CZ433898A3

CZ433898A3 - Nevodné protické peptidové formulace

Info

Publication number: CZ433898A3
Application number: CZ984338A
Authority: CZ
Inventors: James B. Eckenhoff; Cynthia L. Stevenson; Sally A. Tao; Steven J. Prestrelski; Jeremy C. Wright; Joe Leonard
Original assignee: Alza Corporation
Priority date: 1996-07-03
Filing date: 1997-07-01
Publication date: 1999-04-14
Also published as: EP0909175A1; IL127769A0; CN1231256C; NZ333580A; CA2259403A1; NO986209L; ZA975942B; JP2008195739A; WO1998000152A1; AU3407397A; CO4890854A1; PL189402B1; AR008060A1; HUP9903942A2; MY121684A; RU2203085C2; NO323933B1; AU737664B2; SK284490B6; CN1224356A

Description

Oblast techniky

Vynález se týká stabilních nevodných protických formulací peptidových sloučenin. Zvláště popisuje formulace s vysokou koncentrací peptidových sloučenin.

Dosavadní stav techniky

Hormon způsobující uvolnění luteinizačního hormonu (LHRH), který je také znám jako hormon uvolňující gonadotropin (GnRH), je dekapeptid se strukturou:

pGlu - His - Trp - Ser - Tyr - Gly - Leu - Arg - Pro - Gly NH₂.

Vylučuje ho hypotalamus a váže se na receptory na podvěsku mozkovém a uvolňuje luteinizační hormon (LH) a hormon stimulující folikuly (FSH). LH a FSH stimuluje pohlavní žlázy k syntéze steroidních hormonů. Je známa řada analogů LHRH, které zahrnují peptidy příbuzné k LHRH, které působí jako agonisty, a ty, jež působí jako antagonisty. (Zoladex, Physician's Desk Reference, 50. vyd., str. 28582861 (1996); U.S. patent č. 3,914,412, vydaný 21. 10. 1975; U.S. patent č. 4,547,370, vydaný 15. 10. 1985; U.S. patent č. 4,661,472, vydaný 28. 4. 1987; U.S. patent č. 4,689,396, vydaný 25. 8. 1987; U.S. patent č. 4,851,385, vydaný 25. 7. 1989; U.S. patent č. 5, 198,533, vydaný 30. 3. 1993; U.S. patent č. 5,480,868, vydaný 2. 1. 1996; WO92/20711 publikováno 26. 11. 1992; W095/00168 publikováno 5. 1. 1995; W095/04540 publikováno 16. 2. 1995; Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution, V. J. Helm, B. W. Muller, Pharmaceuticai Research, 7/12, str. 1253-1256 (1990); New Degradation Product of Des-Gly¹⁰-NH₂-LH-RH-Ethylamide (Fertirelin) in Aqueous Solution, J. Okada, T. Seo, F. Kasahara, K. Takeda, S.

Kondo, J. of Pharmaceuticai

·· 0« • · 0 · • · *· · • · · · · · • · ·· ··

Sciences, 80/2, pages 167-170 (1991); Characterization of the Solution Degradation Product of Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist, A. R. Oyler, R. E. Naldi, J. R. Lloyd, D. A. Graden, C. J. Shaw, M. L. Cptter, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/3, pages 371-375 (1991); Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution, M. F. Powell, L. M. Sanders, A. Rogerson, V. Si, Pharmaceutical Research, 8/10, pages 1258-1263 (1991)). Analogy LHRH jsou známy, že se používají pří léčbě onemocnění, které jsou závislé na hormonech, jako je zhoubné bujení u prostaty, benigní prostatomegalie, endometrioza, hysteromyom, metrofibrom, předčasná puberta nebo zhoubné bujení u prsní žlázy a jako antikoncepce. (U.S. patent č. 5, 480, 868, Vydány 2. 1. 1996). Aplikace s nepřerušovaným uvolňováním aktivní látky se preferuje v obou případech, jak u látek příbuzných s agonistou LHRH, které po opakované aplikaci redukují řadu dostupných receptorů tak, že dochází k potlačení produkce steroidních hormonů, tak i u látek příbuzných s antagonistou LHRH, které se musí aplikovat bez přerušení, aby došlo k trvalé inhibici endogenního LHRH (U.S,.. patent č. 5, 480,868, Vydaný 2. 1. 1996).

Nepřerušované parenterální podávání léků, zvláště peptidových léků, nese řadu výhod. V oboru je dobře známé použití implantovatelných nástrojů pro nepřerušované zavedení různých léků nebo jiných činidel. Typické nástroje se popisují například v publikacích: U. S. patenty č. 5,034,229; 5,057,318 a 5,110,596.

V obecném případě orální biodostupnost peptidů, které zahrnují sloučeniny příbuzné LHRH, je malá ( Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aquaous Solution, D. M. Johnson, R. A. Pritchard ), W. F. Taylor, D. Conley, G.

• · • · ·

Zuniga, K. G. McGreevy, Intl. J. of Pharmaceutics, 31, pages 125-129 (1986) ; Percutaneous Absorption Enhancement of Leuprolide, Μ. Y. Fu Lu, D. Lee, G. S. Rao, Pharmaceutical Research, 9/12, pages 1575-1576 (1992)).

V současné cLobě prodávané formulace LHRH, jeho analogů a příbuznycíi sloučenin , které se používají ve formě parenterálních injekcí , jsou vodné roztoky, které obsahují relativně nízké koncentrace sloučenin příbuzných s LHRH (0,05 mg/ml až 5 mg/ml) a mohou také obsahovat excipienty, jako je manitol nebo laktóza (Lutrepulse (gonadorelinacetate for IV injection), Physician's Desk Reference, 50 th Edition, pages 980-982 (1996); Factrel (gonadorelin HCI for subcutaneous or IV injection), Physician's Desk Reference, 50 th Edition, pages 2877-2878 (1996) ; Lupron (leuprolide aaetate for depot suspension), Physician's Desk Reference, 50 th Edition, pages 2556-2562 (1996)). Takové formulace sloučenin příbuzných s LHRH se musí skladovat buď v lednici nebo po krátkou dobu při teplotě místnosti.

Dostupné skladované formulace sloučenin příbuzných s LHRH aplikované nepřerušovaným uvolňováním po dobu 1 až 3 měsíců zahrnují formulaci obsahující 15 % sloučeniny příbuzné s LHRH dispergovanou v matrici z kopolymerů kyselin D, Lmléčné a glykolové, která tvoří cylindr' á je zavedena do těla podkožní injekcí (Zoladex, Physician-s Desk Reference, 50 th Edition, pages 2858-2861 (1996)), a formulaci obsaženou v mikropartikulích, které zahrnují jádro tvořené sloučeninou příbuznou s LHRH a želatinou a obklopené kopolymerem kyseliny D, L-mléčné a glykolové. Tyto mikropartikule jsou suspendovány v ředidle vhodném pro podkožní nebo intramuskulární injekci (Lupron (leuprolide aoítate for depot suspension), Physician's Desk Reference, 50 th Edition, pages 2556-2562 (1996)); Preparation of Three-Month Depot Injectable Microspheres of Leuprorelin Acetate Using • · flfl flfl · · ·· I flfl • flflfl pages 167-170 (1991);

Degradation Product of

Shaw, M. L. Cptter, J.

pages 371-375

1991);

Chemical and Physical

Biodegradable Polymers, Pharmaceutical Research, 11/8, pages 1143-1147 (1994)). Tyto produkty se musí skladovat při teplotě místnosti nebo nižší. Je známo, že vodné formulace sloučenin příbuzných s LHRH vykazují jak chemickou tak fyzikální nestabilitu, stejně jako degradaci po ozáření (Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution, V. J. Helm, B. W. Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, pages 1253-1256 (1990); New Degradation Product of DesGly¹⁰-NH₂-LH-RH-Ethylamide (Fertirelin) in Aquaous Solution, J. Okada, T. Seo, F. Kasahara, K. Takeda, S. Kondo, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/2,

Characterization of the Solution

Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist, A. R. Oyler, R. E. Naldi, J. R. Lloyd, D. A. Graden, C. J.

of Pharmaceutical Sciences, 80/3, Parenteral Peptide Formulations: Properties of Native Luteinizing

Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution, M. F. Powell, L. M. Sanders, A. Rogerson, V. Si, Pharmaceutical Research, 8/10, pages 1258-1263 (1991); Degradation of the LHRH Analog Nafareiin Acetate in Aquaous Solution, D. M. Johnson, R. A. Pritchard ), W. F. Taylor, D. Conley, G. Zuniga, K. G. McGreevy, Intl.'J. of Pharmaceutics, 31, pages 125-129 (1986); Pharmaceutical Manipulation of

Leuprorelin Acetate to Improve Clinical Performance, H. Toguchi, J. of Intl. Medical Research, 18, pages 35-41 (1990) ; Lor.g-Term Stability of Aqueous Solutions of Luteinizing Hormone-Releasing Hormone Assessed by an In-Vitro Bioassay an Liquid Chromatography, Y. F. Shi, R. J. Sherins, D. Brightwell, J. F. Gallelli, D. C. Chaterji, J. of Pharmaceutical Sciences, 73/6, pages 819-821 (1984); Solution Behavior of Leuprolide Acetate, an LHRH Agonist, as Determined by Circular Dichroism Spectroscopy, Μ. E. Powers, • * ···· ·· · ·· ·· • · · 4 4 4 4 4 4 4 4

4 4 4 · · 4 4 ·· 4 • 4 4 4 4 4 β 444444

4 4 4 4 4 4

4444 444 44 444 44 44

A. Adejei, Μ. Y. Fu Lu, M. C. Manning, Intl. J. of Pharmaceutics, 108, pages 49-55 (1994)). Formulace, které jsou stabilní (t₉₀ okolo 5 let), jsou velmi málo koncentrované (25 pg/ml) vodné pufrované roztoky, je .ž se skladují při teplotě ne vyšší než je teplota místnosti (25 °C) (Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution, M. F. Powell, L. M. Sanders, A. Rogerson, V. Si, Pharmaceutical Research, 8/10, pages 1258-1263 (1991)).

Je nutné připravit stabilní formulaci peptidů.

Podstata vynálezu

Vynález popisuje stabilní nevodné formulace, které jsou roztoky peptidových sloučenin v nevodných protických rozpouštědlech. Zvláště popisuje formulace, kde koncentrace peptidů je alespoň okolo 10 %. Tyto stabilní formulace se mohou skladovat při vyšších teplotách (např. 37 °C) po dlouhou dobu a zvláště implantovatelných zaváděcích se používají nástrojů jako ve formě dlouhodobě vylučované léky (například po dobu 1 až 12 měsíců i déle).

Vynález popisuje stabilní nevodné-formulace peptidových sloučenin; uvedené formulace obsahují alespoň jednu peptidovou sloučeninu v alespoň jednom nevodném protickém rozpouštědle. Zvláště preferované formulace zahrnují alespoň přibližně 10 % (hmotnost/hmotnost) peptidové sloučeniny.

Vynález dále popisuje způsoby přípravy stabilní nevodné formulace peptidové sloučeniny, které zahrnují rozpuštění alespoň jedné peptidové sloučeniny v nejméně jednom nevodném protickém rozpouštědle. Preferované formulace obsahují alespoň okolo 10 % (hmotnost/hmotnost) peptidové sloučeniny.

Dále vynález popisuje způsoby léčby Subjektu trpícího stavem, který může být zmírněn aplikací peptidové sloučeniny, « · 4 · · · racemizace a oxidace formulace stabilizují které zahrnují aplikaci účinného množství stabilní nevodné formulace obsahující nejméně jednu peptidovou sloučeninu v alespoň jednom nevodném protickém rozpouštědle.

Vynález je založen na neočekávaném objevu, že rozpouštění peptidových sloučenin v nevodných protických rozpouštědlech vede k vytvoření stabilních formulací. Dříve známé formulace peptidových sloučenin, což jsou zředěné pufrované vodné roztoky obsahují excipienty, jako jsou EDTA nebo kyselina askorbové, které se musí skladovat při nízkých teplotách (4 až 25 °C) , tvoří degradační produkty cestou, jako je kyselinou/bází katalyzovaná hydrolýza, deamidace, Naproti tomu současně nárokované peptidové sloučeniny při vyšších teplotách (např. 37 °C až 80 °C) a při vyšších koncentracích (to je nejméně okolo 10 %).

Standardní peptidové a proteinové formulace jsou tvořeny zředěnými vodnými roztoky. Dva kritické aspekty peptidové formulace zahrnují rozpouštění a stabilizaci molekuly léku.

Rozpouštění peptidů ve vodném prostředí je standardní, protože napodobuje přírodu. Rozpouštění v nevodném prostředí však není známo. Zjistilo se, že je možné formulovat peptidy v nevodných protických rozpouštědlech.

Stability peptidů se obvykle dosahuje úpravou jednoho nebo více následujících faktorů: pH, typ pufru, iontová síla, excipienty (EDTA, kyselina askorbová atd.). U těchto formulací nelze plně stabilizovat degradaci vyžadující vodu (hydrolýza, deamidace, racemizace). Naopak vysoce koncentrované formulace peptidů podle vynálezu vytvořené v nevodných roztocích, jako je propylenglykol a polyethylenglykol, jsou chemicky a fyzikálně stabilní. Taková rozpouštědla se považují za nevodná protická rozpouštědla. Některá nevodná protická rozpouštědla mohou snižovat rychlost degradace,

444444 4 4 · ·· 4 · • · · · · · · · · · · • 444 4 4 4 4 4 4 4

444 4 4 4 444444

4 4 4 4 4 · protože nemají velké dipólové momenty potřebné pro stabilizaci kroků určujících rychlost.

Vynález zahrnuje použití nevodných protických rozpouštědel, jako je propylenglykol a polyethylenglykoly, ke stabilizaci vysoce koncentrovaných peptidových a proteinových formulací proti chemické a fyzikální degradaci. Objev zahrnuje realizaci použití propylenglykolu nebo polyethylenglykolů pro zlepšení rozpustnosti a stability peptidů v širokém rozmezí podmínek formulace, které zahrnují vysoké koncentrace a vyšší teploty, což umožňuje zavedení peptidů v implantovatelných zaváděcích nástrojích, což by nebylo jinak proveditelné.

A. Definice:

Následující termíny mají tyto významy:

Termín chemická stabilita znamená, že se tvoří přijatelné procento degradačních produktů produkované chemickou cestou, jako je oxidace nebo hydrolýza. Formulace je zvláště považována za chemicky stabilní, jestliže se po dvou měsících při teplotě 37 °C netvoří více jak přibližně 20 % degradačních produktů.

Termín fyzikální stabilita znamená, že se tvoří přijatelné procento agregátů (např. dimerů, trimerů a větších forem). Formulace se zvláště považuje za fyzikálně stabilní, jestliže se po dvou měsících při teplotě 37 °C netvoří více jak přibližně 15 % agregátů.

Termín stabilní formulace znamená, že po dvou měsících při teplotě 37 °C alespoň 65 % peptidové sloučeniny zůstává chemicky a fyzikálně stabilní (nebo při ekvivalentních podmínkách při vyšší teplotě). Zvláště preferované formulace jsou ty, kde za těchto podmínek zůstává alespoň 80 % sloučeniny chemicky a fyzikálně stabilní. Zvláště preferované stabilní formulace jsou ty, které nevykazují žádnou degradaci • ·

444 444

4 • · 44

4 4 4 4 4 ·* • 4 · · 4

4444 4 ·

4 4 4 4 »44 po sterilizaci ozářením (např. paprsky gama, beta nebo elektronovými paprsky).

Termíny „peptid a/nebo „peptidová sloučenina znamenají polymery až do přibližně 50 aminokyselinových zbytků spojených dohromady amidovými vazbami (CONH). Tyto termíny zahrnují analogy, deriváty, agonisty, antagonisty a farmaceuticky přijatelné sole libovolného z nich. Tyto termíny také zahrnují peptidy a/nebo peptidové sloučeniny, které obsahují jako součást struktury D-aminokyseliny, modifikované, derivatizované nebo přirozeně se nevyskytující aminokyseliny v D- nebo L- konfiguraci a/nebo peptomimetické jednotky.

Termín „sloučenina příbuzná s LHRH znamená hormon uvolňující luteinizační hormon (LHRH) a jeho analogy a farmaceuticky přijatelné sole. V termínu „sloučenina příbuzná s LHRH jsou zahrnuty okta-, nona- a deka-peptidové agonisty a antagonisty LHRH, stejně jako nativní LHRH. Zvláště preferované sloučeniny příbuzné s LHRH zahrnují LHRH, leuprolid, goserelin, nafarelin a jiné známé aktivní agonisty a antagonisty. (Zoladex, Physician's Desk Reference, 50th Edition, str. 2858-2861 (1996); U.S. patent č. 3,914,412, vydaný 21.10.1975; U.S. patent č. 4,547,370, vydaný 15.10.1985; U.S. patent č. 4,661,472, vydaný 28.4.1987; U.S. patent č. 4,689,396, vydaný 25.8.1987; U.S. patent č. 4,851,385, vydaný 25.7.1989; U.S. patent č. 5,198,533, vydaný 30.3.1993; U.S. patent č. 5,480,868, vydaný 2.1.1996; WO92/20711 publikováno 26.11.1992; W095/00168 publikováno 5.1.1995; W095/04540 publikováno 16.2.1995; Stability of Gonadorelin and Triptorelin in Aqueous Solution, V. J. Helm,

B. W. Muller, Pharmaceutical Research, 7/12, pages 1253-1256 (1990) ; New Degradation Product of Des-Gly¹⁰-NH2~LH-RHEthylamide (Fertirelin) in Aqueous Solution, J. Okada, T. Seo, F. Kasahara, K. Takeda, S. Kondo, J. of Pharmaceutical

4444

4

4 4

444

Sciences, 80/2, pages 167-170 (1991); Characterization of the Solution Degradation Product of Histrelin, a Gonadotropin Releasing Hormone (LHRH) Agonist, A. R. Oyler, R. E. Naldi, J. R. Lloyd, D. A. Graden, C. J. Shaw, M. L. Cotter, J. of Pharmaceutical Sciences, 80/3, pages 371-375 (1991); Parenteral Peptide Formulations: Chemical and Physical Properties of Native Luteinizing Hormone-Releasing Hormone (LHRH) and Hydrophobic Analogues in Aqueous Solution, M. F. Powell, L. M. Sanders, A. Rogerson, V. Si, Pharmaceutical Research, 8/10, pages 1258-1263 (1991); Degradation of the LHRH Analog Nafarelin Acetate in Aquaous Solution, D. M. Johnson, R. A. Pritchard ) , W. F. Taylor, D. Conley, G. Zuniga, K. G. McGreevy, Intl. J. of Pharmaceutics, 31, pages 125-129 (1986); Percutaneous Absorption Enhancement of Leuprolide, Μ. Y. Fu Lu, D. Lee, G. S. Rao, Pharmaceutical Research, 9/12, pages 1575-1576 (1992); Lutrepulse (gonadorelin acetate for IV injection), Physician's Desk (1996); Factrel IV injection),

Reference, 50 th Edition, pages 980-982 (gonadorelin HCl for subcutaneous or Physician^s Desk Reference, 50 th Edition, pages 2877-2878 (1996); Lupron (leuprolide aotate for depot suspension), Physician's Desk Reference, 50 th Edi-tion, pages 2556-2562 (1996) ) .

Termín vysoká koncentrace znamená alespoň přibližně 10 % (hmotnost/hmotnost) až hodnotu maximální rozpustnosti určité sloučeniny.

Termín excipient znamená více nebo méně inertní sloučeninu ve formulaci, která se přidává jako ředidlo nebo jako vehikl nebo je nutná pro dosažení určité formy nebo konzistence. Excipienty se odlišují od rozpouštědel, jako je EtOH, které se používají k rozpuštění léků ve formulacích, od neiontových povrchově aktivních látek, jako je Tween 20, které se také používají k rozpuštění léků ve formulacích, a

4444 «♦ 4 ·♦ *·

4·· 4 4 44 4444

444 4 4 4 4 4 4 4

444 4 4 4 444444 od konzervačních činidel, jako jsou benzylalkoholy a metylnebo propylparabeny, které se používají při prevenci nebo inhibici mikrobiálního růstu.

Termín „nevodné protické rozpouštědlo znamená nevodné rozpouštědlo, které obsahuje vodík spojený s kyslíkem nebo dusíkem tak, že je schopen tvořit vodíkové vazby nebo poskytnout proton. Příklady nevodných protických rozpouštědel jsou polyethylenglykoly (PEG), propylenglykol (PG) , polyvinylpyrrolidon (PVP), methoxypropylenglykol (MPEG), glycerol a glykofurol.

Termín „polární aprotické rozpouštědlo znamená polární rozpouštědlo, které neobsahuje kyselý vodík a nepůsobí jako donor vodíkové vazby. Příklady polárních aprotických rozpouštědel jsou dimethylsulfoxid (DMSO), dimethylformamid (DMF), hexamethylfosforotriamid (HMPT) a N-methylpyrrolidon.

B. Příprava formulací:

Vynález popisuje nevodné formulace peptidových sloučenin v nevodném protickém rozpouštědle, které jsou stabilní po delší dobu a při vyšších teplotách. Standardní ředěné vodné peptidové a proteinové formulace vyžadují k dosažení stability volbu typu pufru, iontové síly, pH a ekcipientů (např. EDTA nebo kyselina askorbová). Naopak formulace, na které se uplatňuje ochrana, dosahují stabilizace peptidových sloučenin použitím nevodných protických rozpouštědel. Formulace podle vynálezu zvláště vykazuje stabilitu sloučenin s vysokou koncentrací (alespoň 10 % hmotnost/hmotnost).

Příklady peptidů a peptidových sloučenin, které se mohou formulovat podle vynálezu, zahrnují ty peptidy, které mají biologickou aktivitu nebo které se mohou použít při léčbě onemocnění nebo jiného patologického stavu. Uvedené peptidy zahrnují, ale nejsou omezeny na adrenokortikotropní hormon, angiotensin I a II, síňový natriuretický peptid, bombesin, ···· • · • 0 · 0

0 0 0 0 0 0

000 0 00 0

0 0 0 0 0 0

000 0 0 0 «00040 • 0 0 0 0 0 0

0000 000 00 000 00 00 bradykinin, kalcitonin, cerebellin, dynorfin A, endorfin alfa a beta, endotelin, enkefalin, epidermální růstový faktor, fertirelin, folikulární peptid uvolňující gonadotropin, galanin, glukagon, gonadorelin, gonadotropin, goserelin, peptid uvolňující růstový hormon, histrelin, inzulín, leuprolid, LHRH, motilin, nafarelin, neurotensin, oxytocin, somatostatin, substance P, faktor nekrózy nádoru, triptorelin a vasopressin. Mohou se také použít analogy, deriváty, antagonisty, agonisty a farmaceuticky přijatelné sole shora uvedených látek.

Peptidové sloučeniny použitelné ve formulacích a metodách podle vynálezu se také mohou použít při tvorbě sole, s výhodou při tvorbě farmaceuticky přijatelné sole. Použitelné sole jsou známy v oboru a zahrnují sole anorganických kyselin, organických kyselin, anorganických bází nebo organických bází. Upřednostňované sole jsou acetátové sole.

Při použití podle vynálezu se preferují peptidy a peptidové sloučeniny, které jsou snadno rozpustné v nevodných protických rozpouštědlech. Odborník může jednoduše stanovit, které sloučeniny jsou použitelné na základě jejich rozpustnosti, to znamená, že sloučenina- musí být rozpustná v určitém nevodném protickém rozpouštědle, alespoň v přijatelném množství, které by mělo být farmaceuticky účinné množství. Preferované rozpustnosti jsou alespoň okolo 10 % (hmotnost/hmotnost). Zvláště preferované peptidové sloučeniny jsou sloučeniny příbuzné s LHRH, které zahrnují leuprolid a leuprolidacetát.

Poměr peptidu může kolísat v závislosti na sloučenině, na léčeném stavu, na rozpustnosti sloučeniny, na očekávané dávce a na délce aplikace (popisuje se například v publikacích: The Pharmacological Basis of Therapeutics,

Gilman et al., 7^th ed. (1985) a Pharmaceutical Sciences, φφ φφφφ φ φ φ φ φφφ φφ φφ » φ φ φ

I Φ Φ Φ φφφ φφφ hodnoty 20 % až (hmotnost/hmotnost). V rozmezí okolo 30 % protickém rozpouštědle, rozpouštědel, jako je

Remington, 18^th ed. (1990)). Koncentrace peptidu ve vysoce koncentrovaných formulacích se může pohybovat od hodnoty okolo 10 % (hmotnost/hmotnost) až do hodnoty maximální rozpustnosti sloučeniny. Preferované rozmezí je od přibližné do hodnoty přibližně 60 % současné době se více preferuje až do hodnoty okolo 50 % (hmotnost/hmotnost) a nejvíce se preferuje rozmezí okolo 35 % až do hodnoty okolo 45 % (hmotnost/hmotnost).

V obecném případě stabilní formulace podle vynálezu se mohou připravit jednoduše rozpuštěním požadovaného množství požadované peptidové sloučeniny ve vybraném nevodném Zjistilo se, že v případě polymerních PEG, je rozpustnost nepřímo úměrná molekulové váze rozpouštědla. Preferovaná nevodná protická rozpouštědla zahrnují propylenglykol (PG) , polyethylenglykol (PEG), methoxypropylenglykol (MPEG), glycerol a polyvinylpyrrolidon (PVP).

Odborník ví, že je výhodné do farmaceutických peptidových formulací přidat vodu, pufr, solubilizátor, jako je neiontové povrchové činidlo, eXýcipienty, jako je EDTA, a konzervační činidla, jako jsou benzylalkoholy, methyl- nebo propylparabeny (uvádí se například v publikaci: Phar .maceutical Sciences, Remington, 18^th ed. (1990)). Taková činidla se mohou přidat do formulací s nárokovanou ochranou.

C. Metodologie

Zjistilo se, že stabilní nevodné formulace peptidových sloučenin se mohou připravit rozpuštěním peptidové sloučeniny v nevodných protických rozpouštědlech.

Testovala se stabilita uvedených formulací, které obsahují peptidové sloučeniny, zvláště sloučeninu příbuznou s

LHRH, jako je leuprolid, tak, že se látky vystavily • · • ft ftftftft • · • ··· ft • · ftft • ftft ftft · · ft ft · · · • ft · · · ft ftft • ftft ftft ftft urychlenému stárnutí při vyšší teplotě a měřila se chemická a fyzikální stabilita formulací. Výsledky těchto studií (jsou uvedeny například v tabulce č. IIÍ a na obrázcích č. 1, 2, 6 a 7) ukazují, že tyto formulace jsou stabilní za podmínek, které se blíží nebo přesahují podmínky skladování při teplotě 37 °C po dobu jednoho roku.

Také se testovala stabilita formulací obsahujících peptidové sloučeniny, které se připravily zde popsaným způsobem, po ozářením gama paprsky v intenzitě '1,5 megarad. Výsledky uvedené v tabulce č. IV ukazují, že tyto formulace zůstaly po takovém ozáření chemicky a fyzikálně stabilní. Formulace ozářené elektronovými paprsky také zůstaly stabilní.

Jak se uvádí v tabulce č. 1, testovala se stabilita rozsáhlé řady peptidových formulací, zvláště leuprolidu, goserelinu, LHRH, bradykininu, inzulínu a trypsinogenu tím, že se rozpustily (nebo se pokusily rozpustit) ve vodě, pak se vystavily zrychlenému stárnutí při vyšších teplotách. Měřila se stabilita formulací. Výsledky se uvádějí v tabulce č. I, jako poločasy rozpadu při teplotě 37 °C, přičemž předpokládaná hodnota E_a je 22,2 kcal/mol. Řada testovaných peptidů je rozpustná v nevodných protických rozpouštědlech a zůstávají za testovaných podmínek stabilní. Rozpustnost určitého peptidů ve vodě a stabilita výsledného roztoku je snadno stanovitelná za použití rutinních procedur, které jsou dobře známy v oboru.

Tabulka č. I: Stabilita peptidů v nevodných protických rozpouštědlech.

Formulace	Poločas rozpadu* (teplota)
40 % leuprolid v PG	5,2 let (37 °C)
40 % goserelin v PG	6,2 let (80 °C)
20 % LHRH v PG	1,2 let (65 °C)
20 % bradykinin v PG	3,2 měsíce (65 °C)
20 % inzulín v PG	Degradoval během 24 hodin (65 °C)

0·

0 0 0

000 »00

0

00

000

0 0000 • · • ·00

0 00

40 % trypsinogen v PG	Nerozpustný
40 % trypsinogen v PEG	Nerozpustný
20% trypsinogen v PEG	7,7 měsíců (65 °C)
•poločas rozpadu při teplotě 37 °C se odhaduje E_a = 22,2 kcal/mol

Formulace 40 % leuprolidu v propylenglykolu skladovaná po dobu šesti měsíců při teplotě 37 °C vykazuje lineární degradaci, což se měří celkovou ztrátou peptidu v roztoku. Analýza těchto dat poskytla hodnotu aktivační energie (E_a)

16,6 kcal/mol a tgo je 9,6 měsíců, což vykazuje stabilitu těchto formulací při vyšších teplotách.

Neočekávaně se také zjistilo, že jisté peptidové formulace podle vynálezu jsou bakteriostatické (to znamená, že inhibují bakteriální růst), bakteriocidní (to znamená, že způsobují odumírání bakterií) a sporicidní (to znamená, že usmrcují spory). Zvláště leuprolidové formulace v koncentraci 50 až 400 mg/ml vykazují bakteriostatickou, bakteriocidní a sporicidní aktivitu. Stabilita vzorků nebyla ovlivněna vnesením bakterií, což naznačuje, že enzymy uvolněné z odumřelých a lyžovaných bakterií neovlivnily nepříznivě stabilitu produktu. Prokazuje to, že tyto formulace nevyvolaly enzymatickou aktivitu.

Je známo, že některé peptidy, například kalcitonin a leuprolid, jsou fyzikálně nestálé a vykazují agregaci, gelovatění a fibrilaci, jsou-li formulovány v roztoku v nevodných protických rozpouštědlech stejně jako ve vodném roztoku. Například leuprolid je možno převést na gel zvýšením koncentrace peptidu, přídavkem solí nebo mírným mícháním. Zlepšení fyzikální stability umožní jednodušší parenterální aplikaci včetně použití implantovatelných systémů pro zavádění léků.

Dále se zjistilo, že, když se přidají polární aprotická rozpouštědla, jako je DMSO, k formulacím jistých peptidů, • « « «« · · · f · · · · • ··· · · • ft · · · • 9 9 9 •9494·· 44

94 44

4 4 4 4

4 9 4 4 • 4 449 444

9 9

449 ·· 44 jako je leuprolid, goserelin a kalcitonin, v nevodných protických rozpouštědlech, předejde se rosolovatění formulací. Je tomu tak zřejmě proto, že nevodná polární aprotická rozpouštědla nutí peptidy tvořit konformaci náhodné šroubovice/alfa helixu, která se nemění na strukturu beta listu a proto nedojde ke tvorbě gelu. Tato rozpouštědla tedy působí proti tvorbě gelu.

Dále se studovala stabilita kapalných a rosolovitých (vzniklých mícháním) leuprolidových formulací v nevodném protickém rozpouštědle, kterým je PG (s koncentrací 370 mg/ml) in vitro při teplotě 37 °C a in vivo na krysách. Výsledky jsou uvedeny v tabulce č. II a ukazují, že jak gelové tak i kapalné formulace zůstávají stabilní po dobu 12 týdnů.

Tabulka č. II: Studie stability kapalných a gelových leuprolidových formulací v PG.

studie	doba (týdny)	kapalina (zbývající %)	gel (zbývající %)
dlouhodobá stabilita	6	98,50
dlouhodobá stabilita	12	98,00
krysy	6		97,40
krysy	12		95, 90

Hlavní aspekt vynálezu spočívá v tom, že nevodné roztoky obsahující peptidové sloučeniny v nevodných protických rozpouštědlech jsou stabilní při vysokých teplotách po dlouhou dobu. Takové formulace jsou stabilní i při použití vysokých koncentrací. Výhodou těchto formulací tedy je, že se mohou skladovat po dlouhou dobu při teplotě místnosti nebo vyšší. Tyto formulace jsou také vhodné při použití v implantovatelných zaváděcích nástrojích.

• · · · · · ·· Β··· • · • · · · roztoků leuprolidacetátu ztrátu leuprolidu ze

Přehled obrázků na výkresech

Obrázek č. 1 zobrazuje stabilitu 40 %roztoku leuprolidacetátu v propylenglykolu (PG) po dvou měsících při teplotě 80 °C, měřeno HPLC s reverzními fázemi (RP-HPLC).

Obrázek č. 2 znázorňuje RP-HPLC stejného vzorku jako na obr. č. 1, naneseného na vylučovací chromatografií na základě velikosti (SEC) zobrazující tvorbu 3 % dimeru a trimeru, přičemž agregáty vyššího řádu nebyly detekovány.

Obrázek č. 3 znázorňuje Arrheniův vztah vykazující ztrátu leuprolidu ze 40® v propylenglykolu (PG).

Obrázek č. 4 znázorňuje ztrátu leuprolidu ze 40% leuprolidového roztoku v propylenglykolu po dobu 4 až 6 měsíců při teplotě 37 °C, 50 °C, 65 °C nebo 80 °C.

Obrázek č. 5 znázorňuje chemickou a fyzikální stabilitu 40% leuprolidového roztoku v PG po čtyřech měsících při teplotě 80 °C.

Obrázek č. 6 znázorňuje chemickou stabilitu 40% roztoku leuprolidacetátu v PG po devíti měsících při teplotě 37 °C.

Obrázek č. 7 znázorňuje chemickou stabilitu 40% roztoku leuprolidacetátu v PG/acetátovém pufru . (30 : 70) po jednom roce při teplotě 37 °C.

Obrázek č. 8 znázorňuje fyzikální stabilitu 40% roztoku leuprolidacetátu v PG/acetátovém pufru (30 : 70) po jednom roce při teplotě 37 °C.

Obrázek č. 9 znázorňuje stabilitu 40% roztoku leuprolidacetátu ve směsi PG/voda s konzervačními přísadami (30 : 70) po šesti měsících při teplotě 60 °C po ozáření.

999 99 99

9

999

Obrázek č. 10 znázorňuje dlouhodobou fyzikální stabilitu 40 % roztoku leuprolidacetátu ve směsi PG/voda (30 : 70) po šesti měsících při teplotě 37 °C po ozáření.

Obrázek č. 11 znázorňuje stabilitu 30 % roztoku goserelinu v PEG 600/acetátovém pufru (30 : 70) po 14 dnech při teplotě 80 °C.

Příklady provedení vynálezu

1. Příprava leuprolidacetátových roztoků.

Leuprolidacetát (získaný například od firmy Mallinckrodt, St. Louis, Missouri) se zvážil a rozpustil se v médiu (PG, PEG, MPEG, PG/H₂O, PEG/PG, MPEG/H₂O nebo PG s EDTA) ve vhodné koncentraci (hmotnost/hmotnost) při teplotě 80 °C, podle potřeby se míchal a/nebo centrifugoval. Jestli není jinak uvedeno, termín PEG znamená PEG 300. Termín suchý PG znamená PG formulace připravené v prostředí s nízkou vlhkostí (to znamená v atmosféře dusíku).

Není-li uvedeno jinak obsah volné leuprolidové báze se vypočítal z dokumentu potenciálních hodnot analýzy, což je 37 % volné báze. To bylo 40 % leuprolidové báze.

2. Příprava rezervoárů.

Rezervoáry implantovatelných nástrojů pro zavedení léku (jak dokládá v přihláška U. S. patentu č. 08/595,761) se naplnily vhodným roztokem leuprolidacetátu. U naplněných nástrojů se pak testovala stabilita. Formulace se vnesly do titanových nebo polymerových rezervoárů a každý konec se zablokoval polymerní zátkou. Naplněný rezervoár se zatavil do polyfóliového sáčku a umístil se do trouby vhodné pro testování stability.

• 0 0000 • 0 • 0 0 0 · 00 · · 0 0 00 0

0 0 0 0 0 0

000 · 0 0 000 000 0 0 0 0 0 0 0 000 000 00 000 00 00

Je nutné poznamená^ že formulace uvnitř rezervoáru uvedených nástrojů jsou zcela izolovány od vnějšího prostředí.

3. HPLC s reverzními fázemi (RP-HPLC).

U všech testovaných vzorků se stanovila koncentrace leuprolidu a % pfocJjy píku za použití eluce gradientem v testu HPLC s reverzními fázemi s chlazeným autosamplerem (při teplotě 4 °C), aby se minimalizovala degradace vzorku. Podmínky chromatografie jsou uvedeny dále v textu.

Podmínky RP-HPLC

Popis	Parametr
kolona	HaiSil C18, 4,6x250 mm, S/N 5103051
průtoková rychlost	0,8 ml/min
nanesený objem	20 μΐ
detekce	210 nm
čas retence leuprolidu	mezi 25 až 30 minutami
mobilní fáze	A = 100 mM fosforečnan sodný, pH 3,0 B = 90 % acetonitril / voda
gradient	min 0 5 25 40 41 46 46,1 50 %B 15 26,5 26,5 65 85 85 15 15

Leuprolidové standardy (rozpuštěny ve vodě) ve 4 až 6 koncentracích, v typickém případě se- koncentrace pohybuje mezi 0,1 až 1,2 mg/ml, se testovaly společně se vzorky, u nichž se testovala stabilita. Vzorky, kde se testovala stabilita, se srovnávaly se standardní sadou, přičemž standardní sada neobsahovala více jak 40 vzorků. Zahrnuly se všechny píky mezi objemem dutiny a 45 minutami průběhu testu. Integrované p píků leuprolidových standardů se vynesly do grafu jako funkce koncentrace. Koncentrace leuprolidu ve vzorcích, kde se testovala stabilita, se pak vypočítaly použitím metody lineární regrese. % p&oby píků v případě píku leuprolidu, součet všech píků, které se vymyly před leuprolidem (označeno jiné) a součet všech píků eluovaných • 1 ·*·· 4· * · · · · • ··· · · • » · · · • · · · ··»···· ·· • ·4 ·· ·· · · · · · 4 · · • 4 ·»· «44 • · 4

444 4« ·· po leuprolidu (označeno agregáty) se také zaznamenaly a vynesly do grafu, jako funkce času eluce vzorků.

4. Vylučovací chromatografie na základě velikosti (SEC).

U vybraných vzorků, kde se testovala stabilita, se analyzovalo % pčvzhy píků a molekulové váhy za použití testu SEC s izokratickým roztokem a s chlazeným autosamplerem (při teplotě 4 °C) . Podmínky chromatografie jsou uvedeny dále v textu.

Podmínky SEC chromatografie

Popis	Parametry
kolona	Pharmacia Peptide, HR 10/30, 10 x 300 mm
průtoková rychlost	0,5 ml/min
nanesený objem	20 μΐ
detekce	210 nm
čas retence leuprolidu	Přibližně 25 minut
mobilní fáze	100 mM fosforečnan amonný, pH 2,0; 200 mM chlorid sodný; 30 % acetonitril

Při výpočtu molekulové váhy je potřeba znát objem dutiny a celkový objem kolony. Pro stanovení objemu dutiny a celkového objemu se použily standardy s vysokou molekulovou hmotností Bio-Rad a 0,1 % aceton. Zaznamenaly se retenční časy prvního píku u standardu Bio-Rad a acetonového píku a převedly se na objemové jednotky za použití rovnice uvedené dále v textu. Protože tyto hodnoty jsou konstantní pro určitou kolonu SEC a systém HPLC, objem dutiny a celkové objemy se musí stanovit vždy, když se provedou změny na koloně SEC nebo v systému HPLC. Pak se vzorky testovaly klasickým průběhem testu. Standardní směs obsahovala přibližně 0,2 mg/ml následujících peptidů: bursin (molekulová hmotnost je 449), peptid WLFR (molekulová hmotnost je 619), angiotensin (molekulová hmotnost je 1181), GRF (molekulová

hmotnost je 5108) a cytochrom C (molekulová hmotnost je 12 394). Tyto standardy se vybraly, protože měly srovnatelnou molekulovou hmotnost s leuprolidem a všechny měly hodnotu pl k<,iitkoy (9,8 až 11,0) podobnou leuprolidu.

% p&vrhy plků se zaznamenaly pro všechny píky. Molekulové hmotnosti separovaných latc-jc se vypočítaly za použití rovnic uvedených dále¹,

V_s = průtoková rychlost (ml/min) x retenční čas píku vzorku (min)

V_o = průtoková rychlost (ml/min) x retenční čas píku objemu dutiny (min)

V_t = průtoková rychlost (ml/min) x retenční čas celkového objemu píku (min)

K_d = V₃ - V_oV_t - V_o kde V_s je standardní objem nebo objem vzorku V_o je objem dutiny V_t je celkový objem

V_s se vypočítal pro každý standardní pík peptidů. Pak se vypočítala hodnota Kd pro každý peptidový standard za použití hodnot V_t a V_o, které se stanovily dříve. Křivka lineární regrese z grafu závislosti logaritmus molekulové hmotnosti versus Kd¹ se použila pro stanovení molekulových hmotností pro každý pík vzorku, u kterých se stanovovala stabilita. Zaznamenaly se % pCccáy píků vzorků ke stanovení stability.

5. Přístrojové vybavení a materiály.

Přístrojové vybavení a materiály používané při RP-HPLC a SEC byly následující:

• · ··· · · · · ···· ···· · · · · ·· ·

HPLC systém Waters Millennium obsahující autosampler 717, čerpadlo 626, kontrolní jednotku 6000S, fotodiodový detektor 900 a detektor indexu lomu 414 (Waters Chromatography, Milford, MA) zkumavky pro HPLC pro 48 pozic a pro 96 pozic (Waters Chromatography, Milford, MA)

HaiSil C18, 120 A, 5 pm 4, 6 x 250 mm kolona HPLC

(Higgins Analytical, Mountain View, CA)
Pharmacia Peptide, Biotech, Piscataway, NJ).	HR	10/30	kolona SEC	(Pharmacia
6. Čistota.
Vzorky pro stanovení	stability	se analyzovaly	za použití
RP-HPLC. Podíl fochy	pod	křivkou v případě	píku pro

leuprolid a součtu pfocfi pod křivkou všech píku dal % čistoty. (Je nutné poznamenat, že data % koncentrace prezentované s daty % čistoty (uvedeno v příkladech 6, 8, 9 a 10) jsou neprůkazná). Analytické metody používané pro stanovení % koncentrace v těchto experimentech nejsou spolehlivé.)

Příklad 1: Akcelerovaná studie stability leuprolidacetátových formulací.

Připravily se formulace 40 % (hmotnost/hmotnost) leuprolidacetátu (ekvivalent k 37 % leuprolidové volné bázi) ve vehikúLu, jak se popisuje shora v textu, a použily se k naplnění rezervoárů implantovatelných nástrojů pro zavedení léků, jak se také popisuje shora v textu. Některé rezervoáry se připravily z polymerových materiálů, zatímco některé byly titanové.

Naplněné nástroje se vystavily akcelerovanému stárnutí skladováním při vyšších teplotách (80 °C až 88 °C) v inkubátoru (Precision Scientific nebo Telco) po dobu sedmi • · • · · • · « • · » · » · • · · dní. To odpovídá přibližně šesti měsícům při teplotě 37 °C nebo přibližně jednomu roku při teplotě místnosti . (25 °C). Předpokládá se, že hodnota aktivační energie (E_a) je 16,6 kcal/mol.

Vzorky se analyzovaly za použití RP-HPLC a SEC, jak se popisuje shora v textu, aby se stanovila chemická a fyzikální stabilita stárnoucích formulací.

Výsledky uvedené v tabulce č. III ukazují, že tyto formulace jsou schopny udržet stabilitu LHRH-příbuzné sloučeniny leuprolidu. V každém případě se zachovalo alespoň 65 % leuprolidu.

Tabulka č. III: Stabilita leuprolidacetátových nevodných protických formulací po sedmi dnech skladování při vyšších teplotách.

Teplota (°C)	Materiál rezervoáru	Formulace	% leuprolidu po 7 dnech
88	Polymer	40 % v PG	70
88	Polymer	40% v PEG/H₂O (70/30)	73
88	Polymer	40% v PEG/H₂O (90/10)	77
88	Titan	40 % v PG	87
1 co co	Polymer	20% v PEG/PG (50/50)	74
88	Polymer	20 % v PEG/H2O (88/12)	68
80	Polymer	40 % v PG	74
80	Titan	40 % v PG	80
80	Titan	40% v PEG/H2O (90/10)	86
80	Titan	40 % v PG	87
80	Titan	40 % v PG	80
80	Titan	40 % v 1% EDTA v PG	80
80	Polymer	40% v MPEG 350/H₂O (50/50)	83
80	Titan	40% v suchém PG	76

• · ·

Příklad 2: Studie stability ozářených leuprolidacetátových formulací.

Připravila se formulace 40 % (hmotnost/hmotnost) leuprolidacetátu (ekvivalent 37 % leuprolidové volné báze) v pG, jak se popisuje shora v textu a použily se pro naplnění rezervoárů nástrojů pro zavedení léků, jak se také popisuje shora v textu. Všechny rezervoáry jsou připraveny z polymerových materiálů.

Naplněné nástroje se ozářily gama paprsky v intenzitě 2,5 megarad. Vzorky se poslaly do Sterigenics (Tustin, California) a ozářily se gama paprsky (kobalt 60) ve vsádkovém módu. Vzorky označené chlazené se posílaly na suchém ledu a ozáření proběhlo také na suchém ledu. Vzorky se pak vystavily zrychlenému stárnutí, jako v příkladu 1. Vzorky se odebraly v den 0 a v den 7 a analyzovaly se za použití RPHPLC a SEC, jak se popisuje shora v textu, aby se stanovila chemická a fyzikální stabilita ozářených formulací.

Výsledky uvedené v tabulce č. IV ukazují, že tyto leuprolidacetátové formulace jsou po ozáření stabilní. V každém případě se zachovalo alespoň 65 % leuprolidu s nízkým stupněm tvoření agregátů.

« · · · · · » 4 4

4 4 4

4 4 4 β 4 4 4

4 4 4

444 444

4

4 4 4

Tabulka č. IV: Stabilita 40 % (hmotn./hmotn.) leuprolidacetátových protických formulací po ozáření gama paprsky při intenzitě 2,5 megarad v polymerových rezervoárech.

SEC	den 7 \|	% dimeru /trimeru	rPO	ΟΊ LU	9 '5
% monomeru	lO χφ ΟΊ	σ fc ϊ—1 σ	92,2
den 0	% dimer /trimeru	1 6 '0	CQ O O	CM O
% monomeru	cn	CO co cn	CO CO σι
% leyuprolidu sedmý den (RP-HPLC)			co co	1⁷⁵ 1	75
Ozáření			ano	ω d	chlazeno
Formulace			\| 40 % v PG \|	\| 40 % v PG \|	\| 40 % v PG

i

• · · ·

Příklad 3: Studie rozpustnosti leuprolidacetátu v PG.

Připravily se leuprolidacetátové formulace v PG způsobem, který se popisuje shora v textu. Formulace se zahřály na teplotu 80 °C, aby se zrychlilo rozpouštění leuprolidu v PG. Data jsou uvedena v tabulce č. V dále v textu.

Tabulka č. V: % leuprolidu v PG

molekulová hmotnost leuprolidacetátu (mg)	molekulová hmotnost PG (mg)	celková hmotnost	% leuprolidacetátu
148,6	225, 7	374,3	39, 70
154	183, 7	337,7	45, 60
146, 8	147,2	294	49, 93

Příklad 4: Dlouhodobá akcelerovaná studie stability leuprolidacetátu v PG.

Připravily se roztoky 40% leuprolidacetátu (hmotnost./hmotnost.), které se naplnily do rezervoárů a skladovaly se po dobu 2 měsíců při teplotě 80 °C a podrobily se analýze, jak se popisuje shora v textu. Výsledky zobrazené na obr. č. 1 (RP-HPLC) a č. 2 (SEC) ukazují, že se po dvou měsících získalo 55,9 % leuprolidu, pouze s 37,2 % chemickou degradací a 15,2 % fyzikální agregací. Tyto formulace jsou stabilní (jak se definuje shora v textu) po dobu sedmi dní při teplotě 80 °C, což odpovídá dvěma měsícům při teplotě 37 °C.

Připravily se roztoky 40% leuprolidacetátu (hmotnost./hmotnost.), naplnily se do rezervoárů a skladovaly se po dobu 4 měsíců při teplotě 80 °C a podrobily se analýze za použití RP-HPLC, jak se popisuje shora v textu. Obrázek č. 5 zobrazuje graf pro leuprolid a jeho produkty chemické a fyzikální degradace, které se získaly během čtyř měsíců. Součet těchto tří elementů se také prezentuje jako hmotnostní • · flflfl· » · · » · · • flfl I bilance. Výsledky ukazují, že každý peptidový materiál může být s jistotou označen buď jako intaktní leuprolid nebo degradační produkt, z čehož vyplývá, že studie stability nevynechávají žádný neznámý degradační proces nebo produkt.

Připravily se roztoky 40 % leuprolidacetátu (hmotnost./hmotnost.) v PG, naplnily se do rezervoárů a skladovaly se po dobu 4 až 6 měsíců při teplotě 37 °C, 50 °C, 65 °C nebo 80 °C a podrobily se analýze za použití RP-HPLC, jak se popisuje shora v textu. Výsledky uvedené na obrázku č. 4 ukazují, že průběh degradace leuprolidu odpovídá kinetice pseudo-prvního řádu. Jak se popisuje dále v textu, obrázek č. 3 navíc ukazuje, že průběh degradace leuprolidu v PG odpovídá lineární Arrheniově kinetice. Proto jsou akcelerované studie stability platnou metodou pro odhad stability leuprolidu a extrapolaci na teplotu 37 °C.

Připravily se roztoky 40 % leuprolidacetátu (hmotnost./hmotnost.) v PG, naplnily se do rezervoárů a skladovaly se po dobu při teplotě 37 °C, 50 °C, 65 °C nebo 80 °C a podrobily se analýze za použití RP-HPLC, jak se popisuje shora v textu. Výsledky se vypočítaly způsobem, jak se popisuje v publikaci Physical Pharmacy: Physical Chemical Principles in the Pharmaceutical Sciences, 3^rd ed., Martin et al., Chapter 14 (1983) a ukazují, že hodnota E_a těchto roztoků je 16,6 kcal/mol a hodnota t₉₀ je při teplotě 37 °C

9,6 měsíců. Data jsou uvedena dále v textu a Arrheniovo grafické znázornění dat je zobrazeno na obr. č. 3.

PG
°C	Kobs (měsíce^-1)	ti/2 (měsíce)
37	1,12 x 10^-z	61, 6
50	3,13 x 10^-z	22,2
65	8,64 x 10^-z	1 O 00
80	0,322	2,4

E_a - 16,6 kcal/mol • · 4

Příklad 5: Dlouhodobá studie stability leuprolidacetátu v PG.

Chemická stabilita 40 % roztoků leuprolidacetátu připravených a analyzovaných způsobem, který se popisuje shora v textu, je zobrazen na obrázku č. 6. Po 9 měsících při teplotě 37 °C bylo přítomno více jak 90 % (90,1 %) leuprolidu s méně než 5 % (3,1 %) produktů chemické degradace (zobrazeno jako časné) a s méně než 10 % (5,6 %) fyzikální agregace (zobrazeno jako pozdní). Závěry jsou podloženy daty z RPHPLC, ale jsou v souladu s daty získanými metodou SEC.

Příklad 6: Dlouhodobá studie stability leuprolidacetátu v PG/acetátovém pufru.

Připravily se roztoky 30% leuprolidacetátů (hmotnost./hmotnost.) v PG/acetátovém pufru (pH 5,0, 0,0282

M) (v poměru 30 : 70), jak se popisuje shora v textu, a pak stírn-žn/di se naplnily do ampulí, ozářily se způsobem, který se popisuje shora v textu, a skladovaly se po dobu jednoho roku při teplotě 37 °C. Analýza (jak se popisuje shora v textu) pomocí RP-HPLC (obr. č. 7) a SEC (obr. č. 8) ukazuje, že tyto formulace jsou stabilní. Po devíti měsících analýza RP-HPLC ukazuje, že ve formulacích je přítomno více jak 70 % chemicky aktivního leuprolidu. Výsledky metody SEC ukazují, že ve formulacích je po 9 měsících při teplotě 37 °C přítomno 90 % fyzikálně stabilního leuprolidu.

Příklad 7: Dlouhodobé akcelerované studie stability leuprolidacetátu v PG/voda.

Připravily se formulace 40 % leuprolidacetátu (hmotnost/hmotnost) ve směsi PG/voda s konzervačními činidly (v poměru 30 : 70) smíšením 0,18 % methylparabenu a 0,025 % propylparabenu s vodou za vzniku směsi PG/voda v poměru 30 : 70 s konzervačním roztokem a rozpuštěním leuprolidacetátu v tomto roztoku, jak se popisuje shora v textu. Formulace se • 0 · · · · · • · · · · ·· · • ·

vnesly do skleněných ampulí, pak se ozářily a skladovaly se při teplotě 60 °C, jak se popisuje shora v textu.

Čistota se testovala v období šesti měsíců, jak se popisuje shora v textu. Výsledky jsou uvedeny na obrázku č.

9. Tyto data ukazují, že čistota těchto formulací je 45. den přes 90 % a v šestém měsíci je to okolo 65 %. Devadesátý den data vykazují velmi vysokou standardní odchylku.

Příklad 8: Dlouhodobé studie stability leuprolidacetátu v PG/voda.

Připravily se formulace 40 % . leuprolidacetátu (hmotnost/hmotnost) ve směsi PG/voda (30 : 70), jak se popisuje shora v textu. Nanesly se do skleněných ampulí, ozářily se a skladovaly se po dobu 6 měsíců při teplotě 37 °C, jak se popisuje shora v textu, pak se testovaly za použití HPLC.

Výsledky uvedené na obrázku č. 10 naznačují, že po 6 měsících se zachovalo více jak 70 % leuprolidu.

Příklad 9: Akcelerované studie stability goserelinu v PEG 600/acetátovém pufru.

Připravily se formulace 30 % goserelinu (hmotnost/hmotnost) ve směsi PEG 600/acetátový pufr, stejným způsobem jako v případě leuprolidacetátu, jak se popisuje shora v textu. Formulace se skladovaly ve skleněných ampulíčh po dobu 14 dnů při teplotě 80 °C a analyzovala se jejich čistota, jak se popisuje shora v textu.

Výsledky na obrázku č. 11 ukazují, že po devíti dnech se zachovalo 65 % goserelinu.

Příklad 10: Studie stability goserelinových formulací.

Připravily se formulace 40 až 45 % goserelinu (hmotnost/hmotnost) ve směsi PEG 600 nebo PG/acetátový pufr • fl fl··· • fl

flfl flfl « flfl · • flfl · flflfl flflfl (v poměru 30 : 70), způsobem, který se popisuje shora v textu a naplnily se do polymerových kontejnerů. Kontejnery se skladovaly v inkubátoru při teplotě 37 °C po dobu jednoho měsíce. Vzorky se analyzovaly za použití RP-HPLC za účelem stanovení chemické stability formulací, které prošly procesem stárnutí.

Výsledky uvedené dále v textu ukazují, že tyto formulace jsou schopny si udržet stabilitu LHRH-příbuzných sloučenin goserelinu. V každém případě se zachovalo alespoň 98 % goserelinu, jak se zjistilo z dat získaných testováním čistoty.

Lék	vehikl	% čistoty	Koncentrace %
goserelin	PEG 600	99, 3	23, 6
goserelin	PG/acetátový pufr (30 : 70)	98,2	49, 7

Příklad 11: Studie stability nafarelinových formulací.

Připravily se 15 % formulace (hmotnost/hmotnost) nafarelinu buď v PEG 600 nebo v propylenglykolu, jak se popisuje shora v textu v případě leuprolidu, a umístily se do polymerových kontejnerů.

Kontejnery se skladovaly v inkubátoru při teplotě 37 °C po dobu jednoho měsíce.

Vzorky se analyzovaly za použití RP-HPLC za účelem stanovení chemické stability formulací, které prošly procesem stárnutí.

Výsledky uvedené dále v textu ukazují, že tyto formulace jsou schopny si udržet stabilitu LHRH-příbuzné sloučeniny nafarelinu. V každém případě se zachovalo alespoň 99 % goserelinu, jak se zjistilo z dat získaných testováním čistoty.

···*

0 0 0 0 00 0000 0000 0000 0 0 0 0 0 0 0 0 »00 0 0 0 000000 0 0 0 0 0 0 0 000 00· 00 000 0» <0

Lék	vehikl	% čistoty	koncentrace %
nafarelin	PEG 600	99, 4	15, 8
nafarelin	PG	99, 4	12, 9

Modifikace shora uvedených módů, ke kterým dochází v různých provedeních vynálezu, jsou odborníkovi zřejmé.

j

Ρ A T E N

T 0 V É

Claims

NÁROKY

Změněné nároky

1. Stabilní nevodná formulace peptidové sloučeniny, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) alespoň jednu peptidovou sloučeninu; a (b) alespoň jedno nevodné protické rozpouštědlo, kde uvedená formulace je stabilní při teplotě 37 °C po dobu alespoň 3 měsíců.

2. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, přibližně 10 % (hmotnost/hmotnost)

3. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, přibližně 30 % (hmotnost/hmotnost) ž e obsahuje alespoň peptidové sloučeniny.

ž e obsahuje alespoň peptidové sloučeniny.

4. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, sloučenina je sloučenina příbuzná s ž e uvedená peptidová LHRH.

5. Formulace podle nároku 4, vyznačující se tím, že uvedená peptidová sloučenina je vybrala ze skupiny zahrnující leuprolid, LHRH, nafarelin a goserelin.

6. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, žejepo ozáření stabilní.

•4 4949

4

494

9

4 44

9 9

9 4

4 4

444

44

4 4 4

9 4 4

449 449 • · ·· 44

7. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že je při teplotě 37 °C stabilní alespoň po dobu jednoho roku.

8. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, žeje adaptována pro použití v implantovatelném nástroji pro zavedení léku.

9. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedené alespoň jedno nevodné protické rozpouštědlo je vybráno ze skupiny zahrnující PG, PEG a glycerol.

10. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že tvoří gel.

11. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jedno nevodné polární aprotické rozpouštědlo.

12. Formulace podle nároku 11, vyznačující se tím, že uvedeným polárním aprotickým rozpouštědlem je DMSO nebo DMF.

13. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje vodu.

14. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále obsahuje alespoň jednoho zástupce vybraného ze skupiny zahrnující excipient, povrchově aktivní činidlo, solubilizátor a konzervační činidlo.

ΒΒ ΒΒΒΒ ·♦

ΒΒΒ Β Β

ΒΒΒΒ Β Β

Β ΒΒΒΒ

Β ΒΒΒ

ΒΒΒΒΒΒΒ ΒΒ

ΒΒ Β·

Β Β Β Β

Β ΒΒΒ ΒΒΒ

Β Β ·» Β Β

15. Formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, žev podstatě obsahuje přibližně 30 % až přibližně 50 % (hmotnost/hmotnost) s LHRH příbuzné sloučeniny leuprolidacetátu v PG nebo PEG nebo jejich směsi.

16. Způsob přípravy stabilní nevodné formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje rozpuštění alespoň jedné peptidové sloučeniny v nejméně jednom nevodném protickém rozpouštědle.

17. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, přibližně 10 % (hmotnost/hmotnost)

18. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, přibližně 30 % (hmotnost/hmotnost) ž e se rozpustí alespoň peptidové sloučeniny.

ž e se rozpustí alespoň peptidové sloučeniny.

19. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, sloučenina je sloučenina příbuzná s ž e uvedená peptidová LHRH.

20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedená peptidová sloučenina je vybrána ze skupiny zahrnující leuprolid, LHRH, nafarelin a goserelin.

21. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že se přidá alespoň jeden člen skupiny zahrnující excipient, povrchově aktivní činidlo, solubilizátor a konzervační činidlo.

• • • • 0 00 0 0 0 • · · • · ·· · 4 4 4 4 0 0 • 0 0 0 4 0 04 0 0 0 4 0 0 0 0 4 0 0 0 4 000 400 0 0 0 0 000 00 «0 34 22. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se tím, že zahrnuj e přidání alespoň jednoho nevodného polárního aprotického rozpouštědla. 23. Způsob podle nároku 22, vyznačuj ící se tím, že uvedeným polárním aprotickým rozpouštědlem je DMSO nebo DMF. 24. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se tím, že zahrnuj e přidání vody. 25. Způsob podle nároku 16, vyznačuj ící se tím, že uvedené alespoň jedno

nevodné protické rozpouštědlo je vybralo ze skupiny zahrnující PG, PEG a glycerol.

26. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že přibližně 30 % až přibližně 50 % (hmotnost/hmotnost) LHRH příbuzné sloučeniny leuprolidacetátu se rozpustí v PG nebo PEG nebo v jejich směsi.

27. Způsob léčby subjektu trpícího stavem, který se může zmírnit aplikací peptidové sloučeniny, vyznačující se tím, že se uvedenému subjektu podá účinné množství formulace podle nároku 1.

28. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená aplikace je parenterální aplikace.

··«··· ftft · ftft ftft • ftft ftftftft ftftftft ftftftft ftft « ftftftft ft ftft· ft ft * ······ • ftftftft ftft ftftftft ··· ftft ftft· ftft ftft

29. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená aplikace je dlouhodobá aplikace.

30. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedená aplikace se provede použitím implantovatelného nástroje pro zavedení léku.

31. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedeným stavem je zhoubné bujení prostaty a uvedeným peptidem je leuprolid.

32. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že se denně aplikuje alespoň přibližně 80 mikrogramů leuprolidu.

33. Způsob podle nároku 32, vyznačující se tím, že denní aplikace trvá po dobu vybranou ze skupiny zahrnující 3 měsíce, 6 měsíců a 12 měsíců.

34. Způsob podle nároku 33, vyznačující se tím, že uvedená denní aplikace po uvedenou dobu je nepřerušovaná aplikace, která s provádí použitím implantovatelného systému pro zavedení léku

35. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že uvedeným stavem je zhoubné bujení prostaty a uvedeným peptidem je antagonista

LHRH.

44

4 · 4

4 4 4 »44 449

4

44

36. Způsob podle nároku 16, vyznačující se tím, že probíhá v atmosféře inertního plynu.

37. Způsob podle nároku 36, vyznačující se tím, že uvedenou atmosférou je suchý dusík.

38. Stabilní nevodná formulace peptidové sloučeniny, vyznačující se tím, že zahrnuje:

(a) alespoň jednu peptidovou sloučeninu; a (b) alespoň jedno polární aprotické rozpouštědlo, kde uvedená formulace vykazuje bakteriostatickou, baktericidní nebo sporicidní aktivitu, aniž se použije běžné bakteriostatické, baktericidní nebo sporicidní činidlo.

39. Způsob přípravy stabilní nevodné formulace podle nároku 38, vyznačující se' tím, že zahrnuje rozpuštění alespoň jedné peptidové sloučeniny v nejméně jednom polárním aprotickém rozpouštědle s podmínkou, že se do formulace nepřidá běžné bakteriostatické, baktericidní nebo sporicidní činidlo.

40. Způsob léčby subjektu trpícího stavem, který se může zmírnit aplikací peptidové sloučeniny, vyznačující se tím, že zahrnuje aplikaci účinného množství formulace podle nároku 38 uvedenému subj ektu.

číslo minuty

Λ _

AU způsob zpracování: SEC minuty