CZ307437B6

CZ307437B6 - 15β-substituované deriváty estronu jako selektivní inhibitory 17β-hydroxysteoiddehydrogenáz

Info

Publication number: CZ307437B6
Application number: CZ2016-342A
Authority: CZ
Inventors: Martin Kotora; Eva Prchalová; Jerzy Adamski; Gabriele MĂ¶ller; Ondřej Štěpánek; Petr Bartůněk; David Sedlák; Marián Hajdúch; Petr Džubák
Original assignee: Ăšstav organickĂ© chemie a biochemie AV ÄŚR, v.v.i.; Ústav molekulární genetiky AV ČR, v. v. i.; Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci; Helmholtz Zentrum MĂĽnchen GmbH,
Priority date: 2016-06-07
Filing date: 2016-06-07
Publication date: 2018-08-22
Also published as: US20190330258A1; US10759826B2; WO2017211330A1; CZ2016342A3; EP3464314A1; AU2017276477A1; CA3026704A1

Abstract

15β-substituované deriváty estronu obecného vzorce I, kde substituenty R, R, R, R, Rjsou nezávisle na sobě zvoleny ze skupiny zahrnující: C-Calkyl, C-Calkoxy, C-Chalogenalkyl, halogen, COOR, kde Rje C-Calkyl; H, OH; popřípadě jsou R, Ra Rkaždý tvořen vodíkovým atomem a současně Ra Rspolu tvoří aryl, výhodně naftyl; přičemž aromatický kruh v poloze C-15 může být uvedenými substituenty Raž Rmono-, di-, tri-, tetra- i penta-substituovaný. Sloučeniny podle vynálezu mohou být využity k diagnostice a případně i k léčbě estrogen-dependentních onemocnění.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká přípravy a využití nových ligandů, selektivně inhibujících skupinu enzymů 17p-hydroxysteoriddehydrogenáz (17PHSD). Sloučeniny, které selektivně regulují aktivitu 17pHSD, mohou být účinnou složkou farmaceutických prostředků, a to zejména prostředků využitelných pro diagnostiku a léčbu estrogen-dependentních typů onemocnění.

Dosavadní stav techniky

Enzymy HSD patří do skupiny NADP(H)/NAD(H) dependentních oxidoreduktáz, které v těle regulují konverzi ketosteroidů na hydroxysteroidy a vice versa v procesu zvaném steroidogeneze. 17pHSD umožňují tento oxidačně-redukční proces v pozici C-17 steroidního skeletu. Redukcí C-l7-oxo skupiny steroidů tak z biologicky ne příliš aktivního estronu (El) vzniká vysoce potentní 17P-estradiol (E2), stejně tak z 4-androsten-3,17-dionu testosteron (T) a z 5aandrostan-3,17-dionu dihydrotestosteron. Uvedené 17|3-hydroxy formy, na rozdíl od 17β— ketosteroidů, disponují vysokou afinitou k příslušným receptorům, a tím zásadně ovlivňují četné pochody v těle, především však proliferaci a diferenciaci buněk. 17pHSD tedy mají klíčovou roli při tvorbě biologicky aktivních estrogenů a androgenů a specifická regulace těchto enzymů by mohla otevřít dveře k novým skupinám terapeutických a diagnostických látek (Poirier, D. Current. Med. Chem. 2003,10, 453).

V současné době je v literatuře popsáno již 15 izoenzymů rodiny 17fi-HSD, přičemž jednotlivé typy se navzájem podstatně liší tkáňovou, substrátovou a kofaktorovou specifitou, ale i distribucí v buňkách.

Nadměrná exprese některých izoenzymů z řady 17fiHSD, a tedy nadměrná produkce 17β— hydroxysteroidů v tkáních, koreluje s výskytem estrogen/androgen-dependentních onemocnění. Selektivní inhibitory jednotlivých izoenzymů by s výhodou mohly být použity pro terapii takových chorob a stanovení míry exprese příslušných typů HSD v postižených tkáních by pak mohlo sloužit jako diagnostický markér zmíněných nemocí. To je důvodem značné pozornosti, jež je v posledních desetiletích věnována výzkumu 173HSD.

Předkládaná přihláška vynálezu se týká inhibitorů izoenzymů 17PHSD1 a 17PHSD5. Tyto izoenzymy se podílejí na produkci estrogenů a androgenů v lidském těle. Ovlivňují progresi četných hormonálně senzitivních onemocnění, zejména rakoviny prsu, prostaty, nemalobuněčného karcinomu plic (NSCLC), spinocelulámího karcinomu a dalších. Zvýšená hladina E2 vede k výskytu benigních anomálií, zejména endometriózy, adenomyózy, děložních myomů a poruch menstruačního cyklu. Hledání látek, které by byly schopny ovlivnit průběh takových nemocí, je stále věnováno značné úsilí. Důvodem jsou buď dosavadní absence vhodné terapeutické látky, nebo nevýhody stávajících terapeutických možností, využívaných při léčbě hormonálně senzitivních chorob. Jedná se především o nežádoucí účinky, vznik rezistence při dlouhodobém podávání a v neposlední řadě o častý relaps onemocnění.

17PHSD1 byl jako první ze všech izoenzymů popsán Engelem et al. n 50. letech 20. století (Ryan, K.J.; Engel, L.L. Endocrinology 1953, 52, 287). 17pHSDl přednostně reguluje redukci estronu (El) na estradiol (E2) a je přirozeně exprimován zejména v placentě, vaječnících, prsní tkáni, děloze a endometriu. Ve vaječnících katalyzuje produkci E2 z El, v periferních tkáních pak kontroluje hladinu a dostupnost E2 na pre-receptorové úrovni (intrakrinní modulace). V

- 1 CZ 307437 B6 menší míře 17pHSDl katalyzuje také konverzi dehydroepiandrosteronu (DHEA) na 5androsten-3p,17p~diol (A⁵-diol).

Význam pohlavního hormonu E2 v lidském těle spočívá v jeho silné afinitě k estrogenovým receptorům (ER), jejichž prostřednictvím reguluje expresi řady genů (tzv. transkripční faktor). ER se v klidovém stavu nacházejí obvykle v cytosolu v podobě monomerů. Po vazbě E2 na ER jednotky receptorů dimerují, vstupují do buněčného jádra a tam se váží na sekvence DNA označované jako estrogen responzivní jednotky (ERE). Po vazbě komplexu E2-2ER na ERE se aktivuje kaskáda procesů, vedoucí k proliferaci a diferenciaci buněk. Toto množení buněk může být jak fyziologické, tak i patologické, vedoucí ke zhoubnému bujení (Ciocca, D.R.; Fanelli, M.A. Trends Endocrinol Metab. 1997, 8, 313).

Z výše uvedených skutečností vyplývá, že proliferaci a diferenciaci buněk, způsobenou estrogeny, lze regulovat ovlivněním metabolizmu E2. Jednou z možností je zamezení vazby E2 do aktivního místa ER, další možností je blokace syntézy samotného E2 inhibici jednoho či několika enzymů, účastnících se steroidogeneze (17pHSDl, aromatázy, sulfatázy) (Hong, Y.; Chen, S. Mol. Cell. Endocrinol. 2011, 340, 120).

Estrogen senzitivní typy nádorů prsu, ženského pohlavního ústrojí a plic (tzv. non-small-cell lung carcinoma, NSCLC) jsou charakteristické zvýšenou expresí I7PHSD1. Se zvýšenou hladinou E2 je pak spojena řada benigních anomálií. Mezi nejběžnější z nich patří endometrióza (patologická lokalizace děložní výstelky jinde než v dutině děložní), adenomyóza (přesun výstelky děložní dutiny-endometria do vrstvy děložní svaloviny), menoragie (abnormálně silné menstruační krvácení), metroragie (acyklické, dysfunkční krvácení), dysmenorea (bolesti a jiné obtíže provázející menstruaci) a děložní myomy (WO 2008034796 A2).

17pHSD5 je exprimována především ve varlatech, běžně se vyskytuje též v prostatě, játrech a nadledvinkách. Zvýšenou expresi vykazují některé typy tumorů prsní tkáně a prostaty (Dufort et al. Endocrinology. 1999, 140, 568). Mezi ostatními izoenzymy zaujímá 17PHSD5 poněkud zvláštní postavení. Jako jediný z rodiny 17pHSD enzymů patří mezi tzv. aldo-ketoreduktázy, zatímco ostatní typy patří mezi dehydrogenázy/reduktázy typu krátký řetězec. Navíc díky značně prostornému vazebnému místu vykazuje jistou substrátovou multispecifitu. To znamená, že sice přednostně redukuje 4-androsten-3,17-dion na T, dokáže však vázat i některé další estrogeny a androgeny a ovlivňovat jejich konverzi v polohách 3α-, 17β— a 20α-, 17pHSD5 se také podílí na syntéze prostaglandinů (prostaglandin PGF_2a). Bylo prokázáno, že PGF_2a hraje důležitou roli při růstu některých typů nádorů, zejména kolorektálního karcinomu (Qualtrough, D. Int. J. Cancer 2007, 121, 734). Vzhledem k tomu, že byl prokázán vliv 17pHSD5 na progresi jak steroid-senzitivních, tak i nesenzitivních karcinomů, je selektivní inhibice 17PHSD5 dlouhodobě jednou z výzev pro další výzkum.

Nejčastějším nádorovým onemocněním u žen je rakovina prsu. Standardní postup léčby raných stádií estrogen pozitivních typů rakoviny prsu spočívá v operaci a následné adjuvantní chemoterapii. V rámci následné terapie se nejčastěji u premenopauzálních žen podávají selektivní modulátory estrogenových receptorů (ŠERM) jako Tamoxifen, Raloxifen a další. Jedná se o částečné nebo úplné antagonisty ER. U žen po menopauze, jejichž nádor má ER+ status, zůstává Tamoxifen léčivem první volby. V případě ER- tumorů prsu pak bývají vhodnou volbou terapie tzv. SEEM (Selective Estrogen Enzyme Modulators), např. Tibolon či Anastrozol. Tyto látky selektivně ovlivňují příslušné enzymy steroidogeneze, aromatázu, sulfatázu a sulfotransferázu. Nevýhodou dlouhodobé léčby ŠERM i SEEM je častý výskyt závažných nežádoucích účinků. V případě ŠERM se jedná o vaginální krvácení, endometriální karcinom, nutnost hysterektomie, ischemické cerebrovaskulární příhody a venózní tromboembolie (Demissie et al. J. Clin. Oncol. 2001, 19, 322). Po aplikaci SEEM jsou pozorovány zvýšená lámavost kostí, zácpa/průjem, nevolnost a zvracení, poruchy spánku, ůnava/slabost, návaly a pocení, krvácení z pochvy, řídnutí vlasů, změny hmotnosti, deprese a další (Eastell et al. J. Clin. Oncol. 2008, 26, 1051). Podstatná

-2CZ 307437 B6 část tumorů prsní tkáně vykazuje zvýšenou expresi 17pHSDl. Předpokládá se, že modulací činnosti 17PHSD1 by bylo možné ovlivnit lokální hladinu E2 v postižené tkáni a docílit tak regulace růstu nádorové tkáně. Žádný 17PHSD1 inhibitor prozatím neprošel klinickými zkouškami.

Léčba rakoviny prostaty je založena na snížení hladiny androgenů. Toho lze dosáhnout chirurgickou nebo farmakologickou (hormonální) kastrací, případně jejich vhodnou kombinací. Hormonální léčba spočívá buď v zastavení produkce testosteronu varlaty (LHRH-analoga gonadotropinů), nebo v blokaci androgenního receptorů v prostatické buňce antiandrogeny (např. cyproteron acetát). I u antiandrogenní terapie jsou nežádoucí účinky značné, zahrnují především impotenci, návaly horkosti, gynekomastii, mastodynii, dále zažívací obtíže, depresi, únavu, malátnost a další. Také podstatná část tumorů prostaty vykazuje zvýšenou expresi 173HSD5. Předpokládá se, že modulací činnosti 17PHSD5 by bylo možné ovlivnit lokální hladinu T v postižené tkáni a docílit tak regulace růstu nádorové tkáně.

V literatuře je popsána celá řada inhibitorů 17PHSD. Značný důraz je přitom kladen na přípravu selektivních, reverzibilních inhibitorů 17PHSD1 s minimálním nebo žádným estrogenním efektem. Přestože výzkum v této oblasti je velmi intenzivní a zahrnuje nespočet in vitro a in vivo studií, doposud se žádný selektivní inhibitor 173HSD1 nedostal do klinické fáze testování jako potenciální terapeutikum na léčbu estrogen-dependentních typů onemocnění (Poirier, D. Expert Opin. Ther. Patents 2010, 20, 1123).

Inhibitory 17PHSD1 a 173HSD5 lze ze strukturního hlediska rozdělit do dvou velkých skupin, a to na inhibitory nesteroidní povahy a inhibitory na bázi steroidů. Vzhledem k tomu, že předkládaná přihláška vynálezu popisuje inhibitory, jež jsou deriváty estronu, bude dále diskutována pouze skupina steroidních inhibitorů 173HSD1 a 17PHSD5. Na téma 17PHSD inhibitorů bylo publikováno několik souhrnných článků (Penning, T.M.; Ricigliano, J.W. J. Enzyme. Inhib. 1991, 5, 165; Poirier, D. Curr. Med. Chem. 2003, 10, 453; Brožič et al. Curr. Med. Chem. 2008, 15, 137; Poirier, D. Anti-cancer Agents Med. Chem. 2009, 9, 642; Day et al. Minerva Endocrinol. 2010, 35, 87).

Následující přehled bude zaměřen na vývoj v oblasti inhibitorů 173HSD1 především od roku 1990 do současnosti. Inhibiční aktivita vůči 173HSD1 byla testována u derivátů progestinu, např. nomegestrol acetátu, medrogestonu, tibolonu a jejich metabolitů, za použití rakovinných linií MCF-7 a T-47D (estrogen-dependentní typy rakoviny prsu) při fyziologické hladině El. Inhibitory nebyly selektivní vůči 173HSD1 (např. Chetrite et al. J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 1996, 58, 525; Chetrite, G.S.; Pasqualini, J.R. J. Steroid Biochem. Molec. Biol. 2001, 76, 95; Shields-Botella et al. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 2005, 93, 1). Testován byl i účinek Dydrogesteronu (Duphaston®) a jeho 20-dihydro metabolitů vzhledem ke konverzi El na E2. (Chetrite, G.S. et al. Anticancer Res. 2004, 24, 1433).

Série sedmnácti estratrienů fluorovaných v poloze C-17 byla připravena Delucou et al. a byla testována vzhledem k inhibiční aktivitě vůči pěti izoformám 173PHSD (1, 2, 4, 5, 7). Látky vykazovaly průměrnou inhibiční aktivitu vůči 173HSD1 a mizivou selektivitu vůči ostatním testovaným izoformám. Studium estrogenního potenciálu látek nebylo předmětem této studie (Deluca et al. Mol. Cell. Endocrinol. 2006, 248, 218).

Série různě substituovaných látek na bázi E2 s inhibiční aktivitou vůči 173HSD1 (testovány i izoformy 2 a 3) byla připravena ve skupině D. Poiriera. Inhibitor, nesoucí na uhlíku C-6 butyl(methyl)thiaheptanamidový substituent, vykázal 40% inhibiční aktivitu při koncentraci 0,1 pmol-l ¹ (Poirier et al. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998, 64, 83). Následně byly připraveny i tzv. duální inhibitory, nesoucí současně dva farmakofory v pozici C-16. Nejlepší z připravených derivátů vykazoval i antiestrogenní účinky (Pelletier et al. Steroids 1994, 59, 536; Tremblay, M.R.; Poirier, D. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 11996, 2765).

-3 CZ 307437 B6

Připraveny byly i hybridní inhibitory se steroidním skeletem, mající na uhlíku C-16 postranní řetězec různé délky nesoucí adenosin. Nejlepší látka EM-1745 je vynikajícím kompetitivním, reverzibilním inhibitorem (Qiu et al. FASEB J. 2002, 16, 1829; Poirier et al. Synt. Commun. 2003, 33, 3183). V roce 2005 byly popsány nové série selektivních hybridních inhibitorů 17PHSD1 (testován ještě izoenzym ]7pHSD2). Jednalo se o deriváty El (nebo 2—ethyl—El), nesoucích v poloze C-16 skupinu -CH2CONHR. Nejlepší z připravených látek vykazovaly koncentraci látky nutnou k 50% inhibici, tj. IC₅o, v rozmezí 27 až 37 nmolT¹ při koncentraci El = 2 nmol-Γ¹ (Lawrence et al. J. Med. Chem. 2005, 48, 2759). Souběžně byly vyvíjeny i inhibitory s C-16oc-bromalkylovou a C-16[3-bromalkylovou skupinou. Látky sice byly potentními inhibitory 17PHSD1, byly však estrogenní. Estrogenicitu se podařilo později odstranit modifikací steroidního skeletu v pozici C-7, tato modifikace ovšem vedla ke zhoršení inhibiční aktivity (Tremblay, M.R.; Poirier, D. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 1998, 66, 179; Blomquist et al. Endocrinol. 1997,153, 453; Tremblay et al. Steroids 2001, 66, 821). Dalšími modifikacemi C-16 postranního řetězce steroidního skeletu bylo připraveno velké množství látek typu enonů, enolů, fenolů, sulfamátů a nasycených alkoholů. Zlepšení inhibiční aktivity vůči 173HSD1 však nebylo dosaženo (Ciobanu, L.C.; Poirier, D. Chem. Med. Chem. 2006,1, 1249).

Studována byla také E1/E2 derivatizace v polohách C-7, C-16, C-17. Připraveny byly deriváty El s pyrazolovým, nebo isoxazolovým kruhem, jehož součástí byla C-C vazba mezi uhlíky C-16 a 17 (Sweet et al. Biochem. Biophys. Res. Comm. 1991, 180, 1057); testovány byly také série derivátů E1/E2 nesoucích substituovaný pyrazolový kruh, jehož součástí byla C-C vazba mezi uhlíky C-16 a 17. Hodnoty IC₅₀ derivátů El-C16-methylkarboxyamidů se pohybovaly v rozmezí od desítek nmol-Γ¹ (Allan et al. J. Med. Chem. 2006, 49, 1325). U skupiny N- a Csubstituovaných 1,3,5( 10)-estratrien-[l 7,16-c]-pyrazolových derivátů byla inhibiční aktivita horší, pohybovala se ve stovkách nmol-Γ¹. A-substituce pyrazolového kruhu však potlačuje estrogenicitu těchto derivátů. Později připravené deriváty měly řádově lepší hodnoty IC₅₀stanovené na T-47D buňkách (W02004085457; Vicker et al. Chem. Med. Chem. 2006, 1, 464). Souhrnně je E1/E2 derivatizace v polohách C-7, C-16, C-17 a biologická aktivita nejslibnějších inhibitorů diskutována v práci (Purohit et al. Mol. Cell. Endocrinol. 2006, 248, 199).

Testována byla také E1/E2 derivatizace v polohách C-3, C-16, C-17. Nejlepším z testovaných inhibitorů 173HSD1 byl 16p-»j-carbamoylbenzyl-E2 (E2B), schopný redukovat proliferaci indukovanou fyziologickou hladinou El v T-47D ER+ buňkách o 62 %. Růst buněk nebyl zastaven ze 100 %, protože látka sama vykázala slabou estrogenicitu (Laplante et al. Bioorg. Med. Chem. 2008,16, 1849). Proto byl připraven její 16p,17p-y-lakton. Látka nebyla estrogenní, ale její inhibiční aktivita vůči 17PHSD1 signifikantně klesla. Derivát E2B, který namísto 3-OH skupiny nesl bromethylový řetězec, prokázal, že pro úspěšnou inhibici 173HSD1 není nezbytná přítomnost 3-OH skupiny na kruhu A steroidního skeletu. Tato látka není estrogenní, je kompetitivním irreverzibilním, selektivním inhibitorem a byla testována in vivo na myším xenograft modelu s buňkami T-47D Bylo prokázáno, že při dávce 250 pg/den/myš se nádor po 32 dnech zmenšil o 74 % (WO2012129673, Ayan et al. Mol. Cancer. Ther. 2012, 11, 2096; Maltais et al. J. Med. Chem. 2014, 57, 204).

Messinger et al. připravili rozsáhlou série C—15α/β—El derivátů, z nichž některé měly v poloze C-3 hydroxylovou skupinu, některé její methylether, a vykázaly vynikající inhibiční aktivitu. Selektivita ani estrogenicita nebyla diskutována (Messinger et al. Mol. Cell. Endocrinol. 2009, 301, 216; WO 2005047303, US 20050192263). Stejní autoři patentovali také 17difluorestratrieny substituované v poloze C—15 řetězcem, nesoucím ve většině případů amidickou funkční skupinu (WO 2006125800, US 20060281710). Opět se jedná o početnou skupinu látek s vysokou inhibiční aktivitou, většinou dostatečně selektivních vůči 17PHSD1 (WO 2008065100). Autoři popsali metodu měření estrogenicity, nicméně estrogenicita není v dokumentu kvantifikována. Série estratrienů, substituovaných v poloze C-15 deriváty triazolu, je popsána v WO 2008034796 a US 20080146531. Jedná se o velice početnou skupinu látek s vynikající

-4CZ 307437 B6 inhibiční aktivitou kolem 90 % při koncentraci 1 pmol-l Vybrané deriváty jsou selektivní inhibitory 17pHSDl (testovány ještě izoenzymy 173HSD2 a 3). Estratrieny substituované v poloze C-15 deriváty triazolu, se steroidním skeletem modifikovaným v polohách C-2, 3, 4, 15 a 17, představují selektivní inhibitory 17pHSDl (WO 2014207311, WO 2014207309, WO 2014207310).

Mezi inhibitory 17PHSD1 patří také C-2-D-homo-E 1 deriváty; nejaktivnějším je 2-fenethyl-Dhomo-El s IC₅₀ = 15 nmol-Γ¹ (Moller et al. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, 6740; WO 2006003012).

Nové 2-substituované estra-l,3,5(10)-trien-17-ony jsou popsány v patentu US 7419972 (WO 2006003013). Jejich inhibiční aktivita vzhledem k 17pHSDl je charakterizována hodnotami IC₅₀, které se pohybují v rozmezí desítek až sta nmol-1¹.

Pokud je nám známo, až do současnosti jsou C-15 deriváty estronu jako inhibitory 17PHSD1 předmětem pouze několika výše uvedených patentů Solvay Pharmaceuticals (J. Messinger) a Forendo Pharma LTD (L. Hirvela) a jedné publikace (Messinger et al. Mol. Cell. Endocrinol. 2009, 301, 216-224).

Ve všech uvedených případech se jedná o strukturně velmi podobné látky, které se však od námi předkládaných derivátů podstatně liší. Nyní předkládané deriváty vykazují výhodnější a komplexnější soubor biologických vlastností.

Inhibitory 17PHSD5

Připraveny byly C-3,17 a 18-oxiranové steroidní deriváty, ovšem jejich inhibiční aktivita ani selektivita prozatím nebyla publikována (Penning et al. Molec. Cell. Endocr. 2001, 171, 137). Selektivní inhibice 17pHSD5 byla popsána u derivátu J2404 (Deluca et al. Mol. Cell. Endocrinol. 2006, 248, 218). Z testované série spirolaktonů byl nej lepším kompetitivním a selektivním inhibitorem derivát EM 1404 (3-carboxamido-l,3,5-( 10)-estratrien-l 7(7?)-spiro-2(5,5-dimethyl-6-oxo)tetrahydro-pyran) s IC₅₀ = 3,2 nmol-Γ¹ a Kj = 6,9 nmol-Γ¹ (Qiu et al J. Biol. Chem. 2007, 282, 8368; WO 9946279).

Obdobný spirolakton připravený Bydalem et al., 3-deoxyestradiol s C-17-dimethyI-spiro-6laktonem vykazoval IC₅₀ = 2,9 nmol-Γ¹. Látka je jen zanedbatelně estrogenní a není androgenní, ale selektivita vůči jednotlivým izoenzymům není diskutována (Bydal et al. Eur. J. Med. Chem. 2009, 44, 632). Zveřejněna byla také syntéza dvou sérií C-l 7-spirolaktonových derivátů androstanu. Látky se neváží na ER ani nevykazují androgenní aktivitu, 173HSD5 inhibují v rozmezí 54 až 73 % při koncentraci 0,3 pmol-L¹ (Djigoué et al. Molecules 2013, 18, 914). Bothem a spoluautory byla nedávno představena série estra-l,3,5(10), 16-tetraen-3karboxamidových derivátů (WO 2013045407, WO 2014128108). Látky nesou v poloze C-17 různě substituovaný pyridinový kruh a byly představeny jako inhibitory 17PHSD5, IC50 < 50 nmol-Γ¹. Syntézu a použití C-3 substituovaných estra-1,3,5( 10), 16-tetraenů s obdobnou hodnotou IC50 předkládá WO 2014009274.

Podstata vynálezu

Tato přihláška vynálezu předkládá skupinu nových C-15 derivátů estronu, které zcela specificky inhibují pouze izoenzymy 17[3-HSD1 a/nebo 17p-HSD5, aniž by současně při dané koncentraci ovlivňovaly ostatní testované izoenzymy, konkrétně 17(3-HSD typu 2, 3,4, 7.

Předmětem vynálezu jsou 15[3-substituované deriváty estronu obecného vzorce I,

-5CZ 307437 B6

kde:

substituenty R¹, R², R³, R⁴, R⁵ jsou nezávisle na sobě zvoleny ze skupiny zahrnující: C]-C4 alkyl, C,-C4 alkoxy, C|-C4 halogenalkyl, halogen, COOR⁶, kde R⁶ je Ci~C4 alkyl; H, OH;

popřípadě R¹ a R² spolu dohromady tvoří aryl, výhodně nafityl, a pak jsou R³, R⁴ a R⁵ každý tvořen vodíkovým atomem;

přičemž aromatický kruh v poloze C-15 může být mono-, di-, tri-, tetra- i penta-substituovaný uvedenými substituenty R¹ až R⁵.

Alkyl je lineární nebo rozvětvený C| až C₄ alkylový řetězec, tedy methyl, ethyl, propyl, isopropyl či butyl.

Alkoxy je skupina -OR_a, kde R_a je alkyl.

Aryl je uhlovodíková skupina obsahující 6 až 10 uhlíkových atomů a alespoň jeden aromatický kruh. S výhodou je aryl vybrán ze skupiny zahrnující fenyl, benzyl, nafityl; aryl může být nesubstituovaný nebo substituovaný 1 až 5 substituenty, vybranými ze skupiny zahrnující -OH, halogen, Ci až C₄ alkyl, C| až C₄ alkoxyl, -CN a -COORb, kde Rb je vodík nebo Ci až C₄ alkyl.

Halogen je vybrán ze skupiny zahrnující -F, -Cl, -Br, -I.

V rozsahu uvažovaných terapeutických koncentrací nemají předkládané sloučeniny estrogenní ani toxický účinek. Vybrané deriváty navíc vykazují vlastností ER/AR antagonistů a/nebo antiproliferační účinek in vitro.

Předkládané látky vykazují jedinečný soubor vlastností, díky nimž mohou být využitelné v terapii a diagnostice estrogen-dependentních onemocnění. Jsou selektivními inhibitory 17pHSD, nemají estrogenní účinek a nejsou obecně cytotoxické. Selektivní inhibici skupiny enzymů 17β— hydroxysteoid dehydrogenáz (173HSD), majících mají klíčovou roli při tvorbě biologicky aktivních estrogenů a androgenů, mohou zásadně ovlivnit četné pochody v těle, především proliferaci a diferenciaci buněk.

Nadměrná exprese sledovaných izoenzymů zrady 17PHSD, a tedy nadměrná produkce 17β— hydroxysteroidů v tkáních, souvisí s výskytem takových estrogen/androgen - dependentních onemocnění, jako jsou tumory prsní tkáně, vaječníků, endometria, prostaty, kolorektální karcinom, karcinom plic, spinocelulární karcinom, ale i nenádorové poruchy typu akné, hirsutismu, pseudohermafroditismu a mnohé další. Selektivní inhibice aktivity jednotlivých isoenzymů tedy může přispět k léčbě těchto onemocnění. Stanovení míry exprese příslušných typů HSD v postižených tkáních pak poskytuje markér pro jejich včasnou diagnostiku.

Sloučeniny podle vynálezu byly výhodně připraveny novým způsobem, jímž je křížová metatetická reakce derivátů 15[3-vinylestronu s příslušnými alkeny za katalýzy komplexy

-6CZ 307437 B6 ruthenia v organických rozpouštědlech. Následné dva syntetické kroky pak využívají běžné postupy k získání cílové molekuly.

Strukturním základem předkládaných sloučenin je 3-hydroxy-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (estron), u něhož je použito následující číslování uhlíkových atomů:

Příklady uskutečnění vynálezu

Seznam zkratek

[a]o	specifická rotace
δ	chemický posun
σ	směrodatná odchylka
A549	lidský adenokarcinom plic
Ac	acetyl
AKR	aldo-ketoreduktázy
APCI	chemická ionizace za atmosférického tlaku
AR	androgenní receptor
b	broad (široký) signál v NMR spektru
BJ	lidské fibroblasty
Bu	butyl
cDNA	komplementární DNA (DNA vzniklá zpětným přepisem z RNA do DNA)
CEM	T-lymfoblastická leukémie
CEM-DNR-bulk	T-lymfoblastická leukémie rezistentní na doxorubicin
CHO	křeččí karcinom ovária
d	dublet
DHEA	dehydroepiandrosteron
DMEM	Eaglovo médium modifikované podle Dulbecca
DMSO	dimethylsulfoxid
DNA	deoxyribonukleová kyselina
El	estron
E2	estradiol
E3	estriol
ekv	ekvivalent
ER	estrogenní receptory
ERE	úsek DNA, na který se váže estrogenový receptor, aktivovaný vazbou estrogenu (estrogen response element)
ESI	ionizace elektrosprejem
EST	estrogen sulfotransferáza
Et	ethyl
FBS	fetální hovězí sérum
HCT116p53	wt lidská rakovina tlustého střeva, wild-type
HCT116p53-/-	lidská rakovina tlustého střeva, mutant p53
HMPA	hexamethylfosfortriamid
HPLC	vysokoúčinná kapalinová chromatografie

HR-MS HSD IC₅₀

IČ J

K562 K562-Tax LHRH m

MCF-7 Me MRC7 MTT test NAD(P) NMR NSCLC P450 p53 PGF_2apGL4

PgP PgR ppm q Rf s SDR SEEM SERD ŠERM SHBG SPE STS t

T-47D TBAF TBS TES THF TLC TMS tR tt

U2OS

UV hmotnostní spektrometrie s vysokým rozlišením hydroxysteroiddehydrogenázy koncentrace látky, nutná k 50% inhibici infračervená spektroskopie interakční konstanta lidská myeloidní leukémie lidská myeloidní leukémie rezistentní vůči taxolu hormon, řídící uvolňování luteinizačního hormonu (LH) multiplet buněčná linie odvozená z lidského prsního karcinomu methyl lidské fíbroblasty kolorimetrický test stanovení životnosti buněk nikotinamidadenindinukleotid(fosfát) nukleární magnetická rezonance nemalobuněčný karcinom plic cytochrom P450 tumor supresorový gen prostaglanin F2a luciferázový reporterový vektor protein mnohočetné lékové rezistence progresteronový receptor dílů či částic najeden milion (parts per million) kvadruplet retardační faktor singlet dehydrogenázy typu krátký řetězec selektivní modulátor enzymů steroidogeneze selektivní deregulátor estrogenních receptorů selektivní modulátor estrogenních receptorů globulin, vázající pohlavní hormony extrakce na pevné fázi sulfatáza testosteron triplet buněčná linie odvozená z lidského prsního karcinomu tetrabutylammonium fluorid z-butyldimethylsilyl triethylsilyl tetrahydrofuran chromatografie na tenké vrstvě trimethylsilyl retenční čas teplota tání buňky lidského osteosarkomu ultrafialové záření wt

A⁵-diol wild type androstendiol (androst-5-en-3p,17P-diol)

Syntetické postupy 'H NMR spektra byla měřena při teplotě 24 °C a při frekvenci 400 MHz na spektrometrech Bruker AVANCE-400 a 500 v deuterochloroformu nebo deuteromethanolu, s tetramethylsilanem jako vnitřním standardem. Chemické posuny jsou udány v ppm (δ-stupnice), interakční konstanty (./) jsou udány v Hz. Multiplicity signálů jsou označeny následovně: s - singlet, d

-8CZ 307437 B6 dublet, t - triplet, q - kvadruplet, m - multiplet, písmeno b označuje široký signál (broad). Body tání byly změřeny na přístroji Kofler. Optická rotace byla měřena polarimetrem Autopol IV (Rudolf Research Analytical, Flanders, USA), [a]_D hodnoty jsou uvedeny v 10 ^l.deg.cm²g ^l a byly kompenzovány na standardní teplotu 20 °C. Infračervená spektra byla měřena v roztocích vzorků nebo v tabletách bromidu draselného pomocí spektrometru Bruker 1FS 55, vlnočty jsou udány v cm“¹. Hmotnostní spektra byla měřena na spektrometrech ZAB-EQ (při 70 eV) nebo LCQ Classic (Thermo Finnigan). HPLC chromatografie byla prováděna na přístroji Waters 600 s detektorem s diodovým polem PDA 2996. Fluká 60 silica gel byl používán na sloupcovou chromatografií, pro tenkovrstvou chromatografií (TLC) byly používány aluminiové desky potažené vrstvou 60 FB₂54b silikagelu. Pro vizualizaci TLC byly využívány roztoky KMnO₄ a fosfomolybdenové kyseliny a UV detekce.

Syntéza výchozí látky

Příklad 1: 3-(/-butyldimethylsilyloxy)-estra-l,3,5(10),15-tetraen-17-on (1)

Enon 1 byl připraven v souladu s publikovanou metodou (Sakakibara, M.; Uchida, A.O. Biosci. Biotech. Biochchem 1996, 60, 3, 405) Saegusovou oxidací v 75% výtěžku: tt 148 °C; [a]_D -37,4 (c 0,203; CHCI3); 'H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 0,19 (s, 6H, Si-(CH3)₂), 0,98 (s, 9H, (CHjjj-C),

I, 11 (s,3H, H-18), 1,55 (m, 1H, H-7a), 1,66-1,85 (m, 3H, H-8, 11a, 12a), 2,01 (m, 1H, H-12b), 2,18 (dm, 1H, J = 12,9 Hz, H-7b), 2,33 (m, 1H, H-9), 2,43 (m, 1H, H-l la), 2,50 (dm, 1H, J =

II, 6 Hz, H-l4), 2,87-2,96 (m, 2H, H-6), 6,08 (dd, 1H, J = 6,0; 3,2 Hz, H-l6), 6,59 (bd, 1H, J = 2,7 Hz, H-4), 6,64 (dd, 1H, J= 8,5; 2,7 Hz, H-2), 7,12 (d, 1H, J = 8,5 Hz, H-8), 7,63 (dd, 1H, J = 6,0; 1,9 Hz, H-l 5); ^l3C NMR (150,9 MHz, CDC13) δ -4,41 (SHCH3)2), 181,5 (CACH^E), 20,97 (C—18), 25,34 (C-l 1), 25,67 (C-(C ^)3), 26,68 (C-7), 29,08 a 29,19 (C-6, 12), 35,48 (C8), 45,15 (C-9), 51,46 (C-13), 56,13 (C-14), 117,33 (C-3), 120,01 (C^l), 125,82 (C-l), 131,87 (C-l6), 132,28 (C-l0), 137,31 (C-5), 153,58 (C-3), 158,26 (C-l 5), 213,09 (C-l 7); IČ (CHC13) v 3076, 3050, 3029, 2960, 2932, 2897, 2860, 1705, 1615, 1607, 1569, 1497, 1472, 1463, 1443, 1436, 1417, 1391, 1371, 1363, 1258, 1186, 1104, 1005, 941, 885, 697, 582, 449 cm“¹; HR-MS (ESI) vypočítaná pro C24H₃4O₂SiNa [M+Na⁺] 405,22203 nalezená 405,22212. R<7/1 hexan/EtOAc) = 0,6.

Příklad 2: 3-(/-butyldimethylsilyloxy)-15P-vinyl-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (2)

TBSO

(2)

Pokud je nám známo, příprava 15[3-vinylestronu je publikována pouze v WO 200834796. Tuto metodu jsme pozměnili tím, že místo r-butyldimethylsilylové chránící skupiny (poskytující výtěžek reakce 24 %) byla nyní použita skupina benzylová. Podařilo se tak podstatně zvýšit výtěžky vinylestronu 2, které po krystalizaci z EtOAc reprodukovatelně převyšují 90 %. Směs 1 mol l“¹ roztoku vinylmagnesiumbromidu v THF (13 ml, 13,08 mmol), Cul (65 mg, 0,654 mmol)

-9CZ 307437 B6 a HMPA (2,8 ml, 15,7 mmol) v CH₂C1₂ (50 ml) a inertní atmosféře argonu byla ochlazena na teplotu -78 °C. K této směsi byl po kapkách přidán roztok enonu 1 (2,5 g, 6,54 mmol) a TMSC1 (1,7 ml, 13,08 mmol) v CH₂CI₂ (50 ml). Reakční směs byla poté pozvolna zahřátá na teplotu místnosti a míchána do druhého dne. Po přidání vody a přikapání 1 mol-1 ¹ HC1 byla směs míchána ještě 5 minut, poté naředěna CH2CI2 a promyta vodou. Spojené organické fáze byly promyty nasyceným roztokem NaCl, vysušeny pomocí MgSO4 a odpařeny za sníženého tlaku. Po chromatografii na silikagelu ve směsi (1/1 hexan/CH2Cl2) bylo získáno 2,5 g vinylestronu 2 v 92% výtěžku ve formě bílé krystalické látky: tt 141 °C; [a]D +52.7 (c 0,186; CHCf); *H NMR (500 MHz, CDC13) δ 0,19 (s, 6H, Si-(CH3)2), 0,98 (s, 9H, (CHjjj-C), 1,03 (s, 3H, H-18), 1,411,56 (m, 3H, H-7a, 11a, 12a), 1,72-1,83 (m, 2H, H-8, 14), 1,90 (m, 1H, H-12b), 2,15 (m, 1H, H-7b), 2,28 (m, 1H, H-9), 2,36 (m, 1H, H-l la), 2,52 (dd, 1H, J = 19,5; 9,0 Hz, H-l6b), 2,63 (dd, 1H, J = 19,5; 2,2 Hz, H-l6a), 2,80-2,92 (m, 2H, H-6), 3,13 (m, 1H, H-l 5), 5,13 (dt, 1H, J = 10,4; 1,6 Hz, H-2b’), 5,17 (dt, 1H, J= 17,2; 1,6 Hz, H-2a'), 6,10 (ddd, 1H,J = 17,2; 10,4; 6,7 Hz, H-l'), 6,58 (dm, 1H,J = 2,7 Hz, H^l), 6,62 (dd, 1H,J=8,4; 2,7 Hz, H-2), 7,11 (dd, 1H,J = 8,6; 0,9 Hz, H-l); ¹³C NMR (150,9 MHz, CDCI3) δ -4,40 (Si-fCHQ?), 16,87 (C-l8), 18,17 (C(CH₃)₃), 25,48 (C-l 1), 25,70 (C-(CH3)₃), 26,31 (C-7), 29,24 (C-6), 33,38 (C-12), 35,94 (C-8), 37,10 (C—15), 41,75 (C—16), 44,50 (C-9), 47,69 (C-13), 52,69 (C-14), 115,96 (C-2'), 117,24 (C-2), 119,98 (C^l), 125,85 (C-l), 132,63 (C-10), 137,62 (C-5), 139,00 (C-l’), 153,54 (C-3), 220,40 (C-l 7); IR (CHCI3) v 3080, 2960, 2932,2895, 2860, 1732, 1637, 1607, 1570, 1497, 1472, 1463, 1442, 1435, 1419, 1404, 1391, 1377, 1362, 1256, 1186, 1159, 1100, 1008, 1000, 941,922, 883, 841, 806, 697, 586, 447 cm¹; HR-MS (ESI) vypočítaná pro C26H38O2SiNa [M+Na⁺] 433,25333 nalezená 433,25330. Rz(7/1 hexan/EtOAc) = 0,5.

a) Obecný postup metatéze vinylestronu s různými olefiny

K. roztoku vinylestronu 2 (100 mg, 0,244 mmol) a druhého olefinu (0,488 mmol) ve směsi rozpouštědel CH₂Cl₂/trifluorotoluen (21 ml, 2/1) byl přidán rutheniový katalyzátor (Sigma Aldrich, katalogové číslo 569755) Hoveyda-Grubbs druhé generace (15 mg, 0,024 mmol) a Cul (5 mg, 0,024 mmol) v inertní atmosféře argonu a výsledná směs byla míchána při teplotě 40 až 70 °C, nejlépe 65 °C po dobu 4 až 12 h, s pak výhodou po dobu 4 h. Po dalším přídavku druhého olefinu (0,488 mmol) a katalyzátoru (7,5 mg, 0,012 mmol) byla směs dále míchána při stejné teplotě přes noc. Poté byla reakce ukončena odpařením rozpouštědel za sníženého tlaku. Po chromatografii na silikagelu (hexan/EtOAc 95/5) byl získán produkt zkřížené metatéze. Výtěžky metatezí vinylestronu 2 s různými olefiny se u většiny připravovaných látek pohybovaly v rozmezí 56 až 98 %.

b) Odstranění TBS skupiny z hydroxylové skupiny v poloze C-3 derivátů

K produktu metatéze, rozpuštěnému v THF, byl postupně za teploty místnosti přikapán roztok TBAF, 1 mol-L¹ v THF (lekv). Po 1 h byla přidána voda a reakční směs byla extrahována CH2C1₂ a/nebo CHCI3. Spojené organické fáze byly promyty nasyceným roztokem NaCl, vysušeny pomocí MgSO₄ a rozpouštědla byla odstraněna za sníženého tlaku. Chromatografii na silikagelu byl získán finální odchráněný produkt. Výtěžky reakce vždy převýšily 90 %.

c) Redukce dvojné vazby

Baňka s roztokem odchráněného produktu metatéze a katalyzátoru Pd/C (10 hmotn. %) v EtOAc byla za vydatného míchání evakuována a posléze naplněna vodíkem. Reakční směs byla vždy míchána přes noc. Průběh reakce byl monitorován pomocí TLC, k vizualizaci bylo využíváno roztoku KMnO₄, který selektivně detekuje dvojnou vazbu vedle jednoduché. Navíc výchozí látky byly obvykle viditelné pod UV lampou při vlnové délce 254 nm, zatím co redukované produkty již při téže vlnové délce viditelné nebyly. Hodnoty R_z výchozí látky a produktu hydrogenace byly vždy stejné. Reakční směs byla po zreagování výchozí látky zfiltrována přes Celit (filtrační křemelina SiO₂), rozpouštědla byla odstraněna za sníženého tlaku a chromatografii na HPLC

- 10CZ 307437 B6 (AcCN/H₂O) byly získány finální bezbarvé, krystalické produkty. Výtěžky reakce byly vždy vyšší než 90 %.

Příklad 3: 3-hydroxy-15[3-fenethyl-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (3)

(3)

Látka 3 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 se styrenem (56 μΐ). Po chromatografii na HPLC (30/70 AcCN/H₂O, t_R = 15 min) bylo získáno 36 mg bezbarvé pevné látky 3 (číslování postranního C—15 řetězce je ve všech následujících příkladech stejné jako u derivátu 3): mp 153 °C; [a]_D +52,6 (c 0,547; CHCf); 'H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 1,03 (s, 3H, H-l8), 1,35-1,55 (m, 3H, H-7a, 1 la, 12a), 1,62-1,76 (m, 3H, H-8, 14, l’a), 1,86-1,97 (m, 3H, H-7a, 12b, l'b), 2,25 (m, 1H, H-9), 2,30-2,38 (m, 2H, H-llb, 15), 2,40 (dd, 1H, J= 19,3; 2,8 Hz, H-l6a), 2,49 (dd, 1H,J= 19,3; 8,1 Hz, H-l 6b), 2,54 (ddd, IH, .7 = 13,6; 9,2; 7,1 Hz, H-2'a), 2,75 (ddd, 1H, J = 13,6; 9,8; 5,2 Hz, H-2'b), 2,80-2,93 (m, 2H, H6), 4,82 (bs, 1H, OH), 6,59 (dm, 1H, J = 2,8 Hz, H-4), 6,63 (ddm, 1H, J = 8,4; 2,8 Hz, H-2), 7,13 (dd, 1H, J = 8,5; 1,1 Hz, H-l), 7,18 (m, 2H, H-2), 7,21 (m, 1H, H-4), 7,30 (m, 2H, H3); ^,3C NMR (150,9 MHz, CDC13) δ 17,71 (C-18), 25,47 (C-l 1), 26,57 (C-7), 29,30 (C-6), 33,09 (C-l'), 33,73 (C-l5), 33,82 (C-12), 35,80 (C-2’), 35,91 (C-8), 42,70 (C-16), 44,47 (C-9), 47,19 (C-l3), 52,77 (C-l4), 112,70 (C-2), 115,22 (C^l), 126,04 (C^l), 126,16 (C-l), 128,41 (C-2), 128,46 (C-3), 132,33 (C-10), 138,00 (C-5), 141,65 (C-l), 153,54 (C-3), 221,37 (C17); 1Č (CHCf) v 3599, 3413, 3086, 3064, 3027, 2929, 2861, 1729, 1603, 1585, 1499, 1454, 1465, 1378, 1261, 1178, 1166, 1151, 1124, 1030, 903,701,472 cm’¹; HR-MS (APCI) vypočtená pro C26H₃₀O₂Na [M+Na⁺] 397,21380 nalezená 397,21384. R_z (4/1 hexan/EtOAc) = 0,4.

Přiklad 4: 3-hydroxy-15fi-(4-(trifluormethyl)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (4)

(4)

Látka 4 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 4(trifluormethyl)styrenem (72 μΐ). Po chromatografii na HPLC (30/70 AcCN/H₂O, t_R= 19 min) bylo získáno 24 mg bezbarvé pevné látky 4: mp 168 °C; [a]_D +51,5 (c 0,136; CHC1₃); ’H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 1,03 (s, 3H, H-18), 1,37-1,55 (m, 3H, H-7a, 11a, 12a), 1,60-1,76 (m, 3H, H-8, 14, l'a), 1,83-1,97 (m, 3H, H-7a, 12b, l’b), 2,26 (m, 1H, H-9), 2,30-2,38 (m, 2H, H-llb, 15), 2,41 (dd, 1H, J = 19,4, 2,5 Hz, H-l 6a), 2,47 (dd, 1H, J = 19,4; 8,5 Hz, H-l 6b), 2,60 (bddd, 1H, J= 13,8; 9,0; 7,3 Hz, 2'a), 2,81 (bddd, 1H, J= 13,7; 9,8; 5,3 Hz, 2'b), 2,82-2,92 (m, 2H, H6), 4,91 (s, 1H, OH), 6,59 (bd, 1H, J= 2,8 Hz, H-4), 6,64 (bdd, 1H, J= 8,5; 2,8 Hz, H-2), 7,13 (bd, 1H, J= 8,5 Hz, H-l), 7,29 (m, 2H, H-2), 7,56 (m, 1H, H-3); ^l3C NMR (150,9 MHz, CDCf) δ 17,72 (C-18), 25,43 (C-ll), 26,60 (C-7), 29,24 (C-6), 32,82 (C-Γ), 33,71 (C-15), 33,80 (C-12), 35,59 (C-2'), 35,87 (C-8), 42,54 (C-16), 44,43 (C-9), 47,18 (C-13), 52,70 (C14), 112,75 (C-2), 115,21 (C^), 124,24 (q, = 271,7 Hz, CF₃), 125,40 (q, ./ * = 3,8 Hz, C-3), 5 126,15 (C-l), 128,46 (q, f~^T= 32,4 Hz, C-4), 128,71 (C-2), 132,21 (C-10), 137,88 (C-5),

145,73 (q,./' = 1,3 Hz, C-l), 153,61 (C-3), 220,97 (C-17); ^l9FNMR(470,3 MHz,CDCI3)658,46; IČ (CHC13) v 3598, 3433, 3060, 2938, 2864, 1730, 1618, 1560, 1466, 1453, 1418, 1377, 1326, 1249, 1167, 1128, 1108, 1068, 1095, 1057, 1019, 834, 611, 446 cnf¹; HR-MS (APCI) vypočtená pro C27H₂₉O₂F₃Na [M+Na⁺] 465,20119 nalezená 465,20102. R/(4/l hexan/EtOAc) = 10 0,4.

Příklad 5: 3-hydroxy-15P-(4-(fluor)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (5)

(5)

Látka 5 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 4fluorstyrenem (58 μΐ). Po chromatografii na HPLC (30/70 AcCN/H₂O, t_R= 21 min) bylo získáno 26 mg bezbarvé pevné látky 5: mp 164 °C; [a]_D +33,8 (c 0,222; CHCI₃); 'H NMR (500 MHz, 20 CDC1₃) δ 1,03 (s, 3H, H-l 8), 1,34-1,56 (m, 3H, H-7a, 11a, 12a), 1,58-1,77 (m, 3H, H-8, 14,

Fa), 1,82-1,96 (m, 3H, H-7a, 12b, l'b), 2,26 (m, 1H, H-9), 2,28-2,38 (m, 2H, H-l lb, 15), 2,39 (bdd, 1H, J= 19,4, 2,5 Hz, H-l 6a), 2,45 (bdd, 1H, J = 19,4; 8,5 Hz, H-l 6b), 2,50 (m, 1H, 2'a),

2.72 (m, 1H, 2'b), 2,78-2,94 (m, 2H, H-6), 5,03 (bs, 1H, OH), 6,60 (bd, 1H, J = 2,7 Hz, H^l),

6,64 (bdd, 1H, J = 8,4; 2,8 Hz, H-2), 6,99 (m, 1H, H-2), 7,07-7,20 (m, 3H, H-l, 3); ¹³C NMR 25 (150,9MHz, CDCI3) δ 17,71 (C-18), 25,44 (C-ll), 26,56 (C-7), 29,27 (C-6), 33,16 (C-l'),

33,56 (C-15), 33,79 (C-12), 34,90 (C-2'), 35,88 (C-8), 42,64 (C-16), 44,43 (C-9), 47,20 (C-

13), 52,72 (C-14), 112,73 (C-2), 115,20 (d, = 21,2 Hz, C-3), 115,22 (C^l), 126,14 (C-l),

129.72 (d, f~^T = 7,8 Hz, C-2), 132,20 (C-10), 137,21 (d, Λ' = 3,3 Hz, C-l), 137,92 (C-5),

153,62 (C-3), 161,32 (d, / ' = 243,7 Hz, C^T'), 221,3 (C-17); ^l9F NMR (470,3 MHz, CDC1₃) δ 30 -1 10,93 (m, 1F); IČ (CHC1₃) v 3598, 3431, 3028, 2936, 2864, 1729, 1610, 1585, 1502, 1466,

1453, 1440, 1378, 1281, 1248, 1190, 1157, 1095, 1057, 983, 959, 939, 877, 582, 472 cm¹; HRMS (APCI) vypočtená pro C₂6H₂₉O₂FNa [M+Na⁺] 415,20438 nalezená 415,20447. R/4/1 hexan/EtOAc) = 0,4.

Příklad 6: 3-hydroxy-15p-(4-(chlor)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-l 7-on (6)

- 12CZ 307437 B6

Látka 6 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 4chlorstyrenem (59 μΐ). Po chromatografii na HPLC (35/65 AcCN/H₂O, t_R = 30 min) bylo získáno 34 mg bezbarvé pevné látky 6: tt 168 °C; [a]_D +69,3 (c 0,150; CHCI₃); 'H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1,02 (s, 3H, H-18), 1,36-1,56 (m, 3H, H-7a, 11a, 12a), 1,65 (m, 1H, H-la'), 1,64-1,76 (m, 2H, H-8, 14), 1,84-1,94 (m, 3H, H-lb', 7b, 12b), 2,26 (m, 1H, H-9), 2,26-2,38 (m, 2H, H11b, 15), 2,40 (dd, 1H,J= 19,3, 2,6 Hz, H-16a), 2,44 (dd, 1H, J= 19,3; 8,3 Hz, H-16b), 2,50 (ddd, 1H, J = 13,8; 8,9; 7,3 Hz, H-1'a), 2,72 (ddd, 1H, J = 13,8; 9,5; 5,2 Hz, H-1'b), 2,81-2,93 (m, 2H, H-6), 4,70 (s, 1H, OH), 6,59 (d, 1H, J = 2,8 Hz, H-4), 6,63 (dd, 1H, J= 8,4; 2,8 Hz, H2), 7,10 (m, 2H, H-2), 7,13 (d, 1H, J = 8,4 Hz, H-l), 7,21 (m, 2H, H-3); ^,3C NMR (150,9 MHz, CDCI3) δ 17,73 (C-18), 25,45 (C-l 1), 26,60 (C-7), 29,27 (C-6), 32,96 (C-Γ), 33,62 (ΟΙ 5), 33,82 (C-l2), 35,08 (C-2'), 35,89 (C-8), 42,58 (C-l6), 44,45 (C-9), 47,17 (C-l3), 52,73 (C-14), 112,73 (C-2), 115,21 (C^l), 126,17 (C-l), 128,57 (C-3), 129,74 (C-2), 131,79 (C4), 132,33 (C-10), 137,95 (C-5), 140,04 (C-l), 153,54 (C-3), 220,95 (C-17); IČ (KBr) v 3372, 1728, 1711, 1618, 1611, 1501, 1492, 1464, 1407, 1375, 1015 cm¹; HR-MS (APCI) vypočtená pro C₂₆H₃o0₂Cl [M+H⁺] 409,19288 nalezená 409,19284. R/4/1 hexan/EtOAc) = 0,4.

Příklad 7: 3-hydroxy-15p~(4-ethyl-methylbenzoát)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (7)

(7)

Látka 7 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 4vinyl-methylbenzoátem (62 μΐ). Po chromatografii na HPLC (40/60 AcCN/H₂O, t_R = 30 min) bylo získáno 17 mg bezbarvé pevné látky 7: tt 139 °C; [a]_D +70,2 (c 0,084; CHCI3); 'H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 1,02 (s, 3H, H-18), 1,34-1,55 (m, 3H, H-7a, 11a, 12a), 1,65-1,76 (m, 3H, H-l'a, 8, 14), 1,82-1,98 (m, 3H, H-1'b, 7b, 12b), 2,25 (m, 1H, H-9), 2,28-2,38 (m, 2H, H-l lb, 15), 2,39 (dd, 1H, J = 19,3; 2,6 Hz, H-16a), 2,45 (dd, 1H, J = 19,3; 8,4 Hz, H-16b), 2,60 (ddd, 1H, J= 13,7; 8,8; 7,2 Hz, H-2'a), 2,80 (ddd, 1H, J= 13,7; 9,6; 5,3 Hz, H-2'b), 2,80-2,93 (m, 2H, H-6), 3,91 (s, 3H, OCH₃), 5,01 (bs, 1H, OH), 6,59 (bd, 1H,J = 2,8 Hz, H-4), 6,64 (bdd, 1H, J = 8,4; 2,8 Hz, H-2), 7,12 (dd, 1H, J = 8,5; 1,0 Hz, H-l), 7,25 (m, 2H, H-2), 7,98 (m, 2H, H-3); ^l3C NMR (150,9 MHz, CDC1₃) δ 17,73 (C-18), 25,43 (C-l 1), 25,59 (C-7), 29,25 (C-6), 32,68 (C-l'), 33,64 (C-l5), 33,80 (C-l2), 35,73 (C-2'), 35,87 (C-8), 42,53 (C-l6), 44,43 (C-9), 47,17 (C-l3), 52,07 (OCH,), 52,71 (C-14), 112,74 (C-2), 115,22 (C-4), 126,13 (C-l), 128,05 (C^T), 128,48 (C-2), 129,84 (C-3), 132,19 (C-10), 137,90 (C-5), 147,14 (C-l), 153,65 (C-3), 167,09 (CO), 220,99 (C-17); IČ (KBr) v 3406, 3020, 1733, 1720, 1700, 1610, 1584, 1502, 1436, 1415, 1351, 1282, 964 cm HR-MS (APCI) vypočtená C₂₈H3₃O₄ [M+H⁺] 433,23734 nalezená 433,23716. R/(4/l hexan/EtOAc) = 0,2.

- 13 CZ 307437 B6

Příklad 8: 3-hydroxy-15P-(ethyl-2-naftyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (8)

Látka 8 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 2vinylnaftalenem (75 mg). Po chromatografii na HPLC (30/70 AcCN/H₂O, t_R = 38 min) bylo získáno 13 mg bezbarvé pevné látky 8: tt 201 °C; [oc]d +77,0 (c 0,309; CHC1₃); ’H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1,05 (s, 3H, H-18), 1,32-1,55 (m, 3H, H-7a, 1 la, 12a), 1,66-1,75 (m, 2H, H-8,

14), 1,76 (dddd, 1H, J = 13,6; 11,7; 8,9; 5,3 Hz, H-l a), 1,86-1,95 (m, 2H, H-7b, 12b), 2,02 (dddd, 1H, J= 13,6; 9,5; 7,2; 2,1 Hz, H-1'b), 2,24 (m, 1H, H-9), 2,31-2,42 (m, 2H, H-l lb, 15), 2,40-2,52 (m, 2H, H-l 6), 2,71 (ddd, 1H, J = 15,8; 8,9; 7,2 Hz, H-2'a), 2,78-2,91 (m, 2H, H-6),

2,92 (ddd, 1H,J = 13,8; 9,5; 5,3 Hz, H-2'b), 5,11 (bs, 1H, OH), 6,59 (bd, 1H, J= 2,8 Hz, H^l), 6,64 (bdd, 1H, J=8,4; 2,8 Hz, H-2), 7,12 (dd, 1H,J=8,5; 1,1 Hz, H-l), 7,32 (dd, 1H,J=8,4;

1,8 Hz, H-3), 7,44 (bddd, 1H, J = 8,0; 6,8; 1,4 Hz, H-6), 7,47 (bddd, 1H, J = 8,1; 6,8; 1,5 Hz, H-7), 7,61 (m, 1H, H-l), 7,79 (m, 1H, H-8), 7,80 (bd, 1H, J = 8,4 Hz, H-4), 7,82 (m, 1H, H-5); ’³C NMR (150,9 MHz, CDCI₃) δ 17,74 (C-18), 25,47 (C-l 1), 26,62 (C-7), 29,27 (C-6), 32,85 (C-Γ), 33,75 (C-l5), 32,85 (C-l2), 35,89 (C-2'), 35,95 (C-8), 42,71 (C-l6), 44,47 (C-9), 47,24 (C-13), 52,82 (C-14), 112,74 (C-2), 115,24 (C-4), 125,30 (C-6), 126,07 (C-l), 126,11 (C-7), 126,51 (C-l), 127,07 (C-3), 127,35 (C-8), 127,64 (C-4), 128,09 (C-5), 132,06 (C4a), 132,28 (C-10), 133,58 (C-8a), 137,97 (C-5), 139,07 (C-2), 153,65 (C-3), 221,38 (C17); IČ (KBr) v 3371, 3052,3018, 1729, 1719, 1610, 1601, 1584, 1502, 1451, 1442 cm HR-MS (APCI) vypočtená C₃₀H₃₃O₂ [M+H⁺] 425,24751 nalezená 425,24746. RX4/1 hexan/EtOAc) = 0,4.

Příklad 9: 3-hydroxy-153~(4-(methoxy)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (9)

(9)

Látka 9 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 4methoxystyrenem (65 μΐ). Po chromatografii na HPLC (37/63 ACCN/H₂O, t_R = 30 min) bylo získáno 24 mg bezbarvé pevné látky 9: tt 159 °C; [a]_D +48,0 (c 0,154; CHC1₃); ’H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1,02 (s, 3H, H-18), 1,35-1,55 (m, 3H, H-7a, 11a, 12a), 1,63 (m, 1H, Η-Γ), 1,65-1,76 (m, 2H, H-8, 14), 1,85-1,94 (m, 3H, H-1'b, 7b, 12b), 2,25 (m, 1H, H-9), 2,28-2,36 (m, 2H, H-l lb, 15), 2,39 (dd, 1H, J = 19,4; 2,7 Hz, H-l6a), 2,44 (dd, 1H, J = 19,4; 8,7 Hz, H16b), 2,49 (ddd, 1H, J = 13,8; 9,0; 7,2 Hz, H-2'a), 2,69 (ddd, 1H, J = 13,8; 9,7; 5,3 Hz, H-2'b), 2,79-2,93 (m, 2H, H-6), 3,80 (s, 3H, OCH₃), 4,69 (bs, 1H, OH), 6,59 (bd, 1H, J = 2,8 Hz, H-4), 6,63 (bdd, 1H, J = 8,4; 2,8 Hz, H-2), 6,84 (m, 2H, H-3), 7,09 (m, 2H, H-2), 7,13 (bd, 1H, J = 8,4 Hz, H-l); ^l3C NMR (150,9 MHz, CDC1₃) δ 17,71 (C-18), 25,49 (C-ll), 26,59 (C-7), 29,32 (C-6), 33,27 (C-l’), 33,66 (C-15), 33,83 (C-12), 34,87 (C-2’), 35,93 (C-8), 42,17 (C-16), 44,49

- 14CZ 307437 B6 (C-9), 47,19 (C-l3), 52,79 (C-14), 55,27 (OCH₃), 112,69 (C-2), 113,86 (C-3), 115,22 (C^l), 126,18 (C-l), 129,30 (C-2), 132,39 (C-10), 133,69 (C-l), 130,06 (C-l), 138,03 (C-5), 153,51 (C-3), 157,89 (C^l), 221,31 (C-17); IČ (KBr) v 3386, 3059, 2835,1730, 1718, 1619, 1583, 1512, 1452, 1442, 1246, 1035, 965, 708 cm¹: HR-MS (APCI) vypočtená C₂₇H₃₃O₃[M+H⁺] 405,24242 nalezená 405,24235. R/(4/l hexan/EtOAc) = 0,3.

Příklad 10: 3-hydroxy-15P-(3-(methoxy)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (10)

(10)

Látka 10 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 3methoxystyrenem (66 μΐ). Po chromatografii na HPLC (30/70 ACCN/H₂O, t_R = 16 min) bylo získáno 52 mg bezbarvé pevné látky 10: tt 178 °C; [cc]_D +58,3 (c 1,706; CHC1₃); Ή NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1,03 (s, 3H, H-18), 1,36-1,50 (m, 2H, H-7a, 12a), 1,50 (m, 1H, H-lla), 1,611,76 (m, 3H, H-la', 8, 14), 1,86-1,96 (m, 3H, H-lb, 7b, 12b), 2,25 (m, 1H, H-9), 2,23-2,38 (m, 2H, H-llb, 15), 2,40 (dd, 1H,J= 19,4; 2,8 Hz, H-16a), 2,46 (dd, 1H,J= 19,4; 8,1 Hz, H-16b), 2,51 (ddd, 1H, J= 13,8; 9,1; 7,1 Hz, H-2a'), 2,73 (ddd, 1H, J = 13,7; 9,7; 5,3 Hz, H-2b'), 2,80-

2,93 (m, 2H, H-6), 3,81 (s, 3H, OCH₃), 5,00 (bs, 1H, OH), 6,59 (bd, 1H, J = 2,8 Hz, H-4), 6,64 (ddm, 1H, J = 8,4; 2,8 Hz, H-2), 6,73 (bdd, 1H, J = 2,6; 1,6 Hz H-2), 6,76 (ddd, 1H, J = 8,2; 2,6; 1,0 Hz, H-4), 6,78 (ddd, 1H, J= 7,5; 1,6; 1,0 Hz, H-6), 7,13 (dd, 1H, J = 8,5; 1,1 Hz, H1), 7,22 (bt, 1H, J = 7,8 Hz, H-5); ^l3C NMR (150,9 MHz, CDC13) δ 17,70 (C-l 8), 25,46 (C-l 1), 26,58 (C-7), 29,29 (C-6), 32,91 (C-l'), 33,72 (C-l5), 33,80 (C-l2), 35,81 (C-2'), 35,90 (C-8), 42,68 (C-16), 44,47 (C-9), 47,21 (C-13), 52,74 (C-14), 55,16 (OCH3), 111,03 (C^l), 112,70 (C-2), 114,41 (C-2), 115,22 (C-^l), 120,83 (C-6), 126,15 (C-l), 129,44 (C-5), 132,24 (C10), 137,96 (C-5), 143,29 (C-l), 153,59 (C-3), 159,64 (C-3), 221,54 (C-17); 1Č (CHC13) v 3598, 1729, 1611, 1602, 1594, 1585, 1500, 1489, 1439, 1281, 1259, 1233, 1191, 1165, 1153, 1017, 616 cm¹; HR-MS (APCI) vypočtená C27H₃₃O₃ [M+H⁺] 405,24242 nalezená 405,24247. R/4/1 hexane/EtOAc) = 0,3.

Příklad 11: 3-hydroxy-15[3-(3,4-(dimethoxy)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (11)

(11)

Látka 11 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 3,4dimethoxystyrenem (72 μΙ). Po chromatografii na HPLC (30/70 AcCN/H₂O, t_R = 14 min) bylo získáno 17 mg bezbarvé pevné látky 11: tt 146 °C; [a]_D +55,3 (c 0,347; CHC1₃); 'H NMR (500 MHz, CDClj) δ 1,03 (s, 3H, H-18), 1,31-1,56 (m, 3H, H-7a, 11a, 12a), 1,60-1,77 (m, 3H, H1 a’, 8, 14), 1,85-1,95 (m, 3H, H-lb, 7b, 12b), 2,25 (m, 1H, H-9), 2,28-2,38 (m, 2H, H-l lb, 15),

- 15 CZ 307437 B6

2,37-2,52 (m, 3H, H-l 6, H-2a'), 2,71 (ddd, 1H, J= 13,8; 9,3; 5,2 Hz, H-2b’), 2,78-2,92 (m, 2H, H-6), 3,86 (s, 3H, OCH₃), 3,88 (s, 3H, OCH₃), 5,62 (bs, 1H, OH), 6,60 (bdm, IH, J = 2,8 Hz, H4), 6,65 (bdd, 1H, J = 8,5, 2,8 Hz, H-2), 6,70 (d, 1H, J = 2,0 Hz, H-2), 6,72 (dd, 1H, J = 8,1;

2,8 Hz, H-6), 6,81 (d, 1H, 7=8,1 Hz, H-5), 7,12 (bd, 1H,J=8,5 Hz, H-l); ^l3C NMR (150,9 MHz, CDC1₃) δ 17,69 (C-18), 25,41 (C-l 1), 26,56 (C-7), 29,25 (C-6), 33,03 (C-Γ), 33,49 (C-

15), 33,75 (C-12), 35,20 (C-2’), 35,87 (C-8), 42,64 (C-16), 44,40 (C-9), 47,22 (C-13), 52,67 (C-l 4), 55,80 (OCH₃), 55,87 (OCH₃), 111,19 (C-5), 111,62 (C-2), 112,73 (C-2), 115,22 (C4), 120,29 (C-6), 126,06 (C-l), 131,98 (C-10), 134,17 (C-l), 137,79 (C-5), 147,24 (C^), 148,79 (C-3), 153,79 (C-3), 221,87 (C-l7); IČ (CHC1₃) v 3598, 2839, 1610, 1591, 1516, 1501, 1454, 1442, 1260, 1193, 1155, 1029, 870, 808, 581, 544 cm¹; HR-MS (APCI) vypočtená C₃₄H47O₄Si [M+Si] 547,32381 nalezená 547,32368. R/4/1 hexan/EtOAc) = 0,25.

Příklad 12: 3-hydroxy-15[3-(4-(ethoxy)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (12)

(12)

Látka 12 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 4ethoxystyrenem (73 μΐ). Po chromatografii na HPLC (30/70 AcCN/H₂O, t_R = 17 min) bylo získáno 62 mg bezbarvé pevné látky 12: tt 173 °C; [a]_D +62,5 (c 0,208; CHC1₃); *H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1,02 (s, 3H, H-18), 1,35-1,49 (m, 2H, H-7a, 12a), 1,41 (t, 3H, J = 7,0 Hz, OCH₂CH₃), 1,50 (m, 1H, H-l la), 1,58-1,75 (m, 3H, H-1'a, 8, 14), 1,84-1,93 (m, 3H, H-1'b, 7b, 12b), 2,25 (m, 1H, H-9), 2,28-2,37 (m, 2H, H-llb, 15), 2,39 (dd, 1H,.7= 19,4, 2,8 Hz, H-16a), 2,44 (dd, 1H, J = 19,4; 8,1 Hz, H-l6b), 2,47 (ddd, 1H, J = 13,8; 9,0; 7,1 Hz, H-2'a), 2,69 (ddd, 1H, J= 13,8; 9,6; 5,3 Hz, H-2'b), 2,78-2,93 (m, 2H, H-6), 4,02 (q, 2H, OCH₂CH₃), 4,83 (bs, 1H, OH), 6,59 (bdt, 1H, J = 2,8; 1,0; 1,0 Hz, H^l), 6,63 (bdd, 1H, J = 8,4; 2,8 Hz, H-2), 6,83 (m, 2H, H-3), 7,08 (m, 2H, H-2), 7,13 (dd, 1H, J = 8,5; 1,1 Hz, H-l); ^l3C NMR (150,9 MHz, CDC13) δ 14,87 (OCH2CH3), 17,70 (C-18), 25,48 (C-l 1), 26,57 (C-7), 29,32 (C-6), 33,25 (ΟΙ¹), 33,63 (C—15), 33,82 (C-12), 34,86 (C-2'), 35,91 (C-8), 42,72 (C-16), 44,48 (C-9), 47,20 (C-13), 52,77 (C—14), 63,42 (OCH2CH₃), 112,69 (C-2), 114,44 (C-3), 115,22 (C-4), 126,16 (C-l), 129,28 (C-2), 132,33 (C-10), 133,55 (C-l), 138,01 (C-5), 153,54 (C-3), 157,23 (C4), 221,46 (C-17); IČ (CHC1₃) v 3598, 3098, 3060, 1729, 1611, 1583, 1512, 1502, 1453, 1441, 1245, 1042 cm'; HR-MS (APCI) vypočtená C₂₈H₃₅O₃ [M+H⁺] 419,25807 nalezená 419,25810. R/4/1 hexan/EtOAc) = 0,3.

Příklad 13: 3-hydroxy-15p-(4-(/-butoxy)fenethyl)-estra-l,3,5( 10)-trien-l7-on (13)

(13)

- 16CZ 307437 B6

Látka 13 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 4-Zbutoxystyrenem (92 μΙ). Po chromatografíi na HPLC (30/70 AcCN/H₂O, t_R = 17 min) bylo získáno 94 mg bezbarvé pevné látky 13: tt 192 °C; [a]_D +62,5 (c 0,208; CHC1₃); *H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1,02 (s, 3H, H-18), 1,35-1,49 (m, 2H, H-7a, 12a), 1,41 (t, 3H, J = 7,0 Hz, OCH₂CH₃), 1,50 (m, 1H, H-l la), 1,58-1,75 (m, 3H, H-1'a, 8, 14), 1,84-1,93 (m, 3H, H-1'b, 7b, 12b), 2,25 (m, 1H, H-9), 2,28-2,37 (m, 2H, H-l lb, 15), 2,39 (dd, 1H, J = 19,4; 2,8 Hz, H-l 6a), 2,44 (dd, 1H, J = 19,4; 8,1 Hz, H-l 6b), 2,47 (ddd, 1H, J = 13,8; 9,0; 7,1 Hz, H-2'a), 2,69 (ddd, 1H, J= 13,8; 9,6; 5,3 Hz, H-2'b), 2,78-2,93 (m, 2H, H-6), 4,02 (q, 2H, OCH₂CH₃), 4,83 (bs, 1H, OH), 6,59 (bdt, 1H, J = 2,8; 1,0; 1,0 Hz, H-4), 6,63 (bdd, 1H, J = 8,4; 2,8 Hz, H-2), 6,83 (m, 2H, H-3), 7,08 (m, 2H, H-2), 7,13 (dd, 1H, J = 8,5; 1,1 Hz, H-l); ’³C NMR (150,9 MHz, CDC13) δ 14,87 (OCH2CH3), 17,70 (C-18), 25,48 (C-l 1), 26,57 (C-7), 29,32 (C-6), 33,25 (CΓ), 33,63 (C-l5), 33,82 (C-l2), 34,86 (C-2'), 35,91 (C-8), 42,72 (C-l6), 44,48 (C-9), 47,20 (C-13), 52,77 (C-14), 63,42 (OCH2CH3), 112,69 (C-2), 114,44 (C-3), 115,22 (C^l), 126,16 (C-l), 129,28 (C-2), 132,33 (C-l0), 133,55 (C-l), 138,01 (C-5), 153,54 (C-3), 157,23 (C-4), 221,46 (C-l 7); IČ (CHCI3) v 3598, 3098, 3060, 1729, 1611, 1583, 1512, 1502, 1453, 1441, 1245, 1042 cm¹; HR-MS (APCI) vypočtená C28H₃₅O₃ [M+H⁺] 419,25807 nalezená 419,25810. R/4/1 hexan/EtOAc) = 0,3.

Příklad 14: 3-hydroxy-15|3-(4-(hydroxy)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (14)

Látka 14 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 4vinylfenolem (59 mg). Po chromatografíi na HPLC (30/70 AcCN/H₂O, t_R = 12 min) bylo získáno 37 mg bezbarvé pevné látky 14: tt 169 °C; [oc]_D +79,1 (c 0,283; CH₃OH); 'H NMR (500 MHz, MeOD) δ 0,99 (s, 3H, H-18), 1,29 (s, 1H, H-7a), 1,34-1,47 (m, 2H, 11a, 12a), 1,57-1,68 (m, 3H, H-l’, 8, 14), 1,75-1,89 (m, 3H, H-1'b, 7b, 12b), 2,17 (m, 1H, H-9), 2,25-2,33 (m, 2H, H11b, 15), 2,34-2,40 (m, 2H, H-16), 2,42 (dt, 1H, J = 13,6, 7,9 Hz, H-2'a), 2,66 (ddd, 1H, 7 = 13,6; 8,5; 5,4 Hz, H-2'b), 2,74-2,80 (m, 2H, H-6), 6,49 (dm, 1H, J = 2,7 Hz, H-4), 6,53 (bdd, 1H, J = 8,5; 2,7 Hz, H-2), 6,71 (m, 2H, H-3), 7,00 (m, 2H, H-2), 7,04 (dd, 1H, J = 8,5; 1,1 Hz, H-l); ¹³C NMR(150,9 MHz, MeOD) δ 18,21 (C-18), 26,68 (C-l 1), 27,78 (C-7), 30,38 (C6), 34,57 (C-l 5), 34,58 (C-l¹), 35,09 (C-l2), 35,69 (C-2'), 37,41 (C-8), 43,64 (C-l6), 45,83 (C-9), 48,49 (C-13), 53,92 (C-14), 113,71 (C-2), 116,12 (C-^), 116,14 (C-3), 126,91 (C-l), 130,54 (C-2), 132,33 (C-10), 134,00 (C-l), 138,76 (C-5), 156,11 (C-3), 156,52 (C-4), 224,20 (C-l 7); IČ (KBr) v 3370, 2926, 2855, 1716, 1612, 1583, 1514, 1450, 1441, 1376, 1356, 1217, 1170, 1099, 922, 827, 755, 731 cm¹: HR-MS (APCI) vypočtená C26H3IO3 [M+H⁺] 391,22677 nalezená 391,22690. R/7/1 CHCl3/MeOH) = 0,3.

Příklad 15: 3-hydroxy-15|3-(4-(methyl)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (15)

- 17CZ 307437 B6

(15)

Látka 15 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 4methylstyrenem (64 μΐ). Po chromatografií na HPLC (35/65 AcCN/H₂O, t_R = 36 min) bylo získáno 25 mg bezbarvé pevné látky 15: tt 159 °C; [a]_D -13,9 (c 0,170; CHCI₃); 'H NMR (500 MHz, CDC1₃)5 1,02 (s, 3H, H-18), 1,36-1,55 (m, 3H, H-7a, 11a, 12a), 1,64 (dddd, 1H, J= 13,6; 11,7; 9,2; 5,3 Hz, H-1'a), 1,66-1,76 (m, 2H, H-8, 14), 1,86-1,95 (m, 3H, H-lb', 7b, 12b), 2,25 (m, 1H, H-9), 2,33 (s, 3H, CH₃-Ph), 2,30-2,34 (m, 2H, H-l lb, 15), 2,37-2,46 (m, 2H, H-16), 2,49 (ddd, 1H, J = 13,7; 9,2; 6,9 Hz, H-1'a), 2,71 (ddd, 1H, J = 13,7; 9,8; 5,3 Hz, H-1'b), 2,80-

2,94 (m, 2H, H-6), 4,68 (s, 1H, OH), 6,59 (dm, 1H, J = 2,8 Hz, H^t), 6,63 (dd, 1H, J = 8,5;

2,8 Hz, H-2), 7,07 (m, 2H, H-2), 7,11 (m, 2H, H-3), 7,13 (dd, 1H, J = 8,5; 1,0 Hz, H-l); ¹³C NMR (150,9 MHz, CDC13) δ 17,73 (C-18), 21,01 (CH3-Ph), 25,51 (C-ll), 26,62 (C-7), 29,34 (C-6), 33,22 (C-Γ), 33,81 (C-15), 33,85 (C-12), 35,40 (C-2¹), 35,95 (C-8), 42,72 (C-16), 44,52 (C-9), 47,20 (C-13), 52,81 (C-14), 112,71 (C-2), 115,23 (C-4), 126,20 (C-l), 128,29 (C-2), 129,15 (C-3), 132,41 (C-10), 135,54 (C-4), 138,05 (C-5), 138,58 (C-l), 153,51 (C-3), 221,34 (C-17); IČ (KBr) v 3382, 1734, 1719, 1584, 1514, 1501, 1443, 708 cm’¹; HR-MS (APCI) vypočtená C27H₃₃O₂ [M+H⁺] 389,24751 nalezená 389,24751. R/ (4/1 hexan/EtOAc) = 0,3.

Příklad 16: 3-hydroxy-15p-(3,4,5-(trifluor)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (16)

(16)

Látka 16 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 3,4,5trifluorstyrenem (77 mg). Po chromatografií na HPLC (30/70 AcCN/H₂O, t_R = 21 min) bylo získáno 8 mg bezbarvé pevné látky 16: tt 182 °C; [a]_D +48,3 (c 0,118; CHC1₃); *H NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1,03 (s, 3H, H-18), 1,39-1,56 (m, 3H, H-7a, 1 la, 12a), 1,57-1,77 (m, 3H, H-1'a, 8, 14), 1,81-1,96 (m, 3H, H-1'b, 7b, 12b), 2,21-2,40 (m, 3H, H-l lb, 9, 15), 2,36 (dd, 1H, J = 19,3; 2,2 Hz, H-16a), 2,46 (dd, 1H, J= 19,3; 8,9 Hz, H-16b), 2,48 (ddd, 1H, J= 14,0; 9,3; 7,0 Hz, H-2'a), 2,69 (ddd, 1H, J = 14,0; 9,7; 5,1 Hz, H-2'b), 2,82-2,95 (m, 2H, H-6), 4,86 (bs, 1H, OH), 6,60 (d, 1H, J = 2,8 Hz, H-4), 6,64 (dd, 1H, J= 8,4; 2,7 Hz, H-2), 6,78 (m, 2H, H-2), 7,13 (bd, 1H, J = 8,4 Hz, H-l); ^l3C NMR (150,9 MHz, CDC13) δ 17,73 (C-18), 25,41 (C-ll), 26,66 (C-7), 29,20 (C-6), 32,60 (C-l'), 33,56 (C-15), 33,79 (C-12), 35,08 (C-2'), 35,86 (C-8), 42,43 (C-16), 44,42 (C-9), 47,16 (C-13), 52,65 (C-14), 112,19 (dd, f^v= 15,9; 4,7 Hz, C-2), 112,78 (C-2), 115,23 (C-4), 126,14 (C-l), 132,14 (C-10), 137,77 (C-l), 137,82 (C-5), 138,16 (dt, f'^Y = 249,4; 15,2 Hz, C-4), 151,10 (ddd, / ' = 249,6; 9,8; 3,9 Hz, C-3), 153,65 (C-3), 220,74 (C-l 7); ^l9F NMR (470,3 MHz, CDCI3) δ -160,47 (t, 1F, f ^F = 20,5 Hz), -131,13 (d, = 20,5 Hz); IČ (KBr) v 3295, 1718, 1620, 1585, 1529, 1501, 1376 cm’¹; HR-MS (APCI) vypočtená C₂6H₂sO₂F₃ [M+H⁺] 429,20259 nalezená 429,20349. RJ4/1 hexan/EtOAc) = 0,3.

- 18CZ 307437 B6

Příklad 17: 3-hydroxy-15[3-(2,3,4,5,6-(pentafluor)fenethyl)-estra-l,3,5(10)-trien-17-on (17)

Mn O

Látka 17 byla připravena podle výše uvedeného obecného postupu reakcí vinylestronu 2 s 2,3,4,5,6-pentafluorstyrenem (67 μΐ). Po chromatografií na HPLC (35/65 ACCN/H₂O, t_R = 42 min) bylo získáno 27 mg bezbarvé pevné látky 17: tt 151 °C; [a]_D +43,7 (c 0,544; CHCI3); *H

NMR (500 MHz, CDC1₃) δ 1,00 (s, 3H, H-18), 1,41-1,55 (m, 3H, H-7a, 11a, 12a), 1,61 (m, 1H, H-la'), 1,69 (m, 1H, H-8), 1,74 (m, 1H, H-14), 1,85-1,95 (m, 3H, H-lb', 7b, 12b), 2,27 (m, 1H, H-9), 2,30-2,39 (m, 2H, H-l lb, 15), 2,43 (dd, 1H, J= 19,4; 2,4 Hz, H-l 6a), 2,51 (dd, 1H, J = 19,4, 8,6 Hz, H-l 6b), 2,67 (m, 1H, H-2a'), 2,79 (m, 1H, H-2b'), 2,83-2,96 (m, 2H, H-6), 4,93 (bs, 1H, OH), 6,60 (bd, 1H, J= 2,8 Hz, H-4), 6,64 (dd, 1H, J= 8,4; 2,8 Hz, H-2), 7,13 (bd, 1H,

J= 8,4 Hz, H-l); ⁿC NMR (150,9 MHz, CDCI3) δ 17,63 (C-18), 22,19 (C-2’), 25,43 (C-l 1), 26,56 (C—7), 29,19 (C-6), 30,80 (C-l'), 33,74 (C-12), 33,96 (C-15), 35,86 (C-8), 42,34 (C-16), 44,40 (C-9), 47,12 (C-13), 52,61 (C-14), 112,77 (C-2), 114,44 (bt, .W = 18,8 Hz, C-l), 115,23 (C^l), 126,16 (C-l), 132,10 (C-10), 137,46 (dm,/’^F = 250,4 Hz, C-3), 137,87 (C-5),

139,68 (dm, ^h = 251,7 Hz, C^l), 144,97 (dm,' = 243,2 Hz, C-2), 153,63 (C-3), 220,53 (C-17); ^l9F NMR (470,3 MHz, CDCI3) δ -158,78 (m, 2F, F-3), -153,61 (t, 1F, F-4), -141,15 (m, 2F, F-2); IČ (CHC1₃) v 3599, 1732, 1657, 1611, 1585, 1521, 1504, 1440, 1378, 1122, 1068, 963 cm’¹; HR-MS (APCI) vypočtená C₂₆H₂₆O₂F₅ [M+H⁺] 465,18475 nalezená 465,18468. R/4/1 hexan/EtOAc) = 0,3.

Výsledky testování

Příklad 18: Stanovení míry inhibice enzymové aktivity 17pHSD vyvolané působením testovaných sloučenin

Inhibiční aktivita testovaných látek byla stanovena pro jednotlivé izoenzymy rodiny 17pHSD, konkrétně se jednalo o typy 1, 2, 3, 4, 5 a 7. Pro rekombinantní expresi jednotlivých izoenzymů lidské 17PHSD bylo použito expresních systémů Escherichia coli a savčích buněk. Pouze v případě 17PHSD5 byl enzym částečně purifíkován, a pro testování byl použit supematant, získaný centrifugací bakteriálního lyzátu. Systémy, exprimující konkrétní typ 17pHSD, byly suspendovány v reakčním pufru a inkubovány s tritiem značenými substráty a příslušnými kofaktory při teplotě 37 °C ve dvou souběžných testech, v kontrolním uspořádání (absence inhibitoru) a v testovacím uspořádání. DMSO slouží v tomto případě jako negativní kontrola (Schéma 11). Poté, co bylo v kontrolním testu 20 až 30 % substrátu přeměněno činností enzymu na produkt, byly oba testy ukončeny. Substrát a produkt z testovacího uspořádání byly izolovány pomocí SPE (extrakce na pevné fázi) a následně separovány pomocí HPLC na reverzní fázi. Konverze substrátu byla určena pomocí integrace signálů substrátu a produktu a byla vyjádřena v %. Pro účely následujícího výpočtu inhibice enzymu byla konverze kontrolního testu zvolena jako 0 % inhibice. Všechny testy byly provedeny v triplikátech. Hodnoty IC₅₀ byly poté určeny standardní metodou pomocí One Ligand Binding modelu modulu SigmaPlot kinetics (Schustera et. al. J. Ster. Biochem. Mol. Biol. 2011, 125, 148; Moller et. al. Bioorg. Med. Chem. Letí. 2009, 19, 6740; Moller et. al. PLoS One, 2010, 5, 6, e 10969).

- 19CZ 307437 B6

Testované látky vykázaly vysokou inhibiční aktivitu vůči lidské 17pHSD typu 1 a obvykle také 17pHSD typu 5. Jedná se o velmi potentní inhibitory při koncentracích látek v testu jak 1 μιηοΙ-Γ¹, tak i 0,1 μιηοΙ-Γ¹. Inhibiční aktivita testovaných derivátů vyjádřená v % inhibice lidské 17pHSD typu 1 a 5 při různých koncentracích testovaných látek je shrnuta v tabulce 1. Dva nejúčinnější deriváty jsou v tabulce 1 zvýrazněny.

Aktivita ostatních zkoumaných izoenzymů - 17pHSD typu 2, 3, 4 a 7 - nebyla přítomností látek při koncentrací 1 pmol-l¹ v testech vůbec ovlivněna. Jedná se proto o zcela selektivní inhibitory 17PHSD1 a 17PHSD5. Látka 2 inhibuje exkluzivně pouze izoenzym 17PHSD1, současně však vykazuje i částečnou estrogenicitu.

Tabulka 1. Inhibiční aktivita vybraných derivátů vyjádřená v % inhibice lidské 17PHSD typu 1 a 5 při různých koncentracích testovaných látek.

č.d.	17pHSDl	17pHSD5 1 pmolT¹
0,1 pmolT¹	1 pmolT¹	ICsoínmoir¹)
2	79	95	17	7
3	66	83	50	60
4	68	91	42	89
5	72	92	55	70
6	90	97	9	90
7	84	99	16	63
8	77	92	18	76
9	91	100	10	91
10	72	87	ns	ns
11	36	67	ns	ns
12	85	88	ns	ns
13	62	80	ns	ns
14	72	97	ns	ns
15	87	100	8	86
16	67	95	36	79
17	56	90	ns	ns

ns: nebylo stanoveno; č.d: číslo derivátu.

Příklad 19: Stanovení aktivity sloučenin na steroidních receptorech ERa a AR v buněčných luciferázových reportérových testech.

Vliv nově připravených látek na aktivitu steroidních receptorů, estrogenního receptoru a (ERa) a androgenního receptorů (AR), byl ověřen in vitro pomocí selektivních luciferázových reportérových testů založených na buněčných reportérových liniích pro ERa a AR v U2OS buňkách (Sedlák et al. Comb. Chem. High T. Ser. 2011, 14, 248). Tyto buněčné linie byly

-20CZ 307437 B6 vytvořeny vnesením expresního vektoru s kódující sekvencí pro konkrétní lidský steroidní receptor a reportérového vektoru pGL4 (Promega, USA), obsahujícího responsivní elementy pro konkrétní steroidní receptor v promotoru, řídícím expresi luciferázového genu. Buňky, které oba vektory stabilně integrovaly do genomu, byly izolovány pomocí selekčního média obsahujícím hygromycin a G418 (aminoglykosid Geneticin®). Z takto selektované buněčné kultury byly dále izolovány klony buněk, poskytující optimální odpověď při testování s referenčními ligandy pro daný steroidní receptor.

Reportérové linie U2OS byly pěstovány v médiu DMEM (Thermo Fisher Scientific, katalogové číslo 11880-036) bez fenolové červeně s přídavkem 10% FBS (Thermo Fisher Scientific, katalogové číslo 10270-106), 2 mmolT¹ Glutamaxu (Thermo Fisher Scientific, katalogové číslo 35050061) a roztoku penicilinu a streptomycinu (Thermo Fisher Scientific, katalogové číslo 15070063). Buňky byly inkubovány v prostředí s 5% CO₂, při teplotě 37 °C. Dva dny před testováním sloučenin bylo vyměněno růstové médium za DMEM bez fenolové červeně, s přídavkem 2 mmol-Γ¹ Glutamax a 4% FBS zbaveného lipofilních složek (včetně endogenních ligandů steroidních receptorů) (Hyclone, GE Healthcare Life Sciences, USA). Dva dny po výměně média byly buňky sklizeny, spočítány a resuspendovány v médiu stejného složení v koncentraci 0,5 x 10⁶/ml. Buněčná suspenze byla dávkově přenesena do 1536jamkových bílých destiček s úpravou pro kultivaci adherentních buněk (Coming lne., NY, USA). Do každé jamky byly vneseny 4 μΙ buněčné suspenze odpovídající 2500 buněk. Testované sloučeniny byly naředěny v DMSO a přeneseny do jamek k buňkám pomocí bezkontaktního akustického dávkovače sloučenin Echo 520 (Labcyte). Testování bylo provedeno v 10 koncentračních bodech v rozsahu od 10 pmol-l¹ do 1 nmol-F¹, v triplikátech. Experiment byl proveden ve dvou modech.

V agonistickém modu byly stanoveny agonistické vlastnosti testovaných látek, v antagonistickém modu byly detekovány antagonistické vlastnosti. V antagonistickém modu bylo k testovaným vzorkům 30 min po přenosu testovaných látek přidáno 0,5 μΐ roztoku agonisty. Pro ERa byl použit roztok 1 nmol Γ¹ E2, pro AR 1 nmol-1 ¹ dihydrotestosteronu. Pro rozpuštění agonistů bylo použito růstové médium pro buňky.

Luciferázová aktivita byla stanovena komerčním kitem Britelite plus luciferase reportér gene assay reagent (Perkin Elmer, USA), 24 h po přidání sloučenin k buňkám. Intenzita luminescence byla změřena na multimode spektrofotometru Envision (PerkinElmer).

V rozsahu uvažovaných terapeutických koncentrací látky nemají estrogenní účinek. Vybrané látky vykazují dokonce vlastnosti ER/AR antagonistů. Látky 3, 4 a 7 jsou antagonisty ER; látka 9 je antagonista AR a látky 11,12 a 13 jsou antagonisty obou typů receptorů (ER i AR).

Příklad 20: Stanovení cytotoxicity sloučenin v buněčné linii U2OS

Pro oddělení antagonistické aktivity testovaných sloučenin od cytotoxického efektu na U2OS buňkách (buněčná linie odvozená z osteosarkomu) byl paralelně s reportérovým testem proveden experiment pro stanovení buněčné viability. Původní, geneticky nemodifikované U2OS buňky byly pěstovány za stejných podmínek jako reportérové buňky. Tyto buňky byly dále zpracovány a inkubovány se sloučeninami zcela identickým způsobem a po stejnou dobu jako buňky v reportérovém testu. Na konci experimentu bylo stanoveno množství ATP pomocí luciferázového homogenního testu BriteLite jako míra buněčné viability. Data byla poté zpracována spolu s daty z reportérových testů.

Tento orientační test cytotoxicity byl proveden pro všechny připravené látky a jeho výsledky ukázaly, že žádný z připravených derivátů nevykazuje cytotoxické vlastnosti do koncentrace 20 pmol-l ' testovaných sloučenin.

-21 CZ 307437 B6

Příklad 21: Stanovení cytotoxicity sloučenin na nádorových a nenádorových buňkách

K hodnocení protinádorové účinnosti byly použity referenční látky 5, 6, 7, 9, 14 a 15. V in vitro podmínkách byl použit cytotoxický MTT test na buněčných liniích derivovaných z normálních tkání i nádorů. Konkrétně se jednalo o linii K562 (lidská myeloidní leukémie), K562-Tax (lidská myeloidní leukémie rezistentní na taxol a overexprimující protein mnohočetné lékové rezistence PgP), CEM (T-lymfoblastická leukémie), CEM-DNR-bulk (T-lymfoblastická leukémie rezistentní na doxorubicin, postrádající expresi cílového genu pro inhibitory topoizomerázy II alfa), linie A549 (lidský adenokarcinom plic), HCT116p53 wt (lidská rakovina tlustého střeva), HCT116p53—/—(lidská rakovina tlustého střeva, mutant p53), linie lidského osteosarkomu U2OS a dvě fibroblastové linie BJ a MRC5 jako příklady nenádorových buněk. Expresní charakteristiky, profily vnímavosti na klasická protinádorová léčiva i metodologie cytotoxického MTT testu byly opakovaně publikovány (např. Nosková et al. Neoplasma 2002, 49, 418; Šarek et. al. J. Med. Chem. 2003, 46, 25, 5402).

Látky v testech nevykazovaly významnou cytotoxicitu na nádorových nebo nenádorových buněčných liniích různého histogenetického původu, což ukazuje na absenci off-target protinádorového účinku. Výsledky testů shrnuje tabulka 2.

Tabulka 2. In vitro cytotoxicita látek (IC₅₀, pmol-l ') testovaná na buněčných liniích nádorového i nenádorového původu.

Č.d.	CEM IC₅₀ σ	CEM-DNR-bulk IC₅₀ σ	K562 IC50 σ	K562-Tax IC₅₀ σ	A549 IC₅₀ σ
5	25,16	3,80	28,24	1,79	25,25	4,68	19,31	2,44	35,76	4,48
6	16,34	0,90	24,61	2,29	26,89	4,88	13,21	1,72	35,75	3,48
7	25,56	4,97	32,81	3,78	>50,00	0,00	12,49	2,76	>50,00	0,00
9	21,36	3,53	22,14	3,48	27,70	5,71	9,12	0,96	40,98	3,48
14	25,81	3,63	30,76	2,85	22,60	3,20	18,89	1,59	41,32	3,33
15	21,67	2,82	24,10	1,95	23,80	3,25	13,80	1,73	28,21	3,90
	HCT116	p53 wt	HCT116	ip53-/-	U2OS	BJ		MRC5
č.d.	IC₅₀	σ	IC_5O	σ	IC_5O	σ	IC_5O	σ	IC_5O	σ
5	29,19	3,33	30,47	2,73	30,38	3,70	24,26	2,89	18,37	3,11
6	29,34	1,97	30,80	2,13	27,88	3,18	28,81	3,76	21,00	1,83
7	>50,00	0,00	>50,00	0,00	>50,00	0,00	>50,00	0,00	>50,00	0,00
9	29,38	3,33	35,73	0,54	45,32	2,86	>50,00	0,00	>50,00	0,00
14	28,22	2,90	32,57	2,14	44,59	4,38	50,00	0,00	50,00	0,00
15	28,27	1,50	29,35	1,88	28,90	2,34	27,93	1,62	19,55	3,58

σ: směrodatná odchylka.

Příklad 22: Stanovení inhibice 17pHSD v buňkách in vitro

Účinek látek na inhibici 17pHSD v buněčných liniích derivovaných z hormonálně aktivních nádorů MCF-7 (lidský karcinom prsu transfekovaný lidskou 17pHSDl) a CHO (křečci karcinom ovaria transfekovaný lidskou 17pHSDl) byl sledován prostřednictvím kumulace prekurzoru

-22CZ 307437 B6

17PHSD, hormonu El, v supematantu buněčných linií v časovém intervalu 8 a 24 hodin. Pro tento experiment byly použité necytotoxické koncentrace derivátů estronu (10 pmol-E¹). Hladiny El byly stanovené imunoenzymaticky.

Přidání estronových derivátů k 17PHSD1 transfekovaným buněčným kulturám hormonálně aktivních/dependentních nádorů in vitro vedlo již do 8 hodin k významnému zvýšení hladiny El, který je substrátem enzymu 17pHSD. Toto pozorování je konzistentní s inhibici 173HSD in vitro. Výsledky analýzy inhibice 17PHSD na buněčných liniích in vitro shrnuje tabulka 3.

Tabulka 3. Výsledky analýzy inhibice 17pHSD na buněčných liniích in vitro

MCF-7 CHO

	8 hod.	24 hod.	8 hod.	24 hod.
č.d.	El (pg/ml) El (pg/ml) El (pg/ml) El (pg/ml)
kontrola	564	543	745	482
5	3373	2236	3194	1576
6	4251	3323	4137	1804
7	1921	1839	2101	1476
9	1300	1182	1171	739
14	4298	2626	3179	1054
15	719	948	750	554

Kontrola: buněčné linie netransfekované 17pHSDl.

Příklad 23: Stanovení inhibice lidské 173HSD in vivo

K hodnocení biologické aktivity látek in vivo bylo využito měření poklesu tvorby E2 v plazmě myší léčených kandidátní látkou 9. Pro tento účel byly použity samice outbredního kmene myší NMRI ve věku 8 týdnů. Tyto zvířata byla léčená po dobu 7 nebo 14 dnů látkou 9 rozpuštěnou v olejovém vehikulu (olivový olej) perorálně gastrickou sondou, lx denně, v dávce 20 mg/kg váhy myši v celkovém objemu 0,1 ml. Paralelně bylo kontrolní skupině zvířat aplikováno vehikulum samotné. Po 7, respektive 14 dnech byl provedený odběr krve za účelem zpracování krevní plazmy a analýzy hladin E2. Paralelně byla provedená pitva a makroskopické zhodnocení jednotlivých orgánů.

Podávání látky bylo zvířaty dobře tolerováno, nebyl pozorován signifikantní pokles hmotnosti a makroskopická analýza orgánů neodhalila žádnou zjevnou patologii. Plazma léčených i kontrolních zvířat byla podrobena imunoenzymatické analýze na kvantifikaci E2. Tato analýza prokázala podstatnou a vysoce signifikantní redukci hladiny hormonu E2 po 14-denním podávání, což je konzistentní s inhibici 17PHSD in vivo (tabulka 4).

-23 CZ 307437 B6

Tabulka 4. Inhibice produkce E2 po podání látky 9 in vivo v plazmě experimentálních zvířat.

Vehikulum 7 dní	E2 (pg/ml)		Vehikulum 14 dní	E2 (pg/ml)
Myš B 1	4660		Myš D 1	5447
Myš B 2	4988		Myš D 2	5991
Myš B 3	4570		Myš D 3	4796
Myš B 4	6835		Myš D 4	4973
Myš B 5	6202		průměrná hodnotai σ	5302±2416
Myš B 6	6372
Myš B 7	4824		látka 9:14 dní 20 mg/kg denně	E2 (pg/ml)
průměrná hodnotai σ	5632±950,l		MyšC 1	6020
		MyšC 2	2668
látka 9:7 dní 20 mg/kg denně	E2 (pg/ml)		MyšC 3	2657
Myš A 1	4927		MyšC 4	3566
Myš A 2	4357		Myš C 5	4312
Myš A 3	6020		Myš C 6	4025
Myš A 4	7379		průměrná hodnotai σ	3874±1253,2
Myš A 6	5857		P	0,019
Myš A 7	5617
průměrná hodnota± σ	5693±1034,7
E	0,362

P: hodnota statistické významnosti; σ: směrodatná odchylka

Průmyslová využitelnost

Sloučeniny podle vynálezu mohou být využity k diagnostice a případně i k léčbě estrogendependentních onemocnění, především estrogen-dependentních typů nádorů, endometriózy, 10 kožních chorob či poruch pohlavního dospívání. Látky mohou najít uplatnění i při léčbě neplodnosti, k navození předčasné menopauzy, hormonální kastraci, nebo jako antikoncepce.

Mezi estrogen-dependentní onemocnění se řadí rakovina prsu, rakovina vaječníků, rakovina dělohy, endometrióza, adenomyóza, menoragie, metroragie, dysmenorea, děložní myomy, 15 syndrom polycystických ovarií, fíbrocystická nemoc prsu, rakovina prostaty, nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC), spinocelulární karcinom, kolorektální karcinom, karcinom žaludku, akné, hirsutismus, pseudohermafroditismus, seboroická dermatitida, androgeny vyvolaná alopecie, hyperestrogenismus.

Claims

1. 153-substituované deriváty estronu obecného vzorce I, kde:

substituenty R¹, R², R³, R⁴, R⁵ jsou nezávisle na sobě zvoleny ze skupiny zahrnující: C|-C4 alkyl, C,-C4 alkoxy, C,-C4 halogenalkyi, halogen, COOR⁶, kde R⁶ je C|-C4 alkyl; H, OH;

popřípadě jsou R³, R⁴ a R⁵ každý tvořen vodíkovým atomem a současně R¹ a R² spolu tvoří aryl, výhodně naftyl;

přičemž aromatický kruh v poloze C—15 může být uvedenými substituenty R¹ až R⁵ mono-, di-, tri-, tetra- i penta-substituovaný.

2. Způsob výroby sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1, vyznačující se tím, že v prvním kroku se k roztoku 3-(7-butyldimethylsilyloxy)-153-vinyl-estra-l,3,5(10)-trien-17-onu 2 a příslušného druhého olefinu ve směsi rozpouštědel CH₂CI₂/trifluorotoluen v objemovém poměru 2/1 přidá rutheniový katalyzátor Hoveyda-Grubbs druhé generace a Cul v inertní atmosféře argonu, výsledná směs se nejprve míchá při teplotě 40 až 70 °C po dobu 4 až 12 h a po dalším přídavku příslušného druhého olefinu a katalyzátoru při stejné teplotě přes noc; poté se reakce ukončí odpařením rozpouštědel za sníženého tlaku a chromatografii na silikagelu se získají příslušné produkty zkřížené metatéze;

ve druhém kroku se k produktu metatéze, rozpuštěnému v tetrahydrofuranu, postupně za teploty místnosti přikape 1 mol Γ¹ roztok tetrabutylammonium fluoridu v tetrahydrofuranu, po 1 h se přidá voda a reakční směs se extrahuje CH₂C1₂ a/nebo CHC1₃; spojené organické fáze se pak promyjí nasyceným roztokem NaCl, vysuší pomocí MgSO₄ a rozpouštědla se odstraní za sníženého tlaku, přičemž odchráněné produkty se izolují chromatografii na silikagelu; a ve třetím kroku se baňka s roztokem odchráněného produktu metatéze v ethylacetátu a katalyzátoru Pd/C v množství 10 % hmotnostních za vydatného míchání evakuuje a posléze se naplní vodíkem, reakční směs se pak míchá přes noc, následně se přefiltruje přes filtrační křemelinu SiO₂ a po odstranění rozpouštědla za sníženého tlaku se vysoce účinnou chromatografii získají finální krystalické produkty.

3. Způsob výroby podle nároku 2, vyznačující se tím, že výsledná směs v kroku 1 se nejprve míchá při teplotě 65 °C po dobu 4 hodin před přídavkem olefinu a katalyzátoru.

4. Sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití jako léčivo.

-25 CZ 307437 B6

5. Sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití k diagnostice a léčení estrogendependentních onemocnění.

6. Farmaceutický prostředek obsahující jako aktivní složku sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1.

7. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití k diagnostice a léčení estrogen-dependentních onemocnění a poruch.

8. Farmaceutický prostředek obsahující sloučeniny obecného vzorce I podle nároku 1 pro použití k diagnostice a léčení estrogen-dependentních onemocnění, kterými jsou rakovina prsu, rakovina vaječníků, rakovina dělohy, endometrióza, adenomyóza, menoragie, metroragie, dysmenorea, děložní myomy, syndrom polycystických ovarií, fibrocystická nemoc prsu, rakovina prostaty, nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC), spinocelulámí karcinom, kolorektální karcinom, karcinom žaludku, akné, hirsutismus, pseudohermafroditismus, seboroická dermatitida, androgeny vyvolaná alopecie, hyperestrogenismus, k léčení neplodnosti, k navození předčasné menopauzy, k hormonální kastraci, nebo pro použití jako antikoncepce.

9. Použití sloučenin obecného vzorce I podle nároku 1 k výrobě farmaceutického prostředku pro diagnostiku a léčení estrogen-dependentních onemocnění, kterými jsou rakovina prsu, rakovina vaječníků, rakovina dělohy, endometrióza, adenomyóza, menoragie, metroragie, dysmenorea, děložní myomy, syndrom polycystických ovarií, fibrocystická nemoc prsu, rakovina prostaty, nemalobuněčný karcinom plic (NSCLC), spinocelulámí karcinom, kolorektální karcinom, karcinom žaludku, akné, hirsutismus, pseudohermafroditismus, seboroická dermatitida, androgeny vyvolaná alopecie, hyperestrogenismus, k léčení neplodnosti, k navození předčasné menopauzy, k hormonální kastraci, nebo pro použití jako antikoncepce.