CZ303403B6 - Použití acetyl-L-karnitinu k príprave léciva pro zvýšení exprese transfektovaných genu - Google Patents
Použití acetyl-L-karnitinu k príprave léciva pro zvýšení exprese transfektovaných genu Download PDFInfo
- Publication number
- CZ303403B6 CZ303403B6 CZ20022757A CZ20022757A CZ303403B6 CZ 303403 B6 CZ303403 B6 CZ 303403B6 CZ 20022757 A CZ20022757 A CZ 20022757A CZ 20022757 A CZ20022757 A CZ 20022757A CZ 303403 B6 CZ303403 B6 CZ 303403B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- alc
- carnitine
- acetyl
- cells
- transfected
- Prior art date
Links
- RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N O-acetyl-L-carnitine Chemical compound CC(=O)O[C@H](CC([O-])=O)C[N+](C)(C)C RDHQFKQIGNGIED-MRVPVSSYSA-N 0.000 title claims abstract description 52
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 22
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 title claims abstract description 18
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims abstract description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 4
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 108060001084 Luciferase Proteins 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 15
- 239000005089 Luciferase Substances 0.000 description 12
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 10
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 10
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 description 7
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000003670 luciferase enzyme activity assay Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N (R)-carnitine Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC([O-])=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-N 0.000 description 2
- KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 2,3-bis[[(z)-octadec-9-enoyl]oxy]propyl-trimethylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC(C[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC KSXTUUUQYQYKCR-LQDDAWAPSA-M 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 2
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 2
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000004700 cellular uptake Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- 230000002354 daily effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000010217 densitometric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N europium atom Chemical compound [Eu] OGPBJKLSAFTDLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003203 everyday effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K48/00—Medicinal preparations containing genetic material which is inserted into cells of the living body to treat genetic diseases; Gene therapy
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Medicinal Preparation (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Použití acetyl-L-karnitinu (ALC) k príprave léciva urceného pro použití v kombinaci s genovou terapií. Soucasné podávání acetyl-L-karnitinu vede ke zvýšení exprese transfektovaných genu.
Description
Použití acetyl-L-karnitími k přípravě léčiva pro zvýšení exprese transfektovaných genů
Oblast techniky
Zde popisovaný vynález se týká použití C| - C6 alkanoyl-L-kamitinů, zvláště acetyl-L-kamitinu k přípravě rekombinantních proteinů.
Dosavadní stav techniky
Výroba proteinů technologií genetického inženýrství, tj. využíváním buněčných klonů, ve kterých jsou vloženy geny transfekci, je známa. Jeden z problémů, se kterým je nutno počítat pri použití transfektovaných klonů tkví v tom, že po určité době se geny uměle do buněk vkládané za účelem tvorby požadovaného proteinu utlumí. Problém útlumu genů si uvědomujeme mnohem pronikavěji v genové terapii. V tomto případě geny, které byly pacientovi vloženy přestávají vytvářet terapeuticky nezbytný protein.
Podstata vynálezu
Nyní bylo zjištěno, že Cj-Có alkanoyl-L-kamitiny a zvláště acetyl-L-kamitin nebo L-kamitin zvyšuje genovou expresi transfektovaných genů,
Kamitinenť' je pro účel tohoto vynálezu míněn Cj-C6 alkanoyl-L-kamitin nebo L-kamitin.
V následujícím popisu, čistě jako příklad, se bude odkazovat na upřednostňované řešení s acetylL-kamitinem.
Působení acetyl-L-kamitínu v buněčných klonech transfektovaných známými technikami, např. liposomy, značně zvyšuje expresi proteinů, kódovaných transfektovanými geny.
Předmětem předloženého vynálezu je způsob zvýšení genové exprese transfektovaných genů spočívající v podávání acetyl-L-kamitinu,
Z hlediska průmyslové využitelnosti při použití acetyl-L-kamitinu odkazuje zde popisovaný vynález na zvýšení exprese rekombinantních proteinů současně se způsobem výroby těchto rekombinantních proteinů spočívající v použití acetyl-L-kamitinuje zvýšení exprese jmenovaných proteinů.
V terapeutické oblasti a v oblasti genetického inženýrství obecně, je předmětem zda popisovaného vynálezu použití acetyl-L-kamitinu k přípravě produktu vhodného ke genové terapii pro zlepšení exprese proteinů, rovněž tak jako jeho použití (acetyl-L-kamitinu) k přípravě produktu vhodného k udržení transfektovaných genů v klonech.
Zde popisovaný vynález je dále ilustrován dále uváděnou pokusnou částí.
Materiály a metody
Pokusy in vitro
Buněčné kultury.
Byly použity buněčné linie HeLa ATCC rakoviny děložního hrdla. Buňky byly kultivovány v mediu RPMI 1640 (eurobio) obsahujícím antibiotika a 10% fetální telecí sérum.
- 1 CZ 303403 B6
Pokusy s acetyl-L-kamitinem (ALC)
4.106 a 5.106 buněk kultivovaných v mediu obsahujícím ALC o výsledné koncentraci 5mM a lOmM bylo naočkováno po dvou 125ml lahví, přičemž 2.106 buněk, na které se nepůsobilo ALC bylo naočkováno do 75ml lahve. Pokus byl opakován po 48 hodinách (shodující se s naočkováním buněk pro transfekci) a po 72 hodinách (na konci transfekce) a opakoval se také po 120 hodinách, a to pouze u vzorků transfektovaných na lysi ve 72 hodině.
Přechodná transfekce plasmidu pRL-CMV
Buňky pro transfekci byly naočkovány 24 hodin předem na 12 jamkové plotny (Corning) v počtu odpovídajícím 105 buněk na jamku. Transfekce byla provedena trojnásobně pro každý vzorek s použitím liposomu DOTAP (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) a plasmidu pRL-CMV (Promega, č. kat. E2261). Stručně: na každý vzorek bylo použito 1,5 pg DNK na jednu jamku a 9,2 μΜ liposomu na jednu jamku stím, že konečný objem byl 1050 μΐ na jeden vzorek; transfekční směs (25 μΙ na vzorek) byla ponechána pri teplotě okolí po dobu 30 minut a potom přidán HBS2x (20mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,4) v množství 25 μΐ roztoku najeden vzorek a 50 μΐ takto získaného roztoku z jednoho vzorku bylo přidáno k buňkám na dobu 5 hodin. Po provedení tří promytí PBS (fosforečnanový ústojný roztok o pH 7,4) bez vápníku a hořčíku se ponechaly buňky kultivovat v růstovém mediu obsahujícím ALC v koncentracích vyznačených u pokusů až do doby kyze buněk na luciferázovou zkoušku. Jako kontrolní byla přidána čistá DNK v roztoku lx HBS.
Lucíferázová zkouška v transfektovaných vzorcích in vitro
Buňky byly promyty PBS (fosforečnanový ústojný roztok o pH 7,4) bez vápníku a hořčíku a podrobeny lyži přídavkem 200 μΙ lyzačního ústojného roztoku obsaženého v soupravě GeneLux L002-100 (Wallac) používané pro luciferázovou zkoušku. Po 20 minutách byly odebrány celkové proteiny a 10 μΐ z každého vzorku analyzováno na luciferázu postupem vedeným v soupravě; zkouška byla provedena na 96 jamkových plotnách za použití luminotnetru Victor2 (Wallec). Získané hodnoty luminiscence vyjádřené v relativních světelných jednotkách (RLU) byly přepočteny na mg celkových proteinů s použitím výpočtu Bransfordovy metody.
Pokusy in vivo
Působení acetyl-L-kamitinem (ALC)
Použitými zvířaty pro pokusy in vivo byly myši Balb/c (Harlan), a to v každé skupině 5 zvířat. Skupiny byly rozděleny na kontrolní zvířata (3 skupiny) a na zvířata (6 skupin), která dostávala orálně ALC v dávce lOOmg.kg'1, Pokus začal čtyři dny před transfekci při denním podávání a byl opakován každý den až do utracení.
Utracení zvířat
Zvířata byla utracena 24, 48 a 72 hodin po transfekci.
Z každého zvířete byly odebrány plíce, promyty fyziologickým roztokem, zváženy, zmraženy kapalným dusíkem a skladovány při -80 °C až do doby extrakce proteinu.
Transfekce plasmidu pRL-CMV
Zvířata tvořící kontrolní skupiny a tři skupiny zvířat zkoušených ALC obdržely intravenózní injekce 25 pg pRL-CMV plasmidu na jednu myš použitím liposomu o koncentraci 12 pm.pg'1 injikované DNK. Liposomy a DNK byly smíseny v roztoku PBS a uchovávány na ledu po dobu 1 hodiny před injikováním. Další tři skupiny zkoumaných zvířat obdržely injekce 25 pg pRL-CMV
-2CZ 303403 B6 plasmidu na jednu myš v roztoku samotného PBS. Výsledný objem injikovaného roztoku každému zvířeti byl 208 μΙ.
Extrakce proteinů z plic a luciferázová zkouška
Výsledky
Exprese luciferázy při transfekci in vitro io Lyzáty ve 24 hodině. Exprese luciferázy získaná ze vzorků zkoušených s ALC byla vyšší než u vzorků kontrolních buněk. Střední hodnota RLU na mg celkových proteinů počítaná na základě trojnásobně provedených vzorků vykazovala v porovnání s kontrolními vzorky přibližně 1,6 násobné zvýšení u vzorků na které se působilo 5mM ALC. Navíc bylo pozorováno, že ve vzorcích zkoušených s lOmM ALC nebylo žádné další zvýšení. Získané výsledky ukazují, že neexis15 tuje vztah dálkové závislostí mezi ALC a expresí luciferázy, a to alespoň u koncentrací použitých v našich pokusech, zatímco na expresi transfektované luciferázy kladný účinek vykazují. U vzorků transfektovaných samotnou DNK, která tvoří naši kontrolní skupinu, nebyla pozorována žádná aktivita luciferázy.
Lyzáty ve 48. hodině. Pozorovaný účinek na vzorcích vystavených lyži ve 24. hodině se neudržel 48 hodin po transfekci, kde se exprese luciferázy v absolutních hodnotách snižovala u všech transfektovaných vzorků. Získané hodnoty RLU na mg proteinu nevykazují žádné významné rozdíly mezi pokusnými a kontrolními vzorky.
Lyzáty ve 72. hodině. Vzorky nevykazovaly žádnou expresi luciferázy, takže hodnoty RLU.mg 1 nemohly být stanoveny.
Exprese luciferázy in vitro
Pokus 1. HeLa 100 000/12 jamkové plotny 1,5 pg na jamku
| RLU.mg střední hodnota a std. odch. | |
| Dotap. + LUC | 491,090 |
| 142,451 | |
| Dotap + ETC | 20,802 |
| 2,283 | |
| 5mM ALC + LUC | 18,060 |
| 3,241 | |
| 5mM ALC + ETS | 17,025 |
| 3,481 | |
| 5mM ALC + dotap + LUC Ί | 779,340 |
| 159,453 | |
| 5mM ALC + dotap + ETS | 22,411 |
| 2,447 | |
| lOmM ALC + LUČ | 20,481 |
| 7,044 | |
| lOmM ALC + ETS | 17,724 |
| 1,020 | |
| 1 OmM ALC + dotap + LUC | 750,034 |
| 94,431 | |
| lOmM ALC + dotap + ETS | 20,520 |
| 2,180 |
-3CZ 303403 B6
Usoudili jsme, že k ověření, zda kladný účinek ALC na aktivitu luciferázy má vztah k aktivaci transkripčního mechanismu nebo zvýšení propustnosti buněk, vyhodnotíme celkové množství transfektované nitrobuněčné plasmidové DNK analýzou slot blot.
Slot blot”
Buněčná kultura. Buněčné linie HeLa (ATCC) rakoviny děložního hrdla byla uchovávána v médiu RPMI (Europio) doplněného 10% fetálním telecím sérem, 1% P/S ve zvlhčené atmosféře obsahující 5% CO2.
Působení s ALC.
5.106 buněk bylo naočkováno do 125ml lahve a uchováváno v RPMI doplněného jako v předchozím postupu a obsahujícího ALC ve dvou koncentracích (5mM a lOmM) 4 dny před transfekcí. Působení bylo opakováno na konci transfekce. Buňky, na které nebylo působeno ALC byly kultivovány za stejných podmínek a použity jako kontrolní.
Přechodná exprese pRL-CMV.
Na I2jamkové plotně (Corning) bylo l den před transfekcí naočkováno 105 buněk na jamku. Pro transfekcí byt použit liposom DOTAP (Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN) a plasmid pRLCMV (Promega, č. kat. E2261) v 6 jamkách na vzorek. Stručně: 1,5 pg DNK a vodný roztok liposomu o koncentraci 9,2μΜ na jamku byly za laboratorní teploty smíseny (25 μΐ na vzorek) k vytvoření komplexu DNK-liposom. Po inkubaci po dobu 30 minut byl přidán stejný objem HBS 2x (20mM HEPES, 150mM NaCl, pH 7,4) na jednu jamku a transfekční směs byla rozdělena (50 μΐ na jamku v doplněném mediu). Buňky byly s tímto komplexem inkubovány po dobu 5 hodin a potom komplex odstraněn promytím PBSD (fosforečnanem pufrovaný fyziologický roztok o pH 7,4, prostý Ca2+ a Mg2+). Buňky byly udržovány v doplněném médiu obsahujícím ALC po dobu 24 hodin a potom použity k analýze. Jako kontrolní byla transfektována čistá DNK v PHS Ix (pRL-CMV).
Extrakce DNK.
Celková buněčná DNK byla od transferovaných buněk extrahována alkalickou lyží metodou uváděnou maniatísem. Po promytí PBS byly buňky odebrány s PBS (1 molů na jamku) a centrifugovány při 15 000 g po dobu 10 minut za laboratorní teploty.
Podle postupu byla každá peleta umístěna na led lyžována za použití: 100 μΐ roztoku I (50mM glukóza, 25mM Tris-HCl (pH - 8), lOmM EDTA (pH = 8)), 200 μΐ roztoku II (0,2N NaOH, 1% SDS), 150 μΐ roztoku III (5M octan draselný, ledová kyselina octová). Po odstředění při 12 000 g po dobu 5 minut při 4 °C by! supematant oddělen a DNK vysrážena EtOH. Pelety byly resuspendovány vTe lx (50 μΐ navzorek).
Značení vzorků
Vzorek luciferázového genu byl získán štěpením pRL-CMV po dobu 2 hodin HindíII při 37 °C a potom za stejných podmínek BamHI. Po štěpení byla směs podrobena elektroforéze na 0,8 % agarózovém gelu v ústojném roztoku TAE lx (40 mM Tris-HCl (pH 7,8), l,lmM EDTA a 37mM octan sodný) a excizí izolován fragment odpovídající luciferázovému genu. Značení luciferázového genu bylo provedeno značkovacím systémem Rediprime II DNK (Amersham Pharmacia biotech, č. kat. RPN 1633) a stabilizovaný Ridivue [a-32P]dCTP (Amersham Pharmacia biotech, č. kat. AA 0005) podle obdrženého návodu.
-4CZ 303403 B6
Slot blot
Vzorky DNK byly absorbovány na kladně nabitou nylonovou membránu (Boehringer, č. kat. 1209299) za použití přístroje Biorad Slot Blot. DNK byla navázána na filtr UV Stratalinkerem5 2400 (Stratagene). Po předběžné inkubaci na filtru s hybridizaěním roztokem QuikHyb (Stratagene, č. kat. 201220) po dobu 20 minut při 68 °C bylo po povaření s DNK lososího spermatu po dobu 2 minut přidáno 2,5.106 cpm.ml značeného vzorku. Hybridizace byla prováděna při 68 °C po dobu l hodiny a potom byl filtr dvakrát promýván ústojným roztokem I (SSC 2x SDS 0,1 %) po dobu 15 minut za laboratorní teploty a potom ústojným roztokem II (SSC 0,lx, SDS, io 0,1% po dobu 30 minut při 60 °C. Filtr byl k zobrazení vystaven v luminiscenčním přístroji ('Phosphor Imager) záření a potom denzitometricky analyzován s použitím softwaru IPlab Gel.
Denzitometrie slot blot (viz tabulka) prozrazuje, že neexistuje žádný rozdíl mezi hodnotami získanými u transfektovaných buněk v přítomnosti a nepřítomnosti ALC. Malý pokles byl pozo15 rován u lOmM ALC. Tyto výsledky ukazují, že přítomnost ALC nemění buněčnou absorpci komplexu DNK-liposom buňkou, což ukazuje, že by ALC mohla ovlivňovat expresi luciferázy v oblasti transkripce.
Denzitometrické hodnoty (v relativních jednotkách)
| slot | objem | střední hodnota | |
| čistá DNK | 1 | 81620 | |
| 2 | 93505 | ||
| 3 | 85305 | 72618.2 | |
| 4 | 64280 | ||
| 5 | 56880 | ||
| 6 | 54119 |
| komplex Dotap/DNK | 7 | 239399 | |
| 8 | 250530 | ||
| 9 | 251720 | 252088,5 | |
| 10 | 258812 | ||
| 11 | 258100 | ||
| 12 | 253970 |
| čistá DNK + 5mM ALC | 13 | 59846 | |
| 14 | 58324 | ||
| 15 | 61431 | 61441,5 | |
| 16 | 70373 | ||
| 17 | 63045 | ||
| 18 | 55630 |
| komplex Dotap/DNK + 5mM ALC | 19 | 222013 | |
| 20 | 255756 | ||
| 21 | 253422 | 240634,5 | |
| 22 | 234654 | ||
| 23 | 239053 | ||
| 24 | 238909 |
| čistá DNK + lOmM ALC | 25 | 26326 | |
| 26 | 71831 | ||
| 27 | 54172 | 52595,2 | |
| 28 | 70496 | ||
| 29 | 48707 | ||
| 30 | 44037 |
| komplex Dotap / DNK + lOmM ALC | 31 | 173870 | |
| 32 | 225644 | ||
| 33 | 116848 | 165345 | |
| 34 | 114911 | ||
| 35 | 157762 | ||
| 36 | 203035 |
-5CZ 303403 B6
Tabulka: na obrázku jsou znázorněny jednotlivé hodnoty (v relativních jednotkách) navzokovaných filtrů získané denzitometrickou analýzou za použití softwaru IPlab Gel. Jak je výše uvedeno, pRL-CMV DNK byla transfektována Dotap (komplex Dotap/DNK) a transfekce byla provedena jak s buňkami, na které nebylo působeno (slot 7 až 12), tak s buňkami s 5mM (slot 19 až
24) a lOmM (slot 31 až 36) ALC, Jako kontrolní byla za stejných pokusných podmínek pouižita pRL-CMV bez liposomu (čistá DNK): buňky, na které nebylo působeno (slot 1 až 6), buňky s 5mM (slot 13 až 18) a 1 OmM (slot 25 až 30) ALC.
Shrnutí.
io
Porovnání mezí denzitometrickými hodnotami získanými transfekcí provedenou v přítomnosti nebo nepřítomnosti ALC ukazuje, že mezi permeabilitou buněk pro komplex DNK/Dotap a kladným účinkem ALC na aktivitu luciferázy není žádný vztah.
Claims (1)
1. Použití acetyl-L-kamitinu k přípravě léčiva pro použití v kombinaci s genovou terapií ke zvýšení exprese proteinů kódovaných transferovanými geny.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| IT2000RM000077A IT1316990B1 (it) | 2000-02-17 | 2000-02-17 | Metodo per aumentare l'espressione genica per geni trasfettati. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20022757A3 CZ20022757A3 (cs) | 2003-02-12 |
| CZ303403B6 true CZ303403B6 (cs) | 2012-08-29 |
Family
ID=11454443
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20022757A CZ303403B6 (cs) | 2000-02-17 | 2001-02-09 | Použití acetyl-L-karnitinu k príprave léciva pro zvýšení exprese transfektovaných genu |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US20030022859A1 (cs) |
| EP (1) | EP1257658B1 (cs) |
| JP (1) | JP4726378B2 (cs) |
| KR (1) | KR100768264B1 (cs) |
| AT (1) | ATE366320T1 (cs) |
| AU (1) | AU2001237712A1 (cs) |
| CA (1) | CA2400110A1 (cs) |
| CY (1) | CY1106872T1 (cs) |
| CZ (1) | CZ303403B6 (cs) |
| DE (1) | DE60129206T2 (cs) |
| DK (1) | DK1257658T3 (cs) |
| ES (1) | ES2288164T3 (cs) |
| HU (1) | HUP0204460A2 (cs) |
| IT (1) | IT1316990B1 (cs) |
| MX (1) | MXPA02007959A (cs) |
| PL (1) | PL204125B1 (cs) |
| PT (1) | PT1257658E (cs) |
| SK (1) | SK287759B6 (cs) |
| WO (1) | WO2001061025A1 (cs) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IT1316990B1 (it) * | 2000-02-17 | 2003-05-26 | Sigma Tau Ind Farmaceuti | Metodo per aumentare l'espressione genica per geni trasfettati. |
Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0681839A2 (en) * | 1994-05-12 | 1995-11-15 | Hirohiko Kuratsune | A pharmaceutical preparation comprising an acylcarnitine |
| US5656628A (en) * | 1993-06-21 | 1997-08-12 | Zw Biomedical Research Ag | Use of L-acetylcarnitine for the treatment of AIDS |
| WO1998001128A1 (en) * | 1996-07-05 | 1998-01-15 | Mendes S.R.L. | Use of l-acetylcarnitine, l-isovalerylcarnitine, l-propionylcarnitine for increasing the levels of igf-1 |
| WO1999056784A2 (en) * | 1998-05-06 | 1999-11-11 | Transgene S.A. | Inprovements in gene therapy using compositions comprising a polynucleotide and a nuclease inhibitor or interleukin-10 |
| WO1999057094A2 (en) * | 1998-05-06 | 1999-11-11 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Perfluorinated esters of alkanoyl l-carnitine for the preparation of cationic lipids for the intracellular delivery of pharmacologically active compounds |
| EP1257658A1 (en) * | 2000-02-17 | 2002-11-20 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. | Method for increasing the gene expression of transfected genes |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6040295A (en) * | 1995-01-13 | 2000-03-21 | Genemedicine, Inc. | Formulated nucleic acid compositions and methods of administering the same for gene therapy |
| AU8765298A (en) | 1997-07-31 | 1999-02-22 | Larkom, L.L.C. | Shared high speed network access |
| AU5207799A (en) * | 1998-07-02 | 2000-01-24 | Genzyme Corporation | Transgene expression in polarized cells |
-
2000
- 2000-02-17 IT IT2000RM000077A patent/IT1316990B1/it active
-
2001
- 2001-02-09 KR KR1020027010503A patent/KR100768264B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-09 JP JP2001559862A patent/JP4726378B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2001-02-09 PL PL365011A patent/PL204125B1/pl not_active IP Right Cessation
- 2001-02-09 CZ CZ20022757A patent/CZ303403B6/cs not_active IP Right Cessation
- 2001-02-09 HU HU0204460A patent/HUP0204460A2/hu unknown
- 2001-02-09 DE DE60129206T patent/DE60129206T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-09 AT AT01910129T patent/ATE366320T1/de active
- 2001-02-09 ES ES01910129T patent/ES2288164T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-09 WO PCT/IT2001/000057 patent/WO2001061025A1/en not_active Ceased
- 2001-02-09 EP EP01910129A patent/EP1257658B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2001-02-09 US US10/203,924 patent/US20030022859A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-09 AU AU2001237712A patent/AU2001237712A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-09 PT PT01910129T patent/PT1257658E/pt unknown
- 2001-02-09 CA CA002400110A patent/CA2400110A1/en not_active Abandoned
- 2001-02-09 SK SK1187-2002A patent/SK287759B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2001-02-09 MX MXPA02007959A patent/MXPA02007959A/es active IP Right Grant
- 2001-02-09 DK DK01910129T patent/DK1257658T3/da active
-
2004
- 2004-09-27 US US10/949,194 patent/US7560439B2/en not_active Expired - Fee Related
-
2007
- 2007-09-17 CY CY20071101195T patent/CY1106872T1/el unknown
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5656628A (en) * | 1993-06-21 | 1997-08-12 | Zw Biomedical Research Ag | Use of L-acetylcarnitine for the treatment of AIDS |
| EP0681839A2 (en) * | 1994-05-12 | 1995-11-15 | Hirohiko Kuratsune | A pharmaceutical preparation comprising an acylcarnitine |
| WO1998001128A1 (en) * | 1996-07-05 | 1998-01-15 | Mendes S.R.L. | Use of l-acetylcarnitine, l-isovalerylcarnitine, l-propionylcarnitine for increasing the levels of igf-1 |
| WO1999056784A2 (en) * | 1998-05-06 | 1999-11-11 | Transgene S.A. | Inprovements in gene therapy using compositions comprising a polynucleotide and a nuclease inhibitor or interleukin-10 |
| WO1999057094A2 (en) * | 1998-05-06 | 1999-11-11 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.P.A. | Perfluorinated esters of alkanoyl l-carnitine for the preparation of cationic lipids for the intracellular delivery of pharmacologically active compounds |
| EP1257658A1 (en) * | 2000-02-17 | 2002-11-20 | Sigma-Tau Industrie Farmaceutiche Riunite S.p.A. | Method for increasing the gene expression of transfected genes |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Gadaleta a kol. (1990) FEBS Lett. 277, 191-193 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1257658T3 (da) | 2007-11-05 |
| MXPA02007959A (es) | 2003-02-10 |
| AU2001237712A1 (en) | 2001-08-27 |
| IT1316990B1 (it) | 2003-05-26 |
| DE60129206D1 (de) | 2007-08-16 |
| WO2001061025A1 (en) | 2001-08-23 |
| CZ20022757A3 (cs) | 2003-02-12 |
| ES2288164T3 (es) | 2008-01-01 |
| EP1257658A1 (en) | 2002-11-20 |
| SK287759B6 (sk) | 2011-09-05 |
| US20030022859A1 (en) | 2003-01-30 |
| JP2003522544A (ja) | 2003-07-29 |
| CA2400110A1 (en) | 2001-08-23 |
| US7560439B2 (en) | 2009-07-14 |
| HUP0204460A2 (en) | 2003-04-28 |
| ITRM20000077A0 (it) | 2000-02-17 |
| ATE366320T1 (de) | 2007-07-15 |
| EP1257658B1 (en) | 2007-07-04 |
| SK11872002A3 (sk) | 2002-11-06 |
| KR20030072204A (ko) | 2003-09-13 |
| PL204125B1 (pl) | 2009-12-31 |
| KR100768264B1 (ko) | 2007-10-18 |
| DE60129206T2 (de) | 2008-03-06 |
| ITRM20000077A1 (it) | 2001-08-17 |
| PT1257658E (pt) | 2007-09-14 |
| CY1106872T1 (el) | 2012-09-26 |
| JP4726378B2 (ja) | 2011-07-20 |
| PL365011A1 (en) | 2004-12-27 |
| US20050124570A1 (en) | 2005-06-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12274743B2 (en) | Nucleic acid vaccines | |
| CN109562192B (zh) | 用合成信使rna治疗原发性纤毛运动障碍 | |
| CN117106824A (zh) | 一种治疗听力损伤的双载体系统及其应用 | |
| WO2023086830A1 (en) | Intraspinal delivery of therapeutic agents | |
| CZ303403B6 (cs) | Použití acetyl-L-karnitinu k príprave léciva pro zvýšení exprese transfektovaných genu | |
| RU2846338C1 (ru) | Гетерокомплекс на основе теломерной последовательности для восстановления мышечной ткани | |
| WO2025153053A1 (en) | Composition and methods for inducing antigen specific immunity against kras mutant cells | |
| CA2049538A1 (en) | Chondromodulin-i protein | |
| HK40076592B (en) | Nucleic acid vaccines | |
| HK40072892B (en) | Nucleic acid vaccines | |
| CN108578699A (zh) | 分子靶标在牙种植体修复中的应用 | |
| HK1235003B (en) | Nucleic acid vaccines | |
| KR20120029127A (ko) | 클러스터린 발현 또는 활성 촉진제를 포함하는 지방간 예방 및 치료용 조성물 | |
| HK1237653A1 (en) | Nucleic acid vaccines |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20121127 |