CZ301506B6 - Selektivne se replikující rekombinantní virový vektor a zpusob jeho prípravy, farmaceutická formulace, zpusob usmrcení bunky s defektní dráhou, transformovaná bunka a promotor reagující na dráhu p53 a TGF-ß - Google Patents

Abstract

Selektivne se replikující rekombinantní virový vektor, který obsahuje promotor reagující na dráhu operativne pripojený na represor replikace viru, kde vektor je selektivne replikován v neoplastických bunkách majících defektní dráhu, na kterou promotor reaguje.

Description

Selektivní se replikující rekombinantní virový vektor a způsob jeho přípravy, farmaceutická formulace, způsob usmrcení buŮky s defektní dráhou, transformovaná buňka a promotor reagující na dráhu p53 a TGF-β

Oblast techniky

Předmětný vynález poskytuje rekombinantní vity, které replikují virový genom selektivně jako odezvu na intracelulámf podmínky cílové buňky a to prostřednictvím použití promotoru reagujíio čího na určitou dráhu, který řídí expresi inhibitoru replikace viru.

Dosavadní stav techniky

Rekombinantní adenoviry jsou dnes používány v řadě terapeutických režimů jako prostředníci pro dopravení terapeutických transgenů. Rozsáhlá nakažlivost těchto vektorových systémů však způsobila zvýšení obav z toho, že by exprese viru vjiných než nádorových buňkách mohla způsobovat současné zničení jiných buněk než neoplastických. V důsledku toho bylo vyvinuto Široké spektrum systémů, jejichž úkolem je v daném typu buňky přednostně exprímovat transgen.

Pro zajištění přednostní replikace vektoru v určitých typech buněk byly použity tkáňově specifické a nádorově specifické promotory. Například mezinárodní patentová přihláška PCT/US96/10838, publikovaná 16.1.1997 (mezinárodní publikace WO97/01358) popisuje použití vektorů, které se replikují ve specifické hostitelské buňce prostřednictvím použití promotorových prvků specifických pro prostatu, které řídí funkce El, E2 nebo E4 a které příležitostně obsahují cytotoxickou transgenní expresní kazetu. Tato publikace konkrétně popisuje konstrukt, ve kterém kontroluje zesilovač specifický pro prostatu expresi El a obsahuje expresní kazetu, zahrnující CMV-promotor, který řídí expresi genu pro cytosíndeaminasu a který je inzertován do oblasti E3. Tyto vektory jsou replikačně kompetentní a v konkrétním typu buňky jsou schopny se sbalovat do intaktních virionů.

Alternativním přístupem k použití nádorově specifických promotorů pro řízení replikace viru je použití specifických delecí v sekvenci kódující adenovirový protein Elb55K. Rekombinantní adenoviry, které obsahují defekty v nukleotidové sekvenci kódující Elb55K, jsou popsány v US patentu 5 677 178, vydaném 14.10.1997. U těchto tkáňově specifických nebo nádorově specifických kontrolních prvků však bylo pozorováno, že jsou „děravé“ tzn., že umožňují replikaci nejen v upřednostňovaných cílových buňkách, ale také v dalších typech buněk.

Alternativou k tomuto typu selektivně se replikujícího vektoru je použití replikačně deficitního adenovirového vektoru, který obsahuje rozsáhlou eliminaci funkce El. Konkrétně byly pro dopravení exogenních transgenů použity vektory obsahující eliminaci delecí El, E2, E3 a částečně E4. Tyto vektory byly použity pro dopravení genu p53 do cílových buněk. Bylo dokázáno, že exprese exogenně podaného divokého („wild type“) p53 v p53 deficitní (s mutovaným p53 nebo bez p53) nádorové buňce je schopna indukovat v nádorové buňce apoptózu zprostředkovanou p53. Tyto virové vektory určené pro dopravení p53 jsou v současné době ve výzkumu ve společ45 nostech Schering Corporation a Introgen Corporation. Tyto vektory dále vykazovaly přijatelné toxikologické profily a terapeutickou účinnost pro terapeutické aplikace u lidí. Nyní jsou ve druhé fázi klinických zkoušek léčby zhoubného bujení spojeného s p53 u mužů.

Porucha replikace a selektivně se replikující vektory mají, alespoň teoreticky, své stinné stránky, které jsou předmětem zájmu kliniků. Protože replikačně deficitní vektory se u pacienta nebudou množit nekontrolované, mají teoreticky přitažlivější bezpečnostní profit. Protože účinná eliminace nádoru vyžaduje, aby byla infikována podstatná část nádorových buněk, je pro zajištění terapeutické účinnosti běžně používán molámí přebytek vektoru. Selektivně se replikující viry jsou považovány za viry, které jsou větším problémem z pohledu bezpečnosti a to vzhledem k jejich schopnosti replikovat se a mutovat za vzniku zcela replikačně kompetentních vektorů. Avšak tím,

-1 CZ 301506 B6 že je udržována přirozená schopnost viru množit se za konkrétních podmínek, je umožněno těmto vektorům rozšířit se na okolní nádorové buňky. Protože vektory sami o sobě jsou schopny se replikovat, je potřeba pouze nižší počáteční dávka těchto vektorů. Toto je důležité z imunologického hlediska, ale rovněž také z důvodů ekonomických při výrobě těchto činidel. Selektivně se replikující viry, které se zaměřují na vnímané bezpečnostní problémy a které současně poskytují zvýšený terapeutický index, jsou v dané oblasti techniky potřebné.

Předmětný vynález řeší tyto problémy tím, že poskytuje selektivně se replikující adenovirové vektory obsahující promotor reagující na určitou dráhu, který řídí expresi represoru replikace viru tak, že se vektor replikuje přednostně v buňkách, které jsou z pohledu sledované dráhy defektní. Předmětný vynález také poskytuje farmaceutické formulace obsahující tyto vektory. Předmětný vynález také poskytuje způsoby oddělení buněk s defektní dráhou od populace normálních buněk a to právě s pomocí těchto vektorů.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je selektivně se replikující rekombinantní virový vektor, který obsahuje promotor reagující na dráhu operativně připojený na represor replikace viru, kde vektor je selektivně replikován v neoplastických buňkách majících defektní dráhu, na kterou promotor reaguje.

Předmětný vynález tedy poskytuje rekombinantní viry, které replikují virový genom selektivně jako odezvu na intracelulámí podmínky cílové buňky prostřednictvím použití promotoru reagujícího na určitou dráhu, který řídí expresi inhibitoru replikace viru. Inhibitor podstatně inhibuje replikaci víru v hostitelské buňce a to na bázi fenotypu nebo genotypu infikované buňky, V cílové buňce je element promotoru reagujícího na určitou dráhu inaktivní a virus se tudíž může replikovat. Výsledkem je: (1) usmrcení buněk přirozenou lýzí viru a/nebo (2) poskytnutí terapeutické dávky transgenního produktu (amplifikováného ve srovnání s replikaěně nekompetentními vektory) cílové buňce a (3) vznik místní koncentrace viru usnadňující infekci okolních cílových buněk rekombinantním virem. Vynález dále poskytuje terapeutické a diagnostické způsoby použití vektorů, farmaceutické formulace obsahující vektory, způsoby přípravy vektorů a transformované buňky, které obsahují tyto vektory.

Předmětný vynález poskytuje selektivně se replikující rekombinantní virus obsahující promotor reagující na určitou dráhu, který je operativně připojen na represor replikace viru.

Termín „selektivně se replikující“ se vztahuje k vektoru, který je schopen se přednostně replikovat v buňce v jednom fenotypovém stavu ve srovnání s buňkou s jiným fenotypovým stavem. Mezi příklady odlišných fenotypových stavů by mohly být zahrnuty buňka s defektní dráhou p53 versus normální buňka stejného buněčného typu. Virus, který vykazuje přednostní replikací, znamená, že se při určité hladině dávky replikuje v daném typu cílové buňky ve srovnání s normální (kontrolní) buňkou stejného typu alespoň s 5 násobnou účinností. Aby bylo možno stanovit, je-li virus skutečně selektivní, je vzhledem k řadě faktorů nezbytné určit schopnost viru replikovat se v cílových buňkách a porovnat ji s replikací v normálních buňkách stejného typu.

Je výhodné srovnat schopnost daného vektoru replikovat se v cílové buňce, která disponuje určitou sledovanou podmínkou a v normální buňce stejného typu, která danou podmínku nevykazuje. Například prvním krokem, který následuje po infekci viru, je indukce buňky tak, aby vstoupila do buněčného cyklu, protože faktory, nezbytné pro maximální účinnost replikace viru, jsou přítomny pouze v S-fázi. Avšak při pokusu o zhodnocení selektivity vektoru z pohledu selektivity vůči nádorovým buňkám, zhodnocení schopnosti replikovat se v nádorové buňce a v jiné buňce, která již vstoupila do buněčného cyklu (jako je nesmrtelná buňka nebo transformovaná buňka), bude selektivita viru pro nádorové buňky do určité míry nejasná resp. zkreslená. Dále bylo pozorováno, že různé typy buněk vykazují pro daný virus velmi odlišnou nakažlivost. Ačkoliv některé viry jako jsou adenoviry vykazují široký tropismus tkání, jiné viry jsou typem buněk, které infikují,

-2L-L JU13UO DO omezeny více. Při pokusu o určení Činnosti daného vektoru v buňkách, které se velmi liší schopností být infikovány, je obtížné odhadnout, zdali je malý účinek důsledkem působení vektoru v buňce nebo pouze důsledkem nedostatečné infekce buňky virem jako takové. Vliv různé nakazlivosti se minimalizuje právě určením selektivity v cílových i normálních buňkách stejného typu.

Rovněž musí být brána v úvahu dočasná povaha životního cyklu viru. Například pouze u wildtype vektoru se může zdát, že ve srovnání s normálními buňkami vykazuje selektivitu v nádorových buňkách velmi brzo po infekci a to proto, že buňka je právě v cyklování. Avšak jakmile má virus stimulovaný buněčný cyklus, tato zdánlivá selektivita klesá. Proto tedy musí být doba, která následuje po infekci a ve které je selektivita určována, dostatečně dlouhá pro to, aby byla vyloučena tato počáteční replikační lag fáze v normálních buňkách. Ačkoliv se toto bude lišit podle typu použitého viru, může odborník v dané oblasti techniky tuto počáteční lag fázi snadno určit.

Při určování, vykazuje-li daný rekombinantní adenovirus selektivní účinek v cílových buňkách daného typu, je třeba brát v úvahu také vliv dávkování. Například, jestliže je pozornost zaměřena na eliminaci nádorových buněk a měření účinku prostřednictvím cytotoxicity, může se při různém dávkování viru zdát, že vykazuje selektivní cytotoxicitu. Toto je způsobeno tím, že dostatečně vysoká dávka téměř jakéhokoliv viru bez ohledu na stupeň modifikace genomu, bude cytotoxická a to jednoduše vzhledem k vlivu přítomnosti virových proteinů (jako je hexon v případě adenoviru), o nichž je známo, že jsou cytotoxické. Podobně se vědecká literatura dokonce může odkazovat na virus jako na „replikačně defektní“ (za předpokladu, že virus je zcela neschopný replikace v nepřítomnosti buněčné linie, která je schopna komplementovat defekt viru). Tyto viry jsou přesněji popsány jakožto „oslabené pro replikaci*⁴. Například adenoviry obsahující deleci celé El oblasti, které jsou často označovány jako „replikačně deficitní“ nebo „replikačně defekt25 ní“, se budou do určitého stupně replikovat a to konkrétně v cyklizujících se nebo velmi iychle se dělicích buňkách. Toto pozoroval Mulligan (1990, Science 260:926 až 932):

Ačkoliv v případě exprese El oblasti bylo ukázáno, že ovlivňuje expresi jiných produktů virových genů nezbytných pro replikaci (Horwitz, M,, Virology, Β. N. Fields Ed. (Raven, New York,

1990), kapitola 60), nejeví se požadavek exprese genu El pro replikaci viru jako absolutní.

Dřívější charakterizace El deficitních virů ukazují, že při vysokých multiplicitách infekce byla El oblast pro replikaci postradatelná (Jones a Shenk (1979) PNAS (USA) 76(8): 3 665 až 3 669).

Z tohoto důvodu nemůže být při určování, zdali je nebo není virus replikován selektivním způso35 bem, ignorován účinek dávky viru.

Jedním prostředkem jak stanovit replikační selektivitu viru pro cílové buňky, je určení „indexu selektivity“ pro daný virus. Běžně používaný parametr ED₅₀ (který je definován jako dávka dostatečná pro indukování buněčné smrti u 50% buněk) poskytuje odpovídající základ pro porovnání. Hodnota ED₅₀ viru může být snadno stanovena pomocí typických in vitro experimentů pomocí stupňování dávky. Aby byl zajištěn pevný základ porovnání, je nejvhodnější vyjadřovat ED₅o ve vztahu ke kontrole. Cílem tohoto je minimalizovat vlivy související s různou schopností jednotlivých typů srovnávaných buněk být infikována a rovněž minimalizovat odchylky měření. Proto je poměr ED₅o(virus)/ED₅o(kontrola) používán pro vyjádření relativní toxicity viru v buňce a bude označován jako „index relativní toxicity“ nebo „RTI“. „Index selektivity“ daného viru je vyjádřen poměrem RTI(cílové buňky )/RTI(normální buňky). Selektivně se replikující vektory budou mít index selektivity alespoň 10, ale výhodněji 50,100 nebo vyšší.

Například selektivně se replikující adenovirové vektory U3EE a T1LT jsou konstruovány tak, aby bylo dosaženo selektivní replikace a usmrcení nádorových buněk, které mají defekty p53 dráhy. U3EE je připraven v souladu se zde uvedenými příklady. Stručně, virus U3EE obsahuje první expresní kazetu zahrnující responzivní prvek p53 (p53 CON), který řídí expresi fúzního proteinu E2F-Rb. Fúzní protein E2F-Rb je velmi účinným inhibitorem aktivity adenovirového promotoru E2 a jeho přítomnost v buňce bude účinně potlačovat replikaci viru. Responzivní prvek p53 je aktivní v závislosti na přítomnosti funkční dráhy p53.

-3CZ 3U15U6 B6

Proto tedy v normálních buňkách, kde není p53 dráha porušena, bude virus U3EE exprimovat fúzní protein E2F-Rb a virus se nebude replikovat. Avšak v buňkách, které mají p53 dráhu defektní (většina nádorových buněk), není prvek p53CON aktivní a tudíž zde nedochází k potla5 čení replikace viru. Vektor U3EE obsahuje také expresní kazetu zahrnující MLP promotor, který řídí expres i proapoptotického genu Ad5 E3-10.5K. Použití dočasných promotorů (jako je MLP promotor) je výhodné v případě proapoptotických genů, protože se předpokládá usnadnění replikace virové DNA v cílové buňce dříve než dojde k aktivování proapoptotického signálu. MLP promotor je aktivován přibližně sedm hodin po infekci, tedy jestliže replikace genomu U3EE io indukuje aktivitu proteinu E3-1O.5K. Adenovirový vektor T1LT je nezbytný stejně jako vektor U3EE až na to, že obsahuje další deleci v oblasti Ela a to takovou, aby byly odstraněny aminokyseliny 4 až 25 adenovirových Ela proteinů 243R a 289R. Tato delece porušuje schopnost proteinu p300 vázat se na tyto Ela proteiny.

is U virů U3EE a T1LT byla stanovena jejich schopnost replikovat se v normálních lidských bronchiálních epiteliálních buňkách (NHBE) a C33A (linie epiteliálních nádorových buněk s defektní p53 dráhou) a zabíjet je. Jako kontrola byl použit vektor L9IU. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny na přiloženém obr, 3. Následující tabulka shrnuje data;

Tab, 1: Shrnutí RTI a indexů selektivity virů

Virus	RTI (normální buňky)	RTI (nádorové buňky)	index selektivity
L9ÍU	TO	1*0	L0
U3EE	12,5	0,0233	536
T1LT	10	0,066	152

Jak je patrné z uvedených údajů, vykazují viry U3EE a T1LT vysokou selektivitu pro nádorové buňky. Jak již bylo diskutováno dříve, virus L9IU vykazuje v případě cyklizujících nádorových buněk mírně pozitivní replikaci oproti normálním buňkám v klidovém stavu. Srovnáním poměrů ED5o(virus)/ED5o(kontrola) pro každý typ buněk před tím, nežje vypočítán index selektivity, jsou vlivy těchto odchylek minimalizovány.

Termín „rekombinantní“ se vztahuje ke genomu, který byl modifikován příslušnými rekombinantními technikami.

Termín „virus“ se vztahuje k jakýmkoliv intracelulámím parazitům, které nemají mechanismy 35 pro syntézu proteinů nebo pro výrobu energie. Virový genom může být tvořen RNA nebo DNA spojenou sobalovou proteinovou strukturou lipidové membrány. Mezi příklady virů, kteréjsou prakticky užitečné v předmětném vynálezu, patří rody baculoviridiae, parvoviridiae, picomaviridiae, herpesviridiae, poxviridiae, adenoviridiae, picotmaviridiae. Termín rekombinantní virus zahrnuje chimérické (nebo multimemí) viry, tzn. vektory konstruované pomocí komplementár40 nich kódujících sekvencí z více než jednoho subtypu viru. Toto je uvedeno např. v Feng a kol. Nátuře Biotechnology 15; 866 až 870.

Termín „adenovírus“ je synonymem k termínu „adenovirový vektor“ a vztahuje se k virům rodu adenoviridiae. Termín adenoviridiae se vztahuje celkově k živočišným adenovirům rodu masta45 děno virus včetně lidské, hovězí, ovčí, koňské, psí, prasečí, myší a opičí subgenerace adenovirů. Výše vy jmenované typy však nejsou v žádném směru limitující. Konkrétně lidský adenovírus zahrnuje subgeneraci A-F i jednotlivé sérotypy jejich jednotlivých sérotypů a subgenerace A-F včetně typů lidských adenovirů 1, 2, 3, 4, 4a, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 (AdllA a Adl IP), 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 19a, 20, 21, 22, 23,24, 25,26,27,28,29, 30,31,32, 33, 34, 34a, 35, 35p, 36,

-4vzj juijuu υυ

37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 a 91. Termín hovězí adenoviry zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, hovězí adenoviiy typů 1,2, 3,4, 7 a 10. Termín psí adenoviry zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, typy 1 (kmeny CLL, Glaxo, RI261, Utrect, Toronto 26-61) a 2. Termín koňské adenoviry zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, typy 1 a 2. Termín prasečí adenoviry zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, prasečí typy 3 a 4. V upřednostňovaném provedení vynálezu pochází adenovirus z lidského adenoviru sérotypu 2 nebo 5.

Termín „promotor reagující na určitou dráhu“ se vztahuje k DNA sekvencím, které vážou určitý protein a tudíž způsobují, aby v normální buňce geny v blízkosti tohoto promotoru na vazbu io tohoto proteinu reagovaly na úrovni transkripce. Tyto promotory mohou být vytvořeny začleněním responzivních prvků, což jsou sekvence, na které se vážou transkripční faktory. Tyto odezvy jsou obecně induktivní a tudíž existuje několik případů, kdy zvyšující se hladiny proteinu snižují transkripci. Promotory reagující na určitou dráhu mohou být přirozeně se vyskytující nebo syntetické. Promotory reagující na určitou dráhu jsou většinou konstruovány s ohledem na dráhu nebo is funkční protein, který je předmětem sledování. Například přirozeně se vyskytující promotor reagující na p53 dráhu bude zahrnovat transkripční kontrolní prvky aktivované přítomností funkčního p53 jako je p21 nebo bax promotor.

Příležitostně mohou být pro vytvoření syntetického promotoru reagujícího na určitou dráhu použity syntetické promotory obsahující vazebná místa pro p53 umístěná po směru transkripce (upstream) vůči minimálnímu promotoru (např. oblast TATA box SV40). Syntetické promotory reagující na určitou dráhu jsou obecně konstruovány zjedné nebo více kopií sekvence, která se shoduje v konvenčním vazebném motivu, Tyto konvenční DNA vazebné motivy mohou být snadno určeny. Tyto konvenční sekvence jsou obecně uspořádány jako přímé nebo repetice hlava-ku-konci oddělené několika páry bází. Prvky, které zahrnují repetice hlava-ku-hlavě (např. AGGTCATGACCT) jsou nazývány palindromy nebo obrácené repetice a ty s repeticemi konec-ku-konci jsou nazývány repetice obrácené ven.

Mezi příklady promotorů reagujících na určitou dráhu, které jsou užitečné v praxi předmětného vynálezu, patří syntetické promotory reagující na dráhu insulinu, obsahující konvenční vazebnou sekvenci pro insulin (Jacob a kol. (1995) J. Biol. Chem. 270: 27 773 až 27 779), promotor reagující na dráhu cytokinů, promotor reagující na dráhu glukokortikoidů (Lange a kol. (1992) J. Biol. Chem 267: 15 673 až 15 680), promotory reagující na dráhu IL1 a IL6 (Won K.A., Baumann H (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 3 965 až 3 978), promotory reagující na dráhu T3, promotory reagují35 cí na dráhu thyroidního hormonu, obsahující konvenční motiv: 5'AGGTCA3', promotory reagující na dráhu TPA (TRE), promotory reagující na dráhu TGF-β (popsáno v Grotendorst a kol. (1996) Cell Growth and Differentiation 7: 469 až 480). Další příklady promotorů reagujících na určitou dráhu jsou v dané oblasti techniky dobře známé a je možno je nalézt v databázi Database of Transkription Regulátory Regions on Eukaryotic Genomes, která je přístupná na inter40 netové adrese http//www.eimb.rssi.ru//TRRD.

V upřednostňovaném provedení vynálezu, jak je zde doloženo příkladem, obsahuje vektor syntetický promotor reagující na dráhu TGF-β, jako například promotor obsahující responzivní elementy SRE a PAI-RE, který je aktivní v přítomnosti funkční dráhy TGF-β. PAI-RE se vztahuje k syntetickému responzivnímu elementu TGF-β, který obsahuje sekvence reagující na signál TGF-β, izolované z promotorové oblasti aktivátoru-I plasminogenu. Konstrukce PAI-RE je popsána níže v příkladu 3. Promotor reagující na dráhu PAI-RE může být izolován jako fragment o velikosti 749 bp, kteiý lze izolovat z plazmidu p8001uc (jako je popsáno v Zonneveld a kol. (1988) PNAS 85: 5 525 až 5 529 a je dostupný zGenBank pod přístupovým číslem

103836). SRE se vztahuje k syntetickému responzivnímu elementu TGF-β, který obsahuje repeticí 4 z Smad-4 DNA vazebných sekvencí (GTCTAGAC, popsáno vZawel a kol. (1988) Mol. Cell 1: 611 až 617). Konstrukce SRE je popsána níže v příkladu 3. Responzivní element SRE může být vytvořen spojením komplementárních oligonukleotidů kódujících Smad-4 vazebné sekvence a klonováním v plazmidovém vektoru pGL#3-promotor luciferasa (komerčně dostupný od firmy ProMega).

-5CZ 301506 B6

Podobně „promotor reagující na p53 dráhu“ se vztahuje k transkripčnímu kontrolnímu elementu, který je aktivní v přítomnosti funkční dráhy p53. Promotor reagující na dráhu p53 může být přirozeně se vyskytující transkripční kontrolní oblast aktivní v přítomnosti funkční dráhy p53, jako např. promotory p21 nebo mdm2. Promotor reagující na dráhu p53 může být příležitostně také syntetická transkripční kontrolní oblast aktivní v přítomnosti funkční dráhy p53, jako jsou promotory reagující na dráhu SRE a PAI-RE, p53-CON popisuje promotor reagující na dráhu p53, který obsahuje syntetický responzivní element p53 konstruovaný prostřednictvím inzerce dvou syntetických p53 konvenčních DNA vazebných sekvencí (jako popisuje Funk a kol. (1992) io Mol. Cell Biol. 12: 2 866 až 2 871) které jsou upstream k TATA boxu SV40. Konstrukce promotoru reagujícího na dráhu p53-CON je popsána níže v příkladu 3. RGC se vztahuje k syntetickému promotoru reagujícímu na dráhu p53 použitím jediné vazebné domény pro p53 identifikované v ribozomálním genovém svazku viz Kem a kol. (1991) Science 252: 1 708 až 1 711 a Park a kol. (1996) Molecular Carcinogenesis 16: 101 až 108, Responzivní elementy p53CON a RGC mohou být konstruovány spojením komplementárních oligonukleotidu a p53 responzivní promotory mohou být konstruovány (jako je popsáno v příkladu 3) klonováním v plazmidovém vektoru pGL3-promotor luciferasa (komerčně dostupný od firmy ProMega).

Termín „cílová buňka“ se vztahuje k buňce daného fenotypového stavu, u které je žádoucí, aby byla ošetřena podáváním terapeutického transgenu. Použitím různých promotorových elementů reagujících na určitou dráhu je možno směřovat expresi viru do jakékoliv dané buňky s neporušenou danou dráhou. Například represor replikace viru může být exprimován v neoplastické cílové buňce prostřednictvím použití promotorů reagujících na dráhu TGF-β nebo p53. Represor replikace viru může být exprimován také vartritické cílové buňce prostřednictvím promotoru reagují25 čího na zánět, přičemž vektor případně kóduje IL— 10.

Termín „operativně připojen“ se vztahuje ke spojení polynukleotidových prvků ve funkční vztah. Sekvence nukleové kyseliny je „operativně připojena“ tehdy, je-li umístěna do funkčního vztahu s jinou sekvencí nukleové kyseliny. Například promotor nebo zesilovač je operativně připojen ke kódující sekvenci tehdy, když ovlivňuje transkripci kódující sekvence. Operativně připojený znamená to, že sekvence nukleotidů, které jsou spojovány, jsou většinou spojité. Avšak, protože zesilovače obvykle plní svou funkci tehdy, jsou—li odděleny od promotoru několika kilobázemi a sekvence intronů mohou být různě dlouhé, mohou být určité polynukleotidy operativně připojeny, ale nemusí přímo sousedit a mohou ještě plnit funkci dle různých alel nebo chromozomu.

Termín „represor replikace viru“ se vztahuje k proteinu, který, je-li v dané buňce exprimován, podstatně potlačuje replikaci viru. Represor replikace viru je závislý na původu rodičovského adenovirového vektoru, od něhož je rekombinantní vektor podle předmětného vynálezu odvozen, což odborníci v dané oblasti techniky jistě ocení. Například v případě adenovirových vektorů nebo jiných DNA nádorových virů může být použit fúzní konstrukt E2FRb, což je popsáno v EP přihlášce 94 108 445, publikované 6.12.1995 (publikační číslo 0 685 493 Al). Fúzní protein E2F-Rb se skládá z DNA vazebné domény a DPI heterodimerizační domény lidského proteinového transkripčního faktoru E2F (aminokyseliny 95 až 286 zwild-type E2F) fúzovaného s doménou potlačující růst Rb (aminokyseliny 379 až 928 wíld-type Rb proteinu). E2F-Rb fúzní protein je účinným represorem E2F-dependentní transkripce a váže buňky v G1. DNA vazebná doména je umístěna v aminokyselinách 128 až 193 a dimerizační doména se nachází v pozici 194 až 289. Sekvence lidského proteinu E2F-1 je dostupná vGenBank pod přístupovým číslem M96577, uložené 10.8.1992. Je-li konstruován vektor pro použití v jiných druzích, mohou být použity E2F sekvence od jiných členů E2F rodiny z E2F jiných druhů. V situaci, kdy je rekombi50 nantní virus založen na viru, příbuzném sadenovirem (AAV), jsou rep protein a jeho deriváty účinnými represory replikace viru v nepřítomnosti infekce adenovirem. V situaci, kdy je virus odvozen od viru herpes simplex, může být jako účinný represor replikace viru použit protein ICPO-NX, což je deletovaná forma ranného proteinu IPCO (Liun a kol. (1998) J. Virol. 72: 7785 až 7795). Podobně může být jako represor replikace viru použit jakýkoliv protein s dominantní negativní aktivitou.

-6cr. jvijvu ου

TGF-β a příbuzné proteiny včetně aktivinu, inhibinsu a BMP jsou účinnými přirozenými antirozmnožovacími látkami a předpokládá se, že hrají důležité role v potlačení tumorogenicity. Ve své bioaktivní formě je TGF-β homodimer o velikosti 25 kDa spojený disulfidovými vazbami, který je exprimován prakticky ve všech lidských tkáních. Je zajímavé, že mnoho maligních typů buněk si zachovává průběh exprese, který je pozorován u normálních buněk. TGF-p signalizuje prostřednictvím heteromemích receptorových komplexů serin/threoninkinasovým receptorům typu I a II. Receptor typu II má vlastní kinasovou aktivitu a po vazbě na TGF-β ligand heteromerizuje s receptorem typu I a transfosforyluje ho. Fosforylace receptoru typu I aktivuje jeho kinasovou aktivitu, jejíž výsledkem je fosforylace Smad, což jsou íntracelulámí efektory. Fosforylovaný receptor typu I transportuje signály do buňky a výsledkem je odezva buňky ve formě např. inhibice růstu. Je známo, že jakmile jsou Smad komplexy uvnitř jádra, aktivují transkripci cílových genů buď tím, že sami pracují jako transkripční faktory nebo tím, že regulují aktivitu jiných transkripČních faktorů. U transkripčních faktorů se předpokládá, že jsou regulovány signálem

TGF-p včetně CTFINF-1, FAST-1, Spi, Jun, SRF/TRF, Oct a CREB. Výsledek těchto interakcí vede k různým známým pleiotropním efektům TGF-p.

Transformační růstový faktor-p (TGF-β) a jemu příbuzné proteiny jsou účinnými inhibitory množení mnoha typů buněk. Maligní vývoj jednotlivých nádorů epiteliálního a hematopoietické20 ho původu odpovídá ztrátě antirozmnožovacího a antiinvasivního působení TGF-β. Bylo dokázáno, že porucha signalizace TGF-β zahrnuje mutace nebo delece nebo nedostatečnou expresi receptorů a/nebo intracelulámích efektorů dráhy přenosu signálu. Mnoho maligních nádorů, které jsou rezistentní vůči TGF-β, jsou také násobně defektní pro jiné geny potlačující nádor, čímž je omezena možnost využít nahrazení genu potlačujícího nádor v účinné terapii.

Promotory reagující na dráhu TGF-β byly konstruovány pomocí začlenění sekvencí z plasminogenového aktivátorového inhibitoru—1 (PAI-promotor) nebo vazebných míst pro Smad4/DPC4 (SRE-promotor) upstream k TATA boxu SV40. Aktivity těchto promotorů byly zjištěny pomocí měření přechodné transfekce pomocí lucíferasy jakožto značky. Výsledky jsou uvedeny v tab. 2.

Tabulka 2 Relativní aktivita lucíferasy* (násobek)

Linie buněk	TGF-β dráha	PAI promotor -TGF-β	PAI promotor + TGF-p	SRE promotor -TGF-β	SRE promotor + TGF-β
Hep3B	normální	68,82	128,42	105,02	86,47
293	normální	51,62	88,78	9,40	46,94
A549	normální	33,26	56,76	2,87	17,93
Panel	normální	15,36	141,80	1,14	29,03
U87	normální	110,40	73,88	7,42	7,85
MCF-7	defektní	18,93	10,72	1,28	1,22
WIDR	defektní	10,66	4,41	1,24	1,57
MDA-MB468	defektní	2,28	1,10	1,33	0,62
AsPC-1	defektní	6,56	1,24	1,79	0,76
Caco2	defektní	13,01	13,8	1,18	0,96
MicaPaca2	defektní	14,08	1,81	0,79	26,34

* aktivita lucíferasy je vyjadřována ve vztahu k aktivitě získané v případě konstruktu bez promotoru

-7CZ JU13U0 BĎ

Tyto výsledky ukazují, že oba promotory jsou aktivní pouze v buňkách s funkční cestou přenosu signálu TGF-β. V buněčné linii s defektní TGF-β dráhou jako je MDA-MB468, která je defektní pro přenos signálu TGF-β z důvodu homozygotní delece Smad4/DPC4, obnovuje transfekce

PAI-promotoru nebo SRE-promotoru operativně připojených k luciferase a infekce rekombinantním adenovirem kódujícím Smad4 aktivitu obou výše zmíněných responzivních elementů a dále potvrzuje specifitu promotorů obsahujících responzivní prvky pro dráhu TGF-β, což je ukázáno pomocí dat v tab. 3.

Tabulka 3 Obnovení aktivity promotoru reagujícího na TGF-β v buňkách MDA-MB-468 po infekci rekombinantním adenovirem kódujícím Smad4/DPC4 (relativní aktivita luciferasy (násobek))

Virus	Dávka	PAI promotor -TGF-β	PAI promotor + TGF-β	SRE promotor - TGF-β	SRE promotor + TGF-β
BGCA	1x10»	1,0	1,53	1,00	1,00
BGCA	1x10	0,86	1,06	0,33	0,77
DCCA	1x10“	1,13	4,86	8,50	139,17
DCCA	1x10’	1,93	31,60	22,00	370,84

* aktivita luciferasy je vyjadřována ve vztahu k aktivitě získané v případě konstruktu s BGCA bez přídavku TGF-β. BGCA je rekombinantní adenovirus exprimující gen pro β-gal. DCC A je rekombinantní adenovirus kódující Smad4/DPC4

Poté byl zkonstruován plazmid obsahující PAI-promotor operativně připojený k E2F-Rb a byla u něj testována schopnost selektivně potlačovat E2 promotor v buňkách s neporušenou dráhou TGF-β. Při měření přechodné transfekce vykazovala transfekce E2 promotoru připojeného k luciferase s PAI-promotorem operativně připojeným k E2F-Rb selektivní represi aktivity E2 promotoru u buněk 293 (s normální TGF-β dráhou) a nikoliv u buněk MDA-MB468 (s defektní TGF-β dráhou), což je ukázáno v tab. 4. Důvodem byla selektivní exprese E2F-Rb v buňkách 293. Podle předpokladu transfekce CMV-E2F-Rb, který exprimuje E2F-Rb v obou těchto buněčných liniích, inhibovala aktivitu E2 promotoru v obou buněčných liniích.

Tabulka 4 Selektivní represe aktivity E2 promotoru pomocí PAI-E2F-Rb u buněk 293 versus buňky MDA-MB-468 (relativní aktivita luciferasy (%))

Represor	buňky MDA-MB-468	buňky 293
žádný	100	100
CMV-E2F-Rb	9,38	10,53
PAI-E2F-Rb	124,02	17,38

* aktivita luciferasy je vyjadřována v procentech ve vztahu k aktivitě získané v případě konstruktu bez promotoru

-8Promotory reagující na dráhu p53 byly konstruovány včleněním známých vazebných míst pro p53 buď z ribozomálního genového svazku (RGC-promotor) nebo vysoce afinitních vazebných míst pro p53 (p53CON-promotor). Aktivity těchto promotorů byly stanoveny prostřednictvím měření přechodné transfekce pomocí luciferasy jakožto značky. Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny níže v tab. 5.

Tabulka 5 Aktivity promotorů reagující na p53 v různých liniích buněk (relativní aktivita luciferasy)

Linie buněk	status p53	p53 CON promotor	RGC-promotor
U87	wild-type	3 921,12	112,33
A549	wild-type	647,30	16,36
MCF-7	wild-type	445,25	12,26
293	wild-type, inaktivni	13,03	0,62
Hep3B	nulový	4,62	1,22
NCI-H358	nulový	0,35	0,56
Panel	mutantní	1,56	1,02
WIDR	mutantní	16,17	1,07
MDA-Mb-468	mutantní	4,88	0,87
AsPC-1	mutantní	0,54	1,08
Caco-2	mutantní	14,59	1.13
MicaPaca2	neznámý	28,43	1,24

* aktivita luciferasy je vyjadřována ve vztahu k aktivitě získané v případě konstruktu bez promo· toru

Výsledky naznačují, že oba tyto responzivní elementy jsou aktivní v buňkách s funkčním p53. Aby bylo potvrzeno, že aktivita promotoru reagujícího na p53 je závislá na funkčnosti p53, byly dvě linie buněk WIDR a U87 transfekovány RGC promotorem, který řídí expresi genu pro luciferasu a buď prázdným kontrolním adenovirovým vektorem (ZZCB) nebo rekombinantním adenovirem konstitutivně produkujícím p53 pod kontrolou CM V promotoru (FTCB). Výsledky těchto experimentů jsou uvedeny v tab. 6.

Tabulka 6 Obnovení/zvýšení aktivity promotoru reagujícího na p53 v buňkách WIDR a U87 po 25 infekci rekombinantním adenovirem kódujícím p53 (relativní aktivita luciferasy’)

virus	dávka	WIDR	U87
ZZCB	1 x 10’	1,0	1,0
ZZCB	1 x 10*	1,25	0,67
FTCB	1 x 10’ ——	4,71	20,30
FTCB	lxltf	29,00	109,95

* aktivita luciferasy je vyjadřována ve vztahu k aktivitě získané v případě infekce ZZCB

-9CZ 301506 B6

Jak je patrné z uvedených údajů, aktivita promotoru reagující na p53 se zvyšuje v závislosti na dávce s rostoucí aktivitou p53.

Byly připraveny rekombinantní adenovirové vektory, které kódují kódující sekvenci E2F-Rb pod kontrolou buď promotoru reagujícího na dráhu TGF-β (PAl nebo SRE) nebo promotoru reagujícího na dráhu p53 (RGC nebo p53CON). Do vektorů byl jako značka začleněn gen kódující zelený fluoreskující protein. U vzniklých virů byla testována pomocí měření cytopatického efektu (CPE) jejich schopnost selektivně se replikovat a zabíjet buňky s defektem dráhy TGF-β nebo io p53. Výsledky jsou ukázány na přiloženém obr. 1. U MRC9 (s pozitivní dráhou p53 i TGF-β) byl wild-type adenovirus schopný replikovat se a indukovat CPE již při nízkých koncentracích (1 x l(r částic/ml), zatímco vektory zacílené na dráhy TGF-β nebo p53 nebyly schopny při těchto koncentracích indukovat CPE. Pouze při testování vyšších dávek (IxlO⁸ částic/ml) vykazovaly vektory zacílené na danou dráhu určitý CPE. Na druhé straně u linie buněk jako jsou WIDR (defekty v drahách TGF-β i p53) a Hep3B (bez p53 a s defektní dráhou TGF-β při absenci exogenního TGF-β) byly vektory zacílené na určitou dráhu účinnými induktory CPE již při nízkých koncentracích (IxlO⁶ částic/ml) podobně jako wild-type víry. Fluorescenční mikroskopie buněk Hep3B infikovaných vektory zacílenými na danou dráhu (SRE-Ad a p53CON-Ad) odhalila vysokou hladinu exprese transgenu a rozšíření víru v kultuře, a to již tehdy, by la—li infikována nízkou koncentrací virových částic (IxlO⁵ částic/ml, po dobu 2 h). Naopak buňky Hep3B infikované replikačně defektním (ElA-deletovaným) GFP, který kóduje adenovirus (GFCB), o stejné koncentraci (IxlO⁵ Částic/ml), nevykazovaly žádnou expresi GFP.

Jak již bylo dříve naznačeno, jsou vektory podle předmětného vynálezu schopny se za selektiv25 nich podmínek selektivně replikovat a způsobovat lýzi cílové buňky. To však neznamená, že by do těchto vektorů nemohli být začleněni další nositelé selektivity nebo toxicity. Předmětný vynález rovněž poskytuje rekombinantní adenoviiy obsahující další modifikace virového genomu jako jsou cílené modifikace, transgenní expresní kazety nebo modifikace virového genomu s cílem usnadnit selektivní replikaci v daném typu buňky nebo v buňce daného fenotypu.

Termín „cílená modifikace“ se vztahuje k modifikacím virového genomu, které jsou navrženy tak, aby výsledkem byla schopnost přednostně infikovat konkrétní typ buňky. Specifita k typu buňky nebo zacílení buněčného typu může být dosaženo také u vektorů odvozených od virů, pro které je charakteristická velká nakažlivost jako např. adenovirus a to modifikací virových obalo35 vých proteinů. Zacílení buňky může být provedeno např. u adenovirových vektorů selektivní modifikací virových genomových nevláknitých oblastí (knoflík) a sekvencí kódujících vláknité proteiny. Cílem je dosáhnout exprese modifikovaných nevláknitých a vláknitých domén, které vykazují specifickou interakci se specifickými buněčnými povrchovými receptory. Příklady těchto modifikací jsou popsány např. v publikacích Wickham a kol. (1997) J. Viroi 71(11): 8221 až

8229 (začlenění RGD peptidů do adenovirových vláknitých proteinů); Amberg a kol. (1997)

Virology 227: 239 až 244 (modifikace adenovirových vláknitých genů s cílem dosáhnout tropismu k oku a urogenitálnímu ústrojí); Harris a Lemoine (1996) T1G 12(10): 400 až 405; Stevenson a kol. (1997) J. Viroi. 71(6): 4782 až 4790; Michael a kol. (1995) Gene Therapy 2: 660 až 668 (začlenění fragmentu peptidů uvolňujícího gastrin do adenovirového vláknitého proteinu); Ohno a kol. (1997) Nátuře Biotechnology 15: 763 až 767 (začlenění vazebné domény IgG pro Protein A do viru Sindbis). Mezi jiné způsoby jak dosáhnout specifického zacílení buňky je konjugace protilátek nebo fragmentů protilátek s obalovými proteiny (viz např. Michael a kol. (1993) J. Biol. Chem. 268: 6866 až 6869; Watkins a kol. (1997) Gene Therapy 4: 1004 až 1012; Douglas a kol. (1996) Nátuře Biotechnology 14: 1574 až 1578. Příležitostně mohou být na povrch viru konjugovány konkrétní skupiny s cílem dosáhnout zacílení (viz Nilson a kol. (1996) Gene Therapy 3: 280 až 286 (konjugace EGF k retrovirovým proteinům). Tyto rekombinantně modifikované vektory mohou být produkovány v souladu s praxí předmětného vynálezu.

Termín „transgenní expresní kazeta“ se vztahuje k promotoru funkčnímu v cílové buňce, který je 55 operativně připojen k terapeutickému transgenu. Termín promotor se vztahuje k nukleotidovým

-10V Z. UVAaJW UU sekvencím, které ovlivňují transkripci jiné nukleotidové sekvence. Mezi příklady promotorů patří slabé konstitutivní promotory, dočasné virové promotory a regulovatelné promotory.

Termín „dočasné promotor/* se vztahuje k promotorům, které řídí transkripci terapeutického transgenu v pozdějším stadiu cyklu viru ve srovnání s promotorem, který kontroluje expres i promotoru reagujícího na určitou dráhu. Mezi příklady těchto dočasných regulovaných promotorů patří adenovirový hlavní pozdní promotor (MLP), další promotory jako je E3. V upřednostňovaném provedení vynálezu je použit MLP promotor. V případě virů herpes simplex může být použit promotor LAP (Latent Activated Promotor).

io

Termín „regulovatelné promotory“ se vztahuje k indukovatelným promotorům, tkáňově specifickým nebo nádorově specifickým promotorům. Termín „indukovatelný promotor“ se vztahuje k promotorům, které usnadňují transkripci terapeutického transgenu výhodně (nebo pouze) za určitých podmínek a/nebo v závislosti na externím chemickém nebo jiném podnětu. Příklady is indukovatelných promotorů jsou ve vědecké literatuře známé (viz např. Yoshida a Hamada (1997) Biochem. Biophys. Res. Comm. 230; 426 až 430; lída a kol. (1996) J. Virol. 70(9); 6054 až 6059; Hwang a kol. (1997) I Virol 71(9): 7128 až 7131; Lee a kol. (1997) Mol. Cell. Biol. 17(9): 5097 až 5105; Dreher a kol. (1997) J. Biol. Chem. 272(46); 29 364 až 29 371. Příklady radiačně indukovatelných promotorů jsou popsány v Manome a kol. (1998) Human Gene Thera20 py 9: 1409 až 1417). Jiná úroveň selektivity může být získána pri použití tkáňově specifických a nádorově specifických promotorů. Tkáňově specifické a nádorově specifické promotory jsou v dané oblasti techniky velmi dobře známé a zahrnují promotory aktivní zejména v hladkém svalstvu (α-aktinový promotor), specifické pro pankreas (Paímiter a kol. (1987) Cell 50: 435), specifické pro játra (Rovet a kol. (1992) J. Biol. Chem. 267; 20 765; Lemaigne a kol. (1993)

J. Biol. Chem. 268: 19 896; Nitsch a kol. (1993) Mol. Cello Biol. 13:4 494), specifické pro žaludek (Kovařík a kol. (1993) J. Biol. Chem. 268: 9917; specifické pro hypofyzu (Rhodes a kol. (1993) Genes Dev. 7: 913; specifické pro prostatu atd.

Termín „terapeutický transgen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž expresí v cílové buňce vzniká terapeutický účinek. Termín terapeutický transgen zahrnuje, aniž by tím však byl nějak limitován, geny potlačující nádor, antigenní geny, cytotoxické geny, cytostatické geny, geny aktivující prolék, apoptotické geny, farmaceutické geny nebo antiangiogenní geny. Vektory podle předmětného vynálezu mohou být použity pro produkci jednoho nebo více terapeutických transgenů, buď společně prostřednictvím použití IRES elementů nebo prostřednictvím nezávisle regu35 lovaných promotorů.

Termín „gen potlačující nádor“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v cílové buňce vede ke schopnosti potlačit neoplastický fenotyp a/nebo indukovat apoptózu. Mezi příklady genů potlačujících nádor, které jsou užitečné v provedení předmětného vynálezu, patří gen p53, gen

APC, gen DPCM/Smad4, gen BRCA-1, gen BRCA-2, gen WT-1, retinoblastomový gen (Lee a kol. (1987) Nátuře 329: 642), gen MMAC-1, gen pro protein adenomatózní kolipolyposy (Albertsen a kol. US patent 5 783 666, vydaný 21.7.1998), gen DCC, gen MMSC-2, gen NF-1, gen pro potlačení nasofaryngálního karcinomu, který je na chromozómu 3p21.J. (Cheng a kol. (1998) Proč. Nati. Acad. Sci. 95: 3042 až 3047), gen MTS1, gen CDK4, gen NF-1, gen NF2 a gen VHL.

Termín „antigenní geny“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v cílové buňce vede k produkci buněčného povrchového antigenního proteinu, který může být rozpoznán imunitním systémem. Mezi příklady antigenních genů patří karcinoembryonický antigen (CEA), p53 (jako je popsán v Levine, Mezinárodní patentová přihláška WO94/02167, publikovaná 3.2.1994). Aby bylo usnadněno imunitní rozpoznání, může být antigenní gen fúzován s antigenem I. třídy MHC.

Termín „cytotoxický gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v buňce vede k toxickému účinku. Příklady těchto cytotoxických genů zahrnují nukleotidové sekvence kódující pseudomonadový exotoxin, ricinový toxin, toxin diptherie apod.

- 11 CZ 301506 B6

Termín „cytostatický gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v buňce vede k zastavení buněčného cyklu. Mezi příklady těchto cytostatických genů patří p21, retinoblastomový gen, gen fúzního proteinu E2F-Rb, geny kódující inhibitory cyklindependentní kinasy jako např. P16, pl5, pl8 a pl9, specifický homeoboxní gen (GAX) zabraňující růstu (popsán v Branellec akol., WO97/16459, publikované 9.5.1997 a WO96/30385, publikované 3.10.1996).

Termín „cytokinový gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v buňce vede k produkci cytokinů. Příkladem těchto cytokinů jsou GM-CSF, interleukiny zejména IL-1, IL—2, io IL-4, IL—12, IL—10, IL—19, IL—20, inteďerony podtypu α, β a γ zejména interferon a-2b a fúze jako jsou interferon α-2α-1.

Termín „chemokinový gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese v buňce vede k produkci cytokinů. Termín chemokin se vztahuje ke skupině strukturně příbuzných nízkomole15 kulámích cytokinových faktorů, které jsou vylučovány buňkami a které jsou strukturně příbuzné a mají mitogenní, chemotaktické nebo zánětlivé aktivity. Primárně to jsou kationtové proteiny o 70 až 100 aminokyselinových zbytcích, které mají čtyři konzervativní cysteinové zbytky. Tyto proteiny mohou být rozděleny do dvou skupin a to na základě mezer mezi dvěmi N-koncovými cysteiny. V první skupině jsou dva cysteiny odděleny jediným zbytkem (C-x-C), zatímco ve dru20 hé skupině spolu bezprostředně sousedí (C-C). Mezi „C-x-C“ chemokiny patří např. destičkový faktor 4 (PF4), destičkový základní protein (PBP), interleukin-8 (IL-8), protein stimulující aktivitu růstu melanomu (MGSA), makrofágový zánětlivý protein 2 (MIP-2) myší Mig (ml 19), kuřecí 9E3 (nebo pCEF-4), prasečí alveolámí makrofágové chemotaktické faktory I a II (AMCF-I a II), faktor stimulující růst pre-B buněk (PBSF) a IP10. Mezi členy „C-C“ skupiny patří např., aniž by tím však byl jakkoliv limitován, monocytový chemotaktický protein 1 (MPC1), monocytový chemotaktický protein 2 (MCP-2), monocytový chemotaktický protein 3 (MPC3), monocytový chemotaktický protein 4 (MCP-4), makrofágový zánětlivý protein 1 a (MIP-1a), makrofágový zánětlivý protein I β (MIP-1-β), makrofágový zánětlivý protein 1 γ (MIP-1-γ), makrofágový zánětlivý protein 3-a (MIP-3-a), makrofágový zánětlivý protein 3 β (MIP-3-β), chemokin (ELC), makrofágový zánětlivý protein 4 (MIP-4), makrofágový zánětlivý protein 5 (MIP-5), LD78 β, RANTES, SIS-epsilon (p500), chemokin thymu a chemokin regulovaný aktivací (TARC), eotaxin, 1-309, lidský protein HCC-l/NCC-2, lidský protein HCC-3, myší protein CIO.

Termín „farmaceutický gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese vede k produkci proteinu, který v cílové buňce vykazuje farmaceutický účinek. Mezi příklady farmaceutických genů patří proinzulinový gen a jeho analogy (jako je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce WO98/31397 gen pro růstový hormon, dopamin, serotonin, epidermální růstový faktor, GABA, ACTH, NGF, VEGF (pro zvýšení zásobování cílové tkáně krví, pro indukci angiogene4ú ze, WO98/32859, publikované 30.7.1998), thrombospondin atd.

Termín „proapoptotický gen“ se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese vede k programované smrti buňky. Mezi příklady proapototických genů patří p53, adenovirový E3-11.6K (pocházející zAd2) nebo adenovirový E3-1O.5K (odvozený od Ad), adenovirový gen E4orf4, geny p53 dráhy a geny kóduj ící kaspasy.

Termín „geny aktivující prolék“ se vztahuje k nukleotidovým sekvencím, jejíchž exprese vede k produkci proteinu, který je schopen převádět terapeuticky neúčinnou sloučeninu na terapeuticky účinnou, která činí buňku náchylnou ke smrti vlivem vnějších faktorů nebo která způsobuje toxické podmínky v buňce. Příkladem genu aktivujícího prolék je gen pro cytosindeaminasu, Cytosindeaminasa přeměňuje 5-fluorocytosin (5-FC) na 5-fluorouracil (5FU), což je účinná protinádorová látka. Lýze nádorových buněk poskytuje místní shluk cytosindeaminasy, která je schopna v daném místě nádoru přeměňovat 5FC na 5FU a výsledkem je usmrcení mnoha okolních nádorových buněk. Toto vede ke smrti velkého počtu nádorových buněk a to bez nutnosti infikovat tyto buňky adenovirem (také označováno jako „efekt vedlestojícího“). Rovněž může

-12CL JUIZWO DO být použit gen thymidinkinasy (TK) (viz Woo a kol., US patent 5 631 236, vydaný 20.5.1997 a Freeman a kol. US patent 5 601 818, vydaný 11.2.1997), přičemž buňky exprimující produkt genu TK jsou náchylné k selektivnímu usmrcení podáváním gancykloviru.

Termín „antiangiogenní“ geny se vztahuje k nukleotidové sekvenci, jejíž exprese vede k extracelulámí exkreci antiangiogenních faktorů. Antiangiogenní faktory zahrnují angiostatin, inhibitory vaskulámího endotelového růstového faktoru (VEGF) jako je Tie 2 (popsáno v PNAS(USA) (1998) 95: 8 795 až 8 800), endostatin.

io Odborníkům v dané oblasti techniky bude jistě zřejmé, že pro použití v provedení předmětného vynálezu mohou být učiněny modifikace a/nebo delece výše zmíněných genů, které by kódovaly funkční subfragmenty wild-type proteinu. Například odkaz na gen p53 nezahrnuje pouze wildtype protein, ale také modifikované p53 proteiny. Mezi příklady těchto modifikovaných p53 proteinů patří takové modifikace p53, které zvyšují jadernou retenci, delece např. aminokyselin

Δ13-19, jejíž cílem je eliminovat konvenční místo štěpení pro kalpain, modifikace s cílem oligomerizovat domény (jako je popsáno v Bracco a kol., WO97/0492 nebo v US patentu 5 573 925),

Odborníkům v dané oblasti techniky bude zřejmé, že výše zmíněné terapeutické geny mohou být vylučovány do média nebo mohou být lokalizovány do konkrétních intracelulámích míst a to prostřednictvím začlenění směřující skupiny jako je signální peptid nebo signál pro jadernou lokalizaci (NLS). V definici terapeutického transgenu jsou rovněž zahrnuty fúzní proteiny terapeutického transgenu se strukturním proteinem viru herpes simplex typu Ϊ (HSV-1) VP22. Fúzní proteiny obsahující VP22 signál, jsou v případě, kdy jsou syntetizovány v infikované buňce, exportovány ven z infikované buňky a účinně pronikají do okolních neinfikovaných buněk a to do vzdálenosti přibližně 16 buněk. Tento systém je konkrétně užitečný ve spojení s transkripčně aktivními proteiny (např. p53), protože fúzní proteiny jsou účinně transportovány do jádra okolních buněk. Toto je uvedeno např. V Elliott, G. & 0'Hare, P. Cell. 88: 223 až 233 (1997); Marshall, A. & Castellino, A. Research News Briefs. Nátuře Biotechnology. 15: 205 (1997); 0'Hare a kol. WO97/05265, publikované 13.2.1997. Podobné směřující skupiny odvozené od HN Tat proteinu jsou popsány také v Vives a kol. (1997) J. Biol. Chem. 272: 1601 až 1617.

Mezi další modifikace, které vedou ke zvýšení účinnosti vektorů podle předmětného vynálezu, patří, aniž by však byly jakkoliv limitující, změny v rámci El, začlenění mutací do E4 s cílem zvýšit cytotoxicitu (Muller a kol. (1992) J. Virol. 66: 5867 až 5878), vyšší regulace virových smrtících proteinů jako jsou proteiny E4orf4 nebo E3 11.6K.

V upřednostňovaném provedení vynálezu a je to doloženo příklady, obsahuje vektor předmětného vynálezu adenovirus replikující se v závislosti na podmínkách, který obsahuje promotor reagující na dráhu p53 nebo TGF-β, který řídí expresi fúzního proteinu E2F-Rb. Dále vektor obsahuje gen cytosindeaminasy, který je pod kontrolou dočasného E3 promotoru. V těchto případech je cytosindeaminasa produkována v nádorových buňkách pouze po replikaci viru. V upřednostňovaném provedení předmětného vynálezu je gen pro přeměnu proléku pod kontrolou relativně slabého nebo tkáňově specifického nebo nádorově specifického promotoru.

V jiném provedení předmětného vynálezu vektor obsahuje rekombinantní adenovirus s promotorem reagujícím na dráhu p53 nebo TGF-β, který řídí expresi fúzního proteinu E2F-Rb a transgenní expresní kazetu exprimující cytosindeaminasu samotnou nebo v bi-cistronické expresní kazetě obsahující cytosindeaminasu a prvek IRES a protein MlP-3-alpha. Protože je cytosindeaminasa exprimována, je po podání proléku jako je 5-fluorocytosin dosaženo usmrcení nádorové buňky. Nízká hladina exprese MIP-3-alpha bude pomáhat ve vývoji protinádorové imunity.

V souvislosti s konstrukcí prvků reagujících na určitou dráhu, jako je např. produkce terapeutického účinku, kdy může být současně sledována více než jedna dráha, jsou zde používány zaměnitelně víceúrovňové, muítifunkční nebo násobné kaskády reagující na danou dráhu. Odborníkům v dané oblasti techniky bude zřejmé, že vektorové kontrolní prvky, které jsou popsány výše,

-13C.L JU13U0 »0 mohou být kombinovány a to tak, aby poskytly násobnou úroveň selektivity vektorů podle předmětného vynálezu. Jako příklad multiúrovňové kontroly je možno uvést adenovirus replikující se v závislosti na podmínkách, který se může replikovat a zabíjet buňky, které mají defekty buď v Rb, TGF-β nebo p53 dráze. Tyto vektory budou zahrnovat expresi dominantního negativního inhibitoru replikace viru kontrolované promotorem reagujícím na dráhu p53 jakožto primární úroveň kontroly. Výsledkem v jakékoliv buňce s funkčním p53 (jako jsou všechny normální buňky), ale nikoliv v buňce s inaktivním p53, bude exprese dominantního negativního inhibitoru a replikace viru bude blokována. Tento vektor se však může replikovat v nádorových buňkách s funkčním p53, ale s defekty v jiných drahách jako např. TGF-β a Rb dráze. Tudíž mohou být io inzertovány další úrovně kontroly, které budou podstatně inaktivovat funkční p53 v nádorových buňkách, čímž umožní replikaci viru í když jsou jiné dráhy defektní.

Jako druhou úroveň kontroly bude stejný vektor obsahovat expresní kazetu obsahující adenovirový protein E1B-55K, který může funkčně inaktivovat p53, pod kontrolou promotoru, který je aktivní pouze v buňkách s defektní TGF-β dráhou. Promotor, který je aktivní pouze v buňkách s defektní TGF-dráhou, může být konstruován inzertováním vazebných míst pro represor do promotoru a to tak, že exprese represoru pomocí promotoru reagujícího na TGF-β někde na vektoru povede k blokování aktivity promotoru v buňkách s neporušeným TGF-β signalizováním.

Na druhé straně v buňkách, které mají TGF-β dráhu defektní nebude represor syntetizován a tudíž bude promotor aktivní. Vzhledem k expresi E1B-55K pomocí promotoru, který je aktivní pouze v buňkách s defektní TGF-β dráhou, je inaktivován endogenní p53. Příležitostně může být použit jakýkoliv přirozený promotor, jehož aktivita je z důvodu TGF-β signalizování snižována.

Začlenění dvou výše zmíněných expresních kazet zajistí, že dominantní negativní inhibitor bude exprimován pouze tehdy, když budou dráhy p53 ί TGF-β normální (vede k blokování replikace), f ale nikoliv tehdy, když bude jedna nebo obě dráhy defektní (vede k replikaci viru). f

Jako třetí úroveň kontroly je ve stejném vektoru použita exprese proteinu jako je Smad7 nebo jakákoliv jiná dominantní negativní forma Smad, která je schopna inaktivovat TGF-β dráhu (Nakao a kol. Nátuře 1997 389(6651): 631 až 635) a je kontrolována E2F responzivním promo30 torem. E2F responzivní promotor (jakoje E2F1 promotor, E2 promotor nebo syntetický promotor s více vazebnými místy pro E2F upstream k minimálnímu promotoru jako je SV40 TATA box) je aktivní tehdy, je-li Rb dráha defektní. Vzhledem ke třetí úrovni kontroly je v buňkách s defektní Rb dráhou exprimován Smad7, který naopak inaktivuje Smad4 a blokuje cestu přenosu signálu TGF-β. Tudíž je vytvořen EIB-55K a p53 je inaktivován, což vede k nedostatečné expresi domi35 nantního negativního inhibitoru. V důsledku toho může replikace viru probíhat. Na druhé straně, jestliže je Rb dráha normální, pak Smad7 není syntetizován a cesta přenosu signálu TGF-β tedy probíhá normálně. Proto tedy není vytvořen E1B-55K a výsledkem je funkční p53, který je schopen exprimovat dominantní negativní inhibitor a tím blokovat replikaci viru.

U všech tří výše uvedených úrovní kontroly může vést defekt jedné nebo dvou nebo tří drah (Rb,

TGF-β a p53) k replikaci viru a buněčné lýzi. Replikace viru nebude probíhat pouze tehdy, když budou všechny tři dráhy funkční jako tomu je v normálních buňkách.

Jak jistě ocení odborníci v dané oblasti techniky, mohou být vektory předmětného vynálezu použity v mnoha modifikacích při detekci a léčbě širokého spektra defektů drah a to pomocí řady promotorů reagujících na určitou dráhu, v upřednostňovaném provedení vynálezu a je to doloženo příkladem, je však rekombinantní adenovirový vektor odvozen od rodu Adenoviridiae.

Konkrétně upřednostňované viry jsou odvozeny od lidského adenoviru typu 2 nebo 5. Jestliže je použit adenovirový vektor jakožto rodičovský vektor, pak je výhodným inhibitorem replikace viru fúzní protein E2F-RB.

Ve výhodnějším provedení předmětného vynálezu je v případě, jsou—li použity vektory předmětného vynálezu k léčbě onemocnění spojených s nekontrolovaným buněčným rozmnožováním, upřednostňováno použití adenovirového vektoru obsahujícího specifické delece v oblasti El A a to takové, aby došlo k eliminaci schopnosti produktu genu Ela vázat se na p300 a Rb proteiny,

-14zatímco transaktivační funkce domény Ela CR3 zůstává nezměněna. Vektory předmětného vynálezu obsahují delece v kódující sekvenci Ela s cílem eliminovat p300 a plOŠRb vazebná místa v 13S kódující sekvenci. Ve výhodnějším provedení předmětného vynálezu jsou p300 vazebné delece reprezentovány delecemi aminokyselin od asi 4 do asi 25 nebo od asi 36 do asi 49.

Delece v sekvenci kódující Ela 289R nezbytné pro dosažení eliminace vazby p300 a pRb jsou výhodněji co nejmenší a to proto, aby bylo zabráněno porušení sekundární a terciární struktury proteinu Ela289R. Aby byla vyloučena vazba p300, je výhodnější, aby byla v sekvenci DNA kódující p300 vazebné domény 289R začleněna mutace. Z pohledu eliminace p300 vazby jsou io výhodnější delece méně než asi 30 aminokyselin v C-koncové oblasti, ačkoliv výhodné jsou rovněž menší modifikace. Například příležitostně jsou výhodné delece aminokyselin 4 až 25 (dli 101), od aminokyseliny asi 30 do aminokyseliny asi 49 (dli 103) a ještě konkrétněji 36 až 49, které eliminují vazbu p300. Konkrétně jsou výhodné takové bodové mutace, aby byly dostatečné pro porušení vazby p300. Jako mutace porušující vazbu p300 je uváděna například bodová muta15 ce v proteinu 289R druhé aminokyseliny argininu, kteráje vyměněna za glycin (Arg2-Gly2) (viz např. pm563, Whyte a kol., (1989) Cell 56: 67 až 75). Podobně jsou minimální modifikace výhodné z pohledu eliminování vazby pRbl05. Výhodné jsou eliminace selektivních aminokyselin ve vazebné doméně pRbl05 jako jsou aminokyseliny 111 až 123 (dli 107) a aminokyselin 124 až 127 (dli 108). Delece aminokyselin 111 až 123 (dli 107) je výhodná konkrétně proto, že zacho20 vává ρ 107 vazebnou aktivitu proteinu 289R.

Dále mohou být začleněny eliminace aminokyselin od přibližně 219 do 289 v proteinu Ela 289R a 173 až 243 proteinu E1A243R. Například začleněním bodové mutace v pozici odpovídající pozici 1131 v genomu lidského Ad5 (tzn. záměna cytosinu¹¹³¹ za guanin) vytváří stop kodón.

Tato mutace vede k eliminaci aminokyselin 219 až 289 proteinu Ela 289R a 173 až 243 proteinu El A 243R. Kromě delecí v Rb a p300 vazbě, které jsou popsány výše, je případně prováděna tato mutace. Další příklady těchto rodičovských vektorů jsou popsány v podaných US patentových přihláškách 60/104 317 a 08/09/172 684, podaných 15.10.1998.

Ve výhodnějším provedení předmětného vynálezu, což je zde také doloženo příkladem, jsou výhodnějšími promotory reagujícími na p53 dráhu p53-CON a RGC, Výhodnější promotory reagující na dráhu TGF-β jsou vybrány ze skupiny, kterou tvoří PAÍ-RE a SRE.

Ve výhodnějším provedení předmětného vynálezu je terapeutickým genem gen, aktivující prolék např. cytosindeaminasový. Ve výhodnějším provedení vynálezu pro indukci protinádorové imunity kóduje vektor podle předmětného vynálezu MIP-3-alpha.

Výhodnějšími promotory pro expresi terapeutického genu jsou dočasné promotory jako je MLP aE3.

V adenovirových konstruktech je dosahováno eliminace nebo zpoždění činnosti proteinu Ad E311.6K jejichž úkolem je minimalizovat buněčnou lýzi indukovanou adenovirem předcházející replikaci. Konkrétně by měla být výhodnější eliminace nativního genu E3-11.6K/10.5K. To by mělo minimalizovat imunitní odezvu do té doby, dokud se neuskuteční počáteční fáze místního rozšíření. V této pozdější době, jakmile je dosaženo apoptózy nejdříve infikovaných buněk a je umožněno místní rozšíření viru, by měla být imunitní odpověď výhodná. Protein 11.6K (nebo odpovídající protein E3-10.5K v Ad5) je proapoptotický gen a může být použit pro dosažení buněčné smrti v nádorových buňkách. Protože se však předpokládá, že dojde k pozdržení počáteční lýze cílové buňky, je z pohledu maximalizace replikace viru výhodnější, aby byl gen

11.6K/10.5K umístěn pod kontrolu dočasného promotoru jako je MLP promotor a to proto, aby byl pozdržen nástup jeho apoptotického účinku.

- 15LZ, JU1MJ0 B6

Farmaceutické formulace

Předmětný vynález dále poskytuje farmaceuticky přijatelnou formulaci rekombinantních virů v kombinací s nosičem. Vektory předmětného vynálezu mohou být v praxi formulovány pro aplikaci v dávkách a to v souladu s běžnými farmaceutickými přípravky s přídavkem nosičů a pomocných látek, Dávkovači formulace mohou zahrnovat aplikaci intravenózní, intratumorální, intramuskulární, intraperitonální, topikální, ložiskovou nebo aplikaci ve formě spreje.

Termín „nosič“ se vztahuje ke sloučeninám běžně používaným při formulaci farmaceutických sloučenin, které se používají pro zvýšení stability, sterility a dopravíte lnosti terapeutické sloučeniny. Jestliže je virus formulován ve formě roztoku nebo suspenze, je systémem pro dopravení přijatelný nosič výhodněji vodný nosič. Může být použita řada vodných nosičů např. voda, pufrovaná voda, 0,8% fyziologický roztok, 0,3% glycin, hyaluronová kyselina a podobné. Tyto slouče15 niny mohou být sterilizovány příslušnými, v dané oblasti techniky dobře známými, sterilizačními způsoby nebo mohou být sterilně přefiltrovány. Výsledné vodné roztoky mohou být přímo zabaleny a určeny pro použití nebo mohou být lyofilizovány a pak je třeba před podáváním lyofilizovaný preparát smíchat se sterilním roztokem. Prostředky mohou obsahovat farmaceuticky přijatelné doplňkové látky, které jsou nutné pro přiblížení fyziologických podmínek jako je úprava pH a to jsou např. pufrující Činidla, činidla upravující pružnost, smáčecí prostředky a podobné například acetát sodný, laktát sodný, chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý, sorpční monolaurát, triethanolaminoleát atd.

Předmětný vynález dále poskytuje farmaceutické formulace virů podle předmětného vynálezu s nosičem a Činidlem(y) usnadňujícím dopravení. Termíny „usnadnění dopravení“ nebo „činidla usnadňující dopravení“ jsou zde používány zaměnitelně a zahrnují jedno nebo více činidel, které usnadňují zachycení viru do cílové buňky. Příklady činidel usnadňujících dopravení jsou popsány v podaných U$ patentových přihláškách 09/112 074, podané 8.7.1998 a 08/938089, podané 26.9.1997. Mezi příklady činidel usnadňujících dopravení patří detergenty, alkoholy, glykoly, povrchově aktivní činidla, solí kyseliny žlučové, heparinové antagonisty, inhibitory cyklooxygenasy, hypertonické roztoky solí a acetáty. Alkoholy zahrnují například alifatické alkoholy jako je ethanol, N-propanol, isopropanol, butylakohol, acetylalkohol. Mezi glykoly patří glycerin, propylenglykol, polyethylenglykol a další nízkomolekulámí glykoly jako je glycerol a thioglycerol. Acetáty jako je kyselina octová, glukonová kyselina a acetát sodný jsou dalšími příklady čini35 del usnadňujících dopravení. Hypertonické roztoky solí jako je IM NaCl jsou také příklady činidel usnadňujících dopravení. Příkladem povrchově aktivních Činidel jsou dodecylsulfát sodný (SDS) a lysolecithin, polysorbát 80, nonylfenoxypolyoxyethylen, lysofosfatidylcholin, polyethylenglykol 400, polyoxyethylenéthery, povrchově aktivní činidla na bázi polyglykolétheru a DMSO. Mohou být použity soli kyseliny žlučové jako je taurocholát, taurodeoxycholát sodný, deoxycholát, chenodesoxycholát, kyselina glykocholová, kyselina glykochenodeoxycholová a další astringentní látky jako je dusičnan stříbrný. Rovněž mohou být použity heparinové antagonisty jako kvartémí aminy např. protaminsulfát. Mohou být použity cyklooxygenasové inhibitory jako je salicylát sodný, kyselina salicylová a nesteroídní protizánětlivé léky (NSA1DS) jako je indomethacín, naproxen, diclofenak.

Termín „detergent“ zahrnuje aniontové, kationtové, zwitterionové a neionogenní detergenty. Mezi exemplární příklady detergentů patří, ale nejsou v žádném smyslu limitující, taurocholát, deoxycholát, taurodeoxycholát, cetylpyridinium, benalkoniumchlorid, Zwittergent 3-14, CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylamoniol]-l-propansulfonáthydrát), Big CHAP, Deoxy Big

CHAP, Triton-X-100, C12E8, oktyl-p-D-glukopyranosid, PLURONIC-F68, Tween 20 a Tween 80 (CalBiochem Biochem i cals).

Jednotka dávkovači formulace podle předmětného vynálezu může být součástí soupravy obsahující rekombinantní virus podle nároku 1 v lyofilizované formě a roztok pro rozpuštění lyofilizo-16v-íw ^νίκ/νυ lu» v váného produktu. Rekombinantní viry předmětného vynálezu mohou být lyofílizovány běžnými způsoby a poté opět rozpuštěny.

Vektory předmětného vynálezu mohou být aplikovány také v kombinaci s kalpainovými inhibito5 ry. „Kalpainový inhibitor*⁴ (zkráceně „CI“) se vztahuje ke sloučenině, která inhibuje proteolytický účinek kalpainu-I resp. μ-kalpainů. Termín kalpainové inhibitory, který je zde používán, zahrnuje takové sloučeniny, které mají inhibiční aktivitu vůči kalpainu-I jako dodatek ke svým dalším biologickým aktivitám nebojí mají nezávisle na svých biologických aktivitách. Jako sloučeniny, které vykazují aktivitu v procesu inhibování proteolytické Činnosti kalpainů, je uváděno

Široké spektrum sloučenin. Mezi příklady kalpainových inhibitorů, které jsou užitečné v provedení předmětného vynálezu, patří N-acetyl-Leu-Leu-norleucinal rovněž známý jako „kalpainový inhibitor 1“. Kalpainové inhibitory byly sledovány z pohledu zvýšeni možnosti infekce buněk s ohledem na virové vektory, zvýšení transkripce od promotorů prostřednictvím zvýšení hladin transkripčních faktorů NF-kappaB a AP-1 a z důvodu snížení CTL odezvy na adenovirové vektory, z tohoto důvodu mohou formulace a způsoby podle předmětného vynálezu příležitostně zahrnovat kalpainové inhibitory. Kalpainové inhibitory a jejich aplikace jsou popsány v Atencio a kol. US patentová přihláška 60/104 321 a 09/073 076, podané 15.10.1998.

Způsoby použití

Předmětný vynález poskytuje způsoby usmrcení buňky s určitou defektní regulační dráhou pomocí kontaktu cílové buňky se selektivně se replikujícím vektorem podle předmětného vynálezu. V jednom provedení vynálezu a je to zde doloženo příkladem, je buňkou obsahující defekt dané dráhy buňka neoplastická. Termín „neoplastická buňka“ je buňka vykazující odlišný růstový fenotyp, charakteristický svou nezávislostí na regulaci buněčného růstu, která se vyskytuje u normální buňky. Protože neoplastické buňky se nezbytně nemusí v libovolném časovém okamžiku replikovat, zahrnuje termín neoplastické buňky buňky, které se mohou účinně replikovat nebo se mohou nacházet v dočasném klidovém stavu, kdy se nereplikují (G1 nebo G0). Místní populace neoplastických buněk jsou označovány jako novotvary. Novotvary mohou být maligní nebo benigní. Maligní novotvary jsou rovněž označovány jako karcinomy. Termín karcinom je zde používán zaměnitelně s pojmem nádor. Neoplastická transformace se vztahuje k přeměně normální buňky na neoplastickou často nádorovou buňku.

Předmětný vynález poskytuje způsob ablace neoplastických buněk v savčím organismu in vivo a to podáváním farmaceuticky přijatelné formulace rekombinantního adenoviru podle předmětného vynálezu. Termín „ablace“ znamená podstatné snížení populace životaschopných neoplastických buněk tak, aby došlo ke zmírnění špatných fyziologických projevů způsobených přítomností neoplastických buněk. Termín „podstatně“ znamená vyšší než přibližně 20 % snížení populace životaschopných neoplastických buněk v savčím organismu. Termín „životaschopné“ znamená vykazující nekontrolovaný růst a mající regulační charakteristiky buněčného cyklu neoplastické buňky. Termín „životaschopná neoplastická buňka“ je zde používán pro rozlišení zmíněných buněk od neoplastických buněk, které již nejsou schopny se replikovat. Například nádor může zůstat i po ošetření, avšak populace buněk obsahujících nádorovou masu může být mrtvá. Tyto mrtvé buňky jsou odstraněny a postrádají schopnost se replikovat i když určitá nádorová masa zůstala.

Termín „savčí organismus“ zahrnuje, ale není tím nijak limitován, lidský, prasečí, koňský, kravský, psí a kočičí organismus. Výhodnější je použít adenovirový vektor endogenní vůči typu savce, který je léčen. Ačkoliv je obecně upřednostňováno, aby byl použit virus ze stejného druhu jako je druh, který má být léčen, v určitých případech může být výhodné použít vektory odvozené od odlišného druhu, který disponuje výhodnými patogenními znaky. Například bylo uvedeno (WO 97/06826, publikováno 10.4.1997), že ovčí adenovirové vektory mohou být použity v genové terapii u lidí pro minimalizaci charakteristik imunitní odezvy lidských adenovirových vektorů. Minimalizováním imunitní odezvy je zabráněno rychlé systemické samolikvidaci (clearance) vektoru, což vede k delšímu trvání účinku vektoru.

-17CL JU13U0 bO

Vektory podle předmětného vynálezu je možno konkrétně aplikovat v léčbě nádorů spojených s nedostatečnou antirozmnožovací činností TGF-β včetně karcinomů prsu, tlustého střeva a karcinomů kůže, stejně tak jako v souvislosti s B a T lymfomy (Markowitz& Roberts, 1996).

Mutace TGF-β receptoru typu II byly identifikovány v karcinomech tlustého střeva, trávicího traktu, hlavy a Šupinatých buněk krku. Mutace nebo delece receptorů typu I byly nalezeny také vKaposově sarkomu, nádorech prsu, vaječníku a kolorekta. Mezi intracelulámími efektory signalizování TGF-β, byly jako možné supresorové geny, potlačující nádor, identifikovány Smad a Smad4/DPC4, které byly změněny přibližně v 50 % nádorů pankreasu. Změna genu DPC4 byla io zjištěna také u nádorů tlustého střeva, prsu a vaječníku, ačkoliv s mnohem menší frekvencí výskytu. Vektory podle předmětného vynálezu je možno aplikovat konkrétně pro léčbu nádorů necitlivých na TGF-β jako je např. karcinom pankreasu,

Vektory podle předmětného vynálezuje možno aplikovat také na léčbu nádorových buněk, obsa15 hujících defekty dráhy p53, Mezi tyto nádory patří takové, které vykazují změny v p53, mdm2 a p!4/pl9ARF(INK4a gen). Vektory podle předmětného vynálezu jsou také užitečné v ošetření karcinomových buněk s defekty Rb dráhy. Defekty Rb dráhy jsou výsledkem změn v Rb, cyklinu D, cyklin-dependentní kinase (jako je CDK4) a p 16 (INK4a gen).

Ačkoliv předmětný vynález poskytuje způsob použití samotných rekombinantních adenoviru, rekombinantní adenoviry podle předmětného vynálezu a jejich formulace mohou být použity v kombinaci s odpovídajícími chemoterapeutickými činidly nebo léčebnými režimy. Jako příklady těchto chemoterapeutických činidel je možno uvést inhibitory syntézy purinů (např. pentostatin, 6-merkaptopurin, 6-thioguanin, methotrexát) nebo syntézy pyrimidinů (např. Pala, azarbin), přeměny ribonukleotidů na deoxyribonukleotidy (např, hydroxymočovina), inhibitory syntézy dTMP (5-fluorouracil), činidla poškozující DNA (např. záření, bleomyciny, etoposidy, teniposidy, dactinomycin, daunorubicin, doxorubicin, mitoxantron, alkylační činidla, mitomycin, cisplatin, prokarbazin), ale také inhibitory funkce mikrotubulů (např vinca alkaloidy a colchicin). Chemoterapeutické léčebné režimy se týkají zejména nechemických procesů navržených pro

3o odstranění neoplastických buněk jako je např. ozařování. Příklady kombinované terapie pro případ, že terapeutickým genem je p53, jsou popsány v Nielsen a koi WO/9 835 5 54A2, publikované 20.8.1998.

Imunologická odezva je významná pro opakované in vivo podávání virových vektorů. Vektory podle předmětného vynálezu mohou být podávány v kombinaci s imunosupresivními činidly. Mezi příklady imunosupresivních činidel patří cyklosporin, azathioprin, methotrexát, cyklofosfamid, lymfocytový imunoglobulin, protilátky proti CD3 komplexu, adrenokortikosteroidy, sulfasalzain, FK-506, methoxsalen a thalidomid.

Předmětný vynález rovněž poskytuje způsob odstranění neoplastických buněk v populaci normálních buněk kontaminovaných zmíněnými neoplastickým i buňkami ex vivo a to prostřednictvím podávání rekombinantních adenovírů podle předmětného vynálezu zmíněné populaci. Příkladem aplikace tohoto postupu je postup, který je běžně používán při ex vivo aplikacích a to očištění od autologních produktů kmenové buňky, což je obecně známo pod názvem očištění kostní dřeně.

Termín „produkt kmenové buňky“ se vztahuje k populaci hematopoietických, progenitorových a kmenových buněk, které jsou schopny obnovit dlouhodobou hematopietickou funkci pacienta, který podstoupil myoablativní terapii. Produkty kmenové buňky jsou obecně získány odejmutím (aferezí) zmobilizované nebo nezmobilizované periferní krve. Aferéze je běžně prováděna známými postupy pomocí komerčně dostupných přístrojů pro aferézi jako je COBE Spectra Aphe50 resis Systém, komerčně dostupný od COBE Intenational, Oak Street 1185, Lakewood, CO, USA. Pro optimalizaci léčebných stavuje výhodnější provést „3-log očištění (tzn. odstranění přibližně 99,9 % nádorových buněk z produktu kmenové buňky) a nej výhodnější je „5-log očištění“ (odstranění 99,999 % nádorových buněk z produktu kmenové buňky). Ve výhodném provedení předmětného vynálezu by měl být ošetřen produkt kmenové buňky o objemu 100 ml při poměru

-18počtu částic ku buňkám přibližně 2x10” vektorů podle předmětného vynálezu, době přibližně h a při teplotě 37 °C.

Diagnostické aplikace

Kromě terapeutických aplikací, které jsou popsány výše, jsou vektory podle předmětného vynálezu užitečné také pro diagnostické účely. Vektory podle předmětného vynálezu mohou být například začleněny do oznamovacího genu, který je exprimován po infekci viru nebo po jeho replikaci. Termín „oznamovací gen“ se vztahuje ke genu, jehož produkt je schopný produkovat detekoio vatelný signál ať již sám o sobě nebo v kombinaci s dalšími prvky. K příkladům oznamovacích genů patří gen β-galaktosidasy, gen pro luciferasu, gen pro zelený fluorescenční protein, nukleotidové sekvence kódující proteiny, které lze detekovat různými systémy jako je rentgenové záření nebo systémy využívající magnetické pole (MRI). Tyto vektory by mohly být užitečné pro detekci přítomnosti funkční dráhy (např.p53 nebo TGF-β dráhy). Tyto vektory mohou být také příleži15 tostně použity pro expresi buněčných povrchových proteinů schopných rozpoznávat prostřednictvím vazby molekuly jako je fluorescenčně označená protilátka. V případě, kdy je promotor reagující na určitou dráhu použit pro řízení represoru replikace viru (např. E2F-Rb), mohou být pro řízení oznamovacího genu pro diagnostické aplikace, kdy je promotor reagující na určitou dráhu zablokován, použity pozdní promotory viru (např. E2, který je vypnut prostřednictvím

E2F-Rb nebo jakýkoliv j iný promotor s vazebnými místy pro represor např. vazebnými místy pro E2F). Tyto diagnostické konstrukty mohou být použity pro diagnostické účely in vivo nebo in vitro. Příklady invivo aplikací zahrnují rentgenové záření, CT snímání nebo magnetickou rezonanci (MRI).

Způsoby přípravy vektorů

Předmětný vynález dále poskytuje způsob přípravy rekombinantních virů popsaných výše. Zmíněný způsob se skládá z následujících kroků:

a. infekce produkční buňky rekombinantním virem

b. kultivace zmíněné infikované produkční buňky za takových podmínek, kdy je umožněna replikace virového genomu v produkční buňce

c. sklizení produkčních buněk a d. přečištění rekombinantního viru

Termín „infikování“ znamená vystavení rekombinantního viru produkující buňce za takových podmínek, které usnadňují infekci produkující buňky rekombinantním adenovirem. V buňkách, které byly infikovány několika kopiemi daného viru, jsou aktivity nezbytné pro replikaci viru a sbalení virionu kooperativní. Proto je tedy výhodnější, aby byly podmínky upraveny tak, aby existovala významná pravděpodobnost, že produkční buňky budou násobně infikovány virem. Příkladem podmínky, která zvyšuje produkci viru v produkční buňce je zvýšená koncentrace viru ve fázi infekce. Je však možné, že celkové číslo infekce virem připadající na jednu produkční buňku může být překročeno a pak dojde k toxickým účinkům na buňku. Proto by měla být infekce prováděna při koncentracích viru v rozmezí 1 χ 10⁶ až 1 x IO¹⁰, výhodněji 1 χ 10⁹ virionů připadajících na 1 ml. Pro zvýšení infekce linie produkčních buněk mohou být použita chemická činidla. Předmětný vynález například poskytuje způsob jak zvýšit infekci linií produkčních buněk virem a to prostřednictvím začlenění inhibitoru kalpainu. Mezi příklady kalpainových inhibitorů, které jsou užitečné v provedení předmětného vynálezu, patří kalpainový inhibitor 1 (rovněž známý jako N-acetyl-leucyl-leucyl-norleucinal, komerčně dostupný od Boehringer Mannheim). U kalpainového inhibitoru 1 bylo zjištěno, že zvyšuje možnost infekce linií produkčních buněk rekombinantním adenovirem.

- 19CZ 301506 B6

Termín „produkční buňka“ znamená buňku, kteráje schopna umožnit replikaci virového genomu rekombinantního adenoviru, aby byl produkován, Pro kulturu rekombinantních adenovirů je veřejně dostupná řada savčích buněčných linií. Například pro doplnění nedostatků v El funkci byla připravena linie buněk 293 (Graham a Smiley (1977) J. Gen, Virol. 36: 59 až 72), kteráje výhodnou buněčnou linií pro produkci obvyklých vektorů. Mezi příklady dalších produkčních buněk patří buňky HeLa, PERC.6 (jako jsou popsány v publikaci WO/97/00326, aplikační PCT/NL96/00244).

Termín „kultivace za podmínek, které umožňují replikaci virového genomu“ znamená udržování io takových podmínek pro infikovanou produkční buňku, aby mohlo dojít ke zmnožení viru v buňce producenta. Je žádoucí, aby byly podmínky regulovány tak, aby bylo dosaženo maximálního počtu virových částic produkovaných každou buňkou. Proto také je nezbytné monitorovat a regulovat reakční podmínky jako je teplota, rozpuštěný kyslík, pH atd. Komerčně dostupné bioreaktory jako je CelliGen Plus Bioreactor (komerčně dostupný od firmy New Brunswick Scientific, is lne., Talmadge Road 44, Edison, NJ, USA) jsou zařízením pro monitorování a udržování těchto parametrů vybaveny. Optimalizace infekce a podmínky kultivace se budou vždy trochu lišit, avšak podmínky, vhodné pro účinnou replikaci a produkci viru, mohou odborníci v dané oblasti dosáhnout tím, že budou brát v úvahu známé vlastnosti produkční buňky, vlastnosti viru, typ bioreaktoru atd. Jestliže jsou používány jako linie produkčních buněk buňky 293, je koncentrace kyslíku výhodně udržována v rozmezí přibližně 50 % až 120 % rozpuštěného kyslíku, výhodněji 100 % rozpuštěného kyslíku. V případě, že koncentrace částic viru (což je stanovováno příslušnými postupy jako je HPLC s použitím kolony Resource Q) zůstává dále stabilní, pak je kultivace v reaktoru ukončena a buňky jsou sklizeny.

Termín „sklizení“ znamená shromáždění buněk, obsahujících rekombinantní adenovirus, z média. Toto může být provedeno běžnými způsoby jako je odstředění nebo použití chromatografických technik. V této fázi mohou být sklizené buňky skladovány nebo mohou být dále podrobeny lýzi a přečištění, jehož cílem je izolovat rekombinantní virus. Při skladování by měly být sklizené buňky skladovány v pufru s přibližně fyziologickým pH a zmrazený na teplotu -70 °C.

Termín „lýze“ se vztahuje k porušení produkčních buněk. Lýze může být provedena radou různých způsobů, které jsou v dané oblasti techniky dobře známé. V případě, že je třeba virové částice izolovat od produkčních buněk, jsou buňky lyžovány a to postupy, které jsou v dané oblasti techniky velmi dobře známé. Například savčí buňky mohou být lyžovány za nízkého tlaku (odliš-* ný tlak o 100 až 200 psi) nebo postupem opakovaného zmrazování a rozmrazování. Exogenní volná DNA/RNA je odstraněna degradací DNAasou/RNAasou.

Termín „přečištění“ znamená izolaci podstatně čisté populace částic rekombinantního viru z lyžovaných produkčních buněk. K tomuto účelu mohou být použity příslušné techniky přečiš40 tění jako jsou chromatografické nebo gradientově centrifugační. Ve výhodném provedení předmětného vynálezu je virus přečištěn chromatografíi v kolonovém uspořádání a to postupem, který je v souladu s publikací Huyghe a kol, (1995) Human Gene Therapy 6: 1403 až 1416, což je popsáno v US patentové přihlášce 08/400793, podané 7.3.1995.

Další způsoby a postupy používané pro optimalizaci produkce rekombinantních adenovirů podle předmětného vynálezu jsou popsány v US patentové přihlášce 09/073 076, podané 4.5.1998 a nazvané Viral Production Process.

Přehled obrázků ve výkresech

Obrázek 1. Výsledky CPE stanovení pro určení cytopatického účinku rekombinantních adenovirových vektorů kódujících sekvenci kódující fúzni E2F-Rb pod kontrolou buď promotoru reagujícího na TGF-β dráhu (pAl nebo SRE) nebo promotoru reagujícího na p53 dráhu (RGC nebo p53CON. Dále byl do vektorů jako oznamovatel začleněn gen kódující zelený fluorescenční pro-20tein. Panel A představuje buňky MRC-9, panel B představuje buňky Hep3B a panel C představuje buňky W1DR. Dráha 1: replikačně deficientní (deletovaná El) rekombinantní adenovírus exprimující zelený fluorescenční protein (GFP); dráha 2: PAI-Ad; dráha 3: SRE-Ad; dráha 4:

RGC-Ad; dráha 5: p53CON-Ad. Koncentrace vírových Částic jsou naznačeny na obrázku vpravo.

Obrázek 2. Výsledky fluorescenční mikroskopie (horní panel) zobrazující expresi GFP u vektorů zacílených na určitou dráhu. Panel A představuje kontrolní vektor GFCB, panel B vektor SREAd a panel C vektor p53CON-Ad. infekce byla 5 x 10⁵ částic na mililitr.

io

Obrázek 3. Výsledky infekce normálních bronchiálních epiteliálních buněk (panel A) a buněk C33A (panel B) rekombinantními viry U3EE (čtverečky), T1LT (kolečka) a L9IU (trojúhelníky). Vertikální osy představují procento neinfikovaných kontrol a horizontální osy představují dávku viru v částicích na ml. Pokusy byly provedeny tak, že kultura buněk byla vystavena šesti různým koncentracím viru, které se pohybovaly v rozmezí IO⁵ až 10⁹ částic viru na 1 ml. Buňky byly vystaveny působení viru po dobu 1 h, přebytečný virus byt odstraněn promytím a pomocí MTS stanovení (Promega, Madison Wt), které bylo prováděno v souladu s přiloženým firemním návodem, bylo stanoveno procento životaschopných buněk šestý den po infekci. Horizontální čára představuje hladinu, pri které zůstalo životaschopných 50 % buněk. Průsečík křivek získaných z dat a horizontální Čárkované Čáry představuje hodnotu ED₅₀ pro daný virus.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady poskytují metody a výsledky experimentů, které ukazují konstrukci konkrétních rekombinantních adenovirových a plazmidových vektorů. Odborníkům vdané oblasti techniky, kterým je předmětný vynález určen, bude jistě zřejmé, že předmětný vynález může být proveden také v jiných formách než, které jsou odhaleny v uvedených příkladech, aniž by došlo k odchýlení se od smyslu nebo základních charakteristik vynálezu. Konkrétní provedení vynáíe30 zu, která jsou popsána níže, je třeba tudíž považovat za ilustrativní a nikoliv restriktivní, V následujících příkladech „g“ znamená gramy, „ml“ znamená mililitry, „mol“ znamená moly, „°C“ znamená stupně Celsia, „min.“ znamená minuty, „FBS“ znamená zárodečné hovězí sérum a „PN“ znamená počet Částic rekombinantního viru.

Příklad 1 Konstrukce plazmidů p8001uc, plazmid kódující Iuciferasu pod kontrolou PAI promotoru o velikosti 800 bp byl získán od Dr. Davida Luskutoffa (Scripps Institute, LaJolla, Kalifornie). Plazmid pCTMIE-E2FRb, který obsahuje CMV promotor, po němž následuje tří složková vedoucí sekvence adenoviru-5 a SV40 zesilovač upstream k sekvenci kódující fúzní protein E2F-RB, poskytl Doug Antelman (Canji).

Příklad 2 Konstrukce luciferasových plazmidů s promotory reagujícími na TGF-β

A. Plazmid PAI-luciferasa

Sekvence všech fragmentů jsou uváděny v 5'-3' směru. Fragment o velikosti 749 bp s Sací a Xhol místy na 5' resp. 3' konci a s SV40 TATA boxem namísto nativního TATA boxu v promotoru, byl amplifikován pomocí PCR s použitím p800Iuc jakožto templátu a s primery AGT CGA GCT CCA ACC TCA GCC AGA a GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC (obsahující SV40 TATA box), Výsledný produkt PCR byl naštěpen restrikčními enzymy Sací a Xhol a byl ligován do fragmentu, který byl získán po štěpe-21 CZ 301506 B6 ní PGL3-základního, což je luciferasový konstrukt bez promotoru (Promega). Jako výsledek byl získán PAI-lucíferasa.

B. Plazmid SRE-luciferasa

Byly spojeny následující oligonukleotidy: GG TAT TTA TGA GGA GGC AGT GGC CCA CAG AGG AGC TCG AGG ATC a GAT CCT CGA GCT CCT CTG TGG GCC ACT GCC TCC TCA TAA ATA CC. Výsledný produkt byl naštěpen Xhol a ligován do PGL3-základního, který byl naštěpen Mlul, konce byly ztupeny pomocí Klenowova enzymu a bylo provedeno ještě štěpení Xhol. Výsledkem byl pSVT-Iuc (luciferasový konstrukt s SV40 TATA boxem). Oligonukleotidy, obsahující Smad4/DPC4 vazebná místa, CGT CTA GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC TGT AC a AGT CT A GAC GTC TAG ACG TCT AGA CGT CTA GAC GGT AC byly spojeny a ligovány do konstruktu pSVT-Iuciferasa naštěpeného KpnI. Cílem bylo získat plazmid SRE-luciferasa.

Příklad 3 Konstrukce luciferasových plazmidu s promotory reagujícími na p53

A, Plazmíd RGC-luciferasa

Byly spojeny dva komplementární 5'-fosforylované oligonukleotidy obsahující vazebná místa pro p53 z ribozomálního genového svazku, AG AAA AGG CAA GGC CAG GCA AGT CCA GGC AAC TCG TGG TAC a CA CGA GTT GCC TGG AC1 TGC CTG GCC TTG CCT TTT CTG TAC. Spojený fragment byl ligován do konstruktu pSVT-Iuciferasa naštěpeného KpnI.

Cílem bylo získat plazmid RGC-luciferasa.

B. Plazmid p53CON-lucíferasa

Byly spojeny dva komplementární 5'-fosforylované oligonukleotidy obsahující konvenční vazebná místa pro p53 (p53CON), CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CTG TAC a AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC. Spojený fragment byl ligován do konstruktu pSVT-Iuciferasa, naštěpeného KpnI, Cílem bylo získat plazmid p53CON-luciferasa.

C. Plazmid PAI-E2F-Rb

Sekvence obsahující CMV promotor, po kterém následuje tří složková vedoucí sekvence adenoviru-5 a SV40 zesilovač upstream k sekvenci kódující fuzní protein E2F-RB v plazmidu pCTMIE-E2F-Rb, byla vystřižena prostřednictvím štěpení BglI a Xbal. Výsledný fragment byl ligován s cílem získat plazmid bez promotoru E2F-RB. Fragment obsahující modifikovaný PAI promotor byl vystřižen z plazmidu PAI-luciferasa prostřednictvím štěpení Sací a Xhol a konce byly ztupeny pomocí Klenowova enzymu. Tento fragment byl ligován do plazmidu bez promotoru E2F-RB, který byl naštěpen EcoRI a ošetřen Klenowovým fragmentem DNA polymerasy 1. Cílem bylo získat plazmid PAI-E2F-RB.

Příklad 4 Příprava rekombinantních adenovirů

Přenosový plazmid obsahující sekvenci Ad5 s delecí o velikosti 3 kb v E3 oblasti, ρΝΕΒΔΕ3, byl konstruován klonováním fragmentu o velikosti 7,4 kb získaného štěpením SnaBI zpBHGll (26 676 až 34 140) do pNEB193 (plazmid z NEB) ošetřeného BamHI, AccI a Klenowovým enzymem. Násobné klonovací místo bylo začleněno do výše zmíněného plazmidu spojením 5fosforylovaných oligonukleotidů AAA TAC GTA ATG CAT TCT AGA GCG GCC GCT CGC GAG GAT CCT TAA Ta TAA GGA TCC TCG CGA GCG GCC GCT CIA GAA TGC ATT

-22JW1WV L)U

ACG TAT TTA T a začleněním tohoto fragmentu zaligováním do ρΝΕΒΔΕ3 naštěpeného Pacl.

Cílem bylo získat plazmid pNEBAE3(MCS).

Přenosový plazmid pro vytvoření rekombinantního adenoviru kódujícího E2F-Rb pod kontrolou

PAI promotoru a zesílený zelený fluorescenční protein (GFP) pod kontrolou CMV promotoru byl konstruován následovně. Přechodný vektor pABS.4~E2F-Rb byl připraven ligováním fragmentu obsahujícího PAI promotor a sekvence kódující E2F-Rb, která byla připravena naštěpením PAIE2F-Rb enzymy Naci a Xbal a zaligováním fragmentu do plazmidu pABS.4 (Microbix), který byl připraven pomocí Kpní, ošetřením Klenowovým enzymem a dalším štěpením Xbal. Fragio ment obsahující PAI promotor, E2F-Rb kódující sekvenci a kanamycinový gen byl poté z plazmidu PABS.4-E2F-Rb vystřižen pomocí enzymu Pacl, byl ošetřen Klenowovým enzymem a lígován s fragmentem plazmidu získaným štěpením plazmidu pNEBAE3 enzymy Pacl a ošetřením Klenowovým enzymem. Cílem bylo získat plazmid pNEBAE3-PAI-E2F-Rb bez místa restrikčního místa Pacl. Kanamycinový gen v tomto plazmidu byl nahrazen CMV promotorem operativně připojeným ke genu pro zelený fluorescenční protein (GFP). Toto bylo provedeno štěpením pNEBAE3-PAI-E2F-Rb enzymem Swaí a zaligováním fragmentu izolovaného z pEGFP-N (Clonetech) a to pomocí Štěpení enzymy AflH a SspI a ošetřením Klenowovým enzymem. Cílem bylo získat plazmid pAE3-PAI-E2F-Rb-GFP.

Přenosové plazmidy pro přípravu rekombínantních adenoviru kódujících E2F-Rb pod kontrolou promotoru reagujícího na TGF-β s SRE a zesílený zelený fluorescenční protein (GFP) pod kontrolou CMV promotoru byly konstruovány následovně. Aby byl získán plazmid ρΝΕΒΔΕ3E2F-Rb, byla do plazmidu pNEBAE3(MCS) začleněna E2F-Rb kódující sekvence a to prostřednictvím ligování fragmentu, izolovaného štěpením pNEBAE3(MCS) enzymy Xbal a Nrul a fragmentu vytvořeného štěpením pCTMIE-E2F-Rb enzymy Xbal a NaeL Promotor reagující na TGF-β obsahující SRE byl začleněn do výše zmíněného plazmidu prostřednictvím amplifikace této sekvence PCR s použitím SRE-luciferasy jakožto templatu a fosforylovaných primeru GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C a GAT AAC TAG TGC TCC TCT GTG GGC CAC T. Výsledný produkt PCR byl naštěpen Spěl a ligován do plazmidu pNEBAE3-E2FRb naštěpeného

SnaBI a Xbal za vzniku pAE3-DPC-E2F-Rb.

Přenosové plazmidy pro přípravu rekombínantních adenoviru kódujících E2F-Rb pod kontrolou promotorů reagujících na p53 a zesílený zelený fluorescenční protein (GFP) pod kontrolou CMV promotoru byly připraveny následujícím způsobem. Promotor reagující na p53 obsahující vazeb35 ná místa pro p53 z ribozomálního genového svazku nebo konvenční místo p53 (p53CON) byl začleněn do plazmidu pNEBAE3-E2F-Rb pomocí amplifíkace promotorové sekvence PCR s použitím RGC-luciferasy nebo p53CON“luciferasy jakožto templatu a fosforylovaných příměrů GTA AGG TGC CAG AAC ATT TCT C a GAT ATC TAG ACG TCC TCT GTG GGC CAC T. Výsledné produkty PCR byly naštěpeny enzymem Xbal a byly ligovány do plazmidu pNEBAE3-E2F-Rb naštěpeného SnaBI a Xbal. Cílem bylo získat pAE3-RGC-E2F-Rb a preláta E3-PCON-E2F-Rb.

Příklad 5 Homologní rekombinace pro přípravu rekombínantních adenovirů

Rekombinantní adenoviry PAI-Ad, SRE-Ad, RGC-Ad a CON-Ad byly připraveny homologní rekombinací v bakterii, což je např. popsáno v Chartier a kol. (1996) J. Virol. 70: 4805 až 4810. Aby byly získány fragmenty obsahující E2F-Rb pod kontrolou promotoru reagujícího na určitou dráhu a GFP pod kontrolou CMV promotoru na koncích s Ad5 sekvencemi, byly přenosové plazmidy naštěpeny enzymem AscI. Výsledný fragment byl transformován do bakteriálního kmene BJ 5183 spolu s fragmentem získaným štěpením PTG4609 (dostupný od Transgene, lne. a popsaný v Chartier a kol. (1996) J. Virol. 70: 4805 až 4810) enzymy BstBI a Spěl. U výsledných bakteriálních kolonií byla testována přítomnost žádoucích rekombínantních Ad5 infekčních plazmidů pPAI-GFP-Ad, pSRE-GFP-Ad, pRGC-GFP-Ad a pCON-GFP-Ad. Tyto infekční

-23CZ 301506 B6 plazmidy byly linearizovány prostřednictvím štěpení PacI a přečištěny extrakcí v systému fenolchloroform a ethanolovým srážením. Poté byly použity pro transfekci buněk 293.

Transfekce byla provedena pomocí Superfect (Qiagen) podle přiloženého návodu. Pro transfekci 5 250 000 buněk rostoucích v destičkách o 6 jamkách s 12 μΐ Superfect/jamku bylo použito 2,5 pg linearizovaných plazmidu, Po 8 dnech byl vzhledem k produkci viru pozorován cytopatický účinek. Buňky byly sklizeny spolu se supematanty a byly 3 x podrobeny cyklu zmrazení - rozmražení. Rekombinantní víry ve vzniklých lyzátech byly amplifikovány opakovanou infekcí buněk 293. io

Příklad 6 Linie buněk

Všechny linie buněk, které jsou použity v této studii, byly získány od ATCC (Rockville, MD, 15 USA) a byly kultivovány jako jednovrstvé kultury udržované při teplotě 37 °C v CO2 inkubátoru.

Buňky293, Hep3B, MRC9, A549, Panel, U87, Caco2, MCF-7 a WIDR byly uchovávány v modifikovaném Eagle médiu Dulbecco, které bylo obohaceno 10% zárodečným hovězím sérem. Buňky MDA-MB468 byly kultivovány v médiu Ham obohaceném 10% zárodečným hovězím sérem, zatímco buňky MiaPaca-2 byly kultivovány v DMEM obohaceném 10% záro20 dečným hovězím sérem a 2,5% koňským sérem.

Příklad 7 Transfekce

Buňky byly umístěny buď do destiček se 6 jamkami (250 000 buněk/jamku) nebo do destiček s 24 jamkami (62 500 buněk/jamku) a byly ponechány přes noc. Transfekce byly poté uskutečněny s pomocí fosforečnanu vápenatého v případě buněk 293, což je zde popsáno a s použitím Superfect (Qiagen) v případě jiných buněk, kdy bylo postupováno podle návodů od výrobce.

Příklad 8 Měření oznamovatel/luciferasa

Buňky byly transfekovány 1,5 pg oznamovacího plazmidu a 1,0 pg inhibitorů. Přídavkem IX pufru pro lýzi oznamovatele (promega) a následnou inkubací při laboratorní teplotě po dobu

10 min. byly připraveny posttransfekční lyzáty (po 48 h). Aktivita lucíferasy byla stanovena pomocí zařízení Top Count (packard) a soupravy pro stanovení od stejné firmy a s použitím instrukcí od dané firmy.

Příklad 9 Měření cytopatického účinku způsobeného virem

Buňky byly infikovány zmíněným rekombinantním nebo wild-type adenovirem a byly ponechány po dobu 6 dní po infekci v přítomnosti 0,5% roztoku krystalové violeti, který byl připraven ve 20% methanolu. Vše probíhalo podle postupu, který popsal Bischoff a kol. (1996) Science 274:

373 až 376.

Příklad 10 Konstrukce virů cU3EE a cTILT

Sekvence MLP promotoru byla amplifíkována pomocí PCR za použití primerů GAT CCG ATC GAT AGC GCG TAA TAT TTG TCT AGG GC a GAT CTT AAT TAA ATG GCA GTG ACC CGG AAG, dále byla použita Ad5 DNA jako v plazmidu pFG140 (Microbix) jako templát. Produkt po PCR byl poté klonován do PacI místa plazmidu pdelataE3-PCON-E2F-Rb. Cílem bylo získat pdelataE3-PCON-E2F-Rb~MLP. Adenovirová sekvence kódující protein E3 10.5K byla amplifíkována PCR s použitím primerů GCG ACC CAC CCT AAC AGA a GAT CGG ATC

-24Ví. a/VAk/VV UV

CAA AGC GCA ACA AGG GTC A Výsledný produkt PCR byl klonován do Xhol mísu plazmidu pCDNA3.1 (Invitrogen) s cílem získat plazmid pCDNA3-10.5. Adenovirová sekvence kódující protein E3 10.5K byla poté zpCDNA3-10.5 vystřižena pomocí štěpení enzymy DralII a Xbal, následovalo použití Klenowova enzymu a poté byla ligována do PacI místa a Klenowo5 vým enzymem ošetřeného pdelataE3-PCON-E2F-Rb-MLP. Cílem bylo získat plazmid pdelaUE3-PCON-E2F-Rb-MLP-10.5K.

Rekombinantní adenoviry cU3EE a cTlLT byly připraveny homologní rekombinací v bakterii, což již bylo popsáno (Chartier a kol. (1996) J. Virol. 70: 4 805 až 4 810). Aby byly získány fragío menty obsahující E2F-Rb pod kontrolou sekvence p53CON a E310.5K pod kontrolou MLP promotoru na koncích sAd5 sekvencemi, byl přenosový plazmid naštěpen enzymem AscI.

Výsledný fragment byl transformován do bakteriálního kmene BJ 5283 spolu s fragmentem získaným štěpením PTG4609 (Transgene) enzymy BstBI a Spěl. U výsledných bakteriálních kolonií byla testována přítomnost žádoucího rekombinantního Ad5 infekčního plazmidu pCEMD. Ad5 infekční plazmid pOl/CEMD byl získán použitím podobného protokolu, ale s použitím derivátu PTG4609 (Transgene), v němž byla wild-type sekvence El A nahrazena sekvencí obsahující El A s muUcí 01. Tyto infekční plazmidy byly linearizovány prostřednictvím štěpení PacI, dále byly přečištěny extrakcí v systému fenol-chloroform a ethanolovým srážením. Poté byly použity pro transfekci buněk 293.

Transfekce plazmidů pCEMD a pOl/CEMD byla provedena pomocí Superfect (Qiagen) podle návodu proto, aby byly vytvořeny rekombinantní viry cL13EE a cTILT. Pro transfekci 500 000 buněk rostoucích v destičkách o 6 jamkách a 12 μΐ Superfect/jamku bylo použito 2,5 pg linearizovaných plazmidů. Po 8 dnech byl vzhledem k produkci viru pozorován cytopatický úči25 nek. Buňky byly sklizeny spolu se supematanty a byly 3 x podrobeny cyklu zmrazení rozmražení. Rekombinantní viry ve vzniklých lyzátech byly amplifikovány opětovnou infekcí buněk 293.

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Selektivně se replikující rekombinantní virový vektor, který obsahuje promotor reagující na

   35 dráhu operativně připojený na represor replikace viru, kde vektor je selektivně replikován v neoplastických buňkách majících defektní dráhu, na kterou promotor reaguje.
2. 2. Vektor podle nároku 1, kde neoplastické buňky jsou tumorové buňky.

   40
3. 3. Vektor podle nároků 1 a 2, kde je promotor reagující na dráhu vybrán ze skupiny, složené z promotoru reagujícího na dráhu p53, promotoru reagujícího na dráhu Rb a promotor reagujícího na dráhu TGF-β.
4. 4. Vektor podle nároku 3, kde virus je odvozen od rodu adenoviridiae.
5. 5. Vektor podle nároku 4, kde represor replikace viru je E2F-RB.
6. 6. Vektor podle nároků 1 a 2, který dále obsahuje transgenní expresní kazetu.

   50
7. 7. Vektor podle nároku 6, kde transgenní expresní kazeta obsahuje proapoptotický gen operativně připojený na promotor.
8. 8, Vektor podle nároku 7, kde proapoptotický gen je Ad5 E3-10.5K.

   -25CZ 3U1506 B6
9. 9. Vektor podle nároku 8, kde promotorem reagujícím na dráhu je promotor reagující na dráhu p53.
10. 10. Vektor podle nároku 9, kde promotorem reagujícím na dráhu p53 je p53CON, který má

    5 sekvenci CT CGA CGG ACA TGC CCG GGC ATG TCC TCG ACG GAC ATG CCC GGG

    CAT GTC CTG TAC a AG GAC ATG CCC GGG CAT GTC CGT CGA GGA CAT GCC CGG GCA TGT CCG TCG AGG TAC.
11. 11. Vektor podle nároku 10, kde promotorovou složkou transgenní expresní kazety je dočasný io promotor.
12. 12. Vektor podle nároku 11, kde dočasným promotorem je hlavní opožděný promotor neboli „major latě promotér“ označovaný MLP.

    15
13. 13. Vektor podle nároku 12, který dále obsahuje deleci v adenovirové E1 a kódující oblasti, která eliminuje vazbu p300.
14. 14. Vektor podle nároku 13, kde delece v adenovirové Ela kódující oblasti zahrnuje deleci aminokyselin 4 až 25 z Ela 243R proteinů.
15. 15. Farmaceutická formulace, vyznačující se tím, že jako účinnou přísadu obsahuje selektivně se replikující rekombinantní vektor podle nároků 1 až 14 spojený s jedním nebo více farmaceuticky přijatelnými nosiči.

    25
16. 16. Způsob usmrcení buňky sdefektní dráhou, vyznačující se tím, že se buňka vystaví kontaktu ex vivo se selektivně se replikujícím rekombinantním virem podle nároků 1 až 14.
17. 17. Použití selektivně se replikujícího virového vektoru podle nároků 1 až 14 pro přípravu

    30 farmaceutické formulace pro usmrcení buněk s defektní dráhou.
18. 18. Použití podle nároku 17, kde farmaceutický prostředek se použije při léčení rakoviny,
19. 19. Izolovaná buňka transformovaná selektivně se replikujícím rekombinantním virem, která

    35 obsahuje promotor reagující na dráhu operativně připojený na represor replikace viru.
20. 20. Způsob produkce selektivně se replikujícího virového vektoru podle nároků 1 až 14, vyznačující se tím, že zahrnuje infekci populace produkčních buněk vzorkem vektoru, kultivaci zmíněné linie produkčních buněk za takových podmínek, které umožňují replikaci zmí40 něného vektoru ve zmíněných produkčních buňkách a izolaci vektoru z produkčních buněk.

    45 3 výkresy