CZ426698A3 - Způsob zpracování rostlinných proteinů a nutriční výrobky z nich vyrobené - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká obecně způsobu zpracování rostlinných proteinů pro použití v nutričních výrobcích. Způsob využívá iontové výměnné technologie pro odstranění fytoestrogenů (též známých jako isoflavony), manganu, nukleotidů, nukleosidů a RNA z rostlinných proteinů, za zisku výrobku z rostlinného proteinu s redukovanou hladinou fytoestrogenů, manganu a nukleových kyselin. Vynález se také týká nutričních výrobků, které využívají výrobky z rostlinných proteinů jako zdroj amino dusíku. Stejný způsob může být také použit pro extrakci fytoestrogenů z rostlinných materiálů a pro přípravky, které obsahují izolované rostlinné fytoestrogeny.

Dosavadní stav techniky

Fytoestrogeny nebo rostlinné estrogeny se vyskytují v mnoha rostlinách, včetně rostlinných proteinových materiálů jako jsou ty, které jsou získávány ze sojových bobů. Fytoestrogeny jsou definovány jako rostlinné substance, které jsou strukturálně a funkčně podobné gonadálnímu steroidů 17 β-estradiolu nebo ty, které mají estrogenní účinky. Existují tři hlavní skupiny nesteroidních potravinových estrogenů, kterými jsou l) isoflavony, 2) coumestany a 3) mykoestrogeny (z hub).

Strukturální podobnost mezi těmito substancemi a endogenními savčími estrogeny byla studována. Přehled fytoestrogenů a jejich účinků u savců je uveden v Kaldas a Hughes, v • · « b ♦ · b · · • · a « •

• ·« · 9t

Reproductive and General Metabolic Effects of Phytoestrogens in Mammals, Reproductive Toxicology, svazek 3, str. 81 - 89, 1989. Znalosti z tohoto článku jsou všeobecně známé a nemusí zde být opakovány. Jak je použito v této přihlášce a připojených patentových nárocích, termíny isoflavony a fytoestrogeny jsou ekvivalentní, ve významu, ve kterém jsou tyto termíny definovány a používány v oboru (například Kaldas et al,, článek).

Flavonoidy a isoflavony jsou produkovány mnoha luštěninami a travinami, včetně mnoha rostlin běžně konsumovaných lidmi a domácími zvířaty. Sojové isoflavony zahrnují sloučeniny jako je daidzin, genistin, daidzein a genistein. Obecný strukturální vzorec pro tyto sloučeniny je;

daidzein Η H genistein H OH daidzin G H genistin G OH kde G = glukosyl

Nedávno bylo zjištěno, že isoflavony obsažené v rostlinných proteinech mohou mít škodlivý vliv na savce, kteří konsumují

Β Β

ΒΒΒΒ • Β * Β Β • Β « Β β Β Β

ΒΒ Β β Β · · · ··· >··

Β Β Β Β Β Β Β Β

ΒΒΒΒ ΒΒ ΒΒ ΒΒΒΒ ΒΒ ♦· rostlinné proteiny, viz Kaldas et al., výše. Koncentrace isoflavonů v izolatech nebo koncentrátech rostlinných proteinů jako jsou izoláty sojového proteinu mohou být az 3000 ptg/g proteinu. Isoflavony také způsobují hořkou nebo ”fazolovitou chutí rostlinných proteinů (viz Ewan et al., dále), mohou redukovat biodostupnost esenciálních minerálů a mohou ovlivňovat nutriční hodnotu proteinů (viz Kaldas et al., výše).

Konzumace isoflavonů lidmi a domácími zvířaty byla spojena s poruchou reprodukčních systémů u zvířat. Existuje určitá teorie, že konzumace současných dětských přípravků založených na sóji, které obsahují sojové isoflavony, může mít nežádoucí fyziologický vliv na vývoj neuro-endokriního systému dětí. Tato teorie je částečně založena na důkazu, že zvířecí krmivo založené na sóji může způsobit reprodukční problémy u gepardů. Setchell et al.', 1987, Gastroenterology, 93: 225 - 33.

Naopak, bylo také naznačeno, že isoflavony mohou mít v některých případech pozitivní farmaceutické účinky. Estrogeny mají dva protikladné účinky na nádory, v závislosti na dávce. Vyšší dávky inhibují vývoj karcinomu prsu, zatímco u malých dávek se zdá, že podporují růst nádoru. Tato dualita platí i pro fytoestrogeny nebo isoflavony. Isoflavony mohou stimulovat nebo inhibovat nádorový, růst (Setchell KDR a Welch MB, J.

Chrom. 386: 315 - 323, 1987; Naturaly Occuring Non-Steroidal Estrogens of Dietary Orígin, v McLachlan J.A. vyd., Estrogens in the Enviroment, New York: Elsevier Press, 1985: 69 - 85 a Setchell et al., Nonsteroidal Estrogens of Dietary Origin: Possible Roles in Hormone - Dependent Disease, Am. J. Clin. Nutr. 40: 569 - 578, 1984. Jedním mechanismem, kterým mohou isoflavony působit svůj protinádorový účinek, je blokáda

9 · 9 »

9 9 9 · · · *

·9 • 9 9 9

999

9 «99 ♦9*9 99 estrogenových receptorů a inhibice receptory zprostředkované odpovědi. Tak je schopnost endogenních estrogenů podporovat růst nádoru redukována. Existuje též nepřímý, demografický důkaz podporující isoflavony zprostředkovanou redukci nádorů z hormonálně reaktivních tkání vycházející z pozorování, že ženy v zemích s vegetariánskou dietou mají nižší incidenci karcinomu prsu ve srovnání s zeměmi s konzumací masa. Adlercreutrz et al., Determination of Urinary Lignans and Phytoestrogen Metabolites, Potential Antiestrogens and Anticarcinogens, in Urine of Women on Various Habituals Diets, Steroid. Biochem, 25: 791 - 797, 1986.

Isoflavony mají také antivirové a fungicidní vlastnosti.

Také se předpokládá úloha isoflavonů v redukci hladin sérového cholesterolu u lidí, pozitivní imunologické účinky a aktivita jako antioxidans. Posledním výhodným účinkem isoflavonů je zmírnění vazomotorických příznaků u menopausálních žen. V minulosti používali Čiňanky bylinné léky pro léčbu- návalů. Proto by měl mít proces, který umožní izolaci a koncentrování isoflavonů z rostlinného materiálu význam pro vědeckou komunitu a pro farmaceutický průmysl.

Předpokládá se úloha vysokých hladin manganu v tělesných tkáních ve vývoji kriminálního chování, viz Gottschalk et al., Abnormalities in Hair Trace Elements as Indicators of Aberrant Behavior, Compr. Psychiatry 32: 229 - 237, 1991 a Scientific American, March, 1995, str. 104 - 105. Kromě toho, byly také uveřejněny zprávy, že poruchy učení u dětí mohou být spojeny se zvýšenými hladinami manganu ve vlasech jak to popisuje Collip et al., v článku nazvaném Manganese in Infant Formula anď Learning Disabilities, Ann. Nutritional Metals 27: 488 00 ·0 ♦ ·0 · ·0 ·

000 000

0

0 0 • 0 • 0 • «' • 0 00 « «0

0 0 0

0 0 «00 0000 0·

Μ

494, 1983. Typický izolát rostlinných proteinů obsahuje více než 1000 p.g manganu na gram proteinu. Proto existuje potřeba zlepšených postupů, které ekonomicky a v komerčním rozsahu umožní redukci obsahu isoflavonů a manganu v rostlinném proteinu.

Na použití nukleotidů a nukleosidů (nebo nukleotidových ekvivalentů jak jsou definovány dále) v nutričních přípravcích se v posledních několika letech zaměřila značná pozornost. Bylo naznačeno, že určité hladiny a poměry různých nukleových. kyselin mohou mít pozitivní vliv na imunitní systém u savců a mohou také bránit některým nemocem, jako je průjem. Problém související s použitím rostlinného proteinu v takových nutričních přípravcích spočívá v tom, že rostlinný protein obsahuje typicky velmi -vysoké vlastní hladiny nukleových kyselin, které nemusí být v nejužitečnější formě (například jako RNA) nebo nemusí být v nej výhodnějších poměrech. Kromě toho, značné odlišnosti v obsahu nukleových kyselin způsobují problémy v komerční výrobě. Typický izolát rostlinného proteinu obsahuje více než 15 mg nukleotidových ekvivalentů na gram proteinu. Proto požaduje nutriční průmysl zdroj rostlinného proteinu, který má významně redukovanou hladinu vlastních nukleových kyselin.

Iontoměničová technologie je známá po mnoho let. Iontomeničová pryskyřice jsou typicky syntetické, nerozpustné zesítěné polymery nesoucí kyselé nebo bazické postranní skupiny. Mají vysoké iontoměničové kapacity a mohou být použity pro téměř neomezený počet reakcí. Iontoměničové pryskyřice jsou používány ve zpracování vody, extrakci, separaci, analýze a katalýze.

♦fc fcfc • · · · fc ♦· · • ·*· ·*· fc * fc· ·» • fc fc· ·· ·* • » « ♦ · · * • fcfcfc · · * • · ♦ · · · 4 • · · · * · fcfcfcfc ·· fc· fcfcfcfc

Iontoměničové pryskyřice mají rozsáhlý, otevřený molekulární systém, který obsahuje elektricky nabité iontové skupiny. Kationtový iontoměnič mění pozitivní ionty a proto má negativní ionty vestavené do svého skeletu. Aniontový iontoměnič má pozitivní ionty ve svém skeletu. Ionty mřížky se nazývají fixované ionty; menší ionty opačného náboje, které si mohou vyměňovat místo s ionty v roztoku, se nazývají protiionty.

Běžné problémy spojené s iontoměničovým procesem provedeným na proteinech zahrnují špatný zpětný zisk proteinů (t.j. . .

protein adheruje na pryskyřici) a neschopnost průchodu proteinové kaše přes vrstvu pryskyřice, což vede ke značnému poklesu tlaku v průběhu vrstvy pryskyřice. Způsob, který je zde popsán, splňuje požadavek nutričního průmyslu na ekonomický a komerčně životaschopný proces, který čistě separuje isoflavony z rostlinného proteinu, za zisku ekonomického zdroje isoflavonů, stejně jako vysokého výtěžku výrobku z rostlinného proteinu, který má značně redukovanou hladinu isoflavonů, manganu a nukleotidů.

U.S. patent č. 5352384, Shen, popisuje způsob pro výrobu rostlinných proteinových vláken obohacených o isoflavony. Tento patent popisuje použití glukosidasy pro přeměnu glukon-isoflavonů (t.j. daidzenu) v proteinové kaši na aglukon-isoflavony. Vláknitá frakce je potom získána z kaše centrifugací za zisku aglukonem obohaceného vlákna.

Článek od Ewan et al., v Journal of Food Science, svazek 57, č. 2, 1992, nazvaný: Isoflavone Aglucones and Volatile Organic Compoůnds in Soybeans; Effects of Soaking Treatments, popisuje příznivé účinky namočení sojových bobů v mírně alkalických • · · « «·· * · · ·»··· ···*·· · · *·»«·* ·· ···· ·· ·· roztocích NaHCO^ při zvýšených teplotách při výrobě sojového mléka se zlepšenou chutí. Tato publikace nepopisuje ani nenaznačuje použití iontoměničové pryskyřice pro odstranění isoflavonů, manganu a nukleových kyselin z rostlinného proteinu.

V článku publikovaném ve svazku 47 (1982) Journal of Food Science, str. 933 - 940, J. How a C. Morr, nazvaném Removal of Phenolic Compounds from Soy Protein Extracts Using Activated Carbon je popsáno zpracování extraktů sojových proteinů za použití aktivovaného uhlíku a iontoměničových procesů pro odstranění fenolických sloučenin, které byly popsány jako odpovědné za nežádoucí barevné a chučové charakteristiky výrobků ze sojových proteinů. Proteinové extrakty byly podrobeny dvoukrokovému, sekvenčnímu zpracování na iontoměničích před vysrážením proteinu. Proteinový extrakt byl čerpán spodním tokem přes kationtovou ionexovou kolonu v Na* formě a potom aniontovým iontoměničem v hydroxylové a chloridové formě pro odstranění polyvalentních aniontů včetně fenolických kyselin, fytatu a dalších.

U.S. patent č. 5248804, Nardelli et al., popisuje způsob pro odstranění fytatu z rostlinného proteinu za použití iontoměničových pryskyřic. Způsob využívá makroporosní aniontovou iontoměničovou pryskyřici- (slabou basi nebo silnou basi), která byla upravena 1) konversí na hydroxidovou formu;

2) konversí na chloridovou nebo síranovou formu; a 3) potom konversí na skupin silné base na uhličitanovou formu a skupin slabé base na formu volné base. Rostlinný protein obsahující fytat je potom uveden do kontaktu se zpracovanou pryskyřicí pro odstranění fytatu.

• * · • « » · · · · · • · •ffl ·* «· *···

Fytat obsahuje soli kyseliny fytové. Kyselina fytová je také známá jako inositolhexafosfat. Proto za použití aniontové výměnné pryskyřice poskytují vysoce anionické fosfátové skupiny prostředek, pomocí kterého může pryskyřice extrahovat fytat z proteinové kaše. Oproti tomu, isoflavony a nukleotidy jsou neutrální molekuly a nelze očekávat, že by se vázaly na pryskyřici nebo iontoměnič s anionty na pryskyřici.

U.S. patent č. 5492899, Masor et al., popisuje dětský přípravek s ribonukleotidy. Tento patent uvádí použití určitých koncentrací a poměrů nukleotidových ekvivalentů v dětských přípravcích a popisuje analytickou techniku pro identifikaci a kvantifikaci nukleotidových ekvivalentů v nutričním základu.

Jak je použito zde a v patentových nárocích, termín nukleotid je stejný jako termín nukleotidový ekvivalent, jak je definován v U.S. 5492899. U.S. 5492899 definuje nukleotidové ekvivalenty jako polymerickou RNA, ribo-nukleosidy, ribo-nukleosidy obsahující adukty a mono-, di- a trifosfatribonukleotidy.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález obsahuje způsob pro výrobu rostlinných proteinů s nízkým obsahem isoflavonu, manganu a/nebo nukleotidů. Vynález dále obsahuje proteinové izoláty s nízkým obsahem isoflavonu, manganu a nukleotidů samotné, a takové proteinové izoláty jsou vyrobeny způsobem podle předkládaného vynálezu. Předkládaný vynález dále obsahuje nutriční výrobky vyrobené z proteinových izolátů vyrobených způsobem podle předkládaného vynálezu. Jednou další výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je to, že iontoměničovou kolonou mohou * 00«

0 0 0 0 0 0 • 0 0 «00 00 0 0 00 0· 0 ·0 · být odstraněny nejen isoflavony a mangan, ale také významná část vlastních nukleových kyselin. Dalším aspektem vynálezu je to, Že isoflavony samotné mohou být izolovány dalším zpracováním iontoměničové pryskyřice Činidlem uvolňujícím isoflavony. Tyto a další aspekty předkládaného vynálezu jsou podrobněji popsány dále.

Proto, v prvním širším aspektu, vynález poskytuje způsob pro zpracování rostlinných proteinů, který obsahuje: a) získání kaše rostlinného proteinu, která.obsahuje isoflavony, mangan nebo nukleotidy; b) poskytnutí alespoň jedné aniontové iontoměničové pryskyřice schopné vazby isoflavonů, manganu nebo nukleotidů, které jsou přítomné v uvedené proteinové kaši; c) uvedení uvedené kaše do kontaktu s uvedenou aniontovou iontoměničovou pryskyřicí; a d) separaci uvedené kaše od uvedené aniontové iontoměničové pryskyřice, kde uvedená kaše rostlinného proteinu ma redukovaný obsah isoflavonů, manganu nebo nukleotidů.

Ve výhodné provedení je iontoměničová pryskyřice uvedena do aktivního stavu vystavením pryskyřice před kontaktem kroku c) činidlu, které dodává do pryskyřice výměnný aniont, který: i) nemění pH kontaktované proteinové kaše mimo rozmezí 6,0 až 9,5; a ii) nepřidává nevyhovující anion do kontaktované proteinové kaše v kroku d). Přesněji, pryskyřice mající místa silné base a slabé base může být uvedena do aktivního stavu tak, že je podrobena krokům:

i) konverse na hydroxidovou formu;

ii) konverse na chloridovou nebo síranovou formu; a iii) konverse alespoň některých z uvedených skupin silné base • · ·· • · · »·*· ·· na uhličitanovou formu a alespoň některých uvedených skupin slabé base na formu volné base.

Proto činidla použitelná pro toto uvedení do aktivního stavu zahrnují hydroxid sodný a hydroxid draselný pro krok i); kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu sírovou a chlorid sodný pro krok ii) ; a uhličitan sodný, hydrogenuhličitan sodný a hydroxid amonný pro krok iii).

Krok uvedení do kontaktu může obsahovat umístění aniontové iontoměničové pryskyřice do kaše; nebo alternativně, průchod kaše skrz strukturu (jako je vertikální kolona), která obsahuje aniontovou iontoměničovou pryskyřici a má alespoň jeden vstup a jeden výstup. Výhodně je vstup umístěn níže než výstup, jak je tomu u vertikální kolony.

Způsob může volitelně obsahovat další kroky nového upravení iontoměničové pryskyřice za použití kroků podobných krokům popsaným výše a opětovného použití pryskyřice pro další separaci. Jiné volitelné kroky zahrnují tepelné zpracování proteinu a/nebo hydrolýzu proteinu před kontaktem s iontoměničovou pryskyřicí.

Jiné volitelné další kroky zahrnují ošetření iontoměničové pryskyřice alespoň jedním Činidlem uvolňujícím isoflavony; a separaci činidla uvolňujícího isoflavony, které obsahuje isoflavony, z uvedené aniontové iontoměničové pryskyřice a získání uvedených isoflavonů. Representativní činidla uvolňující isoflavony zahrnují, například, vodné roztoky kyselin (například HCl), vodné roztoky basí (například NaOH nebo KOH), alkoholy (například methanol nebo ethanol), směsi *» «0 · • · «

000 000

0

0 0 0

alkohol/voda, organická rozpouštědla a jejich směsi.

Předkládaný vynález se také týká přípravku rostlinných proteinů, která má redukovaný obsah isoflavonové, manganové nebo nukleotidové složky vybraný ze skupiny skládající se z:

(i) méně než 30 t9 isoflavonů na gram proteinu;

(ií) méně než 450 t9 manganu na gram proteinu;

(iii) méně než 10 mg nukleotidů na gram proteinu.

Takový rostlinný protein může, ale nutně nemusí, být vyroben způsobem podle předkládaného vynálezu, protože doposud neexistoval extrakt rostlinných proteinů mající tak nízké hladiny fytoestrogenů jako extrakt podle předkládaného vynálezu. Výhodněji obsahuje přípravek rostlinného proteinu méně než 20 tg isoflavónu na gram proteinu; a méně než 400- t9 manganu na gram proteinu. Také jsou zde popsány krmivo pro domácí zvířata, dětské přípravky a nutriční výrobky, které využívají rostlinný protein podle předkládaného vynálezu.

Dětské přípravky, například, obsahují méně než 600 t9 isoflavonů na litr přípravku připraveného ke konzumaci, lépe méně než 200 t9 ^a nejlépe méně než 100 t9·

Konečně, vynález se týká přípravků obsahujících isoflavony izolované způsobem podle předkládaného vynálezu.

Typicky je způsob podle předkládaného vynálezu proveden umístěním aniontové iontoměničové pryskyřice v loži, koloně nebo reaktoru, skrz který prochází proteinová kase. Lože, kolona nebo reaktor má alespoň jeden vstup a jeden výstup a výhodně účinkuje jako vertikální kolona s tokem vzhůru.

V jiné provedení může být předem upravená pryskyřice přidána do tanku obsahujícího proteinovou kaši a po vhodné době pro proběhnutí reakce může být pryskyřice obsahující zachycené isoflavony filtrována z kaše.

Aniontová iontoměničová pryskyřice je typicky makroporosní pryskyřice a jedná se výhodně o typ I nebo II makroporosní pryskyřice. Ve výhodné provedení je aniontová iontoměničová pryskyřice vybrána ze slabě basické aniotnové iontoměničové pryskyřice, silně basické aniontové iontoměničové pryskyřice a jejich směsí. Příklady aníontových iontoměničových pryskyřic použitelných v předkládaném vynalezu zahrnuji Amberlite RA95, TM

IRA-910 a IRA-900, prodávané Rohm and Haas Company, Dovex -22 a MSA™-1 prodávané Dow Chemical a Purolite™ A510 a A500 prodávané Purolite Company. Jak je použito zde a v připojených patentových nárocích, Zahrnuje termín pryskyřice gely, o kterých je odborníkům v oboru známo, že jsou použitelné v předkládaném vynálezu. Příklady takových gelů jsou Amberlite^ IRA 410 (typ II gelu, silný basický aniont) prodávaný Rohm and Haas Company, IRA 402 je typ I silně basického aniontového iontoměničového gelu, který není makroporosní a který může být také použit.

Příkady protiiontů použitelných v aniontové iontoměničové pryskyřici podle předkládaného vynálezu zahrnují acetat, citrát, chlorid, kyselý síran, uhličitan a hydrogenuhličitan. Protože většina aníontových iontoměničových pryskyřic je dodávána ve formě chloridu, je možné použít takové chloridové pryskyřice přímo bez předchozího zpracování. Jak je uvedeno dále, výhodný postup pro předzpracování pryskyřice obsahuje promytí chloridové pryskyřice hydroxidem sodným pro • fe fe· • · · • « • fe • « • · · «

• fe

• · • fefefe fe* vyčištění pryskyřice, potom promytí HCl pro vyčistění a kontrolu růstu mikroorganismů a potom konversi pryskyřice na uhličitanovou a/nebo hydrogenuhličitanovou formu.

Při výrobě rostlinného proteinu za použití způsobu podle předkládaného vynálezu je aniont, který je uvolňován z pryskyřice v důsledku zachycení isoflavonu, manganu nebo nukleotidu, významný pro kvalitu konečného produktu. To znamená, že vzniklý protein by neměl být denaturován, neměl by obsahovat nepřijatelné hladiny volných hydroxylových skypin nebo jiných ofensivních aniontů (t.j. chloridu), které by způsobovaly vznik proteinového produktu, který by byl nepřijatelný pro použití jako nutriční výrobek. Například, typický izoláť sojového proteinu obsahuje dostatečné hladiny isoflavonu, manganu a nukleotidů a zpracování s aniontovou iontoměničovou pryskyřicí, která má chlorid jako protiiont způsobí vznik výsledného proteinu, který má nadměrné hladiny chloridu. Podobně, pokud je protiiontem hydroxyl, tak musí být vzniklý produkt ošetřen kyselinou pro neutralizaci básického produktu, což nepřijatelně zvýší obsah minerálů asociovaných s proteinem.

V jednom výhodném provedení předkládaného vynálezu využívá aniontová iontoměničová pryskyřice protiiont, jako je uhličitan nebo hydrogenuhličitan, který vyloučí výše uvedené problémy.

Jak je použito zde a v připojených patentových nárocích, zahrnuje termín uhličitan uhličitan a hydrogenuhličitan.

Proteiny, které mohou být použity ve způsobech podle předkládaného vynálezu zahrnují jakýkoliv rostlinný protein, který obsahuje detekovatelné hladiny isoflavonu, manganu a «4

Ο» *·· nukleotidů. Přesněji, protein je možné získat ze sojových bohů, kukuřice, pšenice, hrachu, fazolí, bavlníkových semen, burských oříšků, mrkve, vojtěšky, jablek, ječmene, lipnice, jetele, kávy, česneku, chmele, konopí, ovsa, řas, sadové trávy, petržele, rýže, žita, šalvěje, sezamu, kvasinek, hub, brambor, jejich hydrolyzátu a směsí.

Je výhodné, aby proteinem byl proteinový izolát nebo koncentrát, ve kterém byly redukovány hladiny tuků, olejů a uhlovodanů. Bylo zjištěno, že přítomnost tuků a olejů redukuje účinnost způsobu podle předkládaného vynálezu. Pokud není. v konečném výrobku požadován intaktní protein, může být způsob podle předkládaného vynálezu použit na proteinových hydrolyzátech a/nebo izolátech.

Chemická činidla použitelná při konversi pryskyřice na hydroxidovou formu zahrnují hydroxid sodný, hydroxid vápenatý, hydroxid draselný a hydroxid hořečnatý. Nejvýhodnějším činidlem je· hydroxid sodný.

Chemická činidla použitelná při konversi pryskyřice na chloridovou nebo síranovou formu zahrnují kyselinu chlorovodíkovou, kyselinu sírovou a chlorid sodný.

Nejvýhodnějším činidle je kyselina chlorovodíková.

Chemická činidla použitelná pro konversi pryskyřice na uhličitanovou formu nebo na formu volné base zahrnují jakékoliv soli slabé base jeko je uhličitan sodný, hydrogenuhličitan sodný a hydroxid amonný. Hydrogenuhličitan sodný je nejvýhodnějším činidlem pro zpětné získání proteinu, protože produkuje protein v pH rozmezí 6,6 - 9,5. Pro získávání

9 9

9 9

999 999 • 9 *99 9 isoflavonů není toto zásadní.

Odborníkům v oboru iontoměničové technologie bude jasné, že proteinová kaše obsahující isoflavony, mangan nebo nukleotidy by měla mít, protože je uvedena do kontaktu s aniontovou iontoměničovou pryskyřicí, pH, které nedenaturuje protein, což by způsobilo ucpání kolony. Dále, úprava pH na neutrální přidá signifikantní množství aniontů do kaše, kde tyto anionty budou soutěžit o místa protiiontů. Typicky je uspokojivé pH mezi 5,5 a 10. Výhodně je pH proteinové kaše v rozmezí od- 6,0 do 8,0. pH vytékající proteinové kaše (opouštějící kolonu nebo vrstvu) by mělo být blízké pH. při kterém bude protein použit v konečném výrobku. Proto, pokud je rostlinný protein zpracovaný způsobem podle předkládaného vynálezu použit v přípravku pro děti, tak by mělo být výtokové pH okolo 6,0 až 7,5. Ve výhodném provedení by měl být rostlinný protein přiváděný na pryskyřici tak prostý přidaných aniontů (t.j. -OH, Cl- a podobně), jak je to možné. Přidání kyselin, basí, solí a podobně do proteinové kaše snižuje účinost odstranění isoflavonů, manganu nebo nukleotidů z proteinové kaše v koloně.

Jak je odborníkům v oboru známo, mají iontoměničové pryskyřice konečnou kapacitu a mohou být regenerovány na aktivní stav po vyčerpání nebo téměř vyčerpání. Proto jsou, jak je obsaženo v předkládaném vynálezu, iontoměničové pryskyřice po kontaktu s rostlinným proteinem regenerovány a rekondicionovány za použití známých kroků na aniontové formy nebo výhodněji pomocí kroků obsahujících:

1) očistění pryskyřice od jakéhokoliv zbytku (t.j. proteinu) a konversi na hydroxidovou formu, například za použití • •0 • 0 0 · · · 0 · 0 ·

0 · » 0 0 0 0 *· ··«··· » 0 0«0 000000 · 0

0000 00 00 »000 00 00 hydroxidu sodného;

2) konversi pryskyřice na chloridovou nebo síranovou formu; a

3) konversi míst silné base na uhličitanovou formu a konversi míst slabé base na formu volné base.

Odborníkům v oboru iontoměničových pryskyřic bude jasné, že může být použita hdvodná regenerace a regenerace alkohol-voda,

Jedno výhodné provedení způsobu podle předkládaného vynálezu obsahuje krok homogenizace kaše rostlinného proteinu před kontaktem s pryskyřicí. Ve způsobu podle předkládaného vynálezu bylo zjištěno, že homogenizace nebo podobné zpracování zvyšuje účinnost odstranění isoflavonů, manganu a nukleotidů z kaše. Kromě toho, homogenizace proteinové kaše před kontaktem s pryskyřicí redukuje pokles tlaku v průběhu vrstvy nebo kolony pryskyřice, což umožňuje snadnou a ekonomickou výrobu rostlinného proteinu pro použití v nutričních výrobcích.

V některých provedeních je cílem získat isoflavonové nebo fytoestrogenové sloučeniny separované od rostlinného proteinového materiálu. V tomto případě je pryskyřice ošetřena činidlem uvolňujícím isoflavon, které způsobí vyplavování isoflavonů z pryskyřice. Příklady činidel uvolňujících isoflavony podle předkládaného vynálezu zahrnují alkoholy jako je ethanol, methanol, propanol, pentanol a podobně; organická rozpouštědla jako je heptan, děkan, cyklohexan, benzen, toluen a podobně; vodné alkalické roztoky jako je NaOH, KOH a hydroxid amonný; a vodné roztoky kyselin jako například HCl a podobně. Obecně, činidlo uvolňující isoflavon musí separovat isoflavon « · • ♦ · · φ · « φ φ ··· φφφ * * ·· φφ od pryskyřice a musí solubilizovat isoflavon. Odbornici v oboru snadno určí vhodná činidla uvolňující isoflavon bez nežádoucího experimentování.

Předkládaný vynález je také zaměřen na izolát rostlinného proteinu, který má specifické hladiny isoflavonů a na rostlinný protein, který byl zpracován způsobem zde popsaným a na nutriční výrobky, které jsou vyrobeny z takových proteinů. Také je zde obsažena potrava pro zvířata, která v podstatě neobsahuje isoflavony. Přesněji, předkládaný vynález se týká rostlinného proteinu obsahujícího méně než 30 /zg isoflavonů na gram proteinu, méně než 450 μ$ manganu a méně než asi 10 mg nukleotidových. ekvivalentů na gram proteinu. Ve výhodnějším provedení je protein získaný ze sojových bobů a obsahuje méně než 20 /zg isoflavonů na gram proteinu. V nejvýhodnějším provedení obsahuje rostlinný protein méně než 10· μ$ isoflavonů na gram proteinu, méně než 5 mg nukleotidů na gram proteinu a méně než 200 μ% manganu na gram proteinu.

Následující příklady popisují určité, ale ne limitující, provedení předkládaného vynálezu. Rysy předkládaného vynálezu, které jsou nové, jsou uvedeny jednotlivě v připojených patentových nárocích a měly by být zřejmé ze struktury a funkce následujících příkladů.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1: Způsob pro zpracování rostlinného proteinu

Způsob podle předkládaného vynálezu byl použít pro izolaci isoflavonů a pro výrobu prášku sojového izolátu s nízkým

Λ · ·

9 • ·

4

94

V • 4 · · » ·4 * · ♦ » · 4 4

494 449

9

49 obsahem isoflavonů, manganu a nukleotidů o hmotnosti celkem 221 kg (487 liber), který byl použit pro výrobu dětského přípravku. Pro výrobu požadovaného izolátu sojového proteinu bylo potřeba celkem šest (6) kol výroby. Značná část pokusů byla provedena na 50 litrovém objemu, za zisku nej lepšího způsobu, který je zde popsán.

Výchozí materiál sojového proteinu použitého v tomto příkladu byl získán od Archer Daniels Midland, lne. (ADM) of Decatur, IL ve formě zahuštěniny. Zahuštěnina nebo proteinová kaše byla komerčně dostupný výrobek izolátu sojového proteinu známý jako Ardex F^R. V typickém komerčním procesu jsou sojové proteiny extrahovány při mírně alkalickém pH z odtučněných sojových vloček nebo z odtučněné sojové moučky. Proteinová frakce je potom vysrážena z extraktu upravením pH na izoelektrický bod proteinů (pH 3,8 až 6,0). Většina proteinů je nerozpustná při tomto pH, zahuštěné formy a proteinové zahuštěniny mohou být separovány od rozpustných cukrů, solí, atd. za použití centrifugace. Pro dokončení přečištění je proteinová zahuštěnina promyta alespoň jednou vodou při tomto izoelektrickém pH, potom je protein sušen postřikem buď za daného stavu, nebo po resuspendaci při neutrálním pH.

V následujících pokusech ADM dodává izoelektrickou zahuštěninu tvořící 10 až 14% celkové solidní hmoty a mající pH okolo 4,5,

Dodaná sojová zahuštěnina byla ředěna na přibližně 6,5% celkové solidní hmoty vodou a byla umístěna do parního duplikátorového kotle. Každá vsádka kaše protein-ve-vodě měla hmotnost okolo 908 kg (2000 liber). Kaše byla potom zahřáta na přibližně 49 °C (120 °F) a neutralizována na pH 6,8 za použití NaOH. Kaše byla potom filtrována přes filtr se sítem 60, byla vw «9

9 9

999 ·

«9 99

9 9 9

9 9

9*9

9*9 • 9 99·· * * 9 • ··· • 9

9

99*9 9* • ο zpracována UHTST (ultravysokou teplotou po krátkou dobu) a homogenizována. UHTST parní injekce měla teplotu 152 °C (305' °F) a trvala 10 sekund. Bylo zjištěno, že UHTST zpracování po expozici aniontovému iontoměniči produkuje protein s nežádoucími organoleptickými vlastnostmi. Kaše byla potom ochlazena na 55 °C (130 °F) a homogenizována při 6895 kPa (1000 psig). Kaše byla potom přenesena do iontoměničového systému.

Jeden aspekt předkládaného vynálezu spočívá v objevu, že zpracování ultravysokou teplotou po krátkou dobu (UHTST) musí být provedeno před kontaktem kaše s pryskyřicí pro prevenci zkažení kaše v průběhu prodlouženého procesu zpracování. Proces se provádí při teplotě, při které se může vyskytovat rychlý růst mikroorganismů. Representativní UHTST podmínky použitelné v předkládaném vynálezu jsou teploty od 120 °C (250 °F) do 155 °C (310 °F) a časy od l do 60 sekund. Nižší teploty jsou spojeny s delšími časy. Toto UHTST zpracování, před kontaktem kaše s pryskyřicí, umožňuje mikrobiologickou stabilitu s minimalizaci degradace živin,

Iontoměničový systém je složen z nerezové, pryží vyložené kolony mající vstup a výstup a délku 401 cm (13¹2'') a průměr 30,5 cm (12 coulů). 70 litrů Amberlite^R IRA-910 aniontové iontoměničové pryskyřice od Rohm and Haas Co, Philadelphia, Pennsylvania, se umístí do kolony. IRA-910 je makroretikulární silně basická aniontová iontoměničová pryskyřice. Basicita této pryskyřice je způsobena kvartérní amonnou funkcí é mírně nižší basickou silou než má typ I aniontové iontoměničové pryskyřice. Tato pryskyřice je dodávána v chloridové formě a je schválena United States Food and Drug Administration (FDA) (po připravení

Cl • · « >44· · · 4 · · · 4 4 4 4 *

4444 44 44 4444

4 4

4 4

U* 444 k použití v cyklu) pro zpracování potravinových výrobků.

Před kontaktem s proteinovou zahuštěninou je pryskyřice uvedena do aktivního stavu. Pryskyřice je uvedena do aktivního stavu kontaktem s 6¾ (hmot./hmot.) NaOH při průtoku 4,6 až 5,7 litrů (1,2 až 1,5 galonu) za minutu po dobu 30 minut s tokem zdola nahoru. Vrstva pryskyřice se potom promyje deionizovanou vodou po dobu 10 až 15 minut s tokem zdola nahoru. Pryskyřice je potom kontaktována s 1,0% (hmot.) HCl s tokem zhora dolů při průtoku 16 litrů za minutu..Pryskyřice se potom promyje deionizovanou vodou s tokem zhora dolů po dobu 30 minut. 2,8 kg (6,18 liber) hydrogenuhličitanu sodného se přidá do asi 196 litrů (49 galonů) vody a míchá se do rozpuštění. Tento roztok se potom čerpá do kolony s tokem zhora dolů při průtoku asi 4 litry za minutu. Vrstva se potom znovu propláchne deionizovanou vodou, dokud není vodivost výtokové kapaliny 300 gmhos nebo menší. Vrstva pryskyřice se potom zpětně promyje odstranění vzduchu a opětovné třídění pryskyřice. Vrstva pryskyřice se nechá přirozeně usadit a voda se odvede z kolony. Kolona je nyní připravena pro provozní cyklus po stečení vody na horní Část vrstvy pryskyřice.

Proteinová kaše se Čerpá vzhůru skrz iontoměničovou kolonu při průtoku 3,6 až 3,8 kg (8 až 8,4 liber) za minutu. Vstupní teplota kaše je 55 - 60 °C (130 - 140 °F) a kontaktní doba je přibližně minimálně 20 minut. Proteinová kaše vystupující z kolony se chladí, odebírají se vzorky a potom se Suší postřikem za použití běžných technik a vybavení,

Kolona se před každou vsádkou regeneruje- 6% NaOH, 1% HCl a 1,5% NaHCO₃ (hydrOgenuhličitanem sodným), jak je popsáno výše • Β • *

BBB

Β

ΒΒ • Β fl fl • » pro počáteční přípravu vrstvy pryskyřice. Všechny roztoky jsou připraveny s deionizovanou vodou.

Výsledky

Bylo vyrobeno celkem šest vsádek za zisku celkem asi 221 kg prášku sojového izolátu zpracovaného na iontoměniči. V průběhu procesu byly z každé vsádky odebrány tři vzorky v různou dobu:

1) proteinová kaše vstupující do iontoměničové kolony; 2) výtok z kolony; a 3) sušený prášek. Vzorky byly analyzovány na minerální profil sodíku, draslíku, fosforu, chloru, vápníku, hořčíku, manganu, hliníku a fluoru. Vzorky byly také analyzovány na isoflavony a nukleotidy. Pro umožnění srovnání mezi kapalinami a práškem byla koncentrace prášku normalizována na 6,5% celkové solidní hmoty.

Průměrné hodnoty a standartní odchylky pro každý analyzovaný prvek před a po zpracování na iontoměniči byly počítány pro šest běhů. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 1. Povšimněte si, že redukce je vyjádřena jako pozitivní hodnota, zatímco negativní hodnota představuje zvýšení koncentrace analyzovaného prvku.

• 0 1

0 • 00 0 0 0

Tabulka 1: Minerální profil

Minerál	Redukce	i %
Fosfor	73,3 +	3,4
vápník	16,5 +	4,2
Hořčík	11,4 ±	5,1
Sodík	-6/3 ±	3,9
Draslík	-7,0 ±	21
Mangan	31,0 ±	10
Hliník	6,0 ±	15
Chlorid	-270,0 ±	110
Fluorid	48,0 ±	29

Nejvýznamnější redukce v koncentraci po zpracování na iontoměniči byla pozorována pro celkový fosfor, fluorid a mangan. Redukce fosforu je v souladu s U.S. 5248804, protože velká část vlastního fosforu v sóji existuje jako sůl fytatu. Naopak, výtokové kapalina vykazovala signifikantní zvýšení chloridu. Toto odpovídá skutečnosti, že HCl je jedním z regeneračních činidel použitých po alkalickém výplachu a silně basická pryskyřice má určité slabě basické skupiny.

Profily vápníku, hořčíku, manganu, fluoridu a hliníku před a po zpracováním vykazují snížení. Z této skupiny vykazuje mangan signifikantní snížení (31 ± 10). Překvapivě, oproti jiným multivalentním kovům, zůstává hliník (náboj +3) v podstatě beze změny. Dále, odstranění vápníku a hořčíku může být vysvětleno adsorpci nebo chelecí s fytatem.

I • 1 • · fcfc · fcfc · fcfcfc ♦ ·» ·

·· ·· *

J • fcfc fcfc·· • « fc · fcfc* · fcfc fc3 fcfcfcfc

Monovalentní kationty, sodík a draslík, byly relativně neovlivněny zpracováním na iontoměnici (-6,3 ± 3,9% a -7 ± 21%, v příslušném pořadí). Negativní hodnoty ukazují na mírné vychytávání jak sodíku, tak draslíku. Tato data ukazují na typické chování aniontové iontoměničové pryskyřice, ve které nejsou monovalentní kationty vyměňovány nebo adsorbovány na aniontovou pryskyřici.

Důležitou výhodou způsobu podle předkládaného vynálezu je to, že ze zpracovaného rostlinného izolátu jsou získány vysoké hladiny proteinu. To znamená, že dochází ke ztrátě velmi malého množství proteinu v pryskyřičné koloně nebo vrstvě. V těchto pokusech bylo více než 90% proteinu vstupujícího do kolony obsahující pryskyřici získáno ve výtokové kapalině.

Je důležité uvést, že celková účinnost způsobu podle předkládaného vynálezu je zlepšena tehdy, když je zvýšena solubilita a homogenita proteinové kaše. Tak pre-filtrace (skrz filtr se sítem 60) a homogenizace významně redukuje pokles tlaku v průběhu kolony, což zvyšuje účinnost způsobu podle předkládaného vynálezu. Pro srovnání, způsob bez pre-filtrace a homogenizace vede k počátečnímu poklesu tlaku okolo 138 kPa (20 psig), zatímco pre-filtrace a homogenizace vede k počátečnímu poklesu tlaku okolo 14 až 35 kPa (2-5 psig). Po 4 až 6 hodinách funkce bez pre-filtrace a homogenizace je pozorován pokles tlaku 276 až 414 kPa (40 - 60 psig), zatímco při pre-filtraci a homogenizaci je pozorován pokles tlaku okolo 55 až 83 kPa (8 - 12 psig).

Způsob podle předkládaného vynálezu je také velmi účinný při odstraňování nukleotidů. Použité analytické postupy jsou popsány v U.S. 5492899, Masor et al. Bylo zjištěno, že odstranění celkových potenciálně dostupných nukleotidů (TPAN) je 57,4 ± 7,2%.

Isoflavony jsou téměř zcela odstraněny způsobem podle předkládaného vynálezu. Tabulka 2 uvádí jednotlivé isoflavony,

hladinu ve vstupní	kaši, hladinu	ve výtoku a hladinu	v prášku.
Tabulka	2
Isoflavon	Vstup Mg/g*	Výstup Mg/g*	Prášek í*g/g	Redukce % Vstup vs Vstup vs prášek výstup
Daid2in	4,12±0,87	' 0,51+0,21	0,68±0,37	83,5+6,8	87,6
Genistin	10,0±2,8	0,82±0,55	0,87±0,72	91,4±5,9	91,8
Daidzein	3,9+6,5	0,10+0,0	0,10+0,0	97,4±4,3	97,4
Genistein	3,7+1,4	' 0,10+0,0	0,10+0,0	97,3±1,4	97,3

normalizováno na 6,5 hmot. % roztoku

Příklad 2: Izolace isoflavonů - alkoholový výplach

V tomto pokusu jsou isoflavony izolovány ze sojového tvarohu za použití dříve popsané iontoměničivé pryskyřice a potom za použití vypláchnutí nebo uvolnění z pryskyřice roztokem alkohol/voda. V laboratorní koloně se Amberlite^R IRA-910 (80 litrů) pre-kondicionuje jak je popsáno v příkladu l a sojový tvaroh, jak je popsán v příkladu 1, se nechá procházet kolonou, dokud se hladina fosforu ve výtoku nepřiblíží prudkému vzestupu (t.j. hladině na vstupu). Kolona se vypláchne teplou vodou (49

**···· ·· ·· )

i °C) pro odstranění zachyceného proteinu a potom chladnou vodou (19 °C). 50% (hmot.) roztok ethanolu a vody se potom Čerpá do kolony s průtokem okolo 4 litrů za minutu směrem dolů. Roztok alkohol/voda se nechá recyklovat kolonou po dobu asi 1 hodiny (3 objemy lože) . V průběhu recyklace se obsah- alkoholu ředí na asi 5% míšením s vodou v koloně. Získá se asi 100 litrů roztoku bohatého na isoflavony. Analytický postup pro analýzu isoflavonů je popsán v příkladu 4. Vstupní sojový protein obsahuje 2,7% hmot. daidzinu a 0,6% genistinu. Roztok z kolony obsahuje 850 ^g/l daidzinu a 380 /zg/l genistinu. Extrakce může být zlepšena ponořením pryskyřice do činidla uvolňujícího isoflavony (například roztoku alkoholu) a zvýšením procenta alkoholu na více než asi 80% hmot. Zvýšení zisku isoflavonů je také pozorováno tehdy, když je činidlo uvolňující isoflavony zahřáto na asi 49 °C.

Příklad 3: Izolace isoflavonů - regenerace

V tomto pokusu je analyzován obsah regeneračního výtoku. Je sledován postup příkladu 1 s tou výjimkou, že v průběhu regenerace pryskyřice při ošetření NaOH je odebrán 240 g (8 oz) vzorek. Analýza tohoto vzorku na isoflavony je uvedena v tabulce III.

#

Tabulka 3: Isoflavony z regenerace

	Daidzin	Genistin	Daidzein	Genistein
	2,6	1,2	<0,1	<0,1
nanomoly/g	6,2	2,8	<0,2	<0,2

·· 9 9·.· · · * · fe · V ·· · · · · * ·« fefe· · · · ·· ··· • fefe··· * · fefefe* fefe fe* fe··* ·* ·*

Jak ukazují data z příkladu 2 a 3, způsob podle předkládaného vynálezu poskytuje účinný a ekonomický prostředek pro izolaci a koncentraci isoflavonových sloučenin.

Příklad 4; Nutriční výrobek využívající sojový protein s nízkým obsahem isoflavonu

Sojový protein vyrobený v příkladu 1 se použije pro výrobu dětského přípravku. Kontrolní výrobek a dětský přípravek podle předkládaného vynálezu se potom analyzují na obsah isoflavonu. Postup použitý pro výrobu pokusného a kontrolního výrobku je stejný jako postup popsaný v U.S. patentu 5021245, Borschel et al. , s tou výjimkou, že se vynechají vlákna.

Typicky obsahují dětské přípravky založené na rostlinném proteinu 1,5 až 2,0 hmot. % proteinu jako potravy (připraveného k požití nebo RTF). výhodným provedením je 1,6 až 1,8 hmot. % proteinu jako potravy. Proto, jak je popsáno dále, dětský přípravek vyrobený z rostlinného proteinu zpracovaného způsobem podle předkládaného vynálezu bude mít obecně obsah isoflavonu menší než 600 μ9/1ΐ^ přípravku (30 μ$ isoflavonu na gram proteinu x 20 g proteinu na litr přípravku (RTF) - 600 yg isoflavonu na litr RTF přípravku).

Technika HPLC (vyskotlaké kapalinové chromatografie), jak je popsána dále, byla použita pro kvantifikaci hlavních sojových isoflavonů (genistinu, daidzinu, genisteinu a daidzeinu) za použití způsobu upraveného ze tří článků, jejich obsah je v oboru znám.

• « ·

......

1) Setchell, KDR and Welch, MB J. Chrom.

386 (1987) 315 - 323

2) Wang, G., Kuian, SS, Francis, OJ, Ware, GM, a Corman, AS J. Agric. Food Chem.

(1990) 185 - 190

3) Barnes, S., Kirk, M,, a Coward, L.

J. Agric. Food Chem.

(1994) 2466 - 2474

Byly získány vzorky pokusného a kontrolního dětského přípravku připraveného k požití a 20 ml každého se naváží do tárované 250 ml zkumavky s plochým dnem. Potom se přidá 80 ml ethylalkoholu a směs se mísí. Na zkumavku se připojí chladič a vzorky se refluxují při 80 °C po dobu 2 hodin. Směsi se potom ochladí na pokojovou teplotu a kvantitativně se přenesou do 100 ml odměrných zkumavek. Sraženina a zkumavka se vypláchne 15 ml 80¾ alkoholu (obj./obj.). Odměrné zkumavky se doplní objemem 80% alkoholu a vzorky se dobře promíchají. Vzorky se filtrují přes Whatman™ No.41 papír a potom se 15 ml každého filtrátu umístí do dělené konické 15 ml zazátkované skleněné testovací tuby. Každá tuba se umístí do vodní lázně a proud dusíku se použije pro odpaření každého vzorku na 3 ml. Tuby se potom ochladí na pokojovou teplotu a do každé tuby se přidá 1 ml methanolu a potom se ředí na 10 ml vodou a dobře se promísí. 1,5 ml každého vzorku se potom filtruje skrz 0,45 μτη polypropylenovou membránu do HPLC autosampler zkumavky. Analýza na isoflavony za použití reversní fáze HPLC se provede za použití HPLC systému následujícím způsobem:

* v

9 • · •«99 ··

Kolona	Vydac™C18 Pharmaceutical; 250	x 4,6 mm; 5 μπι
Detekce	UV absorbance při 254/280 mm
Injekce	50 mel
Teplota	okolní
Průtok	0,8 ml/min
Reakční doba	120 minut
Eluens A	950 dílů vody; 50 dílů CH^CN; trifluoroctové (TFA)	1 díl kyseliny
Eluens B	400 dílů vody; 600 dílů CH3CN; trifluoroctové (TFA)	l díl kyseliny

Gradientový prograrc Čas (minuty) 0	1 5	95	100	102	120
% Eluens B 0	0	60	100	100	0
Výsledky uvedené v	tabulce	4 ukazují,	že způsob podle

předkládaného vynálezu může být použit pro výrobu nutričního výrobku, který má značně redukovanou hladinu isoflavonů.

Tabulka 4

Sojové isoflavony	Kontrola M9/9	Pokusný výrobek μα/g*
Daidzin	11,6	<1,0
Daídzein	1,0	<1,0
Genistin	19,4	<1,0
Genistein	2,2	<1,0
Celkem	34,2	<1,0 N/A

v detekčním limitu

Příklad 5: Studie tolerance

V době podání této přihlášky probíhá klinická studie fyziologických účinků rostlinných estrogenů a isoflavonů v dětských přípravcích vyrobených způsobem podle, předkládaného vynálezu. Před touto rozsáhlou studií byla provedena menší toleranční studie pro hodnocení celkové tolerance sojových přípravků s redukovanými isoflavony na zdravých dětech narozených v normálním termínu.

Tolerační studie byla randomizovaná, dvojitě slepá,

3-týdení studie využívající 145 zdravých dětí věku 2 až 5 let. Dětem byl podáván standartní mléčný přípravek po základní dobu 1 týdne a potom jim byl podáván po dobu 2 týdnů standartní sojový přípravek, přípravek sojového izolátu s isoflavony a malým obsahem fytatu a přípravek hydrolyzovaného sojového izolátu s redukovaným fytatem a isoflavony nebo přípravek obsahující protein podle příkladu 1. Primární sledované hodnoty byly charakteristika stolice, příjem přípravku a incidence vyplivování a zvracení. Sekundární sledované hodnoty byly přírůstek hmotnosti a odpovědi rodičů na dotazník tolerance potravy.

Příjem přípravku a incidence vyplivování a zvracení se nelišil mezi skupinami v základním období a v průběhu studovaného období. Průměrná konsistence stolice byla měkčí u dětí krmených hydrolyzováným přípravkem ve srovnání s jinými pokusy. Rodiče spojovali vodnatou a častější stolici s hydrolyzovaným přípravkem. Děti krmené přípravkem využívajícím protein vyrobený v příkladu 1 měly méně často zácpu než v základním období. Průměrný přírůstek hmotnosti byl stejný pro

Φ

I Φ e ΦΦ • * Φ φ * ·' · •φφφφ φ φ φ φ φ φφφ φ » « ♦ φ » φ φ φφφφ φφ ·* ·φ·· k Φ φφ Φ všechny studované skupiny. Závěrem této studie je, že odstranění fytatu a/nebo isoflavonů ze sojových přípravků má minimální vliv na toleranci.

Průmyslová využitelnost

Způsob popsaný v předkládaném vynálezu je velmi účinný, nenákladný a spolehlivý způsob pro komerční odstranění isoflavonů, manganu a nukleotidů z rostlinných proteinů. Způsob produkuje produkt rostlinného proteinu, který má vysoce žádoucí charakteristiky jako je obsah isoflavonů menší než 30 μg/g proteinu, méně než 450 μ manganu na gram proteinu a méně než 10 mg nukleotidů na gram proteinu. Protein vzniklý zpracováním podle předkládaného vynálezu má také lepší chuť (méně fazolovou chuť), lepší barvu (světlejší) a lepší funkční vlastnosti (t.j. schopnost tvořit stabilní emulsy). Kromě toho, isoflavony získané z regeneračního/alkoholového uvolňovacího procesu po kontaktu s pryskyřicí mají význam jako potenciální protinádorové sloučeniny.

Komerční rozsah použití způsobu podle předkládaného vynálezu je zvětšen, pokud je proteinová kaše pre-filtrována a homogenizována před kontaktem s vrstvou pryskyřice. Nejlépe jsou použity makroporosní pryskyřice v hydrogenuhličitanové formě.

V důsledku předkládaného vynálezu bude nyní nutriční průmysl schopen ekonomické produkce výrobků obsahujících redukované množství isoflavonů, manganu a nukleotidů. Konečně, lidé a zvířata konzumující výrobky podle předkládaného vynálezu budou mit tu výhodu, že se vyhnou konzumaci určitých škodlivých

- r

- ;. · · 0 0 0 0 0® ·· • « 0 · · · • 000 ·0 0* 00·· • 0 · »*« *00 elementů obsažených v rostlinných proteinech.

Ačkoliv byly některé příkladné provedení a podrobnosti uvedeny za účelem ilustrace vynálezu, bude odborníků v oboru jasné, ěe mohou být provedeny různé jeho změny a modifikace, bez odchýlení se od rozsahu a duchu vynálezu, jak jej uvádí připojené patentové nároky.

Claims (24)

1. Způsob zpracování rostlinného proteinu vyznačující se tím, že obsahuje:

a) získání kase rostlinného proteinu, která obsahuje isoflavony, mangan nebo nukleotidy;

b) získání alespoň jedné aniontové iontoměničové pryskyřice schopné vazby isoflavonů, manganu nebo nukleotidů přítomných v uvedené proteinové kaši;

c) kontaktování uvedené kaše s uvedenou aniontovou iontoměničovou pryskyřicí; a

d) separaci uvedené kaše od uvedené aniontové iontoměničové pryskyřice, kde uvedená kaše rostlinného proteinu má redukovaný obsah isoflavonů, manganu nebo nukleotidů.

2. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že dále obsahuje krok expozice pryskyřice před kontaktováním kroku c) činidlu, které umistuje do pryskyřice vyměnitelný aniont, který

i) nemění pH kontaktované proteinové kaše mimo rozmezí 6,0 a ž 9,5 ; a ii) nepřidává nevhodný anion do kontaktované proteinové kaše v kroku d).

3. Způsob podle nároku 1,vyznačuj ící se tím, že získání alespoň jedné aniontové iontoměničové pryskyřice zahrnuje poskytnutí aniontové iontoměničové pryskyřice, která obsahuje skupiny silné base a skupiny slabé base, a která byla podrobena:

i) konversi na hydroxidovou formu;

ii) konversi na chloridovou nebo síranovou formu; a iii) konversi alespoň některých z uvedených skupin silné base na uhličitanovou formu a alespoň některých uvedených skupin slabé base na formu volné base.

4. Způsob podle jednoho z nároků laž3vyznačuj ící se t í ra, že dále obsahuje kroky:

e) po kroku d), kontaktováni uvedené aniontové iontoměničové pryskyřice s alespoň jedním činidlem uvolňujícím isoflavony; a

f) separaci činidla uvolňujícího isoflavony, které obsahuje isoflavony, od uvedené aniontové iontoměničové pryskyřice a získáni uvedených isoflavonů.

5. Způsob podle jednoho z nároků 1 až 2 vyznačuj ící se t í m, že dále obsahuje kroky:

e) po dokončení kroku d), opětovné uvedení pryskyřice pryskyřice do aktivního stavu za pomoci:

i) vystavení pryskyřice působení činidla, které očistí povrch pryskyřice od zbytků a přemění pryskyřici na hydroxidovou formu;

ií) potom vystavení pryskyřice působení činidla, které přemění pryskyřici na buď chloridovou formu nebo na síranovou

0 0 t

00 0000

000 formu; a iii) potom vystavení pryskyřice působení činidla, které přemění alespoň část pryskyřice na uhličitanovou formu;

f) kontaktování další kaše rostlinného proteinu s uvedenou pryskyřicí opětovně uvedenou do aktivního stavu; a

g) separování další kaše z pryskyřice.

6. Způsob podle jakéhokoliv z nároků l až 5, vyznačující se tím, že dále obsahuje homogenizaci kaše rostlinného proteinu před kontaktováním uvedené kaše s uvedenou aniontovou iontoměničovou pryskyřicí.

7. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 5, vyznačující se tím, že dále obsahuje zpracování ultravysokou teplotou po krátkou dobu před kontaktováním uvedené kaše s uvedenou aniontovou iontoměničovou pryskyřicí.

8. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7, vyznačující se tím, že krok c) obsahuje umístění aniontové iontoměničové pryskyřice do kaše.

9. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 1 až 7 vyznačuj ícísetím, že kroky c) ad) obsahují průchod kaše skrz strukturu, která obsahuje aniontovou iontoměničovou pryskyřici a má jeden vstup a jeden výstup.

10. Způsob podle nároku 9, vyznačuj ící se tím, že struktura je vertikální kolona a že kaše vstupuje do uvedené vertikální kolony uvedeným vstupem a opouští uvedený objem

00 00

0 0 * • * « ·' • · • 0 ··«· ·*

0« ·0 • 0· · • 0 0 · • I» 000 0 0

00 *· uvedeným výstupem, kdy vstup je umístěn níže než výstup.

11. Způsob podle jakéhokoliv z nároků 3 až 10,. vyznačující se tím, že uvedená aniontová iontoměničové pryskyřice je makroporosní pryskyřice a uhličitan je hydrogenuhličitan.

12. Přípravek obsahující rostlinný protein^ vyznačující se tím, že má redukovaný obsah isoflavonů, manganu nebo nukleotidů, kde uvedený rostlinný protein je vyroben způsobem podle jakéhokoliv z nároků l až 11.

13. Přípravek rostlinného proteinu podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedený protein má redukovaný obsah alespoň jedné z isoflavonové, manganové nebo nukleotidové složky vybraný ze skupiny skládající se z:

(i) méně než 30 /zg isoflavonů na gram proteinu;

(ii) méně než 450 μ% manganu na gram proteinu;

(iii) méně než 10 mg nukleotidů na gram proteinu.

14. Přípravek rostlinného proteinu podle nároku 13, vyznačující se tím, že uvedený protein obsahuje méně než 20 ^g isoflavonů na gram proteinu; a méně než 400 /zg manganu na gram proteinu.

15. Přípravek rostlinného proteinu vyznačující se tím, že obsahuje protein a méně než 30 μ$ isoflavonů na gram proteinu.

16. Přípravek rostlinného proteinu podle nároku 15, «« φ

φ φ φ *· • · · • · φφ φ » φ ···♦ ·· φ

V ··· · φ « φ • β φ ··« *·· φ · • Φ φφ vyznačující se tím, že uvedené isoflavony jsou přítomné v množství menším než 10 μ$ na gram proteinu.

17. Přípravek rostlinného proteinu podle nároků 15 nebo 16, vyznačující se tím, že uvedený proteinový přípravek obsahuje méně než 250 μ$ manganu na gram proteinu.

18. Přípravek rostlinného proteinu podle nároků 15 nebo 16, vyznačující se tím, Že obsahuje méně než 20 μ% isoflavonů na gram proteinu; a méně než 200 jzg manganu na gram proteinu.

19. Přípravek rostlinného proteinu podle jakéhokoliv z nároků 12 až 18_/ v y z n a č u j í c í se t í ra, že uvedený přípravek je krmivém pro domácí zvířata, nutriční výrobek nebo přípravek pro děti.

20. Přípravek rostlinného proteinu podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený přípravek je dětský přípravek obsahující méně než 200 /zg isoflavonů na litr přípravku připraveného ke konzumaci.

21. Izoflavonový izolát získaný způsobem podle nároku 4.

22. Izoflavonový izolát získaný způsobem podle nároku 21, kde je proteinová kaše vybrána ze sóji nebo hrachu.

23. Způsob podle nároku 4vyznačující setím, že činidlo uvolňující isoflavony je vybráno z vodných roztoků kyselin, vodných roztoků basí, alkoholů, směsí alkohol/voda, organických rozpouštědel a jejich směsí.

./

4 · · ♦ * · ·

* · · ·

4 · · · • 4« *·* • 0

00 ··

24. Způsob podle nároku 3 nebo 5. vyznačující se tím, že činidlo použité v kroku i) je vybráno z hydroxidu sodného a hydroxidu draselného; a že činidlo použité v kroku ii) je vybráno z kyseliny chlorovodíkové, kyseliny sírové a chloridu sodného; a že činidlo použité v kroku iii) je vybráno z uhličitanu sodného, hydrogenuhličitanu sodného a hydroxidu amonného.