CZ303555B6 - Zpusob stanovení závažnosti a prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie - Google Patents

Abstract

Rešení se týká zpusobu stanovení závažnosti a prognózy B-bunecné chronické lymfocytární leukémie z biologického vzorku odebraného z tela pacienta, jehož podstata spocívá v tom, že se stanoví exprese alespon jednoho proteinu vybraného ze skupiny zahrnující membránové receptory Vangl2, Celsr1, a Frizzled 7, cytoplazmatické proteiny Dvl 2, Dvl 3 a Prickle1, kinázy kasein kináza 1 epsilon a kasein kináza 2 alfa a sekretovaný ligand Wnt5a a/nebo alespon jednoho genu kódujícího protein vybraný ze skupiny zahrnující membránové receptory Vangl2, Celsr1, a Frizzled 7, cytoplazmatické proteiny Dvl 2, Dvl 3 a Prickle1, kinázy kasein kináza 1 epsilon a kasein kináza 2 alfa a sekretovaný ligand Wnt5a, pricemž míra upregulace techto proteinu ci genu v B-lymfocytech pacienta oproti kontrole koreluje se závažností a prognózou onemocnení B-CLL tak, že vyšší míra upregulace proteinu ci genu znamená vyšší závažnost a horší prognózu.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu stanovení závažnosti a prognózy B-buněčné chronické lymfocytární leukémie.

Dosavadní stav techniky

B-buněčná chronická lymfocytární leukémie (B-CLL) je klinicky velmi heterogenní onemocnění s dosud nejasnou patogenezí. Z dosavadních poznatků vyplývá, že se jedná o monoklonální expanzi B-lymfocytů, které se následně hromadí jak v periferní krvi, tak v lymfatických orgánech, s čímž jsou spojené další komplikace v podobě zvětšení orgánů, snížené funkce imunitního systému, anémie a dalších. Předpokládá se, že nemoc vzniká v důsledku narušení apoptózy a změny migrace B lymfocytů.

V roce 1975 byl publikován a zaveden první prognostický systém podle Raie (Rai KR, Sawitsky A, Cronkite EP et al.: Clinical staging of chronic lymphocytic leukemia. Blood 1975 46: 219234) a následně v roce 1977 obdobná klasifikace nemocí podle Bineta (Binet J L, Lepoprier M, Dighiero G et al.: A clinical staging systém for chronic lymphocytic leukemia: prognostic significance. Cancer. 40, 855-64, 1977; Binet J L, Auquier A, Dighiero G et al.: A new prognostic classification of chronic lymphocytic leukemia derived from a multivariate survival analysis. Cancer 48:198-206, 1981). Oba systémy jsou založeny na základních, v klinice snadno pozorovatelných znacích či dostupných laboratorních parametrech (počet a tvar bílých krvinek, trombocytů, hodnoty hemoglobinu, anémie, infiltrace orgánů, atd.). Ve spojení s moderními molekulárními markéry se tyto systémy používají pro stanovení prognózy i v současné době.

Se zavedením cytogenetických metod byla pozorována korelace mezi určitými cytogenetickými změnami v buňkách pacientů a vývojem jejich nemoci. Zde můžeme zmínit delece 17p a 1 lq, které jsou spojovány s horší prognózou, a naopak normální nález, delece 13q či trisomie chromozomu 12 bývají považovány za pozitivní prognostický znak. Na p raménku chromozomu 17 je přítomen tumor-supresorový gen p53 a na q raménku chromozomu 11 gen ATM (ataxia teleangiectasia mutated). Oba tyto geny fungují při ochraně buňky před poškozujícími vlivy, proto je jejich ztráta nebo mutace spojena s agresivitou nemoci. Vzhledem k faktu, že cytogenetické abnormality se vyskytují u 75 až 80 % nemocných, bylo vyšetření pomocí panelu FISH sond začleněno mezi standardní vyšetřovací postupy.

Další dnes dostupnou metodou, která významně přispívá ke stanovení prognózy u pacientů je stanovení mutačního statusu variabilní části imunoglobullnového řetězce pomocí sekvence. Je prokázáno, že mutační status se během nemoci nemění. Pacienti s nemutovaným IgVH mají horší prognózu než ti s mutovaným (Hamblin TJ, Davis Z, Gardiner A et al.: Ummutated IgVH genes aere associated with a more aggressive form of chronic lymphocytic leukemia. Blood 94, 1999, 1848-1854), přičemž jako mutovaný IgVH se označuje méně než 98% homologie. Mutační status je významným prognostickým ukazatelem bez ohledu na klinická stádia, ve kterých se pacienti nacházejí. Podporou pro stanovení mutačního statusu a následně prognózy pacienta se stal nedávno identifikovaný molekulární prognostický markér, cytoplazmatický protein ZAP-70 (Rosenwald A, Alizadeh AA, Widhopf G et al.: Relation of gene expression phenotype to immunoglobulin mutation genotype in B cell chronic lymphocytic leukemia. J Exp Med 194, 2001, 1639-1647), jehož vysoká exprese významně koreluje s nemutovaným IgVH. K dalšímu zpřesnění prognózy přispělo např. stanovení exprese povrchové molekuly CD38, která je stabilní v čase a jejíž vysoká exprese je spojována s horším vývojem nemoci (Damle RN, Wasil T, Fais F et al.: IgV gene mutation status and CD38 expression as novel prognostic indicators in chronic lymphocytic leukemia. Blood 94, 1999, 1840-1847).

- 1 CZ 303555 B6

Je známa upregulace genu fzd3 u pacientů s B-CLL (Mahadevan D et al: Gene expression and sérum cytokine profiling of low stage CLL identity WNT/PCP, Fit-3L/Flt-3, and CXCL9/CXCR3 as regulators of cell proliferation, survival, and migration, Human Genomics and Proteomics 2009, 1-12). Dále byla publikována studie ukazující aktivaci Wnt/beta-kateninové dráhy, v níž nejsou ligand Wnt-5a a membránový receptor Fzd—7 upregulované, narozdíl of Fzd3 (Lu D, et al: Activation of the Wnt signál ing pathway in chronic lymphocytic leukemia. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 101,2009,3118-3123).

Je známo více prognostických markérů, které ale dosud nebyly testovány na větší skupině pacientů. Komplexní využití výše zmíněných analýz významně přispívá ke stanovení prognózy pacientů, avšak dosud není znám žádný specifický markér, který by umožnil s jistotou odlišit pacienta, jehož nemoc bude v brzké době progredovat, od toho, který setrvá v klinickém stádiu po mnoho let bez nutnosti terapie.

Předkládaný vynález má potenciál nahradit současné diagnostické a prognostické metody zavedením nových a specifických markérů, které umožní stanovení diagnózy a z ní plynoucí prognózy pacienta a v návaznosti na to výběr nej vhodnějšího léčebného postupu u každého jednotlivého pacienta s možností snadného opakování v průběhu nemoci. Dále je možné na základě předkládaného vynálezu vytvořit cílenou terapii na více úrovních buněčné signalizace s ohledem na aktuální stav konkrétního pacienta.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je způsob stanovení závažnosti a prognózy B-buněčné chronické lymfocytámí leukémie (B-CLL) z biologického vzorku odebraného z těla pacienta, jehož podstata spočívá v tom, že se stanoví exprese alespoň jednoho proteinu vybraného ze skupiny zahrnující membránové receptory Vangl2, Celsrl, a Frizzled 7, cytoplazmatické proteiny Dvl 2, Dvl 3 a Pricklel, kinázy kasein kináza 1 epsilon a kasein kináza 2 alfa a sekretovaný ligand Wnt5a a/nebo alespoň jednoho genu kódujícího protein vybraný ze skupiny zahrnující membránové receptory Vangl2, Celsrl, a Frizzled 7, cytoplazmatické proteiny Dvl 2, Dvl 3 a Pricklel, kinázy kasein kináza 1 epsilon a kasein kináza 2 alfa a sekretovaný ligand Wnt5a, přičemž míra upregulace těchto proteinů či genů v B-lymfocytech pacienta oproti kontrole koreluje se závažností a prognózou onemocnění B-CLL tak, že vyšší míra upregulace proteinů či genů znamená vyšší závažnost a horší prognózu.

Biologickým vzorkem odebraným z těla pacienta je s výhodou vzorek periferní krve.

Expresi proteinu lze stanovit např. metodou Western blotting nebo ELISA, pro membránové receptory lze použít také např. průtokovou cytometrii.

S výhodou je gen kódující protein vybrán ze skupiny zahrnující wnt5a, frizzled 7, vangl2, prickle 1 a celsrl. Expresi genu kódujícího protein lze stanovit např. metodou kvantitativní PCR (realtime PCR).

Pro detekci genové exprese metodou kvantitativní PCR lze použít jako primery následující oligonukleotidy:

Gen	Forward primer (5’ to 3’)	Reverse primer (5’ to 3’)
celsrl	TACAACCTTTGGGCTCTGGCTG	CCTTCATCAGGGTCGTTAGCAC
frizzled?	TACCACGGAGAGAAGGGCATC	GCATAAGAAAAAGCGGAGTTCGG
pricklel	TTCAGTGCTCAGCGGAAGAAAG	AGACAAAACAGGATGGGTGCC
vangl2	ACAGTAGTAACGGGCACCTCAGAGC	TTGAAGGCGACAGAGATGAAGAG
wnt5a	AACAGCCGCTTCAACTCGC	CGTAGCAGCACCAGTGGAACTTG

Lze použít i oligonukleotidy ne zcela identické se zde uvedenými primery, které však mají alespoň 75%, s výhodou alespoň 85%, homologii se zde uvedenými primery. Snížení homologie na 75 % (85 %) ve srovnání s originální sekvencí nukleotidů může být dosaženo zejména prodloužením nebo zkrácením příměrů o několik nukleotidů na 5' a/nebo 3'konci.

Přehled vyobrazení

Obr. 1 shrnuje výsledky diagnostiky B-CLL z mononukleárů periferní krve metodou RT-PCR podle příkladu l. Obrázek IA shrnuje relativní expresi sady testovaných genů vůči endogenní kontrole B2M (Beta-2 mikroglobulín) v mononukleárech 14-ti kontrol a 25-ti pacientů s BCLL. Obrázek 1B ukazuje korelaci exprese markérů se stádii B-CLL.

Obr. 2 shrnuje výsledky diagnostiky B-CLL z mononukleárů periferní krve metodou Western blotting podle příkladu 4. Obr. 2A ukazuje výsledky analýzy vzorků z B-CLL pacientů a zdravých kontrol metodou Western blotting. Obr. 2B ukazuje porovnání míry exprese proteinů u zdravých kontrol, pacientů s B-CLL ve stadiích 0—II a pacientů s B-CLL ve stadiích III—IV na stupnici nedetekovatelná exprese, slabá exprese, silná exprese.

Obr. 3 shrnuje výsledky diagnostiky B-CLL zB-lymfocytů periferní krve metodou Western blotting podle příkladu 5 - výsledky analýzy vzorků z B-CLL pacientů a zdravých kontrol.

Obr. 4 ukazuje způsob diagnostiky B-CLL z B-lymfocytů periferní krve metodou průtokové cytometrie podle příkladu 6.

Přehled sekvencí

SEQ,

SEQ,

SEQ,

SEQ,

SEQ

SEQ

SEQ,

SEQ

SEQ

SEQ

ID. NO. 1: sekvence proteinu Dvl2 ID. NO. 2: sekvence proteinu Dvl3 ID. NO. 3: sekvence proteinu CKlc ID. NO. 4: sekvence proteinu CK2a ID. NO. 5: sekvence proteinu Vangl2 ID. NO. 6: cDNA sekvence Wnt5a ID. NO. 8: cDNA sekvence Frizzled7 (Fz7) ID. NO. 9: cDNA sekvence Prickle 1 ID. NO. 10: cDNA sekvence ťangl2 ID. NO. 11: cDNA sekvence Celsrl

- j CZ 303555 B6

Příklady provedení vynálezu

Poznámka: v příkladech uváděný protein Frizzled 3 a gen jej kódující nespadají do rozsahu tohoto vynálezu.

Příklad 1: Diagnostika B-CLL z mononukleárů periferní krve metodou RT-PCR

Periferní krev B-CLL pacienta byla přenesena do zkumavky a byl změřen objem krve, 6 ml ředěné krve bylo navrstveno na 3 ml Ficoll-Paque Plus® vytemperovaného na laboratorní teplotu. Byla provedena centrifugace 30 minut/400g. Vrstva lymfocytů byla přenesena do čisté zkumavky (15 cm) a doplněna 2% FBS (fetální bovinní sérum ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem) na 10 ml, počet zkumavek byl zvolen tak, aby byly separované lymfocyty naředěny alespoň 2x, obsah zkumavek byl dobře promíchán. Poté byla provedena centrifugace ΙΟΙ 5 minut/200g, byl odsát supematant a sediment byl rozsuspendován v 1 ml chlazeného lyzačního pufru (lyže erytrocytů - 154,9mM NH₄C1, 9,9mM NH4HCO3, lmM EDTA), objem byl doplněn na 10 ml a převracením promíchán. Sedimenty z více zkumavek byly v tomto kroku spojeny. Byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200g, odsát supematant a sediment rozsuspendován v 2% FBS a přenesen do mikrozkumavky. Po další centrifugaci 10 minut/200g byl odsát supernatant a sediment byl lyžován v 350 μΐ RLT pufru (lyzační pufr, součást RNeasy Mini Kát firmy Qiagen určenému na izolaci totální RNA).

Totální RNA byla ze separovaných B-CLL buněk izolována pomocí High Pure RNA Isolation Kit podle instrukcí výrobce (Roche), Kvalita a koncentrace získané totální RNA byla stanovena spektrofometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy byly použity pouze vzorky s dobrými parametry (RIN > 8, koncentrace >50 ng/μΙ). K syntéze cDNA byl použit systém FastStart Taq DNA Polymerase (Roche) podle instrukcí výrobce. Bylo transkribováno 500 ng totální RNA. Získaných 20 μΐ cDNA bylo naředěno RNAse-free vodou na konečný objem 50 μΐ. Každý vzorek byl analyzován v triplikátu pomocí systému LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche), podle instrukcí výrobce. Amplifíkace DNA byla následně detekována přístrojem LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Roche) a získaná data byla analyzována pomocí softwaru LightCycler® 480 Software (Roche). Výsledkem bylo číslo cyklu, při kterém fluorescence dosáhne nastaveného prahu (Ct - fluorescence threshold cycle). Relativní exprese genu byla normalizována k expresi provozního genu GAPDH (Δ Ct). Získaná data byla analyzována pomocí neparametrického Wilcoxova testu.

V následujícím kroku jsme získali vzorky z mononukleárů periferní krve jak zdravých kontrol, tak pacientů v klinických stádiích 0-IV podle Raie a analyzovali expresi lidských homologů genů, které jsou asociovány s nekanonickou Wnt signalizací (se zaměřením na Wnt/PCP dráhu). Exprese genů pricklel, vangl2, celsrl, wnt5a, jrizzled3 a frizzled?, a endogenních kontrol (B2M a aktin) byly stanoveny pomocí RT-PCR. Expresi jsme analyzovali na panelu pacientů v různých klinických stádiích podle Raie. Obrázek 1A shrnuje expresi těchto genů v mononukleárech 14 kontrol a 25 pacientů. Výsledky kvantitativní reál time-PCR (qRT-PCR) analýzy poskytují důkaz, že některé PCR geny jsou vysoce exprimovány na úrovni transkripce v B-CLL buňkách.

Během qRT-PCR a analýzy proteinové exprese jsme zaznamenali značnou variabilitu v expresi jednotlivých markérů. Proto jsme testovali možnost, že exprese PCP genů je asociována s progresí B-CLL. Roztřídili jsme proto pacienti podle klinického stádia (podle Raie) a to do kategorií (i) stádium ft-II a (ii) stádium III—IV. Jak ukazuje obrázek 1B, exprese většiny markérů stanovení RT-PCR koreluje se stádii B-CLL. Tyto trendy jsou zřejmé ve všech genech, ale rozdíly v expresi B-CLL pacientů ve stádiích 0—II a III—IV v naších vzorcích jsou statisticky významné zejména u pricklel a frizzled7 (One way ANOVA, Tukey post test, p<0.05).

-4CZ 303555 B6

Příklad 2: Diagnostika B-CLL z B-lymfocytů periferní krve pomocí kvantitativní RT-PCR

Periferní krev pacienta s diagnózou B-CLL byla odebrána do odběrových zkumavek s antikoagulační látkou (heparin). Mononukleámí buňky byly separovány pomocí gradientově centri5 fugace (Fícoll-Paque PLUS, GE Healthcare), které předcházela inkubace s koktejlem bispecifických protilátek (na jednom konci anti CD2, CD3, CD16, CD36, CD56, CD66b a na druhém konci anti-glykoforin A) (RosetteSep® B Cell Enrichment Cocktail, StemCell), Nežádoucí buňky tvoří pomocí bispecifických protilátek společně s červenými krvinkami formace zvané rozety. Hustota vytvořených rozet je vyšší než hustota samotné nežádoucí buňky a během gradientově i o centrifugace dochází k jejich sedimentaci. Totální RNA byla ze separovaných B-CLL buněk izolována pomocí High Pure RNA Isolation Kit podle instrukcí výrobce (Roche). Kvalita a koncentrace získané totální RNA byla stanovena spektrofotometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy byly použity pouze vzorky s dobrými parametry (RIN > 8, koncentrace > 50 ng/μΙ). K syntéze cDNA byl použit systém FastStart Taq DNA Polymerase (Roche) podle instrukcí výrobce. Bylo transkribováno 500 ng totální RNA. Získaných 20 μΐ cDNA bylo naředěno RNAse-free vodou na konečný objem 50 μΐ. Každý vzorek byl analyzován v triplikátu pomocí systému LightCycler® 480 SYBR Green I Master (Roche), podle instrukcí výrobce. Amplifíkace DNA byla následně detekována přístrojem LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Roche) a získaná data byla analyzována pomocí softwaru LightCycler® 480

Software (Roche). Výsledkem bylo číslo cyklu, při kterém fluorescence dosáhne nastaveného prahu (CT - fluorescence threshold cycle). Relativní exprese genu byla normalizována k expresi provozního genu GAPDH, který byl vybrán na základě stability exprese napříč vzorky.

Příklad 3: Diagnostika B-CLL z B-lymfocytů periferní krve pomocí kvantitativní RT-PCR

Periferní krev B-CLL pacienta byla přenesena do zkumavky a byl změřen objem krve. Dále byl přidán RosetteSep® Human B Cell Enrichment Cocktail (50pl/ml krve), směs byla promíchána kroužením a inkubována 20 minut při laboratorní teplotě. Poté byl přidán minimálně stejný objem 2% FBS (fetální bovinní sérum ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem), promícháno a navrstveno 6 ml ředěné krve na 3 ml Fícoll-Paque plus® vytemperovaného na laboratorní teplotu. Byla provedena centrifugace 30 minut/400g. Vrstva lymfocytů byla přenesena do čisté zkumavky (15 cm) a doplněna 2% FBS na 10 ml, počet zkumavek byl zvolen tak, aby byly separované lymfocyty naředěny alespoň 2x, obsah zkumavek byl dobře promíchán. Poté byla prove35 děna centrifugace 10-15 minut/200g, byl odsát supematant a sediment byl rozsuspendován v 1 ml chlazeného lyzačního pufru (lyže erytrocytů - 154,9mM NH₄C1, 9,9mM NH₄HCO₃, lmM EDTA), objem byl doplněn na 10 ml a převracením promíchán. Sedimenty z více zkumavek byly v tomto kroku spojeny. Byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200g, odsát supematant a sediment rozsuspendován v 2% FBS a přenesen do mikrozkumavky. Po další centrifugaci 10 minut/200g byl odsát supematant a sediment byl lyžován v 350 μΐ RLT pufru (lyzační pufr, součást RNeasy Mini Kit firmy Qiagen určenému na izolaci totální RNA).

Totální RNA byla ze separovaných B-CLL buněk izolována pomocí High Pure RNA Isolation Kit podle instrukcí výrobce (Roche). Kvalita a koncentrace získané totální RNA byla stanovena spektrofometricky (NanoDrop) a elektroforeticky (BioAnalyzer 2100). Pro další analýzy byly použity pouze vzorky s dobrými parametry (RIN > 8, koncentrace > 50 ng/μΙ). K syntéze cDNA byl použit systém FastStart Taq DNA Polymerase (Roche) podle instrukcí výrobce. Bylo transkribováno 500 ng totální RNA. Získaných 20 μΙ cDNA bylo naředěno RNAse-free vodou na konečný objem 50 μΐ. Každý vzorek byl analyzován v triplikátu pomocí systému LightCycler®

480 SYBR Green I Master (Roche), podle instrukcí výrobce. Amplifíkace DNA byla následně detekována přístrojem LightCycler® 480 Real-Time PCR System (Roche) a získaná data byla analyzována pomocí softwaru LightCycler® 480 Software (Roche). Výsledkem bylo číslo cyklu, při kterém fluorescence dosáhne nastaveného prahu (Ct - fluorescence threshold cycle). Relativní

-5CZ 303555 B6 exprese genu byla normalizována k expresi provozního genu GAPDH (Δ Ct). Získaná data byla analyzována pomocí neparametrického Wilcoxova testu.

K detekci genové exprese v příkladech 1-3 byly použity následující primery:

Gen	Forward primer (5’ to 3’)	Reverse primer (5’ to 3’)	Prod (bp)
celsrl	TACAACCTTTGGGCTCTGGCTG	CC rrCATCAGGGTCGTTAGCAC	197
frizzled3	TTGAGGATGTGCCAAGATTTGC	AGCCTACGACAGGGAAGTGTGAC	209
FZ7	TACCACGGAGAGAAGGGCATC	GCATAAGAAAAAGCGGAGTTCGG	207
pricklel	TTCAGTGCTCAGCGGAAGAAAG	AGACAAAACAGGATGGGTGCC	175
vangl2	ACAGTAGTAACGGGCACCTCAG AGC	TTGAAGGCGACAGAGATGAAGAG	248
wntSa	AACAGCCGCTTCAACTCGC	CGTAGCAGCACCAGTGGAACTTG	232

Příklad 4: Diagnostika B-CLL z mononukleárů periferní krve pomocí metody Western Blotting io

Periferní krev B-CLL pacienta byla přenesena do zkumavky a byl změřen objem krve. 6 ml ředěné krve bylo navrstveno na 3 ml Ficoll-Paque Plus® vytemperovaném na laboratorní teplotu. Byla provedena centrifugace 30 minut/400g. Vrstva lymfocytů byla přenesena do čisté zkumavky (15 cm) a doplněna 2% FBS na 10 ml, počet zkumavek byl zvolen tak, aby byly separované lym15 focyty naředěny alespoň 2x, obsah zkumavek byl dobře promíchán. Poté byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200g, byl odsát supematant a sediment byl rozsuspendován v 1 ml chlazeného lyzačního pufru (lyže erytrocytů - 154,9mM NH4CI, 9,9mM NH4HCO3, lmM EDTA), objem byl doplněn na 10 ml a převracením promíchán. Sedimenty z více zkumavek byly v tomto kroku spojeny. Byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200g, odsát supematant a sediment rozsuspendován v 2% FBS a přenesen do mikrozkumavky. Po další centrifugací 10 minut/200g byl odsát supematant a sediment byl lyžován v lyzačním pufru (0,5% NP^IO, 150mM NaCl, 50mM Tris pH 7,4, lmM EDTA). Po sonikaci (Branson Sonifier 150) bylo určeno množství proteinů pomocí Bio-Rad DC Protein Assay kitu. Vzorky byly upraveny na jednotkou koncentraci proteinů 1 pg/μΙ a 20 μΐ každého vzorku bylo naneseno na 8% polyakry lam idový gel a ana25 lyžovanou metodou SDS-PAGE/Westem blotting podle standardního postupu s využitím polyvinylidendifluoridových (PVDF) membrán (Towbin H, Staehelin T, Gordon J. (1979): Electrophoretic transfer of proteins from polyaciylamide gels to nitrocellulose sheets: proceduře and some applications. Proč Nati Acad Sci U SA. 76 (9): 4350-4354; Pluskal MG, Przekop MB, Kavonian MR, Vecoli C, Hicks DA, Immobilon PVDF transfer membrane: A new membrane substráte for Western blotting of proteins. BioTechniques 4, 1986, pp. 272-282). Po blottingu byly membrány blokovány 1 hod v 5% odtučněném mléku (Promil, Laktino) v TBS-Tween (100mM NaCl, 20mM Tris (pH 7,6), 0,05 % Tween 20, ředěné v destilované vodě pH 7,1-7,2) K detekci byly použity následující kombinace protilátek ředěných v 5% mléku/TBS-Tween.

-6CZ 303555 B6

antigen	Primární protilátka (výrobce)	Ředění primární protilátky	Sekundární protilátka (výrobce)	Ředění sekundární protilátky
Dvl2	#3224 antirabbit Dvl2 (Cell Signaling Technology)	1:1000	A6667 anti-rabbit IgG (SigmaAldrich )	1:5000
Dvl3	SC-8027 antimouse Dvl3 (Santa Cruz Biotechnology, inc)	1:500	A6782 anti-mouse IgG (SigmaAldrichr)	1:5000
Kasein kináza 1 s(CKle)	SC-6471 antigoat CK1 (Santa Cruz Biotechnology, inc.)	1:500	A4174 anti-goat IgG (SigmaAldrich j	1:5000
Kasein kináza 2 α/α'	BD 611611 antimouse CK2 (BD Transduction Laboratories™)	1:500	A6782 anti-mouse IgG (SigmaAldrich®)	1:5000
Vangl2	AF4815 antigoat Vangl2 (R&D	1:1000	A4174 anti-goat IgG (SigmaAldrich;	1:5000
	Systems1*)
Prickle 1	abl5577 antirabbit Prickle 1 (Abcam®)	1:500	A6667 anti-rabbit IgG (SigmaAldrich®)	1:5000
Actin	SC-1615antirabbit Actin (Santa Cruz Biotechnology, inc.)	1:5000	A6667 anti-rabbit IgG (SigmaAldrich )	1:5000

Analýza vzorků z 15 B-CLL pacientů a 15-ti zdravých kontrol metodou Western blotting a zís5 kaná data prezentujeme v obrázku 2A. Detekovali jsme zvýšené hladiny PCP proteinů, identifikovaných pomocí qRT-PCR, jako jsou VangI2 a Prickle. To nám poskytuje důkaz, že zvýšené hladiny transkriptů jsou opravdu překládány do proteinů, jejichž zvýšené množství lze touto metodou detekovat. Proteinová analýza dalších komponent nekanonické Wnt signalizace jako jsou Dvl2, DvI3, CKlc a CK2a, vykazovala signifikantně vyšší hladiny těchto mediátorů u Βίο CLL pacientů. Je zajímavé,že transkripty kódující Dvl2 a Dvl3, a CKle a CK2a nebyly průkazně vyšší v prvotní analýza mononukleárů u B-CLL pacientů, což znamená, že hladina těchto proteinů je regulována post-transkripčně.

Protože WB analýza neposkytuje číselná data, roztřídili jsme data pouze do 3 kategorií: nede15 tekovatelná exprese, slabá exprese, silná exprese. Souhrn této analýzy je na obrázku 2B. CKle nebyla nikdy detekována u zdravých kontrol, Vangl2, Dvl2 a Dvl3 byly u zdravých detekovány jen zřídka (méně než 10 % případů vykazovalo jen slabou expresi) a CK2a byla slabě detekována v 50 % případů. Ve vzorcích z periferní krve pacientů ve stádiích O-Π se proteinové hladiny u

Dvl2, Dvl3, Vagl2, Ckle a CK2a lišily od nedetekovateIného signálu až po silný signál (zhruba 20 po třetině). Pacienti ve stádiích III—IV vykazovali silnou expresi všech zmíněných PCP proteinů kromě jen velmi mála pacientů. Díky těmto informacím můžeme říci, že dochází k akumulaci

PCP proteinů a jejich transkriptů s progresí B-CLL.

-7CZ 303555 B6

Příklad 5: Diagnostika B-CLL z B-lymfocytů periferní krve pomocí metody Western Blotting

Periferní krev B-CLL pacienta byla přenesena do zkumavky a byl změřen objem krve. Dále byl přidán RosetteSep® Human B Cell Enrichment Cocktail (50 μΙ/ml krve), směs byla promíchána kroužením a inkubována 20 minut při laboratorní teplotě. Poté byl přidán minimálně stejný objem 2% FBS (fetální bovinní sérum ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem), promícháno a navrstveno 6 ml ředěné krve na 3 ml Ficoll-Paque Plus® vytemperovaného na laboratorní teplotu. Byla provedena centrifugace 30 minut/400g. Vrstva lymfocytů byla přenesena do čisté zkumavky (15 cm) a doplněna 2% FBS na 10 ml, počet zkumavek byl zvolen tak, aby byly separované lymfocyty naředěny alespoň 2x, obsah zkumavek byl dobře promíchán. Poté byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200g, byl odsát supematant a sediment byl rozsuspendován v 1 ml chlazeného lyzačního pufru (lyže erytrocytů - 154,9mM NH4CI, 9,9mM NH4HCO3, lmM EDTA), objem byl doplněn na 10 ml a převracením promíchán. Sedimenty z více zkumavek byly v tomto kroku spojeny. Byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200g, odsát supematant a sediment rozsuspendován v 2% FBS a přenesen do mikrozkumavky. Po další centrifugaci 10 minut/200g byl odsát supematant a sediment byl lyžován a zpracován stejně jako u příkladu 5.

Postup uvedený v příkladu 5 umožňuje odlišit, zdaje zvýšené množství PCP proteinů přímo v BCLL buňkách neboje způsobeno kontaminací jinými buněčnými typy. Upregulace PCP proteinů může být v principu specifická pro B-CLL buňky nebo může odrážet obohacení periferních monoukleárů pacientů B-buňkami. Abychom vyvrátili druhou možnost, analyzovali jsme proteinové hladiny Vangl2, Dvl2, Dvl3, Ckle a CK2a ve vzorcích po separaci pomocí RosetteSep Human B Cell Enrichment Cocktail u 5 kontrol a 5 pacientů a získali jsme podobné výsledky jako u neseparovaných analyzovaných vzorků. Procento CD19+ buněk ve všech analyzovaných separovaných vzorcích bylo metodou FACS stanoveno na 95%. Výsledky jsou demonstrovány v obrázku 3.

Příklad 6: Stanovení přítomnosti PCP proteinů na povrchu B-CLL buněk

Některé PCP proteiny jsou membránové proteiny ajsou proto vhodné pro detekci pomocí průtokové cytometrie. Testovali jsme tedy jejich expresi v CD19+ B-buňkách.

Postup: Periferní krev B-CLL pacienta byla přenesena do zkumavky a byl změřen objem krve. Dále byl přidán RosetteSep® Human B Cell Enrichment Cocktail (50 μΙ/ml krve), směs byla promíchána kroužením a inkubována 20 minut při laboratorní teplotě. Poté byl přidán minimálně stejný objem 2% FBS (fetální bovinní sérum ve fyziologickém roztoku s fosfátovým pufrem), vše promícháno a 6 ml této ředěné krve navrstveno na 3 ml Ficoll-Paque Plus® vytemperovaný na laboratorní teplotu. Byla provedena centrifugace 30 minut/400g. Vrstva lymfocytů byla přenesena do čisté zkumavky (15 cm) a doplněna 2% FBS na 10 ml, počet zkumavek byl zvolen tak, aby byly separované lymfocyty naředěny alespoň 2x, obsah zkumavek byl dobře promíchán. Poté byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200 g, byl odsát supematant a sediment byl rozsuspendován v 1 ml chlazeného lyzačního pufru (lyže erytrocytů - 154,9mM NH₄C1, 9,9mM NH4HCO3, lmM EDTA), objem byl doplněn na 10 ml a převracením promíchán. Sedimenty z více zkumavek byly v tomto kroku spojeny. Byla provedena centrifugace 10 až 15 minut/200g, odsát supematant a sediment rozsuspendován v 2% FBS a přenesen do mikrozkumavky. Po další centrifugaci 10 minut/200g byl odsát supematant, sediment byl promyt Iml PBS a následně po další centrifugaci rozsuspendován v menším množství PBS a fixován v Iml vychlazeného methanolu (-20 °C). Po fixaci v ledovém methanolu byly vzorky opláchnuty v azidovém pufru (PBS, 1%BSA, 0,1% azid sodný) a zcentrifugovány (200g/5min/RT). Každý vzorek byl naředěn tak, aby obsahoval nejméně 0,5x10⁶ buněk. Po přidání 50 μΐ azidového pufru s primární protilátkou v poměru 1:50 byly vzorky inkubovány alespoň 1 hod při teplotě 37 °C. Vzorky byly opláchnuty v azidovém pufru, zcentrifugovány a ponechány v 50 μΐ azidového pufru, ke kterému byla přidána sekundární protilátka (anti-goat-Cy5 od Jackson ImunoResearch 1:200, nebo antirabbit-alexa488 od Axxora 1:1000 nebo anti-mouse-alexa488 od Axxora 1:1000). Takto byly

- 8 CZ 303555 B6 inkubovány l hod při teplotě 37 °C. Měření bylo provedeno na přístroji FACSCalibur (Becton Dickinson) a pro vyhodnocení byl využit software CellQuest 3.0 (Becton Dickinson).

Výsledky ukazujeme v obrázku 4. Tyto výsledky prokazují s využitím několika metod, že PCP proteiny jsou upregulované u B-CLL leukemických klonů ve srovnání s B-buňkami zdravých kontrol, a že jsou přítomné na povrchu B-CLL lymfocytů.

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález je možné využít při diagnostice a léčbě B~buněčné chronické lymfocytámí leukémie (B-CLL). Vzhledem k faktu, že zde popsané proteiny a geny jsou upregulované u BCLL ajejich exprese v dospělých lidských tkáních je poměrně nízká, je možné využít stanovení jejich exprese jako diagnostických/prognostických markérů.

Sekvence_Bryja.ST25

SEQUENCE LISTING <110> Masarykova univerzita <120> Způsob stanovení diagnózy u pacientů s B-buněěnou chronickou lymfocytámí leukémií <130> P <160> 11 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1

- 9 CZ 303555 B6

Met Ala Gly Ser Ser

Thr Gly

Gly Gly Gly 10

val

Gly Glu

Thr

Lys 15

Val

1

5

Ile

Tyr

Hi s

Leu

Asp

Glu

Glu

Glu

Thr

Pro

Tyr

Leu

val

Lys

Ile

Pro

20

25

30

val

Pro

Ala

Glu

Arg

ile

Thr

Leu

Gly

Asp

Phe

Lys

Ser

val

Leu

Gin

35

40

45

Arg

Pro

Ala

Gly

Ala

Lys

Tyr

Phe

Phe

Lys

ser

Met

ASP

Gin

Asp

Phe

50

55

60

Gly

val

val

Lys

Glu

Glu

Ile

Ser

Asp

Asp

Asn

Ala

Arg

Leu

pro

cys

65

70

75

80

Phe

Asn

Gly

Arg

val

val

Ser

Trp

Leu

val

Ser

Ser

Asp

Asn

pro

Gin

85

90

95

Pro

Glu

Met

Ala

Pro

Pro

Val

His

Glu

Pro

Arg

Ala

Glu

Leu

Ala

pro

100

105

110

pro

Ala

pro

Pro

Leu

Pro

Pro

Leu

Pro

Pro

Glu

Arg

Thr

ser

Gly

Ile

115

120

125

Gly

Asp

Ser

Arg

Pro

Pro

Ser

Phe

H7S

pro

Asn

val

ser

Ser

Ser

His

130

135

140

Glu

Asn

Leu

Glu

Pro

Glu

Thr

Glu

Thr

Glu

Ser

Val

Val

ser

Leu

Arg

145

150

155

160

Arg

Gl u

Arg

Pro

Arg

Arg

Arg

Asp

Ser

Ser

Glu

His

Gly

Ala

Gly

Gly

165

170

175

His

Arg

Thr

Gly

Gly

Pro

Ser

Arg

Leu

Glu

Arg

His

Leu

Ala

Gly

Tyr

180

185

190

- 10CZ 303555 B6

Glu

ser Ser Ser 195

sekvence. Thr Leu Met Thr Ser Glu 200

Bryia.ST25

Leu

Glu

Ser 205

Thr

Ser

Leu

Gly

ASp

Ser

Asp

Glu

Glu

ASp

Thr

Met

Ser

Arg

Phe

ser

ser

Ser

Thr

210

215

220

Glu

Gin

Ser

ser

Ala

ser

Arg

Leu

Leu

Lys

Arg

His

Arg

Arg

Arg

225

230

235

240

Lys

Gin

Arg

Pro

pro

Arg

Leu

Glu

Arg

Thr

ser

Ser

Phe

ser

ser

val

245

250

255

Thr

Asp

ser

Thr

Met

Ser

Leu

Asn

Ile

Ile

Thr

val

Thr

Leu

Asn

Met

260

265

270

Glu

Lys

Tyr

Asn

Phe

Leu

Gly

ile

Ser

Ile

val

Gly

Gin

Ser

Asn

Glu

275

280

285

Arg

Gly

ASp

Gly Gly

ile

Tyr

ile

Gly

Ser

Ile

Met

Lys

Gly Gly

Ala

290

295

300

val

Ala

Ala

Asp

Gly

Arg

ile

Glu

Pro

Gly

Asp

Met

Leu

Leu

Gin

val

: 305

310

315

320

i Α5Π

ASp

Met

Asn

Phe

Glu

Asn

Met

Ser

Asn

Asp

Asp

Ala

val

Arg

Val

325

330

335

Leu

Arg

Asp

ile

val

HiS

Lys

Pro

Gly

Pro

ile

val

Leu

Thr

val

Ala

340

345

350

Lys

Cys

Trp 355

Asp

Pro

Ser

Pro

Gin 360

Ala

Tyr

Phe

Thr

Leu 365

pro

Arg

Asn

Glu

Pro

Ile

Gin

Pro

ile

Asp

Pro

Ala

Ala

Trp

val

Ser

HiS

Ser

Ala

370

375

380

Ala

Leu

Thr

Gly

Thr

Phe

Pro

Ala

Tyr

pro

Gly

Ser

Ser

ser

Met

Ser

1 385

390

395

400

Thr

Ile

Thr

ser

Gly

Ser

Ser

Leu

Pro

Asp

Gly

Cys

Glu

Gly

Arg

Gly

405

410

415

Leu

ser

val

HiS

Thr

ASp

Met

Ala

Ser

val

Thr

Lys

Ala

Met

Ala

Ala

420

425

430

Pro

Glu

Ser

Gly

Leu

GlU

val

Arg

ASp

Arg

Met

Trp

Leu

Lys

Ile

Thr

435

440

445

Tle

Pro

Asn

Ala

Phe

Leu

Gly

Ser

ASp

val

val

Asp

Trp

Leu

Tyr

His

450 455 460

-11CZ 303555 B6 sekvence_B ryj a.ST2 5

His 465

val Glu Gly

Phe Pro 470

Glu

Arg Arg

Glu Ala Arg 475

Lys

Tyr

Ala

ser 480

Gly

Leu

Leu

Lys

Ala

Gly

Leu

Ile

Arg

His

Thr

val

Asn

Lys

Ile

Thr

485

490

495

Phe

Ser

Glu

Gin 500

cys

Tyr

Tyr

Val

Phe 505

Gly

Asp

Leu

ser

Gly 510

Gly

cys

Glu

Ser

Tyr

Leu

val

Asn

Leu

Ser

Leu

Asn

Asp

Asn

ASp

Gly

Ser

Ser

515

520

525

Gly

Ala

Ser

Asp

Gin

Asp

Thr

Leu

Ala

Pro

Leu

Pro

Gly

Ala

Thr

Pro

530

535

540

Trp

pro

Leu

Leu

Pro

Thr

Phe

Ser

Tyr

Gin

Tyr

Pro

Ala

Pro

His

Pro

545

550

555

560

Tyr

Ser

Pro

Gin

Pro 565

pro

Pro

Tyr

His

Glu 570

Leu

ser

Ser

Tyr

Thr 575

Tyr

Gly

Gly Gly

Ser

Ala

ser

ser

Gin

His

Ser

Glu

Gly

ser

Arg

Ser

Ser

580

585

590

Gly

ser

Thr 595

Arg

Ser

Asp

Gly Gly 600

Ala

Gly

Arg

Thr

Gly 605

Arg

pro

Glu

Glu

Arg

Ala

ΡΓΟ

Glu

Ser

Lys

ser

Gly

Ser

Gly

Ser

Glu

Ser

Glu

Pro

610

615

620

ser 625

ser

Arg

Gly

Gly

Ser 630

Leu

Arg

Arg

Gly

&

Glu

Ala

Ser

Gly

Thr 640

Ser

Asp

Gly

Gly

Pro

Pro

Pro

Ser

Arg

Gly

Ser

Thr

Gly

Gly

Ala

Pro

645

650

655

Asn

Leu

Arg

Ala

His

Pro

Gly

Leu

HÍS

pro

Tyr

Gly

Pro

Pro

Pro

Gly

660

665

670

Met

Ala

Leu

Pro

Tyr

Asn

Pro

Met

Met

val

Val

Met

Met

Pro

pro

Pro

675

680

685

pro

Pro

Pro

val

pro

Pro

Ala

Val

Gin

Pro

pro

Gly

Ala

Pro

pro

val

690

695

700

Arg

Asp

Leu

Gly

Ser

val

pro

pro

Glu

Leu

Thr

Ala

Ser

Arg

Gl n

Ser

705

710

715

720

Phe

His

Met

Ala

Met

Gly

Asn

pro

Ser

Glu

Phe

phe

val

Asp

Val

Met

725

730

735

- 12CZ 303555 B6 <210> 2 <211> 716 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2

Met Gly 1

Glu

Thr

Lys 5

Ile Ile Tyr His

Leu Asp Gly Gin Glu 10

Thr 15

Pro

Tyr

Leu

val

Lys

Leu

Pro

Leu

Pro

Ala

Glu

Arg

val

Thr

Leu

Ala

Asp

20

25

30

Phe

Lys

Gly

val

Leu

Gin

Arg

Pro

Ser

Tyr

Lys

Phe

Phe

Phe

Lys

Ser

35

40

45

Met

ASp

Asp

ASP

Phe

Gly

val

val

Lys

Glu

Glu

ile

Ser

Asp

ASp

Asn

50

55

60

Ala

Lys

Leu

Pro

Cys

Phe

Asn

Gly

Arg

Val

val

ser

Trp

Leu

val

Ser

65

70

75

80

Ala

Glu

Gly

ser

HiS

Pro

Asp

Pro

Ala

Pro

Phe

cys

Ala Asp

Asn

Pro

85

90

95

Ser

Glu

Leu

pro

pro

Pro

Met

Glu

Arg

Thr

Gly

Gly

Ile

Gly

ASp

Ser

100

105

110

Arg

Pro

Pro

Ser

Phe

HiS

Pro

HÍ S

Ala

Gly

Gly Gly

ser

Gin

Glu

Asn

115

120

125

Leu

Asp

Asn

ASp

Thr

Glu

Thr

ASp

ser

Leu

val

ser

Ala

Gin

Arg

Glu

130

135

140

Arg

Pro

Arg

Arg

Arg

Asp

Gly

Pro

Glu

His

Ala

Thr

Arg

Leu

Asn

Gly

145

150

155

160

Thr

Ala

Lys

Gly

Glu 165

Arg

Arg

Arg

Gl u

Pro 170

Gly Gly

Tyr

Asp

ser 175

ser

Ser

Thr

Leu

Met

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Thr

Thr

Ser

Phe

Phe

ASP

Ser

180

185

190

Asp

Gl u

Asp

ASp

Ser

Thr

ser

Arg

phe

ser

Ser

ser

Thr

Glu

Gin

Ser

195

200

205

Ser

Ala

Ser

Arg

Leu

Met

Arg

Arg

His

Lys

Arg

Arg

Arg

Arg

Lys

Gin

210

215

220

Lys

Val

Ser

Arg

Ile

Glu

Arg

Ser

ser

Ser

Phe

ser

Ser

Ile

Thr

ASp

225

230

235

240

ser

Thr

Met

ser

Leu

Asn

Ile

Ile

Thr

val

Thr

Leu

Asn

Met

Gl u

Lys

- 13CZ 303555 B6

245

Sekvence_8ryj a.ST2 5 250

255

Tyr

Asn

Phe

Leu

Gly

lle

Ser

Ile

Val

Gly

Gin

Ser

Asn

Glu

Arg

Gly

260

265

270

ASp

Gly Gly 275

ile

Tyr

ile

Gly

Ser 280

Ile

Met

Lys

Gly

Ϊ&

Ala

Val

Ala

Ala

ASp

Gly

Arg

ile

Glu

Pro

Gly

Asp

Met

Leu

Leu

Gin

val

Asn

Glu

290

295

300

ile

Asn

Phe

Glu

Asn

Met

Ser

Asn

ASp

Asp

Ala

Val

Arg

val

Leu

Arg

305

310

315

320

Glu

ile

Val

His

Lys

pro

Gly

Pro

ile

Thr

Leu

Thr

val

Ala

Lys

Cys

325

330

335

Trp

ASp

ΡΓΟ

Ser

pro

Arg

Gly

Cys

phe

Thr

Leu

Pro

Arg

Ser

Glu

Pro

340

345

350

Ile

Arg

Pro

ile

ASp

Pro

Ala

Ala

Trp

val

Ser

His

Thr

Ala

Ala

Met

355

360

365

Thr

Gl y

Thr

Phe

pro

Ala

Tyr

Gly

Met

ser

pro

Ser

Leu

Ser

Thr

ile

370

375

380

Thr

ser

Thr

Ser

Ser

Ser

ile

Thr

ser

Ser

ile

pro

Asp

Thr

Glu

Arg

385

390

395

400

Leu

ASP

Asp

Phe

His

Leu

Ser

ile

His

Ser

Asp

Met

Ala

Ala

lle

val

405

410

415

Lys

Ala

Met

Ala

Ser

Pro

Glu

ser

Gly

Leu

Glu

val

Arg

Asp

Arg

Met

420

425

430

Trp

Leu

Lys

ile

Thr

ile

Pro

Asn

Ala

Phe

lle

Gly

ser

ASp

val

Val

435

440

445

Asp

Trp 450

Leu

Tyr

Hi s

Asn

val 455

Glu

Gly

Phe

Thr

Asp 460

Arg

Arg

Gl u

Ala

Arg

Lys

Tyr

Ala

Ser

Asn

Leu

Leu

Lys

Ala

Gly

phe

ile

Arg

His

Thr

465

470

475

480

val

Asn

Lys

ile

Thr

Phe

ser

Gl u

Gin

cys

Tyr

Tyr

ile

Phe

Gly

Asp

485

490

495

Leu

Cys

Gly

Asn

Met

Ala

Asn

Leu

Ser

Leu

His

Asp

His

Asp

Gly

Ser

500

505

510

Ser

Gly

Al a

Ser

ASp

Gin

Asp

Thr

Leu

Ala

pro

Leu

Pro

His

Pro

Gly

- 14CZ 303555 B6

Sekvence_Bryja.ST2 5

515

520

525

Ala

Ala

Pro

Trp

pro

Met

Ala

Phe

pro

Tyr

Gin

Tyr

Pro

pro

Pro

pro

530

535

540

Hi s

pro

Tyr

Asn

Pro

Hi s

pro

Gly

Phe

Pro

Glu

Leu

Gly

Tyr

Ser

Tyr

545

550

555

560

Gly

Gly

Gly

Ser

Ala

ser

Ser

Gin

HÍS

ser

Glu

Gly

Ser

Arg

ser

Ser

565

570

575

Gly

ser

Asn

Arg 580

ser

Gly

Ser

Asp

Arg 585

Arg

Lys

Glu

Lys

Asp 590

ΡΓΟ

Lys

Ala

Gly

Asp

Ser

Lys

ser

Gly

Gly

ser

Gly

ser

Glu

Ser

Asp

His

Thr

595

600

605

Thr

Arg

Ser

ser

Leu

Arg

Gly

Pro

Arg

Glu

Arg

Ala

Pro

ser

Glu

Arg

610

615

620

ser

Gly

Pro

Ala

Ala

ser

Glu

Hi s

Ser

His

Arg

Ser

His

HÍS

Ser

Leu

625

630

635

640

Al a

Ser

ser

Leu

Arg

ser

His

His

Thr

His

Pro

ser

Tyr

Gly

Pro

Pro

645

650

655

Gly

val

pro

Pro

Leu

Tyr

Gly

pro

Pro

Met

Leu

Met

Met

pro

Pro

Pro

660

665

670

Pro

Ala

Ala

Met

Gly

Pro

pro

Gly

Ala

pro

Pro

Gly

Arg

ASp

Leu

Ala

675

680

685

ser

val

Pro

Pro

Glu

Leu

Thr

Ala

Ser

Arg

Gin

Ser

Phe

Arg

Met

Ala

690

695

700

Met

Gly

Asn

Pro

ser

Glu

Phe

Phe

val

Asp

val

Met

705

710

715

<210>

3

<211>

416

<212>

PRT

<213>

Homo sapiens

<400>

3

Met 1

Glu Leu

Arg

val 5

Gly

Asn

Lys

Tyr

Arg 10

Leu

Gly

Arg

Lys

Ile 15

Gly

ser

Gly ser

Phe 20

Gly

Asp

ile

Tyr

Leu 25

Gly

Ala

Asn

Ile

Ala 30

ser

Gly

Glu

Glu val 35

Ala

ile

Lys

Leu

Glu 40

cys

val

Lys

Thr

Lys 45

His

Pro

Gin

- 15CZ 303555 B6

Sekvence_Bryj a.ST2 5

Leu Hi s 50

Ile Glu

Ser Lys

Phe 55

Tyr

Lys Met Met Gin Gly Gly Val 60

Gly

ile

pro

Ser

ile

Lys

Trp

Cys

Gly

Ala

Glu

Gly

Asp

Tyr

Asn

val

Met

65

70

75

80

val

Met

Glu

Leu

Leu 85

Gly

pro

Ser

Leu

Glu 90

Asp

Leu

Phe

Asn

Phe 95

cys

Ser

Arg

Lys

Phe

ser

Leu

Lys

Thr

Val

Leu

Leu

Leu

Ala

Asp

Gin

Met

100

105

110

ile

Ser

Arg

Ile

Glu

Tyr

ile

HÍS

ser

Lys

Asn

Phe

Ile

His

Arg

Asp

115

120

125

val

Lys

pro

ASp

Asn

Phe

Leu

Met

Gly

Leu

Gly

Lys

Lys

Gly

Asn

Leu

130

135

140

val 145

Tyr

Ile

Ile

Asp

Phe 150

Gly

Leu

Ala

Lys

Lys 155

Tyr

Arg

Asp

Ala

Arg 160

Thr

His

Gin

HÍS

ile

Pro

Tyr

Arg

Glu

Asn

Lys

Asn

Leu

Thr

Gly

Thr

165

170

175

Ala

Arg

Tyr

Ala

ser

Ile

Asn

Thr

His

Leu

Gly

Ile

Glu

Gin

Ser

Arg

180

185

190

Arg

ASp

ASp

Leu

Glu

Ser

Leu

Gly

Tyr

val

Leu

Met

Tyr

Phe

Asn

Leu

195

200

205

Gly

Ser 210

Leu

Pro

Trp

Gin

Gly 215

Leu

Lys

Ala

Ala

Thr 220

Lys

Arg

Gin

Lys

Tyr

Glu

Arg

ile

Ser

Glu

Lys

Lys

Met

ser

Thr

Pro

Ile

Gl u

val

Leu

225

230

235

240

Cys

Lys

Gly

Tyr

Pro

Ser

Glu

Phe

ser

Thr

Tyr

Leu

Asn

Phe

Cys

Arg

245

250

255

ser

Leu

Arg

Phe 260

ASp

Asp

Lys

pro

Asp 265

Tyr

ser

Tyr

Leu

Arg 270

Gin

Leu

Phe

Arg

Asn

Leu

Phe

His

Arg

Gin

Gly

Phe

Ser

Tyr

Asp

Tyr

val

Phe

275

280

285

Asp

Trp

Asn

Met

Leu

Lys

Phe

Gly

Ala

Ala

Arg

Asn

Pro

Glu

ASp

val

290

295

300

Asp

Arg

Glu

Arg

Arg

Glu

His

Glu

Arg

Glu

Glu

Arg

Met

Gly

Gin

Leu

305

310

315

320

- 16CZ 303555 B6

Arg

Gly

Ser

Ala

Thr

Arg

Ala

Leu

Pro

pro

Gly

Pro

Pro

Thr

Gly

Ala

325

330

335

Thr

Ala

Asn

Arg

Leu

Arg

Ser

Ala

Ala

Glu

Pro

val

Ala

Ser

Thr

Pro

340

345

350

Al a

ser

Ile

Gin

Pro

Ala

Gly 360

Asn

Thr

Ser

pro

Ala

ile

ser

Arg

val

ASp

Arg

Glu

Arg

Lys

val

ser

Met

Arg

Leu

His

Arg

Gly

Ala

370

375

380

Pro

Ala

Asn

val

ser

Ser

Ser

ASp

Leu

Thr

Gly

Arg

Gin

Glu

val

Ser

385

390

395

400

Arg

Ile

Pro

Ala

Ser

Gin

Thr

ser

val

pro

Phe

ASp

HÍS

Leu

Gly

Lys

405 410 415 <210> 4 <211> 391 <212> PRT <213> Homo sapiens

<400> 4

Arg val Tyr Thr Asp val Asn

Met ser Gly Pro 1

val 5

pro

ser Arg

Ala

10

15

Thr

His

Arg

Pro 20

Arg

Glu

Tyr

Trp

Asp 25

Tyr

Glu

Ser

His

val 30

val

Glu

Trp

Gly

Asn

Gin

ASp

Asp

Tyr

Gl n

Leu

val

Arg

Lys

Leu

Gly

Arg

Gly

35

40

45

Lys

Tyr

ser

Glu

val

Phe

Glu

Ala

Ile

Asn

ile

Thr

Asn

Asn

Glu

Lys

50

55

60

val

val

val

Lys

ile

Leu

Lys

pro

val

Lys

Lys

Lys

Lys

Ile

Lys

Arg

65

70

75

80

Glu

Ile

Lys

Ile

Leu

Glu

Asn

Leu

Arg

Gly

Gly

Pro

Asn

Ile

Ile

Thr

85

90

95

Leu

Ala

Asp

Ile

val

Lys

Asp

ΡΓΟ

val

Ser

Arg

Thr

Pro

Ala

Leu

val

100

105

110

Phe

Glu

HiS

val

Asn

Asn

Thr

Asp

Phe

Lys

Gin

Leu

Tyr

Gin

Thr

Phe

115

120

125

Thr

ASp

Tyr

Asp

ile

Arg

Phe

Tyr

Met

Tyr

Glu

Ile

Leu

Lys

Ala

Leu

130

135

140

- 17CZ 303555 B6

S

iekvence_Bryj

a.ST25

ASp

Tyr

cys

His

Ser

Met

Gly

ile

Met

His

Arg

ASp

val

Lys

Pro

His

145

150

155

160

Asn

val

Met

ile

Asp

His

Gl u

HÍS

Arg

Lys

Leu

Arg

Leu

ile

Asp

Trp

165

170

175

Gly

Leu

Ala

Glu

Phe

Tyr

His

Pro

Gly

Gin

Glu

Tyr

Asn

val

Arg

val

180

185

190

Ala

ser

Arg 195

Tyr

phe

Lys

Gly

Pro 200

Glu

Leu

Leu

Val

55?

Tyr

Gin

Met

Tyr

Asp 210

Tyr

ser

Leu

ASp

Met 215

Trp

ser

Leu

Gly

&

Met

Leu

Ala

ser

Met 225

Ile

Phe

Arg

Lys

Glu 230

Pro

Phe

Phe

His

&

Arg

ASp

Asn

Tyr

Asp 240

Gin

Leu

val

Arg

ile

Ala

Lys

val

Leu

Gly

Thr

Glu

Asp

Leu

Tyr

Gly

245

250

255

Tyr

Ile

Asp

Lys

Tyr

Asn

ile

Glu

Leu

Asp

Pro

Arg

Phe

Asn

Asp

Ile

260

265

270

Leu

Gly

W

HÍS

Ser

Arg

Lys

Arg 280

Trp

Glu

Arg

Phe

val 285

His

Arg

Glu

Asn

Gin

His

Leu

val

Ser

pro

Glu

Ala

Leu

ASp

Phe

Leu

ASp

Lys

Leu

290

295

300

Leu

Arg

Tyr

Asp

His

Gin

ser

Arg

Leu

Thr

Ala

Arg

Glu

Ala

Met

Glu

305

310

315

320

His

Pro

Tyr

Phe

Tyr

Thr

val

val

Lys

ASp

Gin

Ala

Arg

Met

Gly

Ser

325

330

335

Ser

Ser

Met

pro

Gly

Gly

ser

Thr

Pro

Val

Ser

Ser

Ala

Asn

val

Met

340

345

350

Ser

Gly

Ile

Ser

ser

val

Pro

Thr

Pro

Ser

Pro

Leu

Gly

Pro

Leu

Ala

355

360

365

Gly

Ser

Pro

val

Ile

Ala

Ala

Ala

Asn

Pro

Leu

Gly

Met

pro

val

Pro

370

375

380

Ala Ala Ala Gly Ala Gin Gin 385 390 <210> 5 <211> 521 <212> PRT <213> Homo sapiens

- 18 CZ 303555 B6 <400> 5

Met Asp 1

Thr

Glu

Ser 5

Gin Tyr Ser Gly

Tyr 10

ser Tyr

Lys

Ser

Gly 15

His

ser

Arg

ser

Ser 20

Arg

Lys

His

Arg

Asp 25

Arg

Arg

ASp

Arg

His 30

Arg

Ser

Lys

Ser

Arg 35

Asp

Gly

Gly

Arg

Gly 40

ASp

Lys

ser

val

Thr 45

ile

Gin

Ala

pro

Gly

Glu

Pro

Leu

Leu

ASP

Asn

Glu

Ser

Thr

Arg

Gly

Asp

Gl u

Arg

50

55

60

ASp

ASP

Asn

Trp

Gly

Glu

Thr

Thr

Thr

val

val

Thr

Gly

Thr

Ser

Glu

65

70

75

80

His

Ser

ile

ser

His

ASp

Asp

Leu

Thr

Arg

Ile

Ala

Lys

ASp

Met

Glu

85

90

95

Asp

Ser

val

pro

Leu

ASp

cys

ser

Arg

His

Leu

Gly

val

Ala

Ala

Gly

100

105

110

Ala

Thr

Leu

Ala

Leu

Leu

ser

Phe

Leu

Thr

Pro

Leu

Ala

phe

Leu

Leu

115

120

125

Leu

pro

pro

Leu

Leu

Trp

Arg

Glu

Glu

Leu

Glu

pro

cys

Gly

Thr

Ala

130

135

140

cys

Glu

Gly

Leu

Phe

ile

Ser

Val

Ala

Phe

Lys

Leu

Leu

ile

Leu

Leu

145

150

155

160

Leu

Gly

ser

Trp

Ala

Leu

Phe

Phe

Arg

Arg

Pro

Lys

Ala

Ser

Leu

pro

165

170

175

Arg

val

phe

Val

Leu

Arg

Ala

Leu

Leu

Met

val

Leu

val

Phe

Leu

Leu

180

185

190

val

val

ser

Tyr

Trp

Leu

Phe

Tyr

Gly

val

Arg

Ile

Leu

ASp

Ala

Arg

195

200

205

Glu

Arg

ser

Tyr

Gin

Gly

val

val

Gin

Phe

Ala

val

ser

Leu

val

Asp

210

215

220

Ala

Leu

Leu

Phe

val

HÍS

Tyr

Leu

Ala

val

val

Leu

Leu

Glu

Leu

Arg

225

230

235

240

Gin

Leu

Gin

Pro

Gin

Phe

Thr

Leu

Lys

Val

val

Arg

Ser

Thr

ASp

Gly

245

250

255

- 19CZ 303555 B6

Ala

Ser

Arg

Phe 260

Tyr

Asn

val

sekvence_Bryi

a.ST25 Ile Gin

Arg 270

val

Ala

Gly His 265

Leu Ser

Val

Trp

Ile 275

Leu

Glu

Lys

Tyr

Tyr 280

HÍS

Asp

Phe

Pro

val 285

Tyr

Asn

Pro

Ala

Leu

Leu

Asn

Leu

Pro

Lys

Ser

Val

Leu

Ala

Lys

Lys

val

Ser

Gly

290

295

300

Phe

Lys

val

Tyr

ser

Leu

Gly

Glu

Glu

Asn

Ser

Thr

Asn

Asn

Ser

Thr

305

310

315

320

Gly

Gin

Ser

Arg

Ala

val

Ile

Ala

Ala

Ala

Ala

Arg

Arg

Arg

Asp

Asn

325

330

335

ser

HiS

Asn

Glu

Tyr

Tyr

Tyr

Glu

Glu

Ala

Glu

His

Glu

Arg

Arg

val

340

345

350

Arg

Lys

Arg

Arg

Ala

Arg

Leu

val

val

Ala

Val

Glu

Glu

Ala

Phe

Thr

355

360

365

His

ile

Lys

Arg

Leu

Gin

Glu

Glu

Glu

Gin

Lys

Asn

Pro

Arg

GlU

val

370

375

380

Met

ASp

pro

Arg

Glu

Ala

Ala

Gin

Ala

Ile

Phe

Ala

Ser

Met

Ala

Arg 400

385

390

395

Ala

Met

Gin

Lys

Tyr

Leu

Arg

Thr

Thr

Lys

Gin

Gin

Pro

Tyr

His

Thr

405

410

415

Met

Glu

Ser

Ile

Leu

Gin

HÍS

Leu

Glu

Phe

cys

Ile

Thr

HÍS

Asp

Met

420

425

430

Thr

Pro

Lys

Ala

Phe

Leu

Glu

Arg 440

Tyr

Leu

Ala

Ala

Gly

Pro

Thr

ile

435

445

Gin

Tyr

His

Lys

Glu

Arg

Trp

Leu

Ala

Lys

Gin

Trp

Thr

Leu

val

Ser

450

455

460

Glu

Glu

pro

val

Thr

Asn

Gly

Leu

Lys

ASp

Gly

Ile

val

Phe

Leu

Leu

465

470

475

480

Lys

Arg

Gin

Asp

Phe

ser

Leu

val

val

Ser

Thr

Lys

Lys

val

Pro

Phe

485

490

495

Phe

Lys

Leu

Ser

Glu

Glu

Phe

val

ASp

Pro

Lys

ser

Hi S

Lys

Phe

val

500

505

510

Met

Arg

Leu

Gin

Ser

Glu

Thr

Ser

Val

515

520

-20CZ 303555 B6 <210> 6 <211> 1143 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 6

atgaagaagt	ccattggaat	attaagccca	ggagttgctt	tggggatggc	tggaagtgca	60
atgtcttcca	agttcttcct	agtggctttg	gccatatttt	tctccttcgc	ccaggttgta	120
attgaagcca	attcttggtg	gtcgctaggt	atgaataacc	ctgttcagat	gtcagaagta	180
tatattatag	gagcacagcc	tctctgcagc	caactggcag	gactttctca	aggacagaag	240
aaactgtgcc	acttgtatca	ggaccacatg	cagtacatcg	gagaaggcgc	gaagacaggc	300
atcaaagaat	gccagtatca	attccgacat	cgaaggtgga	actgcagcac	tgtggataac	360
acctctgttt	ttggcagggt	gatgcagata	ggcagccgcg	agacggcctt	cacatacgcg	420
gtgagcgcag	caggggtggt	gaacgccatg	agccgggcgt	gccgcgaggg	cgagctgtcc	480
acctgcggct	gcagccgcgc	cgcgcgcccc	aaggacctgc	cgcgggactg	gctctggggc	540
ggctgcggcg	acaacatcga	ctatggctac	cgctttgcca	aggagttcgt	ggacgcccgc	600
gagcgggagc	gcatccacgc	caagggctcc	tacgagagtg	ctcgcatcct	catgaacctg	660
cacaacaacg	aggccggccg	caggacggtg	tacaacctgg	ctgatgtggc	ctgcaagtgc	720
catggggtgt	ccggctcatg	tagcctgaag	acatgctggc	tgcagctggc	agacttccgc	780
aaggtgggtg	atgccctgaa	ggagaagtac	gacagcgcgg	cggccatgcg	gctcaacagc	840
cggggcaagt	tggtacaggt	caacagccgc	ttcaactcgc	ccaccacaca	agacctggtc	900
tacatcgacc	ccagccctga	ctactgcgtg	cgcaatgaga	gcaccggctc	gctgggcacg	960
cagggccgcc	tgtgcaacaa	gacgtcggag	ggcatggatg	gctgcgagct	catgtgctgc	1020
ggccgtggct	acgaccagtt	caagaccgtg	cagacggagc	gctgccactg	caagttccac	1080
tggtgctgct	acgtcaagtg	caagaagtgc	acggagatcg	tggaccagtt	tgtgtgcaag	1140
tag						1143

io <210> 8 <211> 1725 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 8 atgcgggacc ccggcgcggc cgctccgctt tcgtccctgg gcctctgtgc cctggtgctg 60 gcgctgctgg gcgcactgtc cgcgggcgcc ggggcgcagc cgtaccacgg agagaagggc 120 atctccgtgc cggaccacgg cttctgccag cccatctcca tcccgctgtg cacggacatc 180 gcctacaacc agaccatcct gcccaacctg ctgggccaca cgaaccaaga ggacgcgggc 240

-21 CZ 303555 B6

Sekvence_Bryj a.ST2 5

ctcgaggtgc	accagttcta	cccgctggtg	aaggtgcagt	gttctcccga	actccgcttt	300
ttcttatgct	ccatgtatgc	gcccgtgtgc	accgtgctcg	atcaggccat	cccgccgtgt	360
cgttctctgt	gcgagcgcgc	ccgccagggc	tgcgaggcgc	tcatgaacaa	gttcggcttc	420
cagtggcccg	agcggctgcg	ctgcgagaac	ttcccggtgc	acggtgcggg	cgagatctgc	480
gtgggccaga	acacgtcgga	cggctccggg	ggcccaggcg	gcggccccac	tgcctaccct	540
accgcgccct	acctgccgga	cctgcccttc	accgcgctgc	ccccgggggc	ctcagatggc	600
agggggcgtc	ccgccttccc	cttctcatgc	ccccgtcagc	tcaaggtgcc	cccgtacctg	660
ggctaccgct	tcctgggtga	gcgcgattgt	ggcgccccgt	gcgaaccggg	ccgtgccaac	720
ggcctgatgt	actttaagga	ggaggagagg	cgcttcgccc	gcctctgggt	gggcgtgtgg	780
tccgtgctgt	gctgcgcctc	gacgctcttt	accgttctca	cctacctggt	ggacatgcgg	840
cgcttcagct	acccagagcg	gcccatcatc	ttcctgtcgg	gctgctactt	catggtggcc	900
gtggcgcacg	tggccggctt	ccttctagag	gaccgcgccg	tgtgcgtgga	gcgcttctcg	960
gacgatggct	accgcacggt	ggcgcagggc	accaagaagg	agggctgcac	catcctcttc	1020
atggtgctct	acttcttcgg	catggccagc	tccatctggt	gggtcattct	gtctctcact	1080
tggttcctgg	cggccggcat	gaagtggggc	cacgaggcca	tcgaggccaa	ctcgcagtac	1140
ttccacctgg	ccgcgtgggc	cgtgcccgcc	gtcaagacca	tcactatcct	ggccatgggc	1200
caggtagacg	gggacctgct	gagcggggtg	tgctacgttg	gcctctccag	tgtggacgcg	1260
ctgcggggct	tcgtgctggc	gcctctgttc	gtctacctct	tcataggcac	gtccttcttg	1320
ctggccggct	tcgtgtccct	cttccgtatc	cgcaccatca	tgaaacacga	cggcaccaag	1380
accgagaagc	tggagaagct	catggtgcgc	atcggcgtct	tcagcgtgct	ctacacagtg	1440
cccgccacca	tcgtcctggc	ctgctacttc	tacgagcagg	ccttccgcga	gcactgggag	1500
cgcacctggc	tcctgcagac	gtgcaagagc	tatgccgtgc	cctgcccgcc	cggccacttc	1560
ccgcccatga	gccccgactt	caccgtcttc	atgatcaagt	acctgatgac	catgatcgtc	1620
ggcatcacca	ctggcttctg	gatctggtcg	ggcaagaccc	tgcagtcgtg	gcgccgcttc	1680
taccacagac	ttagccacag	cagcaagggg	gagactgcgg	tatga		1725

<210> 9 <211> 2496 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 9 atgcctttgg agatggagcc caagatgagc aaactggcct ttggctgtca gagaagttcc 60 acatcagatg atgactctgg ctgtgcattg gaggagtacg cctgggtccc cccgggcctg 120 agaccagagc agatccagct ctattttgct tgcttaccag aggaaaaagt tccttacgtt 180 aacagccccg gagagaagca tcggattaaa cagcttttgt accagttacc accacatgat 240 aatgaggtac ggtattgcca gtctttgagt gaagaggaga aaaaagagtt gcaggtgttc 300 agtgctcagc ggaagaaaga agcactggga agaggaacaa ttaagcttct gtccagagca 360

-22 CZ 303555 B6 sekvence_Bryja,ST2 5

gtcatgcatg	ctgtgtgtga	gcagtgtggt	ttgaagataa	atggaggtga	agttgcagtg	420
ttcgcctccc	gtgcgggccc	tggtgtgtgc	tggcacccat	cctgttttgt	ctgtttcacg	480
tgtaatgagc	tgctggtcga	cctcatctat	ttttatcagg	atggaaaaat	tcactgtggc	540
aggcaccatg	cagaactgct	caaaccacgg	tgctcagcat	gtgacgagat	aatttttgct	600
gatgagtgca	cagaagctga	gggtcgccat	tggcacatga	aacacttctg	ctgccttgag	660
tgtgaaacgg	tcctgggagg	acagaggtat	atcatgaagg	acggccgccc	cttctgctgt	720
ggctgttttg	agtctctcta	tgcggagtac	tgtgaaacct	gtggggaaca	tattggtgtg	780
gaccatgcac	agatgaccta	tgacgggcag	cactggcacg	ccacggaagc	ctgcttttct	840
tgtgcccagt	gtaaagcctc	tttgttggga	tgtcccttcc	ttcccaaaca	gggtcagatt	900
tactgctcaa	aaacgtgcag	tcttggtgaa	gacgtccatg	cctctgattc	ttccgactct	960
gcatttcagt	cagctcgatc	aagagactcc	cgaagaagtg	tccgaatggg	caagagcagc	1020
cggtcagcag	atcagtgtag	acagtctctc	ctcttatcgc	ctgctctgaa	ctacaagttt	1080
cctggcctct	caggcaatgc	tgatgacacc	ctttctcgaa	aattggatga	tctgagtctc	1140
tccagacaag	gaacaagttt	tgccagtgaa	gaattttgga	aaggcagagt	agagcaggaa	1200
actccagaag	accctgaaga	atgggctgat	catgaagatt	atatgacgca	gctcctcctc	1260
aagtttggtg	ataaaagcct	ctttcagcca	cagcccaatg	agatggatat	tcgagccagt	1320
gagcactgga	tatctgataa	catggttaaa	agtaagaccg	agttaaagca	aaataaccag	1380
agccttgcaa	gtaaaaaata	ccagtctgat	atgtactggg	cacagtcaca	agatggactg	1440
ggcgattctg	cttatggcag	ccacccaggc	cctgcaagca	gtagaaggct	tcaggaattg	1500
gaactggacc	atggggcttc	agggtataat	catgatgaaa	cacagtggta	tgaagattcc	1560
ctggagtgtc	tgtcagacct	gaaaccagag	caaagtgttc	gggattcgat	ggattctttg	1620
gcattgtcca	atatcacagg	ggcttcggtg	gatggagaaa	acaagccaag	gccatcattg	1680
tattctctgc	aaaattttga	ggagatggaa	acagaagatt	gtgagaagat	gagcaatatg	1740
ggaactttga	actcttccat	gctgcacagg	agtgcagagt	ccttaaagag	tctaagttca	1800
gagttgtgtc	cagagaaaat	cctgcctgaa	gagaagccag	tacatctgcc	agtgctcaga	1860
aggtccaagt	ctcaatccag	accccagcag	gtcaagtttt	ctgatgatgt	cattgacaat	1920
gggaactatg	acattgaaat	ccggcagcct	ccgatgagtg	aaaggactcg	gagacgcgtc	1980
tacaattttg	aagagagggg	atccaggtct	catcaccacc	gccgccggag	aagtagaaag	2040
tcccgctccg	acaatgccct	gaatcttgtt	acagaaagaa	aatactctcc	caaggacaga	2100
ctgcggctgt	acacccccga	taactatgag	aaatttatac	agaataaaag	tgcccgggag	2160
atccaagcat	acatccagaa	tgctgatctc	tacggacagt	acgcccatgc	cacttccgat	2220
tatggcctgc	agaacccagg	aatgaatcgg	tttctgggac	tctacggcga	ggatgátgat	2280
tcctggtgtt	cttcctcctc	ctcctcttcc	gactcggaag	aagaaggata	ttttcttgga	2340
caaccaatcc	ctcaaccccg	gccacagaga	tttgcctact	atacagatga	cctttctagt	2400
ccaccatctg	cacttcccac	ccctcagttt	ggtcagagga	caacaaaatc	caagaagaaa	2460
aagggacaca	agggcaaaaa	ttgtattatt	tcttaa			2496

-23 CZ 303555 B6 <210> 10 <211> 1566 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 10

atggacaccg	agtcccagta	ctcgggctat	tcctacaagt	cgggccactc	ccgcagctcc	60
cgcaagcaca	gggaccgccg	ggaccgacac	cgctctaaga	gtcgagatgg	gggccgaggg	120
gacaagtcgg	tgacaatcca	ggctcccggg	gagcccctgc	tggacaatga	gtccacacga	180
ggggatgagc	gggatgacaa	ctggggggaa	acgacgacag	tagtaacggg	cacctcagag	240
cacagcatct	cccatgatga	cctcacacgc	atcgccaagg	acatggagga	cagtgtccct	300
ctggactgct	cccgtcacct	gggtgtggca	gcgggggcca	ccctggcact	gctgtctttc	360
ctcacgcctc	tggccttcct	gctgctgccc	ccactgctgt	ggcgggagga	gctggagcct	420
tgcgggacgg	cctgcgaggg	cctcttcatc	tctgtcgcct	tcaagctgct	catcctgcta	480
ctgggcagct	gggctctgtt	cttccgccgg	cccaaggcct	cgctgccccg	cgtctttgtg	540
ctgcgtgccc	tgcttatggt	gctggttttc	ctgctcgtgg	tctcctactg	gctcttctat	600
ggtgtgcgca	tcctggatgc	tcgggagcgc	agctaccagg	gcgtggtgca	gttcgccgtg	660
tcgctggtgg	acgcccttct	tttcgtgcac	tacctggccg	tggtcctgct	ggagctgcgc	720
cagctccagc	ctcagttcac	gctcaaggtc	gtgcgctcca	ccgacggcgc	cagccgcttc	780
tacaacgttg	gccatctcag	catccagcgc	gtggcagtgt	ggatcctgga	gaagtattac	840
catgacttcc	ctgtctacaa	ccctgccctc	ctcaacctgc	ccaagtccgt	cctggccaag	900
aaagtgtctg	gcttcaaggt	gtattccctc	ggagaggaaa	acagcaccaa	caactccact	960
ggccagtctc	gggctgtgat	tgcagcggca	gctcggaggc	gggacaacag	tcacaatgag	1020
tactactatg	aggaggctga	gcatgagcga	agggtgcgca	agaggagggc	caggcttgta	1080
gtggcggtgg	aggagscctt	cactcacatt	aagcggctgc	aggaagagga	gcagaaaaac	1140
cccagggagg	tgatggaccc	ccgggaggca	gcccaagcca	tctttgcatc	catggcccgt	1200
gccatgcaga	agtaccttcg	gaccaccaag	cagcagccct	accacaccat	ggagagcatc	1260
ctgcagcacc	ttgaattctg	catcacgcat	gacatgacgc	ccaaggcctt	cttggagcga	1320
tacttggcgg	ctggacctac	catccagtac	cacaaggaac	gctggctggc	caaacagtgg	1380
acattggtga	gcgaggagcc	ggtgaccaac	ggcctcaagg	atggcatcgt	tttcctctta	1440
aaacgccagg	acttcagcct	ggtggtcagc	accaagaagg	tcccattctt	caaactctcc	1500
gaggaatttg	tggatcccaa	gtcacacaag	tttgtcatga	ggctgcagtc	tgagacctca	1560
gtgtga						1566

io <210> 11 <211> 9045 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 11

- 24CZ 303555 B6 atggcgccgc cgccgccgcc cgtgctgccc gtgctgctgc tcctggccgc cgccgccgcc 60 ctgccggcga tggggctgcg agcggccgcc tgggagccgc gcgtacccgg cgggacccgc 120 gccttcgccc tccggcccgg ctgtacctac gcggtgggcg ccgcttgcac gccccgggcg 180 ccgcgggagc tgctggacgt gggccgcgat gggcggctgg caggacgtcg gcgcgtctcg 240 ggcgcggggc gcccgctgcc gctgcaagtc cgcttggtgg cccgcagtgc cccgacggcg 300 ctgagccgcc gcctgcgggc gcgcacgcac cttcccggct gcggagcccg tgcccggctc 360 tgcggaaccg gtgcccggct ctgcggggcg ctctgcttcc ccgtccccgg cggctgcgcg 420 gccgcgcagc attcggcgct cgcagctccg accaccttac ccgcctgccg ctgcccgccg 480 cgccccaggc cccgctgtcc cggccgtccc atctgcctgc cgccgggcgg ctcggtccgc 540 ctgcgtctgc tgtgcgccct gcggcgcgcg gctggcgccg tccgggtggg actggcgctg 600 gaggccgcca ccgcggggac gccctccgcg tcgccatccc catcgccgcc cctgccgccg 660 aacttgcccg aagcccgggc ggggccggcg cgacgggccc ggcggggcac gagcggcaga 720 gggagcctga agtttccgat gcccaactac caggtggcgt tgtttgagaa cgaaccggcg 780 ggcaccctca tcctccagct gcacgcgcac tacaccatcg agggcgagga ggagcgcgtg 840 agetattaca tggaggggct gtttgacgag cgctcccggg gctacttccg aatcgactct 900 gccacgggcg ccgtgagcac ggacagcgta ctggaccgcg agaccaagga gacgcacgtc 960 ctcagggtga aagccgtgga ctacagtacg ccgccgcgct cggccaccac ctacatcact 1020 gtcttggtca aagacaccaa cgaccacagc ccggtcttcg agcagtcgga gtaccgcgag 1080 cgcgtgcggg agaacctgga ggtgggctac gaggtgctga ccatccgcgc cagcgaccgc 1140 gactcgccca tcaacgccaa cttgcgttac cgcgtgttgg ggggcgcgtg ggacgtcttc 1200 cagctcaacg agagctctgg cgtggtgagc acacgggcgg tgctggaccg ggaggaggcg 1260 gccgagtacc agctcctggt ggaggccaac gaccaggggc gcaatccggg cccgctcagt 1320 gccacggcca ccgtgtacat cgaggtggag gacgagaacg acaactaccc ccagttcagc 1380 gagcagaact acgtggtcca ggtgcccgag gacgtggggc tcaacacggc tgtgctgcga 1440 gtgcaggcca cggaccggga ccagggccag aacgcggcca ttcactacag catcctcagc 1500 gggaacgtgg ccggccagtt ctacctgcac tcgctgagcg ggatcctgga tgtgatcaac 1560 cccttggatt tcgaggatgt ccagaaatac tcgctgagca ttaaggccca ggatgggggc 1620 cggcccccgc tcatcaattc ttcaggggtg gtgtctgtgc aggtgctgga tgtcaacgac 1680 aacgagccta tctttgtgag cagccccttc caggccacgg tgctggagaa tgtgcccctg 1740 ggctaccccg tggtgcacat tcaggcggtg gacgcggact ctggagagaa cgcccggctg 1800 cactatcgcc tggtggacac ggcctccacc tttctggggg gcggcagcgc tgggcctaag 1860 aatcctgccc ccacccctga cttccccttc cagatccaca acagctccgg ttggatcaca 1920

-25CZ 303555 B6 sekvence_Bryja.ST25

gtgtgtgccg	agctggaccg	cgaggaggtg	gagcactaca	gcttcggggt	ggaggcggtg	1980
gaccacggct	cgccccccat	gagctcctcc	accagcgtgt	ccatcacggt	gctggacgtg	2040
aatgacaacg	acccggtgtt	cacgcagccc	acctacgagc	ttcgtctgaa	tgaggatgcg	2100
gccgtgggga	gcagcgtgct	gaccctgcag	gcccgcgacc	gtgacgccaa	cagtgtgatt	2160
acctaccagc	tcacaggcgg	caacacccgg	aaccgctttg	cactcagcag	ccagagaggg	2220
ggcggcctca	tcaccctggc	gctacctctg	gactacaagc	aggagcagca	gtacgtgctg	2280
gcggtgacag	catccgacgg	cacacggtcg	cacactgcgc	atgtcctaat	caacgtcact	2340
gatgccaaca	cccacaggcc	tgtctttcag	agctcccatt	acacagtgag	tgtcagtgag	2400
gacaggcctg	tgggcacctc	cattgctacc	ctcagtgcca	acgatgagga	cacaggagag	2460
aatgcccgca	tcacctacgt	gattcaggac	cccgtgccgc	agttccgcat	tgaccccgac	2520
agtggcacca	tgtacaccat	gatggagctg	gactatgaga	accaggtcgc	ctacacgctg	2580
accatcatgg	cccaggacaa	cggcatcccg	cagaaatcag	acaccaccac	cctagagatc	2640
ctcatcctcg	atgccaatga	caatgcaccc	cagttcctgt	gggatttcta	ccagggttcc	2700
atctttgagg	atgctccacc	ctcgaccagc	atcctccagg	tctctgccac	ggaccgggac	2760
tcaggtccca	atgggcgtct	gctgtacacc	ttccagggtg	gggacgacgg	cgatggggac	2820
ttctacatcg	agcccacgtc	cggtgtgatt	cgcacccagc	gccggctgga	ccgggagaat	2880
gtggccgtgt	acaacctttg	ggctctggct	gtggatcggg	gcagtcccac	tccccttagc	2940
gcctcggtag	aaatccaggt	gaccatcttg	gacattaatg	acaatgcccc	catgtttgag	3000
aaggacgaac	tggagctgtt	tgttgaggag	aacaacccag	tggggtcggt	ggtggcaaag	3060
attcgtgcta	acgaccctga	tgaaggccct	aatgcccaga	tcatgtatca	gattgtggaa	3120
ggggacatgc	ggcatttctt	ccagctggac	ctgctcaacg	gggacctgcg	tgccatggtg	3180
gagctggact	ttgaggtccg	gcgggagtat	gtgctggtgg	tgcaggccac	gtcggctccg	3240
ctggtgagcc	gagccacggt	gcacatcctt	ctcgtggacc	agaatgacaa	cccgcctgtg	3300
ctgcccgact	tccagatcct	cttcaacaac	tatgtcacca	acaagtccaa	cagtttcccc	3360
accggcgtga	tcggctgcat	cccggcccat	gaccccgacg	tgtcagacag	cctcaactac	3420
accttcgtgc	agggcaacga	gctgcgcctg	ttgctgctgg	accccgccac	gggcgaactg	3480
cagctcagcc	gcgacctgga	caacaaccgg	ccgctggagg	cgctcatgga	ggtgtctgtg	3540
tctgatggca	tccacagcgt	cacggccttc	tgcaccctgc	gtgtcaccat	catcacggac	3600
gacatgctga	ccaacagcat	cactgtccgc	ctggagaaca	tgtcccagga	gaagttcctg	3660
tccccgctgc	tggccctctt	cgtggagggg	gtggccgccg	tgctgtccac	caccaaggac	3720
gacgtcttcg	tcttcaacgt	ccagaacgac	accgacgtca	gctccaacat	cctgaacgtg	3780
accttctcgg	cgctgctgcc	tggcggcgtc	cgcggccagt	tcttcccgtc	ggaggacctg	3840
caggagcaga	tctacctgaa	tcggacgctg	ctgaccacca	tctccacgca	gcgcgtgctg	3900
cccttcgacg	acaacatctg	cctgcgcgag	ccctgcgaga	actacatgaa	gtgcgtgtcc	3960

-26CZ 303555 B6

Sekvence_Bryja.ST25

gttctgcgat	tcgacagctc	cgcgcccttc	ctcagctcca	ccaccgtgct	cttccggccc	4020
atccacccca	tcaacggcct	gcgctgccgc	tgcccgcccg	gcttcaccgg	cgactactgc	4080
gagacggaga	tcgacctctg	ctactccgac	ccgtgcggcg	ccaacggccg	ctgccgcagc	4140
cgcgagggcg	gctacacctg	cgagtgcttc	gaggacttca	ctggagagca	ctgtgaggtg	4200
gatgcccgct	caggccgctg	tgccaacggg	gtgtgcaaga	acgggggcac	ctgcgtgaac	4260
ctgctcatcg	gcggcttcca	ctgcgtgtgt	cctcctggcg	agtatgagag	gccctactgt	4320
gaggtgacca	ccaggagctt	cccgccccag	tccttcgtca	ccttccgggg	cctgagacag	4380
cgcttccact	tcaccatctc	cctcacgttt	gccactcagg	aaaggaacgg	cttgcttctc	4440
tacaacggcc	gcttcaatga	gaagcacgac	ttcatcgccc	tggagatcgt	ggacgagcag	4500
gtgcagctca	ccttctctgc	aggcgagaca	acaacgaccg	tggcaccgaa	ggttcccagt	4560
ggtgtgagtg	acgggcggtg	gcactctgtg	caggtgcagt	actacaacaa	gcccaatatt	4620
ggccacctgg	gcctgcccca	tgggccgtcc	ggggaaaaga	tggccgtggt	gacagtggat	4680
gattgtgaca	caaccatggc	tgtgcgcttt	ggaaaggaca	tcgggaacta	cagctgcgct	4740
gcccagggca	ctcagaccgg	ctccaagaag	tccctggatc	tgaccggccc	tctactcctg	4800
gggggtgtcc	ccaacctgcc	agaagacttc	ccagtgcaca	accggcagtt	cgtgggctgc	4860
atgcggaacc	tgtcagtcga	cggcaaaaat	gtggacatgg	ccggattcat	cgccaacaat	4920
ggcacccggg	aaggctgcgc	tgctcggagg	aacttctgcg	atgggaggcg	gtgtcagaat	4980
ggaggcacct	gtgtcaacag	gtggaatatg	tatctgtgtg	agtgtccact	ccgattcggc	5040
gggaagaact	gtgagcaagc	catgcctcac	ccccagctct	tcagcggtga	gagcgtcgtg	5100
tcctggagtg	acctgaacat	catcatctct	gtgccctggt	acctggggct	catgttccgg	5160
acccggaagg	aggacagcgt	tctgatggag	gccaccagtg	gtgggcccac	cagctttcgc	5220
ctccagatcc	tgaacaacta	cctccagttt	gaggtgtccc	acggcccctc	cgatgtggag	5280
tccgtgatgc	tgtccgggtt	gcgggtgacc	gacggggagt	ggcaccacct	gctgatcgag	5340
ctgaagaatg	ttaaggagga	cagtgagatg	aagcacctgg	tcaccatgac	cttggactat	5400
gggatggacc	agaacaaggc	agatatcggg	ggcatgcttc	ccgggctgac	ggtaaggagc	5460
gtggtggtcg	gaggcgcctc	tgaagacaag	gtctccgtgc	gccgtggatt	ccgaggctgc	5520
atgcagggag	tgaggatggg	ggggacgccc	accaacgtcg	ccaccctgaa	catgaacaac	5580
gcactcaagg	tcagggtgaa	ggacggctgt	gatgtggacg	acccctgtac	ctcgagcccc	5640
tgtcccccca	atagccgctg	ccacgacgcc	tgggaggact	acagctgcgt	ctgtgacaaa	5700
gggtaccttg	gaataaactg	tgtggatgcc	tgtcacctga	acccctgcga	gaacatgggg	5760
gcctgcgtgc	gctcccccgg	ctccccgcag	ggctacgtgt	gcgagtgtgg	gcccagtcac	5820
tacgggccgt	actgtgagaa	caaactcgac	cttccgtgcc	ccagaggctg	gtgggggaac	5880
cccgtctgtg	gaccctgcca	ctgtgccgtc	agcaaaggct	ttgatcccga	ctgtaataag	5940
accaacggcc	agtgccaatg	caaggagaat	tactacaagc	tcctagccca	ggacacctgt	6000

-27 CZ 303555 B6

Sekvence_Bryja.ST2 5

ctgccctgcg	actgcttccc	ccatggctcc	cacagccgca	cttgcgacat	ggccaccggg	6060
cagtgtgcct	gcaagcccgg	cgtcatcggc	cgccagtgca	accgctgcga	caacccgttt	6120
gccgaggtca	ccacgctcgg	ctgtgaagtg	atctacaatg	gctgtcccaa	agcatttgag	6180
gccggcatct	ggtggccaca	gaccaagttc	gggcagccgg	ctgcggtgcc	atgccctaag	6240
ggatccgttg	gaaatgcggt	ccgacactgc	agcggggaga	agggctggct	gcccccagag	6300
ctctttaact	gtaccaccat	ctccttcgtg	gacctcaggg	ccatgaatga	gaagctgagc	6360
cgcaatgaga	cgcaggtgga	cggcgccagg	gccctgcagc	tggtgagggc	gctgcgcagt	6420
gctacacagc	acacgggcac	gctctttggc	aatgacgtgc	gcacggccta	ccagctgctg	6480
ggccacgtcc	ttcagcacga	gagctggcag	cagggcttcg	acctggcagc	cacgcaggac	6540
gccgactttc	acgaggacgt	catccactcg	ggcagcgccc	tcctggcccc	agccaccagg	6600
gcggcgtggg	agcagatcca	gcggagcgag	ggcggcacgg	cacagctgct	ccggcgcctc	6660
gagggctact	tcagcaacgt	ggcacgcaac	gtgcggcgga	cgtacctgcg	gcccttcgtc	6720
atcgtcaccg	ccaacatgat	tcttgctgtc	gacatctttg	acaagttcaa	ctttacggga	6780
gccagggtcc	cgcgattcga	caccatccat	gaagagttcc	ccagggagct	ggagtcctcc	6840
gtctccttcc	cagccgactt	cttcagacca	cctgaagaaa	aagaaggccc	cctgctgagg	6900
ccggctggcc	ggaggaccac	cccgcagacc	acgcgcccgg	ggcctggcac	cgagagggag	6960
gccccgatca	gcaggcggag	gcgacaccct	gatgacgctg	gccagttcgc	cgtcgctctg	7020
gtcatcattt	accgcaccct	ggggcagctc	ctgcccgagc	gctacgaccc	cgaccgtcgc	7080
agcctccggt	tgcctcaccg	gcccatcatt	aataccccga	tggtgagcac	gctggtgtac	7140
agcgaggggg	ctccgctccc	gagacccctg	gagaggcccg	tcctggtgga	gttcgccctg	7200
ctggaggtgg	aggagcgaac	caagcctgtc	tgcgtgttct	ggaaccactc	cctggccgtt	7260
ggtgggacgg	gagggtggtc	tgcccggggc	tgcgagctcc	tgtccaggaa	ccggacacat	7320
gtcgcctgcc	agtgcagcca	cacagccagc	tttgcggtgc	tcatggatat	ctccaggcgt	7380
gagaacgggg	aggtcctgcc	tctgaagatt	gtcacctatg	ccgctgtgtc	cttgtcactg	7440
gcagccctgc	tggtggcctt	cgtcctcctg	agcctggtcc	gcatgctgcg	ctccaacctg	7500
cacagcattc	acaagcacct	cgccgtggcg	ctcttcctct	ctcagctggt	gttcgtgatt	7560
gggatcaacc	agacggaaaa	cccgtttctg	tgcacagtgg	ttgccatcct	cctccactac	7620
atctacatga	gcacctttgc	ctggaccctc	gtggagagcc	tgcatgtcta	ccgcatgctg	7680
accgaggtgc	gcaacatcga	cacggggccc	atgcggttct	actacgtcgt	gggctggggc	7740
atcccggcca	ttgtcacagg	actggcggtc	ggcctggacc	cccagggcta	cgggaacccc	7800
gacttctgct	ggctgtcgct	tcaagacacc	ctgatttgga	gctttgcggg	gcccatcgga	7860
gctgttataa	tcatcaacac	agtcacttct	gtcctatctg	caaaggtttc	ctgccaaaga	7920
aagcaccatt	attatgggaa	aaaagggatc	gtctccctgc	tgaggaccgc	attcctcctg	7980
ctgctgctca	tcagcgccac	ctggctgctg	gggctgctgg	ctgtgaaccg	cgatgcactg	8040

-28CZ 303555 B6

Sekvence_Bryja.ST25

agctttcact	acctcttcgc	catcttcagc	ggcttacagg	gccccttcgt	cctccttttc	8100
cactgcgtgc	tcaaccagga	ggtccggaag	cacctgaagg	gcgtgctcgg	cgggaggaag	8160
ctgcacctgg	aggactccgc	caccaccagg	gccaccctgc	tgacgcgctc	cctcaactgc	8220
aacaccacct	tcggtgacgg	gcctgacatg	ctgcgcacag	acttgggcga	gtccaccgcc	8280
tcgctggaca	gcatcgtcag	ggatgaaggg	atccagaagc	tcggcgtgtc	ctctgggctg	8340
gtgaggggca	gccacggaga	gccagacgcg	tccctcatgc	ccaggagctg	caaggatccc	8400
cctggccacg	attccgactc	agatagcgag	ctgtccctgg	atgagcagag	cagctcttac	8460
gcctcctcac	actcgtcaga	cagcgaggac	gatggggtgg	gagctgagga	aaaatgggac	8520
ccggccaggg	gcgccgtcca	cagcaccccc	aaaggggacg	ctgtggccaa	ccacgttccg	8580
gccggctggc	ccgaccagag	cctggctgag	agtgacagtg	aggaccccag	cggcaagccc	8640
cgcctgaagg	tggagaccaa	ggtcagcgtg	gagctgcacc	gcgaggagca	gggcagtcac	8700
cgtggagagt	accccccgga	ccaggagagc	gggggcgcag	ccaggcttgc	tagcagccag	8760
cccccagagc	agaggaaagg	catcttgaaa	aataaagtca	cctacccgcc	gccgctgacg	8820
ctgacggagc	agacgctgaa	gggccggctc	cgggagaagc	tggccgactg	tgagcagagc	8880
cccacatcct	cgcgcacgtc	ttccctgggc	tctggcggcc	ccgactgcgc	catcacagtc	8940
aagagccctg	ggagggagcc	ggggcgtgac	cacctcaacg	gggtggccat	gaatgtgcgc	9000
actgggagcg	cccaggccga	tggctccgac	tctgagaaac	cgtga		9045

Claims (6)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob stanovení závažnosti a prognózy B-buněčné chronické lymfocytámí leukémie ío z biologického vzorku odebraného z těla pacienta, vyznačený tím, že se stanoví exprese alespoň jednoho proteinu vybraného ze skupiny zahrnující membránové receptory Vangl2, Celsrl, a Frizzled 7, cytoplazmatické proteiny Dvl 2, Dvl 3 a Pricklel, kinázy kasein kináza 1 epsilon a kasein kináza 2 alfa a sekretovaný ligand Wnt5a a/nebo alespoň jednoho genu kódujícího protein vybraný ze skupiny zahrnující membránové receptory Vangl2, Celsrl, a Frizzled 7,

   15 cytoplazmatické proteiny Dvl 2, Dvl 3 a Pricklel, kinázy kasein kináza 1 epsilon a kasein kináza 2 alfa a sekretovaný ligand Wnt5a, přičemž míra upregulace těchto proteinů či genů v B-lymfocytech pacienta oproti kontrole koreluje se závažností a prognózou onemocnění B-CLL tak, že vyšší míra upregulace proteinů či genů znamená vyšší závažnost a horší prognózu.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že biologickým vzorkem odebraným z těla pacienta je vzorek periferní krve.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že exprese proteinu se stanoví metodou 25 vybranou ze skupiny zahrnující Western blotting a ELISA.
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že protein je vybraný ze skupiny zahrnující Vangl2, Celsrl a Frizzled 7, že exprese proteinu se stanoví průtokovou cytometrií.

   -29CZ 303555 B6
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že gen kódující protein je vybrán ze skupiny zahrnující wnt5a, frizzled 7, vangl2, prickle 1 a celsrl, a tím, že exprese genu kódujícího protein se stanoví metodou kvantitativní PCR.
6. 6. Způsob podle nároku 5, vyznačený tím, že se jako primery pro kvantitativní PCR použijí oligonukleotidy mající alespoň 75%, s výhodou alespoň 85%, homologii nukleotidové sekvence se sekvencí vybranou ze skupiny zahrnující:

   Forward primer (5’ to 3’) Reverse primer (5’ to 3’) TACAACCTTTGGGCTCTGGCTG CCTTCATCAGGGTCGTTAGCAC TACCACGGAGAGAAGGGCATC GCATAAGAAAAAGCGGAGTTCGG TTCAGTGCTCAGCGGAAGAAAG AGACAAAACAGGATGGGTGCC ACAGTAGTAACGGGCACCTCAGAGC TTGAAGGCGACAGAGATGAAGAG AACAGCCGCTTCAACTCGC CGTAGCAGCACCAGTGGAACTTG