CZ300018B6

CZ300018B6 - Zpusob zpracování suspenze trombocytu

Info

Publication number: CZ300018B6
Application number: CZ20030015A
Authority: CZ
Inventors: Mohr@Harald
Original assignee: Blutspendedienst Der Landesverbände Des Deutschenroten Kreuzes Niedersachsen, Sachsen-Anhalt, Thüringen, Oldenburg Und Bremen Ggmbh
Priority date: 2000-07-04
Filing date: 2003-01-03
Publication date: 2009-01-14
Also published as: ZA200300257B; DK1307241T3; CA2415063A1; AU7955601A; EP1307241A1; AU2001279556B2; CA2415063C; CN1440297A; DE50106329D1; ES2241850T3; EA200300111A1; EA004246B1; CZ200315A3; CN1264577C; DE10031851A1; SK1002003A3; HUP0301717A2; PL363076A1; PT1307241E; HUP0301717A3

Abstract

Zpusob zpracování suspenze trombocytu zahrnuje krok (A) vystavení suspenze zárení v oblasti vlnové délky 400 až 750 nm v prítomnosti jedné nebo více fotoaktivních látek, které mají v této oblasti vlnových délek jedno nebo více absorpcních maxim. Dále zahrnuje krok (B) vystavení suspenze zárení v oblasti vlnových délek 270 až 320 nm s privádením energie 0,1 až 10 J/cm.sup.2.n., pricemž v tomto kroku (B) není prítomna fotoaktivní látka mající absorpcní maximum v oblasti vlnových délek zárení podle kroku (B).

Description

Vynález se týká způsobu dezaktivace virů a ničení leukocytů v suspenzích trombocytú kombinací fotodynamického zpracování a ozařováním U V-B-/.ařeníin,

11) Dosavadní stav techniky

Je známo, že terapeutické použití krevních preparátů skrývá riziko, že příjemce krevního preparátu bude infikován viry. Je možno uvést např. viry virové hepatitidy B (HBV) a C (HCV), jakož i průvodce AIDS HlV-1 a HIV-2. Toto riziko existuje vždy, kdy se při výrobě preparátu neprois vádí krok dezaktivace nebo eliminace virů.

U vyčištěných plazmaproteinovýeh koncentrátů jako např. albuminu a preparátů z faktoru Vílí a faktoru IX se postupy dezaktivace nebo eliminace virů používají, takže jsou zatím pokládány za virově bezpečné. Také virové riziko čerstvé plazmy může být alespoň sníženo prostřednictvím použití různých metod. Jednou metodou je např. skladování v karanténě. Přitom se zmrazená plazma skladuje po dobu 3 až 6 měsíců a uvolňuje se pro použití teprve poté, kdy je nový krevný vzorek krve dotyčného dárce znovu přezkoušen na obvyklých indikátorech pro HBV, HCV, 111V-I a HIV-2 a je zjištěn jako negativní. Takováto metoda není použitelná pro buněčné krevní produkty, jako např. erythroeytové resp. tromboeytové koncentráty, neboť ty mají trvanlivost asi

7 týdnů resp. 5 dnů. Buněčné krevní produkty ze zřejmých důvodů nemohou být učiněny virově bezpečnými ani prostřednictvím zpracování rozpouštědlem/detergentem, jak je možno v případě plazmaproteinovýeh koncentrátů a v případě plazmy, neboť by tím byla způsobena lýze erythrocytů a trombocytú.

jo Pracuje se intenzivně na tom, dekontaminovat buněčné krevní produkty pomocí fctodynamických postupů. Fotodynamická dezaktivace virů spočívá v tom, že se příslušný preparát v roztoku nebo suspenzi osvětluje v přítomnosti fotoaktivní látky, fotosenzibilizátoru. Vyzařované světlo musí mít vlnovou délku, která je absorbována fotoaktivní látkou. Ta se tím aktivuje a přenáší tuto aktivační energii buď přímo na substrát, který tím ničí nebo poškozuje, nebo také na molekulu kyslíku: aktivované sloučeniny kyslíku, tzn. kyslíkové radikály nebo jednoatomový kyslík totiž mají silný viricidní účinek. Ve výhodném případě má použitá fotoaktivní látka velkou afinitu ke složkám viru, např. k virové nukleové kyselině, a jen malou k ostatním složkám, které jsou v příslušném preparátu přítomny, Tak jsou dezaktivovány viry, a jiné složky se nemění. Širšího použití nachází v současné době fotodynamieký způsob podle evropského patentu EP-B1 0 491

757 (H. Mohr a B. Lambrecht, Verfahren zur Inaktivierung von Vířen in Blut und Blutprodukten). Používá se k dezaktivaci virů v čerstvé plazmě. Jako fotoaktivní látka slouží při technické aplikaci především fenothiazinová methylenová modř. Namísto methylenové modře je možno použít také toluidinovou modř. Také produkty demethylace methylenové modři, tzn. azurové barvivo. A, B a C jakož i thionin jsou fotodynamicky aktivní a jsou vhodné k fotodynamické dezaktivaci virů.

Patent US 5 545 516 (S. J. Wagner: ínactivation of extraellular enveloped viruses in blood and blood components by phenthiazin-5-ium dyes plus light) popisuje dezaktivaci mimobunéěných virů pomocí fenothiazinových barviv v kombinaci s viditelným světlem. Podle US 5' 545 516 se preparáty před fctodynamiekým zpracováním pomocí speciálních filtrů zbavují leukocytů, neboť metody desaktivace virů nepostihují s buňkou asociované viry nebo provtry. Tyto metody rovněž nejsou schopny dezaktivovat malé, neobalené viry, nacházející se v krvi, jako např. viry hepatitidy A (HAV). Volné viry, které mají lipidové.obálky, jako např. původce AIDS HIV-1, viry hepatitidy B a C (HBV, HCV) jsou naproti tomu tímto způsobem dezaktivovatelné. Také z

WO 00/04930 a WO 96/08965 jsou známy způsoby dezaktivace patogenů v biologických vzorCZ J00018 Βή vích, které používají fotoaktivní látky, které absorbují v UV-A-oblasti. a aktivují se ozařováním zářením v oblasti vlnových délek od UV-A až do viditelné oblastí,

Leukocvry v krevních produktech mohou být zničeny pomocí UV-ozařování. V případě suspenzí trombocytů se ukázalo účelné ozařování UV-B-ozářením (oblast vlnových délek 290 až 320 nm), neboř pro odstranění ícukocytů zpravidla stačí energie I až 3 J/em\ která příliš nepoškozuje trombocyty, takže jsou terapeuticky použitelné.

Přivádění energie ozařováním UV-8-zářením větší než 10 J/env působí navíc viricidné (K. N. io Prodoux; J. C. Fratanoni, E. J. Boone a R. F. Bonner v Blood. 70(2), 589 -592 (1987): Use of

Laser-UV for inactivation of virus in blood produets). Avšak přitom jsou trombocyty poškozeny tak. že je nutno vzít v úvahu jejich použitelnost (J. C. Fratanoni a K. N. Prodoux v Transfusion 30(6); 480-481 (1990); Viral inactivation of blood produets).

Podstata vynálezu

Cílem vynálezu je poskytnout efektivní metodu dezaktivace patogenních virů a ícukocytů v suspenzích trombocytů, zejména trombocytových koncentrátech (TK). TK se získávají zdaro20 vaně krve diferenciální eentrifugací nebo přímo od dárců aparátovou aferézou trombocytů.

S překvapením bylo zjištěno, že kombinace fotodynamického zpracování s UV-B ozařováním v suspenzích trombocytů nebo TK efektivně postihuje viry přístupné fotodynamické dezaktivaci virů, a současně nižší leukocyty obsažené v médiu, a odstraňuje tak riziko infekce s buňkou aso25 ciovanými viry nebo proviry. Dále bylo s překvapením zjištěno, že prostřednictvím kombinace těchto způsobů může být množství UV-B-záření potřebné pro zničení leukocytů značně menší, než při samotném ozařování UV-B-zářením. Rovněž s překvapením bylo zjištěno, že přídavné zpracování suspenzí trombocytů UV-B-zářením s intenzitou, která je sama o sobě téměř sobě neúčinná při dezaktivaci virů, značně zvyšuje účinnost fotodynamického zpracování.

Způsob zpracování suspenze trombocytů podle vynálezu zahrnuje krok (A) vystavení suspenze záření v oblasti vlnové délky 400 až 750 nm, zejména 550 až 700 nm, v přítomnosti jedné nebo více fotoaktivních látek, které v této oblasti vlnových délek vykazují

3? jedno nebo více absorpčních maxim, přičemž podstata spočívá v tom. že dále zahrnuje krok (B) vystavení suspenze záření v oblasti vlnových délek 270 až 330 nm, zejména 290 až 320 nm,

U) přičemž kroky (A) a (B) se provádějí v libovolném pořadí a/nebo se časové překrývají a v kroku (B) není přítomna fotoaktivní látka která má absorpční maximum v oblasti vlnových délek záření podle kroku (B).

Suspenze trombocytů má zejména koncentraci více než 5x10- trombocytů na ml, zvláště výhodně více než 10⁹/ml. Trombocyty mohou být např. suspendovány v plazmě nebo v médiu pro uložení trombocytů s libovolným obsahem plazmy.

Krok A zahrnuje fotodynamické zpracování suspenze trombocytů v přítomnosti fotoaktivní látky viditelným světlem; krok B zahrnuje ozařování preparátu - suspenze obsahující trombocyty světlem v oblasti vlnových délek UV-B. Oblast záření UV-B znamená ve smyslu vynálezu oblast vlnových délek 270 až 330 nm.

'7

CZ 300018 36

Koncentrace použité fctoaktivní látky a přívod energie osvětlováním a UV-B-ozarování se měří tak. aby byly dezaktivovány případné přítomné viry a zničeny leukoeyty obsažené v suspenzi trombocytů. avšak aby byla zachována funkčnost trombocytů.

Jako nádoby pro zpracování suspenzí trombocytů slouží nádoby propustné pro UV-B-záření, které zejména sestávají z plastu, a mohou mít formu sáčků. Je však také možné provádět fotodynamícké zpracování a UV-B-zpracování v různých nádobách.

Také je možné provádět zpracování suspenze trombocytů UV-B zářením zatímco se suspenze io trombocytů převádí z jednč nádoby do druhé.

Jako fotoaktivní látka může být použito např. fenothiazinové barvivo methylenová modr, azur Λ, B, Ca thionin. Rovněž jsou použitelné jiné, z např. z literatury známé fotoaktivní látky, v koncentracích pro dezaktivaci virů v krevních produktech. V případě fenothiazinových barviv jako je i ? thionin jsou možné koncentrace asi 0,1 až 10 μΜ, zejména asi 0,5 až 5 μπι nebo 1 až 5 μπι.

Jako zdroje světla pro fotodynantické zpracování, zejména při použití thioninu, slouží zejména nízkotlaké sodíkové výbojky, jejichž maximum emise světlaje kolem 590 nm. To odpovídá přibližně absorpčnímu maximu thioninu, které je ve vodném roztoku asi 595 nm. Jsou však možné

2i) také jiné zdroje světla, zejména tehdy, jestliže se použije fotoaktivní látky, která absorbuje světlo v jiné oblasti vlnových délek než například thionin.

Pro ozařování UV-B-zářením mohou být použity speciální výbojkové trubice, lampy nebo lasery, které emitují ultrafialové svétlo v oblasti vlnových délek mezi asi 270 až 330 nm. Energie

2? přiváděná ozařováním UV-B zářením může být 0,1 až 10 J/cm², zejména 0,3 až 6 J/cm², zvláště výhodně 0.5 až 3 J/cm².

Příklady provedení vynálezu

Obecné:

Následovně popsané pokusy byly prováděny s TK, které byly izolovány z jednotlivých dárců krve a suspendovány v krevní plazmě. Jako fotoaktivní látka byl použit thionin (Th). Obdobných výsledků je možno dosáhnout také pomocí jiných fotoaktivních látek, například fenothiazinového barviva methylenové modři ajejich derivátů azuru A, B a C. Příklady vynález pouze objasňují, neomezují však jeho rozsah.

Postupy a materiály

TK. použité při pokusech byly až 5 dnů skladovány v trombocytových rotátorech. Skladovací nádoby byly komerčně dostupné PVC-sáčky. Pro fotodynamické zpracování a zpracování UVB-zářením byly TK převedeny do plastikových sáčků z polyolefínu, jejichž materiál je propustný pro UV-B-záření. Pro osvětlování v přítomnosti thioninu bylo použito zařízení, vybavené níz45 kotlakými sodíkovými výbojkami ZK byly osvětleny z obou stran. Pro ozařování UV-B-zářením byl použít plošný zářič, opatřený UV-trubicemi, které emitují převážně UV-světlo v oblasti vlnových délek 290 až 320 nm.

Jako testovací virus byl většinou použit virus vezikularnt stomatitidy (VSV), který je snadno množíteIný v buněčné kultuře a v souladu s tím je kvantifikovatelný pomocí testů CPE (CPE= cytopatický efekt). V pokusu 1 byla kromě toho použita ješté rada jiných virů. VSV byly množeny ve vero-buňkách. Tytéž buňky byly použity také pro testy infekčnosti, jejichž pomocí byl stanovován titr viru. Použité médium s buněčnou kulturou bylo RPMI 1640 s 10% plodového telecího séra a antibiotikem. Testy byly prováděny na mikrotitracních destičkách. Příslušné

5? vzorky byly v 1. až 3. kroku .postupně nařeďovány. Pro každé zředění bylo testováno 8 replikátů.

CZ 300018 Bó

Titr viru je vyjádřen jako log_i0 ÍOD50 (TCID = Tissue Culture Infective Doses, dávka infekční pro tkáňovou kulturu) a vypočten metodou podle Kárbera a Spearmana (G. Karber; NaunymSehmiedebers Arch. Exp. Pathol. Pharmakol. 162. 480—tS3 (1931): Beitrag zur kollectiven

Behandlung pharmakologischer Reihenversuche, a C. Spearman; Br. J. Psychol. 2. 277-282 ? í 1908): The method of „right and wrong cases („constant stimul i) without Gauss for mulae).

Jako test funkčnosti trombocytu byla použita hypotonická šoková reakce a kolagenem indukované agregace.

Mononukleámí buňky byly izolovány z krve dárců pomocí gradientově centrifugace. Při pokusech byly přidány v koncentraci 5xl0⁵/ml k suspenzím trombocytů. Po fotodynamickém zpracování resp. UV-B-ozařování byly alikvotni podíly suspenzí odstřeďovány pří nízkých otáčkách. (1500 ot/min po dobu 4 minut), Peletizované buňky byly třikrát propláchnuty kultivačním médiem (RPMI 1640 s 10 % plodového telecího séra a s antibiotikem), a poté v tomto médiu ls znovu suspendovány. Koncentrace buněk byla nastavena na 5xl0Vml. Pro namnožovací pokusy byly buňky stimulovány Concavalinem A (ConA, 2 gg/ml) a ve 200μ1 alikvotních podílech kultivovány v inkubátoru v atmosféře CCT po dobu 3 až 4 dny při 37 °C. Poté byly přidány k buněčným kulturám. O čtyři hodiny později byly spektrofotometricky při vlnové délce 450 nm (OD450) stanoveny míry zabudování brom-deoxyuridinu (BRDU). Hodnoty extinkce jsou úměrné zabudování BRDU a tím životaschopnosti buněk.

Pokus 1: Dezaktivace virů v TK zpracováním pomocí thioninu a světla

Řada virů byla zkoumána na to, zda a v jaké míře jsou dezaktivovatelné zpracováním thioninem a světlem. Koncentrace fotoaktivní látky byla l μΜ. Jak ukazují výsledky shrnuté v tabulce 1, jeví se různé víry rozdílně citlivé: modelové viry lidské hepatitidy C virus BVDV a CSFV jakož ί Togavirus SFV byly po 5 minutách osvětlování zcela dezaktivovány, zatímco infekčnost VSV a SV-40 nebyla plné odstraněna ani po 30 minutách.

Pokus 2: Dezaktivace VSV v TK ozařováním UV-B-zářením

Jak vyplývá z tabulky 2, VSV je velmi odolný proti ozařováním UV-B-zářenírn. Ani po 60 minutách ozařování resp. po přivedení energie 20 J/cm² nebyl virus zcela dezaktivován. Od asi 10 minut ozařování resp. 3 J/cm² se ozařování UV-B-zářením naopak projevovalo negativně na funkci a skladovatelnosti trombocytů (neznázoměno).

Tabulka 1: Fotodynamická dezaktivace virů v TK prostřednictvím zpracování thioninem a světlem

Virus	VSV	CSFV	3VDV	SFV
čeleď	Rhabdo	Flavi	Flavi	Tóga
senom	ssRNA	ssRNA	ssRNA	ssRNA
doba osvětlování (min)	30	5	5	5
snížení titru viru	4,4	ž5,5	>4,9	>5,2

. 4

Virus	HIV-l	SHV-1	SV-40
čeleď	Retro	Herpes	Rapova
genotn	ssRNA	dsDNA	dsDNA
doba osvětlování (min)	30	10	30
snížení titru viru *	>5,7	>3,6	3,9

VSV - Vesicular Stomatítis Virus; CSFV - Classical Swine Fever Virus; BVDV = Bovines Virales Diarrhoe Virus; SFV - Sernliki Forest Virus; HIV-1 = Humanes Immunodeřlzienz Virus typ 1; SHV-1 = Suid Herpes-Virus, typ 1; SV-40= Simian-Virus 40; ssRNA^- single strand RNA; dsDNA = double strand DNA, * snížení titru viru v logioTCIDso.

H)

Tabulka 2: Desaktivace VSV v trombocytových koncentrátech ozařováním UV-B-zářením

UV-B (min)	J/cm²	titr viru (logioTClD₅o)	faktor snížení (logioTCIDjo)
0	0	6,44	0
10	3,25	5,48	0,96
20	6,5	4,53	1,91
30	9,75	4,35	2,09
40	13	3,28	3,16
50	16,25	2,33	4,11
60	19,5	161	4,83

Pokus 3: Desaktivace VSV v TK kombinací zpracování thioninem a světlem a ozařování UVB-zářením

Při těchto pokusech byla koncentrace thioninu opět l pm a doba osvětlování 30 min. Energie přiváděná ozařováním UV-B zářením byla 2,4 J/cnr (doba ozařování 8 minut). Samotným fbtodynamickýrn zpracováním byla infekčnost snížena o 4 resp. 4.42 logio, samotným ozařováním UV-B-zářením o 1,97 resp. 2,21 logio. V kombinaci byla v prvním pokusu infekčnost v prvním pokusu zcela odstraněna (>7,04 logio), ve druhém snížena o 6,26 log|₀ (tab. 3).

Tabulka 3: Desaktivace VSV v TK zpracováním thioninem a světlem, ozařováním UV-B-zářením a kombinací obou pracovních kroků

Infekčnost (logioTClD₅₀)

Thionin/světlo	UV-B	Pokus 1	Pokus 2
-	-	7,28+0,29	ó,68±0,21
X	-	.2,8ó±0,31	2,68±0,12
-	+	5,07±0,12	4,71 ±0,17
T		<0,24+0,00	0,42±0,21

Pokus 4: . Vliv zpracování thioninem a světlem v kombinaci s ozařováním UV-B-zářením na funkci tromboeytů

CZ J00IH8 Bó

Jakje zřejmé z tabulky 4 a 5, ani HSR (hvpotonická šoková reakce), ani kolagenem indukovaná agregace TK není kombinovaným zpracováním thioninem a světlem a ozařováním UV-VB zářením (pokusné podmínky jako v pokusu 3) ovlivněna silněji, než samotným fctodynamiekým zpracováním.

Tabulka4: Vliv zpracování suspenze trombocytů thioninem a světlem £ UV-B na HSR (vyjádřeno v %) měřený l. den a 3. den po zpracování

č.	Zpracování	Pokus l l. den	2. den	Pokus 2 i. den	2. den	Pokus 3 1. den	2. den
1	kontrolní	71,93	63,07	66,71	60,78	78,16	62,59
2	thionin/světlo	65,49	49,16	56,24	52,61	69,30	55,49
3	UV-B-záření (2,4 J/cm²)	61,06	57,09	56,26	48,80	65,67	52,49
4	thionin/světlo + UV-B-záření	47,86	51,16	42,37	30,26	54,45	48,31

in

Tabulka 5: Vliv zpracování suspenze trombocytů thioninem a světlem ± UV-B na kolagenem indukovanou agregaci (vyjádřeno v %) měřený I. den a 3. den po zpracování

č.	Zpracování	Pokus 1 1, den	2. den	Pokus 2 1. den	2. den	Pokus 3 1. den	2. den
1	kontrolní	88,00	23,00	83,33	30,00	79,67	30,33
2	thionin/světlo	73,25	13/75	84,67	27,67	69,67	15,67
3	UV-B-záření (2,4 J/cm²)	76,25	11,25	73,33	24,50	75,67	20,00
4	thionin/světlo + UV-B-záření	69,75	16,75	76,67	53,50	58,33	30,33

Pokus 5: Dezaktivace T-lymfocytů v TK pomocí UV-B-záření; vliv zpracování thioninem a jo světlem

KTK byly přidány mononukleámí buňky v koncentraci 5xl0^J/ml; poté byly po různou dobu ozařovány UV-B-zárením, nebo navíc zpracovány thioninem a světlem (koncentrace barviva 2 μΜ; doba osvětlování 30 minut). Jak ukazují výsledky shrnuté v tabulce 6, byla pro úplnou dezaktivaci buněk potřebná doba ozařování alespoň 4 minuty (1,2 J/cm²). Jestliže byly TK navíc zpracovány thioninem a světlem, mohla být zkrácena na asi 3 minuty, ačkoliv zpracování thioninem a světlem samo nemělo žádný vliv na množení buněk.

CZ 300018 Bň

Tabulka 6: Dezaktivace T-lymfocytů v trombocytovvch koncentrátech ozařováním UV-Bzářením

č.	UV-B (J/cm*)	Thionin/ světlo	Aktivace ConA	Absorpce CChsortírt	Poznámky
1	0	0	-	0,276	negativní kontrolní vzorek
2	0	0	r	0,269	pozitivní kontrolní vzorek
3	0,6	-	+	1,767
4	0,9	-	X	0,747
5	1,2	-	X	0,297
6	0,6	+	+	1,020
7	0,9	+	+	0,387
3	1,2	+'	+	0,240

Zesílení účinku předchozím zpracováním thioninem a světlem po dobu 30 minut. Buňky byly po ozařování popř. zpracování thioninem a světlem stimulovány pomocí ConA. Hodnoty OD45o_11injsou střední hodnoty z trojího stanovení. Představují zabudování BRDU do buněk po době kultivace 3 dny.

Claims

1. Způsob zpracování suspenze trombocytů, zahrnující krok (A) vystavení suspenze záření v oblasti vlnové délky 400 až 750 nm v přítomnosti jedné nebo více fotoaktivních látek, které v této oblasti vlnových délek vykazují jedno nebo více absorpčních

20 maxim, vyznačující se tím, že způsob dále zahrnuje krok (B) vystavení suspenze záření v oblasti vlnových délek 270 až 320 nm s přiváděním energie 0,1 až 10 J/cm², přičemž kroky (A) a (B) se provádějí v libovolném pořadí a/nebo se časově překrývají a 25 v kroku (B) není přítomna fotoaktivní látka která má absorpční maximum v oblasti vlnových délek záření podle kroku (B).

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že fotoaktivní látka je fenothiazinové barvivo.

3. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že se jako fenathiazinové barvivo použije thionin, methylenová modř, toluidinová modř a/nebo azur A, B a C.

35

4. Způsob podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se t í m , že se fotoaktivní látka v kroku (Aj použije v koncentraci 0,1 až 10 pm. zejména 0,5 až 5 pm.

5. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se t í m . žc intenzita záření v kroku (B) se volí tak. že se schopnost množení T-lymfccytů, obsažených v trombocytovém koncentrátu, snižuje o alespoň 50 %, zejména o více

5 než 75 %.

6. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se t í m , že energie, přiváděná v kroku (B), je výhodně 0,3 až 3 J/cm², ío

7. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se v kroku (B) suspenze vystaví záření v oblasti vlnových délek 290 až 320 nm.

8. Způsob podle některého z předcházejících nároků,

15 vyznačující se ti m , že suspenze trombocytu je trombocytový koncentrát.

9. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že suspenze trombocytu nebo trombocytový koncentrát se získá z krve dárců nebo aferézou trombocytu.

10. Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se zpracování suspenze podle kroku (A) a/nebo kroku (B) provádí v plastových nádobkách, propustných pro příslušné záření.

25

11, Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se t í m , že se zpracování suspenze podle kroku (A) a/nebo (B) provádí v aparatuře, propustné pro příslušné záření.

12. Způsob podle některého z předcházejících nároků,

30 vyznačující se tím, že se titr viru, vyjádřený jako logioTCIDjo, sníží o alespoň 5, výhodně 6 jednotek.

13* Způsob podle některého z předcházejících nároků, vyznačující se tím, že se nejprve provede krok (A) a teprve potom krok (B).

40 Konec dokumentu