba typy TNF-receptorů v odlišném stupni, jako jsou například buňky Hep-2, které výlučně exprimují humánní p55-TNF-R a buňky U937 nebo HL60, které kromě toho exprimují také humánní p75-TNF-R [viz Brockhaus a další, Procd. Nat. Acad. Sci. USA 87, 3127 až
3131 (1990); Hohmann a další, J. Biol. Chem. 264, 14927 až 14934, (1989); Loetscher a další (1990); Dembic a další (1990)). Vazebné afinity je také možno stanovovat přímo za použití purifikovaného nativního nebo rekombinantního p55-TNF-R a p75-TNF-R, jak je to konkrétně popsáno v příkladech nebo za použití odpovídajících rozpustných analogů těchto receptorů.
Pod označením selektivní vazebná afinita pro receptor p75 humánního faktoru nekrózy nádorů se v kontextu předloženého vynálezu rozumí rozdíl ve vazebné afinitě ke dvěma typům receptorů TNF. Pokud se týče zkušebního systému popsaného v příkladech, přednostně se mutein podle vynálezu selektivně váže k hp75-TNF-receptorům (pokud možno v podobné míře jako TNF divokého typu), přičemž však v podstatě ztratil schopnost vazby k hp55-TNF-R. V kontextu zkušebního systému, kterého se používá v příkladech, toto označení konkrétněji znamená, že hodnota Kp specifického hTNF muteinu podle vynálezu je alespoň lOx nebo víckrát (s výhodou alespoň lOOx) vyšší než hodnota KD TNF-α divokého typu, při stanovení zkouškou vazby in vitro s rekombinantním rozpustným hp55-TNF-R, zatímco jeho hodnota KD, stanovená zkouškou vazby in vitro s rekombinantním rozpustným hp75-TNF-R se pro stejný hTNF mutein s výhodou neliší více než dvacetinásobně, ve srovnání s TNF-α divokého typu. Je samozřejmé, že uváděné konkrétní hodnoty KD mají sloužit pouze pro ilustrativní účely a v žádném ohledu neomezují vynález.
hTNF muteiny je možno podávat samotné nebo v kombinaci s jednou nebo více přídavnými sloučeninami podle vynálezu, ve formě farmaceuticky vhodných orálních, injekčních nebo topických přípravků. Při podávání se bude používat takových dávek, aby se u pacienta dosáhlo množství účinné sloučeniny, které je schopno účinně modifikovat biologickou funkci, kterou hTNF muteiny mají.
Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou proto přípravky obsahující hTNF muteiny podle tohoto vynálezu ve spojení s kompatibilními farmaceuticky vhodnými nosičovými látkami. Může se používat jakýchkoliv vhodných nosičových látek. Jako nosičové látky přicházejí v úvahu organické nebo anorganické látky, které se hodí pro enterální, perkutánní nebo parenterální podávání. Jako vhodné nosiče je možno
uvést vodu, želatinu, arabskou gumu, laktózu, škrob, stearan hořečnatý, mastek, rostlinné oleje, polyalkylenglykoly, vazelínu apod. Farmaceutické přípravky mohou kromě toho obsahovat také jiné farmaceuticky účinné látky. V souladu s obvyklou praxí výroby farmaceutických přípravků je také možno přidávat další přísady, jako jsou ochucovadla, konzervační látky.., -.stabilizátory, emulgátory, pufry apod.
Farmaceutické přípravky je možno upravovat na jakékoliv obvyklé formy, včetně a) pevných forem pro orální podávání, jako jsou tablety, kapsle, pilule, prášky, granule apod.; b) kapalných forem pro orální podávání, jako jsou roztoky, sirupy, suspenze, elixíry apod.; c) přípravků pro parenterální podávání, jako jsou sterilní roztoky, suspenze nebo emulze; a d) přípravků pro topické podávání, jako jsou roztoky, suspenze, masti, krémy, gely, mikronizované prášky, aerosoly apod. Farmaceutické přípravky je možno sterilizovat a/nebo mohou obsahovat pomocné přísady, jako jsou konzervační látky, stabilizátory, smáčedla, emulgátory, soli pro změnu osmotického tlaku a/nebo pufry.
Z parenterálních dávkovačích forem přicházejí v úvahu infusní roztoky nebo injekční roztoky. Injekce je možno podávat intravenozně nebo intramuskulárně. Přípravky podle vynálezu mohou také obsahovat jiné terapeuticky účinné látky. V souladu s běžnou praxí farmaceutické výroby je také možno k nim přidávat konzervační látky, stabilizátory, emulgátory, pufry apod.
Předmětem vynálezu je tedy také způsob výroby farmaceutických přípravků, jehož podstata spočívá v tom, že se sloučenina vyrobená způsobem podle tohoto vynálezu a popřípadě přídavné farmaceuticky účinné látky smíchají s netoxickým inertním, z terapeutického hlediska kompa tibilním nosičem a vzniklá směs se zpracuje na vhodnou galenickou aplikační formu.
Předmětem vynálezu je též použití sloučeniny vyrobené způsobem podle vynálezu pro výrobu farmaceutického přípravku, popsaného výše.
Proti hTNF muteinům podle vynálezu je konečně možno vypěstovat protilátky. Těchto protilátek se může používat dobře známým způsobem k diagnostickým nebo terapeutickým účelům, jakož i k purifikačním účelům. Protilátky je možno získat tak, že se savcům nebo ptákům injikuje dostatečné množství očkovacího přípravku obsahujícího hTNF mutein podle vynálezu a kompatibilní farmaceutický nosič, aby se vyvolala produkce protilátek proti tomuto hTNF muteinu. Vhodné množství hTNF muteinu, kterého je v tomto případě zapotřebí, je odborníkům v tomto oboru známé, nebo je lze stanovit rutinním experimentováním. Pod označením farmaceutický nosič, jak se ho používá v kontextu tohoto vynálezu, se rozumějí standardní látky, které je možno podávat lidem nebo typické pomocné látky používané v očkovacích látkách pro zvířata.
Jak již bylo uvedeno výše, TNF je silným pleiotropickým cytokinem. Jeho četné různé účinnosti, jako je například účinnost růstového faktoru na imunní buňky, účinnost mediátoru při zánětech nebo účinnost induktoru specifických genů v endotheliu, je možno spatřovat v kontextu obrany hostitele vůči infekci a poranění. TNF také vykazuje vysokou systemickou toxicitu. Škodlivé účinky bakteriemie a septického šoku nebo bakteriální meningitis jsou do značné míry mediovány endogenními cytokiny, mezi nimiž hraje TNF časnou a důležitou úlohu. Kromě toho, mnohé buňky a buněčné linie jsou citlivé vůči přímé cytotoxické účinnosti TNF. V protinádorové účinnosti TNF, jak vyplývá ze
rút’;·'< / c'·; ·'v?
studií na zvířatech, se pravděpodobné spojují různé systemické účinky s celulární toxicitou.
Tato fakta tvoří racionální základ pro vývoj nových terapeutických strategií za použití hTNF muteinů podle tohoto vynálezu. Při těchto strategiích se zejména plně využívá možnosti rozdělení mnoha různých účinností hTNF na žádoucí a nežádoucí tím, že se selektivně aktivuje pouze jeden ze dvou typů hTNF receptorů (na rozdíl od hTNF divokého typu, který se váže a který aktivuje oba typy hTNF receptorů). Potenciální použití hTNF muteinů podle tohoto vynálezu se neomezuje na léčbu rakoviny. Při léčbě jakékoliv choroby, při níž hraje TNF prospěšnou úlohu jako obranný faktor hostitele proti bakteriální infekci [viz například Kindler V. a další Cell 56, 731 až 740 (1989); Nakano Y. a další J. Immunol. 144, 1935 (1990)] nebo jako mediátor při zánětech, se může dosáhnout užitku za použití léčiva, které je specifické vůči receptorům 75kDa TNF typu, jako jsou hTNF muteiny podle tohoto vynálezu. Bylo již také ukázáno, že TNF-α. vykazuje určité katabolické účinky na buňky tuků a na celá zvířata a má svou úlohu při kachexii [například Beutler B. a Cerami, viz výše uvedená publikace; Hotamisligil a další, Science 259, 87, 1993], takže TNF muteinů podle tohoto vynálezu by bylo také možno používat pro antiobezitní terapii. Také bylo ukázáno, že TNF-α vykazuje neutralizační účinek na insulinem stimulovanou rychlost utilizace periferní glukózy [Hotamisligil a další, viz výše uvedená citace]. Tato údajná úloha TNF-α při resistenci vůči insulinu, spojené s obezitou může být vysvětlena jeho možnou úlohou při kachexii na základě rozdílů, závislých na dávce, v biologických účincích a rozdílných rolí dvou TNF receptorových systémů, kterých by bylo možno využít za použití agonistů specifických vůči receptorů určitého typu, popřípadě za přítomnosti inhibitorů TNF divokého typu. I při léčbě chorob, které jsou charakteristické toxickými účin25 nostmi nadměrného uvolňování TNF, jako je k septický šok nebo bakteriální meningitis, se muže dosáhnout užitku za použití agonistů, které jsou specifické vůči receptorům TNF, jako jsou muteiny podle tohoto vynálezu, popřípadě v kombinaci s antagonisty TNF divokého typu.
Byl publikován obšírný přehled nově se objevené role TNF při nových terapiích, při nichž lze od okolnosti, že agonisty specifické pro TNF-receptory určitého typu selektivně spouštějí pouze jednu z mnoha účinností TNF, očekávat podstatné výhody, ve srovnání s TNF divokého typu [Tumor Necrosis Factors, The Molecules and their Emerging Role in Medicine, B. Beutler red. Raven Press, 1992, ISBN 0-88167-852-X. Tento přehled zahrnuje· také účinnosti TNF při modulaci endotheliálních buněčných homeostatických vlastností a neutrofilní adhese, ischemii tkání a poškození reperfusí, při působení na osteoblasty a osteoklasty při resorpci kostí, při působení jako růstového faktoru, obecně na mnohé buňky a při hematopoiesi, jakož i při působení na metabolismus a výživu. Zdá se, že účinnosti TNF, jakožto růstového/diferenciačního faktoru při tvorbě lymfokinem aktivovaných zabiječských buněk (LAK) přispívají k jeho protinádorovým účinnostem. V důsledku toho je použití hTNF-muteinů podle tohoto vynálezu nebo jejich farmaceuticky vhodných solí rovněž předmětem tohoto vynálezu.
Všechny tyto účinnosti je možno posílit nebo modulovat kombinací s jinými rekombinantními cytokiny, jako je například interferon-gamma.
Vynález je podrobněji popsán v následujicích příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a v žádném směru neomezují rozsah vynálezu. V příkladech se používá odkazů na připojené obrázky.
Jsou zavedeny následující zkratky: Symboly Β, E, H, S, Xb a X označují štěpící místa pro restrikční enzymy BglI, EcoRI, HindiII, Sáli, Xbal a Xhol.
představuje trar.skripční terminátory fácu lambda (ύθ) a TI rrn3 operonu Ξ. coli (TI),
N25OPSN25OP29 a R3SII,SphI.
Přehled obrázků na výkrese
Na obr··, la je znázorněna schematická kresba plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α.
Na obr. lb je uvedena úplná nukleotidová sekvence plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α (SEQ ID No. 1). V této sekvenci jsou označeny sekvence rozpoznané restrikčními enzymy z obr. Ia. Znázorněná aminokyselinová sekvence představuje ve třípísměnovém kódu sekvenci maturovaného humánního TNF-a (157 aminokyselin; SEQ ID No. 1 a 2).
Na obr. 2a je uvedena schematická kresba plasmidu pREP4.
Na obr. 2b je uvedena úplná nukleotidová sekvence plasmidu pREP4 (SEQ ID No. 3). V této sekvenci jsou označeny sekvence rozpoznané restrikčními enzym,y z obr. 2a (viz také obr. 2bl až 2b3 v EP 4S6 908).
Na obr. 3 je znázorněna příprava fragmentu EcoRI-HindlII, kódujícího TNF-α mutein TNF-a(D143N , A14 5R) .
Na obr. 4 je znázorněna kompetitivní vazba humánního TNF-α divokého typu a D143N,A145R a D143-A145R muteinů k humunnímu TNFR-p75 a TNFR-p55.
Při zkoušce, která je ilustrována na obr. 4 bylo použito mikrotitřových desek s 96 jamkami, povlečených rekombinančním humánním TNFR-p75-hgamma3 fúzovaným proteinem (horní okénko) a rekombinantním humánním TNFR-p55-hgamma3 fúzovaným proteinem (dolní okénko), které byly inkubovány s radioisotopem-značeným humánním TNF-α za přítomnosti různých koncentrací neznačeného TNF-α divokého typu nebo D143N, A145R nebo D143N-A145R muteinů. Vázaná radioaktivita byla spočítána v gamma-počítači po 3 hodinách při teplotě místnosti.
Pokud není uvedeno jinak, rozumí se pod procentickými údaji u pevných látek v pevných směsích, údaje hmotnostní, u kapalných látek v kapalných směsích, údaje objemové a u pevných látek v kapalných směsích údaje typu hmotnost/objem, které lze vynásobením deseti přepočítat na údaje g/1.
Příklady provedeni vynálezu
Příklad I
Výroba TNF-α(D143N-A145R)
Plasmid pDS56/RBSII,SphI-TNF-a
Humánní TNF-α expresní plasmid pDS56/RBSII,SphI-TNF-α (viz obr. 1) je zdrojem TNF-α genu pro přípravu růných TNF-α muteinú podle tohoto vynálezu. Transformovaný kmen E. coli M15 [ pREP4 ; pDS56/RBSII, SphI-TNF-α] byl v souladu s Budapešťskou dohodou o ukládání mikroorganismů pro patentové účely uložen ve sbírce Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und
Zellkulturen GmbH (DSM) v Branschweigu, SRN, dne 8. září 1991 pod přírůstkovým číslem DSM 6713.
Mutagenese TNF-α genu za použití PCR
Provedou se dvě PCR reakce s plasmidem PDS56/RBSII, SphI-TNF-α (obr. 1), jako templátovou DNA za použití soupravy Perkin-Elmer Cetus GeneAmp^R) DNA Amplification Reagent Kit s rekombinantní Taq DNA polymerasou AmpliTaq(R) [viz obr. 3].
Reakce I se provádí s primery 17/F ( 5'-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3’ (SEQ ID No. 4); primer 17/F obsahuje nukleotidy 3949-3970 plasmidu pDS56/RBSII,SpHI-TNF-α) a 46/M12 ( 5 '-GCGAAAGTTGAGATAGTCGGGCCGATTG-3 ' (SEQ ID No. 5); primer 46/M12 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementární vůči nukleotidům 552-525 plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α mutované báze jsou podtrženy).
Reakce II se provádí s primery 29/MR2 (5'-GAGTCTGGGCAGGTCTACTTTG-3 ' (SEQ ID No. 6); primer 29/MR2 obsahuje nukleotidy 553-574 plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α) a 17/0 (5'-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3' (SEQ ID No. 7); primer 17/0 obsahuje nukleotidy, které jsou komplementární vůči nukleotidům 748-727 plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α).
Při typickém experimentu se 10 μΐ templátové DNA (lOng), 5 μΐ jednoho a 5 μΐ druhého primerů (vždy 100 pmol), 16 μΐ dNTP směsi (l,25mM dATP, dGTP, dCTP a dTTP), 10 μΐ lOx reakčního pufru (lOOmM Tris-Hcl o pH 8,3, 500 mM chloridu draselného, 15mM chloridu hořečnatého a 0,1 % želatiny), 1 μΐ (5 jednotek), AmpliTaqDNA polymerasy a 53 μΐ vody smíchá v Eppendorfově trubici a překryje 80 ml minerálního oleje (Perkin-Elmer Cetus). Trubice se přenesou do thermálního cyklovače pro DNA (TRIO-Thermoblock,
Biometra), udržují 1 munutu při 94 °C, potom se provede 35 cyklů tavení DNA (1 minuta při 94 °C) , hybridizace primerů (1 minuta při 50 °C) a prodlužování primerů (3 minuty při 72 °C). Po dalších dvou minutách při 72 °C se reakční směsi ochladí na teplotu místnosti a extrahují chloroformem. DNA, která je přítomna ve vodné fázi, se srazí ethanolem a podrob elektroforéze na 6% polyakrylamidovém gelu (Sambrook a další, 1989). Po obarvení DNA ethidiumbromidem se z gelu izolují fragmenty I a II (viz obr. 3) a přečistí (Sambrook a další , 1989 ) .
Výroba DNA fragmentu kódujícího TNF-α (Dl43N-A145R )
Fragmenty I a II se enzymaticky fosforylují a potom vzájemně ligují (Sambrook a další, 1989). Provede se tepelná inaktivace ligasy a štěpení restrikčními enzymy EcoRI a HindlII a DNA se podrobí elěktroforéze na 6% polyakrylamidovém gelu. DNA seRóbarví ethidiumbromidem a z gelu se izoluje EcoRI-HindlII fragment A (viz obr. 3), který se potom přečistí (viz výše).
Výroba plasmidu kódujícího TNF-α (D143N-A145R)
EcoRI-HindlII fragment A se vsune standardními metodami [Sambrook a další 1989] do EcoRI-HindlII otevřeného plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-α za vzniku plasmidu p_DSp6/RBSII, SphI-TNF-α(D143N-A145R) . Vyrobí se plasmidová DNA (Birnboima další, 1979) a totožnost kódující oblasti pro TŇF-α mutein se potvrdí sekvenováním dvouřetězcové DNA (Sambrook a další, 1939).
Výroba TNF-α (D143N-A145R)
Plasmid pDS56/RBSII,SphI-TNF-α(D143A-A145R) se transformuje do buněk E. coli M15, které již obsahují plasmid pREP4, standardními metodami (viz výše). Transformované buňky se nechají růst při 37 °C v LB mediu (Sambrook a další, 1989), obsahujícím 100 mg/1 ampicilinu a 25 mg/1 kanamycinu. Při dosažení optické hustoty asi 0,7 až 1,0 (při 600 nm) se přidá IPTG až do finální koncentrace 2mM. Po dalších 2,5 až 5 hodinách při 37 °C se buňky sklidí odstředěním.
Příklad II
Výroba dalších TNF-α muteinů
Další TNF-α muteiny, které jsou uvedeny v tabulce 1, se vyrobí postupem, který je podrobně popsán v příkladu I pro výrobu TNF-α (D143N-A145R). Výsledné expresní plasmidy, které jsou analogické plasmidu pDS56/RBSII,SphI-TNF-a (D143N-A145R) jsou označeny názvem pDS56/RBSII,SphI-TNF-a (mutein), kde pod označením mutein se rozumějí TNF-a muteiny uvedené v tabulce 1. Tyto plasmidy obsahují kódující oblasti pro TNF-α muteiny, v nichž jsou kodony přítomné v plasmidu pDS5ó/RBSII,SphI-TNF-α nahrazeny kodony kódujícími tyto muteiny (viz tabulky 1).
Příklad III
Analýza vazebné aktivity, specifické vůči typu receptoru, humánních TNF-α muteinů v lysátech E. coli
Výroba lysátů E. coli ml suspenze buněk E. coli, které byly transformovány a indukovány způsobem popsaným v příkladech I a II, se odstřeďují po dobu 10 minut při frekvenci otáčení 4000 min-1 a peleta se resuspenduje v 0,9 ml pufru pro lysi (lOmM Tris-HCl o pH 8,0, 5mM EDTA, 2mM PMSF, lOmM benzamidin, 200 jednotek/ml aprotininu a 0,1 mg/ml lysozymu). Po 20 minutách inkubace při teplotě místnosti se přidá 50 μΐ 1M chloridu horečnatého, 20 ul DNasel (5 mg/ml), 50 μΐ 5M chloridu sodného a 50 μΐ 10% NP-40 a směs se dále inkubuje při teplotě místnosti po dobu .15 minut. Lysát se vyčeří 5 minutovou centrifugací při frekvenci otáčení 13000 min-1 a 0,5 ml takto vyčeřeného lysátu se podrobí
' ·» srážení síranem amonným (frakce 25 až 70 %). Peleta získaná se 70% síranem amonným se rozpustí v 0,2 ml PBS a analýzuje elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsulfátem sodným (SDS-PAGE), aby se potvrdila přítomnost a zjistilo přibližné množství rekombinantních proteinů.
Zkouška kompetitivní vazby v pevné fázi za použití radioligandu
Mikrotitrové plotny s 96 jamkami se potáhnou rekombinantními fúzovanými proteiny hTNFR-p75-hgamma3 a hTNFR-p55-hgamma3 (extracelulární část receptoru je fúzována s Fc částí humánního IgG3), přičemž koncentrace prvního z výše uvedených proteinů je 0,3 pg/ml a koncentrace druhého z výše uvedených proteinů je 0,1 pg/ml ve fyziologickém roztoku chloridu sodného, tlumeném fosfátovým pufrem (PBS,
100 μΐ/jamka, přes noc při 4 °C) [Loetscher H. a další, J. Biol. Chem. 266, 18324 až 18329 (1991); Lesslauer W. a další, Eur. J. Immunol. 21, 2883 až 2886 (1991)]. Po blokování blokovacím pufrem (50mM Tris o pH 7,4, 140mM chlorid sodný, 5mM EDTA, 0,02% azid sodný, 1% odtučněného sušeného mléka) se mikrotitrové plotny opláchnou pomocí PBS a inkubují v blokovacím pufru, který obsahuje 0,1 % odtučněného sušeného mléka a 10 ng/ml humánního 123I-TNF-a divokého typu a lysát E. coli v různém zředění v rozmezí od 10-2 do 10“7 (lOnásobné sériové ředění). TNF-α se označí Iodogenovou metodou (Pierce Chemical Company) do dosažení specifické aktivity přibližně 10 až 30 pCi/pg. Použitý objem je 10 μΐ na jamku a s každým zředěním lysátu se provádějí dvě nebo tři replikace zkoušky. Po 3 hodinách při teplotě místnosti se jamky důkladně opláchnou pomocí PBS a radioaktivita se spočítá v gamma-počítači. Výsledky pro lysáty obsahuj ící muteiny uvedené v tabulce 2 jsou uvedeny rovněž v tabulce 2.
Příklad IV
Purifikace humánních TNF-α muteinú
Jeden litr noční kultury buněk E. coli, které byly transformovány a indukovány způsobem popsaným v příkladech I a II, se izoluje centrifugací a potom resuspenduje ve 20 ml 50mM Tris, pH 7,2, 200mM chloridu draselného, 50mM chloridu horečnatého a 5% glycerolu. Buňky se rozbíjí ve Francouzském lisu za tlaku 137,4 MPa nebo zpracováním ultrazvukem v zařízení Branson Sonifier (Model 450, 2x 2 minuty při maximálním výkonu, na ledu). Po vyčeření centrifugací (70 000 x g, 30 min, 4 °C) se vzorky dialýzují proti 20mM Tris-HCl o pH 9,0 přes noc při 4 °C a nanesou se na sloupec Q-Sepharose (Pharmacia, 2,6 x 15 cm), který byl ekvilibrován ve stejném pufru. Proteiny se eluují lineárním gradientem chloridu sodného (0 až 400mM ve 20mM Tris o pH 9,0) při průtokové rychlosti 1 ml/min. Zachycené frakce o objemu 5 ml se analyzují na přítomnost TNF-α muteinú elektroforézou na polyakrylamidovém gelu s dodecylsul- fátem sodným (SDS-PAGE). Pozitivní frakce se spojí, dialýzují proti 20mM 2-morfolinoethansulfonové kyselině (MES) o pH 6,0 a nanesou na sloupec MonoS (HR 5/5, LKB-Pharmacia) ekvilibro- váný ve 20mM MES o pH 6,0. Proteiny se eluují lineárním gradientem chloridu sodného (0 až 400mM ve 20mM MES o pH 6,0) při průtokové rychlosti 0,5 ml/min. V rozmezí od 250mM do 350mM roztoku chloridu sodného se eluují různé TNF-α muteiny ve formě elektroforeticky čistých proteinů. Po dialýze proti roztoku chloridu sodného pufrovanému fosfátem (PBS) se stanoví koncentrace proteinu pomocí stanovení proteinů BCA (Pierce Chemical Company) za použití humánního TNF-α divokého typu, jako standardu nebo měřením absorbance při 280 nm.
Příklad V
Kompetitivní vazba purifikovaného humánního TNF-α divokého typu a muteinů k rekonbínantním humánním receptorům TNFR-p75 a TNFR-p55
Pro zkoušku kompetitivní vazby za použití purifikovaných muteinů se mikrotitrové plotny povlečou rekombinantními fúzovanými proteiny hTNFR-p75-hgamma3 a hTNFR-p55-hgamma3, jak je to popsáno v příkladu III. Po blokování blokovacím pufrem (50mM Tris, pH 7,4; 140mM chlorid sodný; 5mM kyselina ethylendiamintetraoctová, 0,02% azid sodný, 1% netučné sušené mléko) se mikrotitrové plotny opláchnou PBS a inkubuj í v blokovacím pufru obsahujícím 0,1 % netučného sušeného mléka a 10 ng/ml humánního 12=>I-TNF-a divokého typu a různé koncentrace neznačeného TNF-α divokého typu nebo muteinů v rozmezí od 102 do 10-5 pg/ml (lOnásobné sériové ředění). TNF-α je značen Iodogenovou metodou (Pierce Chemical Company), až do dosažení specifické aktivity asi 10 až 30 pCi/pg. Objem činí 100 μΐ/jamka a každá koncentrace se zkouší se dvěma nebo třemi replikacemi. Po 3 hodinách při teplotě místnosti se jamky důkladně opláchnou PBS a stanoví se radioaktivita v počítači gamma rozpadů.
Výsledky dosažené za použití muteinů uvedených v tabulce 3 jsou rovněž uvedeny v tabulce 3 a na obr. 4.
aiagjBBKawanfaBHagpi
Tabulka 1
Kodony použité.pro kódování nových aminokyselin, v muteinech přítomných
Mu t e i n
Nový kodon
| N19D Q21S | GAC TCT |
| L29S0 | TCC |
| L29S-R32W | TCC-TGG |
| L29S-R32W-SS6T | TCC-TGG-ACC |
| L29S-SS6T | TCC-ACC |
| N30T | ACC |
| R.31Ě · | GAG |
| R31.K | AAG |
| R31N-R32T | AAC-ACT |
| R31N-R32T-N34S | AAC-ACT-AGT |
| R-31N-R32T-SS6T | AAC-ACT-ACC |
| R31E-SS6T | GAG-ACC |
| R32Wa | TGG |
| R32W-SS6T | TGG-ACC |
| A33D | GAC |
6
A33T
N34R
N34D
N34C
N34Q
N34E
N34G
N34H
N34I
N34M
N34F
N34P
N34T
N34Y
N34Y
N34V
K65A
K65W
Q67K
Q67T
Q67Y
H73Q
H73T
L75R
L75H
ACC
CGT
GAC
TGT
CAA
G A A
GGT
CAC
ATT
ATG
TTT
CCT
ACT
TAT
TAC
GTT
GCA
TGG
AAA
ACA
TAC
CAA
ACT
CGT
CAC
| L75W | TGG |
| S86D | GAC |
| S36T | ACC |
| Y87Q | CAG |
| YS7Q-QS8A | CAG- |
| Y87E | GAA |
| Y87G | GGT |
| Y87L | CTG |
| YS7K | AAA |
| YS7F | TTC |
| Y87T | ACC |
| Y87T-E104G | ACC-GGG |
| N92R | CGT |
| I97K | AAG |
| 19 7 Y | TAC |
| S99A | GCA |
| S99Y | TAC |
| Y115W | TGG |
| D143N | AAC |
| D143E | GAA |
| D143F | TTC |
| D143W | TGG |
| D143Y | TAC |
| D143V | GTC |
D143V-F144L-A145S GTC-CTG-TCC
| D143N-A145R | AAC-CGC |
| D143V-A145S | GTC-TCC |
| F144R | CGT |
| F144D | GAT |
| F144G | GGT |
| F144L | TTG |
| F144W | TGG |
| F144Y | TAC |
| A145R | CGC |
| A145D . | GAT |
| A145G | GGT |
| A145H | CAC |
| A145K | AAA |
| A145F | TTT |
| A145S | TCC |
| A145T | AGA |
| A145W | TGG |
| A145Y | TAC |
| A145V | GTT |
| E146R | CGT |
| S147N | AAC |
| S14 7L · | CTG |
a Muteiny L29S a R32W byly zkonstruovány v laboratoři Dr. W. Fiers-e, na univerzitě v Ghentu (viz též EP 486 908).
0
Tabulka 2
Vazba humánních TNF-α muteinů k TNFR-p55 a TNF-p75
| Mutein | Zřejdění lysátu E. coli pro 50% ihnibici vazby 125I-TNF-a,ID50a) | ID50 TNFR- | |
| ID50 TNFR- | |||
| TNFR-p55 | TNFR-p75 | ||
| násobek | násobek | ||
| divoký typ°) | 14 260 | 14 140 | 1 |
| N19D | 5 000 | 5 000 | 1 |
| Q21S | 2 500 | 2 500 | 1 |
| L29S c) e) | 2 9.80 | <100 | >29,8 |
| L29S-R32W | 5 000 | «100 | »50 |
| L29S-R32W-SS6T | 2 500 | «100 | »25 |
| L29S-SS6T | 200 | «100 | »2 |
| N30T | 2 860 | 2 500 | 1,1 |
| 'Ss^SHESEMraíHsfcreMímMflQHssEaflBaaiaa&ieuiuiSíaiíaEiiai |
| R3lEc> | 3 470 | 180 | 19,3 |
| R31K | 3 330 | 3 330 | 1 |
| R31N-R32T tí | 3 260 | <100 | >32,6 |
| R31N-R32T-N34S | «100 | «100 | 1 |
| R31N-R32T-S86T | 500 | <100 | >5 |
| R31E-S86T | 2 000 | «100 ' | »20 |
| R32W tí tí | 8 780 | <100 | >87,8 |
| R32W-S86T | 3 330 | «100 | »33,3 |
| A33D | <100 | «100 | >1 |
| A33T | 1110 | 1250 | 0,9 |
| «100 | >1 | ||
| N34R | |||
| N34D | 250 | <100 | >2,5 |
| N34C | 250 | <100 | >2,5 |
| zim | «100 | >1 | |
| N34Q | |||
| ?9ιΊ | «100 | >>3,3 | |
| N34E | |||
| <100 | O o >0,0 | ||
| N34G | |||
| PC1C\ | <100 | >6,7 | |
| N34H | |||
| N34I | 200 | <100 | >2 |
| N34M | <100 | «100 | >1 |
| N34F $ ' | 100 | <1,00 | >1 |
| N34P | <100 | «100 | >1 |
n’ www’.*;
| N34T | 1000 | <100 | >10 |
| N34Y d) | <100 | «100 | >1 |
| N34Y d) | <100 | «100 | >1 |
| N34V d) | <100 | «100 | >1 |
| K65A | 20 000 | 33 330 | 0,6 |
| K65W d) | 500 | 3 330 | 0,2 |
| Q67K | 25 000 | 50 000 | 0,5 |
| Q67T | 25 000 | 33 330 | 0,75 |
| Q67Y | 20 000 | 33 330 | 0,6 |
| H73Q | 10 000 | 10 000 | 1 |
| H73T | 2 000 | 2 000 | 1 |
| L75R | <100 | <100 | 1 |
| L75H | 1670 | 2 500 | 0,7 |
| L75W | 220 | 330 | 0,7 |
| S36D | 6 670 | 1000 | 6,7 |
| S36T | 10 000 | <100 | >100 |
| YS7Q | «100 | «100 | 1 |
| YS7Q-QSSA | «100 | «100 | 1 |
| YS7E | <1(00 | «100 | >1 |
2S^BMaiamasisaisaíBK!íaiiaKíaa!aaaB2ffiaiás^KSxiaiaffisaai2isas^ěaSE
| YS7G | «100 | «100 | 1 |
| Y87L | «100 | «100 | 1 |
| Y87K | «100 | «100 | 1 |
| Y87F | 200 | <100 | >2 |
| Y87T | «100 | «100 | 1 |
| Y87T-E104G | <100 | <100 | 1 |
| N92R | δ 000 | 1250 | 4 |
| I97K | 143 | <100 | >1,4 |
| 19 7 Y | 2 500 | 330 | 7,6 |
| S99A | 6 670 | 6 670 | 1 |
| S99Y | <100 | <100 | 1 |
| Yl 15 \V | 2 220 | 2 220 | 1 |
| D143NG | «100 | 330 | «0,3 |
| D143E | <100 | 330 | <0,3 |
| D143F | «100 | 250 | «0,4 |
| D143W | «100 | 100 | «1 |
| D143YC/ | «100 | 1330 | «0,08 |
| D143V | «100 | ' <100 | <1 |
| D143Y-F144L-A1453 | «100 | <100 | <1 |
| D143N-A145R & | «100 | 125 | «0,8 |
| D143Y-A1453-: | «100 | 200 | «0,5 |
| F144R | 2 500 | 330 | 7,6 |
| F144D | . 5 000 | 330 | 15,2 |
| F144G | 2 500 | 2 000 | 1,2 |
| F144L | 5 000 | 5 000. | 1 |
| F144W | 400 | 180 | 2,2 |
| F144Y | 2860 | 2 860 | 1 |
| A145R | <100 | 3 330 | <0,03 |
| A143D | 5 000 | 6 670 | 0,7 |
| A145G | 2500 | 6 670 | 0,4 |
| A145H | 330 | 1670 | 0,2 |
| A145K | <100 | 1820 | <0,05 |
| A145F 9 | 240 | 6 000 | 0,04 |
| A145S | 14 290 | 25 000 | 0,6 |
| A145T | 5 000 | 6 670 | 0,7 |
| A145W d) | «100 | <100 | <1 |
| A145Y | 1670 | 11110 | 0,1 |
| A14 5 V | 1000 | 2 000 | 0,5 |
| E146R | 6 670 | <100 | >67 |
| S147N ..·· | 10 000 | 10 000 | 1 |
| S147L | '2 000 | 3 330 | 0,6 |
_ : ÍfrTrfWwt V ,·.-?Ί'.ν’.,Λ'
Humánní TNF-α divokého typu a muteiny se exprimují v E. coli a extrahují lysí těchto bakterií. Selektivní vazebná aktivita k jednotlivým receptorům extrahovaného TNF-α, jednak divokého a jednak mutantního typu, se měří vazebnou zkouškou v pevné fázi za použití radioligandu. Pro zjištěni kompetitivni inhibice vazby humánního I-TNF-α k imobilizovaným humánním receptorům TNFR-p75 a TNFR-p55 se • , , - — o používá různých zředěni lysatu E. coli v rozmezí od 10 do 107 (lOnásobné sériové ředění). Hodnoty ID50 (zředění, při němž se dosáhne 50% inhibice) se stanoví vynesením do grafu závislosti inhibice vazby proti zředění lysátu. Jelikož koncentrace rekombinantních proteinů v lysátech se mění v rozmezí od 0,05 do 1 mg/ml (podle stanovení analýzou SDS-PAGE), nelze považovat absolutní hodnoty ID50 za relevantní. Selektivitu pro jednotlivé receptory ukazuje přímé srovnání hodnot ID50, naměřených za použití specifického muteinu, jednak pro TNFR-p75 a jednak pro TNFR-p55.
a) Symbolem < jsou označeny hodnoty nižší než je uvedené číslo (v tomto případě došlo k měřitelné inhibici vazby 125T-TNF-a, ale bez dosažení 50% ihnibice při nejnižším zkoušeném zředění 1:100).
Symbolem << jsou označeny hodnoty, které jsou podstatně nižší než je uvedené číslo (v tomto případě se nedosáhlo měřitelné inhibice při nejnižším zkoušeném zředění 1:100)
Je-li uvedený poměr rovný 1, neexistuje selektivita vzhledem k jednotlivým receptorům.
Je-li uvedený poměr větší než 1, existuje selektivita vzhledem k TNFR-p55.
Je-li uvedený poměr nižš.í než 1, existuje selektivita vzhledem k TNFR-p75.
Muteiny podle tohoto vynálezu by měly mít hodnotu poměru ID50 TNFR-p55/ID50 TNFR-p75 nižší než 1. Tato hodnota může být nižší než 0,5, ale přednostně je nižší než nebo rovna 0,2 (viz muteiny podle nároku 5) nebo ještě lépe nižší než nebo rovna 0,1 (viz muteiny podle nároku 6). Muteiny označené v tabulce 1 symbolem < nebo «, mají hodnotu tohoto poměru ve výše uvedeném rozmezí.
c) V případě těchto muteinú byly připraveny a zkoušeny přinejmenším 3 různé lysáty; uvedené hodnoty ID50 představují hodnoty průměrné.
) Tyto muteiny byly pouze z části rozpustné za podmínek použitých pro výrobu lysátu E. coli (ačkoliv je třeba zdůraznit, že je možno použít různých purifikačních metod a to má za následek různou rozpustnost); koncentrace rozpustného muteinu v těchto lysátech, odhadnutá analýzou SDS-PAGE, je nižší než 0,05 mg/ml.
e) Muteiny L29S a R32W byly zkonstruovány v laboratoři Dr. W. Fiers-ε, na Univerzitě v Ghentu (viz též EP 486 908 ) .
Τ!
Tabulka
Vazba vybraných humánních TNF-α muteinů k humánnímu
TNFR-p75 a TNF-p55
Mutein Koncentrace muteinu pro 50% Pokles vazebné <
inhibici vazby 125I-TNF-a afinity vzhledem
IC50a) k divokému typub^
| TNFR-p55 | TNFR-p75 | TNFR-p55 | TNFR-p7. | |
| ng/ml | ng/ml | násobek | násobek | |
| D143N | >100000 | 300 | >2 500 | 6,7 |
| D143Y | >100000 | 350 | >6 660 | 17,5 |
| A145F | 500 | 30 | no | 1,5 |
| A145R | 100000 | 35 | 2 500 ' | 0,8 |
| A145W | 10000 | 100 | 250 | 2,3 |
| D143N- A143R | »100000 | .300 | >>2 500 | 6,7 |
-i
Vyberou se muteiny s přednostní vazbou k humánní]· receptoru TNFR-p75 (viz tabulka 2) a purifikují se až do zdánlivé homogenity sekvenční ionexovou chromatograf ií . Potom se metodou vazebné zkoušky v pevné fázi za použití radioligandu změří selektivní vazebná aktivita purifikovaných muteinů k jednotlivým receptorům. Při kompetitivní inhibici vazby humánního I-TNF-α divokého typu (10 ng/ml) k imobilizovanému humánnímu TNFR-p75 a TNFR-p55 se zkoušejí různé koncentrace muteinu v rozmezí od 10 do 10 pg/ml (lOnásobné sériové ředění). Hodnoty IC50 (koncentrát potřebná pro 50% inhibici) se zjistí vynesením do grafu závislosti inhibice vazby proti koncentraci (viz obr. 1).
a) Symbol > označuje měřitelnou kompetitivní vazbu, ale bez dosažení 50 % při koncentraci 100 pg/ml.
Symbol >> označuje, že nebylo dosaženo měřitelné kompetitivní vazby při nejvyšší zkoušené koncentraci (100 pg/ml).
k) Snížení afinity se vypočítá vydělením hodnoty IC50, získané v případě muteinu, hodnotou IC50, získanou v případě TNF-α divokého typu. Hodnota IC50 odpovídající divokému typu TNF-α byla stanovena v každém jednotlivém souboru pokusů.zvlášť a zjistilo se, že kolísá v rozmezí od 15 do 45 ng/ml, v závislosti na várce rádiojodovaného TNF-a.
Claims (16)
1. Mutein humánního faktoru-α nekrózy nádorů (TNF-α) s vyšší vazebnou afinitou k humánnímu receptoru p75-TNF než k humánnímu receptoru p55-TNF nebo jeho farmaceutická sůl.
2. Sloučenina podle nároku 1 obsahující přinejmenším jednu odlišnou aminokyselinu, vzhledem k humánnímu TNF-α divokého typu, v poloze, která odpovídá poloze 33, 65, 67, 75, 143, 145 a/nebo 147 humánního TNF-a divokého typu.
3. Sloučenina podle nároku 2, obsahující přinejmenším jednu odlišnou aminokyselinu v poloze, která odpovídá poloze 143 a/nebo 145 humánního TNF-α divokého typu.
4. Sloučenina podle nároku 2, obsahující přinejmenším jednu z následujících změn aminokyseliny v poloze, která odpovídá označené poloze v sekvenci divokého typu:
A3 3T
K65A
K65W
QÓ7K
Q67T
Q67Y
L75H
L7 5W
D143N
D143E
D143F
D143W
D143Y
Dl 43 V
D143V - F144L - A145S
D143N - A145R
Dl 43V - A145S
A145R
A145D
A145G
A145H
A145K
A145F
A145S
A145T
A145W
A145Y
A 145 V
E146R
S147L
5. Sloučenina podle nároku 4, obsahující přinejmenším jednu z následujících změn aminokyseliny v poloze, která odpovídá označené poloze v sekvenci divokého typu:
K65W
D143N
D143E
D143F
D143W
D143Y
D143V
D143V - F144L - A145S
D143N - A145R
D143V - A145S
A145R
A145H
A145K
A1'45F
A145W
A145Y
6. Sloučenina podle nároku 5, obsahující přinejmenším jednu z následujících změn aminokyseliny v poloze, která odpovídá označené poloze v sekvenci divokého typu:
D143N
D143E
D143F
D143W
D143Y
D143V
D143V - F144L - A145S
D143N - A145R
Dl43V - A145S
A145R
A145K
A145F
A 1 4 5 W
A145Y
7. Sloučenina podle kteréhokoliv z předcházejících nároků obsahující přinejmenším jednu z následujících změn aminokyseliny v poloze, která odpovídá označené poloze v sekvenci divokého typu:
D143N D143Y A145F A145R A 1 4 5 W
D143N - A145R
8. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7 v pegylované formě.
9. Sekvence DNA kódující mutein podle kteréhokoliv z nároků 1 až 7.
10. Vektor obsahující sekvenci DNA podle nároku 9.
11. Hostitelská buňka obsahující vektor podle nároku 10.
12. Sekvence RNA, která je komplementární vůči sekvenci DNA podle nároku 10.
13. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 pro použití při chirurgickém nebo léčebném ošetření lidského nebo zvířecího těla nebo při diagnostické metodě.
14. Způsob výroby sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyznačující se tím, že se ve vhodném médiu kultivuje hostitelská buňka podle nároku 11 a potom se mutein purifikuje a purifikovaný mutein se popřípadě pegyluje nebo převede na sůl.
15. Farmaceutický přípravek, vyznačuj ící se t i m , že obsahuje sloučeninu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 v kombinaci s farmaceuticky vhodným nosičem.
16. Způsob výroby farmaceutického přípravku, v y značující se tím, že se sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8 míchá s netoxickým inertním a z terapeutického hlediska kompatibilním nosičem a vzniklá směs se zpracuje na vhodnou galenickou aplikační formu.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| EP93810224 | 1993-03-29 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ67694A3 true CZ67694A3 (en) | 1995-02-15 |
Family
ID=8214942
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ94676A CZ67694A3 (en) | 1993-03-29 | 1994-03-23 | MUTEIN OF HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF-a), PROCESS OF ITS PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED THEREON |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5597899A (cs) |
| EP (1) | EP0619372A1 (cs) |
| JP (1) | JPH089976A (cs) |
| CN (1) | CN1099802A (cs) |
| AU (1) | AU5901994A (cs) |
| BR (1) | BR9401321A (cs) |
| CA (1) | CA2119089A1 (cs) |
| CZ (1) | CZ67694A3 (cs) |
| FI (1) | FI941459A7 (cs) |
| HU (1) | HUT68218A (cs) |
| IL (1) | IL109094A0 (cs) |
| NO (1) | NO941142L (cs) |
| NZ (1) | NZ260146A (cs) |
| RU (1) | RU94009852A (cs) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| MA24169A1 (fr) * | 1996-05-08 | 1997-12-31 | Hoffmann La Roche | Traitement de l'asthme a l'aide de la tnfr-ig |
| EE9900461A (et) | 1997-04-15 | 2000-06-15 | Farmaceutisk Laboratorium Ferring A/S | Modifitseeritud TNFa molekulid, neid kodeeriv DNA ning selliseid TNFa molekule ja DNA sisaldavad vaktsiinid |
| CN1062274C (zh) * | 1997-10-07 | 2001-02-21 | 复旦大学 | 人肿瘤坏死因子α衍生物及其制备方法 |
| US6354297B1 (en) * | 1998-04-16 | 2002-03-12 | The Uniformed Services University Of The Health Sciences | Method and device for destroying fat cells by induction of programmed cell death |
| US6620382B1 (en) * | 1998-05-22 | 2003-09-16 | Biopheresis Technologies, Llc. | Method and compositions for treatment of cancers |
| US8197430B1 (en) | 1998-05-22 | 2012-06-12 | Biopheresis Technologies, Inc. | Method and system to remove cytokine inhibitor in patients |
| US20020077276A1 (en) * | 1999-04-27 | 2002-06-20 | Fredeking Terry M. | Compositions and methods for treating hemorrhagic virus infections and other disorders |
| US6379708B1 (en) * | 1999-11-20 | 2002-04-30 | Cytologic, Llc | Method for enhancing immune responses in mammals |
| US7687461B2 (en) * | 2000-03-02 | 2010-03-30 | Xencor, Inc. | Treatment of TNF-α related disorders with TNF-α variant proteins |
| US7662367B2 (en) * | 2000-03-02 | 2010-02-16 | Xencor, Inc. | Pharmaceutical compositions for the treatment of TNF-α related disorders |
| US7056695B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-06-06 | Xencor | TNF-α variants |
| US7101974B2 (en) | 2000-03-02 | 2006-09-05 | Xencor | TNF-αvariants |
| US20070172449A1 (en) * | 2000-03-02 | 2007-07-26 | Xencor, Inc. | TNF-alpha VARIANT FORMULATIONS FOR THE TREATMENT OF TNF-alpha RELATED DISORDERS |
| US7244823B2 (en) * | 2000-03-02 | 2007-07-17 | Xencor | TNF-alpha variants proteins for the treatment of TNF-alpha related disorders |
| US7446174B2 (en) | 2001-03-02 | 2008-11-04 | Xencor, Inc. | Protein based TNF-α variants for the treatment of TNF-α related disorders |
| US20030166559A1 (en) * | 2002-01-04 | 2003-09-04 | Desjarlais John R. | Dominant negative proteins and methods thereof |
| US7179891B2 (en) * | 2002-03-25 | 2007-02-20 | Tadanori Mayumi | Physiologically active complex |
| JP4177604B2 (ja) * | 2002-03-25 | 2008-11-05 | 株式会社林原生物化学研究所 | 生理活性複合体 |
| EP1578799B8 (en) * | 2002-12-02 | 2011-03-23 | Amgen Fremont Inc. | Antibodies directed to tumor necrosis factor and uses thereof |
| GEP20084487B (en) * | 2002-12-26 | 2008-09-25 | Mountain View Pharmaceuticals | Polymer conjugates of cytokines, chemokines, growth factors, polypeptide hormones and antagonists thereof |
| US7642340B2 (en) * | 2003-03-31 | 2010-01-05 | Xencor, Inc. | PEGylated TNF-α variant proteins |
| AU2004279895A1 (en) | 2003-10-10 | 2005-04-21 | Xencor, Inc | Protein based TNF-alpha variants for the treatment of TNF-alpha related disorders |
| TW200526780A (en) * | 2004-01-06 | 2005-08-16 | Hayashibara Biochem Lab | TNF antagonists and TNF inhibitors comprising the same as the active ingredient |
| PL1949915T3 (pl) * | 2004-04-30 | 2013-04-30 | Biopheresis Tech Inc | Sposób i układ do usuwania rozpuszczalnych TNFR1, TNFR2 i IL2R u pacjentów |
| GB0425972D0 (en) | 2004-11-25 | 2004-12-29 | Celltech R&D Ltd | Biological products |
| US20070065514A1 (en) * | 2005-09-22 | 2007-03-22 | Howell Mark D | Method for enhancing immune responses in mammals |
| US20080075690A1 (en) * | 2006-09-22 | 2008-03-27 | Mark Douglas Howell | Method for enhancing immune responses in mammals |
| WO2008127515A1 (en) * | 2007-03-01 | 2008-10-23 | Cytologic, Inc. | Compositions and method for enhancing immune responses in mammals |
| GB201510758D0 (en) | 2015-06-18 | 2015-08-05 | Ucb Biopharma Sprl | Novel TNFa structure for use in therapy |
| CN106540252B (zh) * | 2016-12-07 | 2020-04-28 | 四川大学 | 针对肿瘤坏死因子α的蛋白疫苗及其用途 |
| GB201621907D0 (en) | 2016-12-21 | 2017-02-01 | Ucb Biopharma Sprl And Sanofi | Antibody epitope |
| WO2018185247A1 (en) * | 2017-04-06 | 2018-10-11 | Universität Stuttgart | Tumor necrosis factor receptor (tnfr) binding protein complex with improved binding and bioactivity |
| WO2020260368A1 (en) | 2019-06-24 | 2020-12-30 | Universität Stuttgart | Tnfr2 agonists with improved stability |
| KR20240035998A (ko) | 2021-06-17 | 2024-03-19 | 이뮤니컴 인코포레이티드 | 포획 리간드로서의 변형된 tnf |
| AR133963A1 (es) * | 2023-09-29 | 2025-11-19 | Trex Bio Inc | MOLÉCULAS DE FUSIÓN VARIANTE TNF-a |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4179337A (en) * | 1973-07-20 | 1979-12-18 | Davis Frank F | Non-immunogenic polypeptides |
| DE3582183D1 (de) * | 1984-03-06 | 1991-04-25 | Dainippon Pharmaceutical Co | Dns den menschlichen tumornekrosisfaktor kodierend und das menschliche tumornekronisfaktor-polypeptid. |
| US4650674A (en) * | 1984-07-05 | 1987-03-17 | Genentech, Inc. | Synergistic cytotoxic composition |
| GR851626B (cs) * | 1984-07-05 | 1985-11-26 | Genentech Inc | |
| DE3750056T2 (de) * | 1986-06-20 | 1995-04-06 | Dainippon Pharmaceutical Co | Polypeptid-Mutanten des menschlichen TNF und für diese Mutanten codierende DNS. |
| JPH07106158B2 (ja) * | 1986-12-04 | 1995-11-15 | サントリー株式会社 | 抗腫瘍活性を有する新規ポリペプチドおよびその製造法 |
| WO1988006625A2 (en) * | 1987-02-26 | 1988-09-07 | Cetus Corporation | Arginine-depleted human tumor necrosis factor |
| DE3843534A1 (de) * | 1988-12-23 | 1990-07-12 | Basf Ag | Neue tnf-polypeptide |
| CA2055168A1 (en) * | 1990-11-21 | 1992-05-22 | Walter Fiers | Tnf-muteins |
| IL99120A0 (en) * | 1991-08-07 | 1992-07-15 | Yeda Res & Dev | Multimers of the soluble forms of tnf receptors,their preparation and pharmaceutical compositions containing them |
| SK376492A3 (en) * | 1992-04-02 | 1995-06-07 | Hoffmann La Roche | Tnf - muteins and method of their production |
-
1994
- 1994-03-15 CA CA002119089A patent/CA2119089A1/en not_active Abandoned
- 1994-03-17 EP EP94104154A patent/EP0619372A1/en not_active Withdrawn
- 1994-03-22 NZ NZ260146A patent/NZ260146A/en unknown
- 1994-03-23 IL IL10909494A patent/IL109094A0/xx unknown
- 1994-03-23 CZ CZ94676A patent/CZ67694A3/cs unknown
- 1994-03-23 HU HU9400829A patent/HUT68218A/hu unknown
- 1994-03-23 AU AU59019/94A patent/AU5901994A/en not_active Abandoned
- 1994-03-24 US US08/217,529 patent/US5597899A/en not_active Expired - Fee Related
- 1994-03-24 RU RU94009852/13A patent/RU94009852A/ru unknown
- 1994-03-28 BR BR9401321A patent/BR9401321A/pt not_active Application Discontinuation
- 1994-03-28 CN CN94103792A patent/CN1099802A/zh active Pending
- 1994-03-28 NO NO941142A patent/NO941142L/no unknown
- 1994-03-29 JP JP6059514A patent/JPH089976A/ja active Pending
- 1994-03-29 FI FI941459A patent/FI941459A7/fi unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| HU9400829D0 (en) | 1994-06-28 |
| BR9401321A (pt) | 1994-10-18 |
| NZ260146A (en) | 1995-10-26 |
| NO941142D0 (no) | 1994-03-28 |
| US5597899A (en) | 1997-01-28 |
| AU5901994A (en) | 1994-10-06 |
| IL109094A0 (en) | 1994-06-24 |
| FI941459A0 (fi) | 1994-03-29 |
| EP0619372A1 (en) | 1994-10-12 |
| CA2119089A1 (en) | 1994-09-30 |
| NO941142L (no) | 1994-09-30 |
| RU94009852A (ru) | 1996-07-20 |
| JPH089976A (ja) | 1996-01-16 |
| CN1099802A (zh) | 1995-03-08 |
| HUT68218A (en) | 1995-06-28 |
| FI941459A7 (fi) | 1994-09-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ67694A3 (en) | MUTEIN OF HUMAN TUMOR NECROSIS FACTOR (TNF-a), PROCESS OF ITS PREPARATION AND PHARMACEUTICAL COMPOSITION BASED THEREON | |
| AU659927B2 (en) | TNF-muteins | |
| US5652353A (en) | DNAs encoding tumor necrosis factor-α muteins | |
| US5863786A (en) | Nucleic acid encoding modified human tnfα (tumor necrosis factor alpha) receptor | |
| FI116943B (fi) | Menetelmä kasvainkuoliotekijän reseptoria sisältävien fuusioproteiinien valmistamiseksi ja niitä koodaava DNA ja vektori | |
| AU646695B2 (en) | Isolated viral protein cytokine antagonists | |
| US6262244B1 (en) | DNA and amino acid sequence specific for natural killer cells | |
| CA2422033A1 (en) | Method for treating inflammation | |
| EP0585939B1 (en) | TNF ligands | |
| AU627477B2 (en) | Interleukin ii analogs | |
| JP2837344B2 (ja) | 腫瘍壊死因子ミュテイン、その製法及び前記ミュテインをコードするポリヌクレオチド | |
| JPH10500300A (ja) | 単球走化性蛋白質−４ | |
| EP0528928A1 (en) | INTERLEUKIN-4 BINDING PROTEIN GAMMA | |
| JPH08188597A (ja) | 変異型ヒト腫瘍壊死因子 | |
| IE911108A1 (en) | Isolated Viral Protein Cytokine Antagonists |