CZ292808B6 - ATR polypeptid, polynukleotid, který jej kóduje, způsoby jejich detekce, vektor a protilátka - Google Patents

Abstract

Purifikovaný a izolovaný ATR polypeptid s lipid kinázovou aktivitou mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo 4 a purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódující tento polypeptid vykazující sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo 3. Expresní vektor obsahující uvedený polynukleotid a protilátka, která se selektivně váže k uvedenému polypeptidu. Způsob detekce přítomnosti uvedeného polynukleotidu ve vzorku z těla člověka, při němž se (a) vzorek z těla člověka nebo zvířete uvede za hybridizačních podmínek do styku se sondou obsahující polynukleotid podle nároku 6 nebo jeho fragment, a (b) v tomto vzorku se detekuje polynukleotid, který hybridizuje k sondě. Způsob detekce polypeptidu podle nároku 7 v biologickém vzorku, při němž se (a) vzorek uvede do styku s výše uvedenou protilátkou za podmínek umožňujících tvorbu komplexu protilátka-antigen; a (b) určí se, zda se vytvořil tento komplex.ŕ

Description

Oblast techniky

Vynález se obecně týká skupiny kontrolních genů, které řídí průběh buněčného cyklu u eukaiyotických buněk. Konkrétněji se týká ATR polypeptidů, polynukleotidů, které se kódují, vektorů obsahujících tyto polynukleotidy, protilátek, které se selektivně vážou k těmto polypeptidům a způsobu detekce těchto polypeptidů a polynukleotidů.

Dosavadní stav techniky

Řízení buněčného cyklu je základem pro růst a zachování eukaryotických organismů, od kvasinek pro savce. Eukaryotické buňky si vyvinuly řídicí dráhy nazývané „kontrolní body (checkpoints), které zajišťují, že jednotlivé individuální fáze buněčného cyklu jsou dokončené předtím, než je zahájena další fáze. Při poškození DNA je tak zvýšena šance na přežití buňky jednak přímo mechanismy opravujícími DNA a také pozastavením postupu v buněčném cyklu. V závislosti na pozici buňky v buněčném cyklu v době ozáření, poškození DNA v savčích buňkách může zabránit (a) přechodu z G1 do S fáze, (b) průběh S fáze nebo (c) přechod z G2 fáze do mitózy. Předpokládá se, že takováto kontrolní místa (checkpoints) zabrání zhoubným událostem, jako je replikace poškozené DNA a segregaci fragmentovaných chromozomů během mitózy.

Gen rad3 z Schizosaccharomyces pombe je nezbytný pro kontrolní body, které odpovídají na poškození DNA a replikační bloky. Rad3 je členem lipid kinázové podtřídy kináz, která obsahuje oblasti vykazující sekvenční homologii s lipid kinázovou doménou subjednotky pllO fosfatidylinositol-3 kinázy (PI-3 kináza). Tato podtřída také zahrnuje protein ATM, který je defektní u pacientů s ataxií (ataxia-telangiectasia). Buňky z těchto pacientů (AT buňky) nevykazují zpoždění S fáze po ozáření a vykazují tak zvanou radio-rezistentní DNA syntézu (Painter a Young, 1989). AT buňky ozářené v S-fázi akumulují v G2 letální poškození, pravděpodobně jako následek pokusu replikovat poškozenou DNA. AT buňky ozářené během G2 fáze vykazují odlišný fenotyp: nezastavují mitózu po poškození DNA a pokračují vmitóze s poškozenou DNA (Beamish a Levin, 1994). Mutace vA-T lokusu, kde byl ATM gen lokalizován, má tedy za následek poškození několika kontrolních bodů nezbytných pro přiměřenou odpověď na ionizující ozáření. Mezi další členy této podtřídy lipidových kináz patří: Tellp (Greenwell et al. 1985), gen účastnící se při udržování správné délky telomer u Sacharomyces verevisiae; Esrlp; Mectl a produkt genu pro kontrolní bod mei-Al u Drosophila melanogaster (Harietal. 1995).

Podstata vynálezu

Předmět vynálezu zahrnuje tyto aspekty:

- Purifikovaný a izolovaný ATR polypeptid s lipid kinázovou aktivitou mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 2 nebo SEQ ED NO: 4;

- Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódující tento ATR polypeptid. Takovým polypeptidem je polynukleotid mající sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1 nebo SEQ ID NO: 3.

- Polynukleotid, který hybridizuje ke komplementu polynukleotidů (a) nebo (b) za podmínek zahrnujících finální promývání při 55 °C.

- Purifikovaný a izolovaný ATR polypeptid kódovaný některým z výše uvedených polynukleotidů.

-1 CZ 292808 B6

- Expresní vektor obsahující některý z výše uvedených polynukleotidů.

- Protilátka, která se selektivně váže k některému z výše uvedených polypeptidů.

- Způsob detekce přítomnosti některého zvýše uvedených polynukleotidů ve vzorku z těla člověka nebo zvířete, jehož podstata spočívá v tom, že se (a) vzorek z těla člověka nebo zvířete uvede za hybridizačních podmínek do styku se sondou obsahující polynukleotid podle nároku 6 nebo jeho fragment a (b) v tomto vzorku se detekuje polynukleotid, který hybridizuje k sondě.

- Způsob detekce některého zvýše uvedených polypeptidů v biologickém vzorku, jehož podstata spočívá v tom, že se (a) biologický vzorek uvede do styku s protilátkou uvedenou výše za podmínek umožňujících tvorbu komplexu protilátka-antigen; a (b) určí se, zda se vytvořil komplex protilátka-antigen obsahující tuto protilátku.

Analyzovali jsme rad3 gen S. pombe a zjistili jsme, že aminokyselinová sekvence je tvořena celkem 2386 aminokyselinami a ne 1070 aminokyselinami, jak uvedl Seatson et al. 1992. Určili jsme, že se jedná o přímý homolog S. cerevisiae Esrlp a že vykazuje shodnou celkovou strukturu jak ATM gen. Oblast C-konce rad3 proteinu obsahuje lipidovou kinázovou doménu, která je pro činnost Rad3 nezbytná. Ukázali jsme, že Rad3 je sám o sobě schopný vzájemného spojování (šelf association). Také jsme určili protein kinázovou aktivitu spojenou s Rad3.

Dále jsme nalezli lidský analog rad3. Tento gen, který jsme pojmenovali ATR (ataxia and rad related), vykazuje značně vyšší homologii s rad3 než s ATM genem.

Sekvence lidské ATR cDNA je uvedena jako Seq ID No.l. Aminokyselinová sekvence ORF od nukleotidu 80 a 8011 je uvedena jako Seq. ID NO: 2.

DNA sekvence otevřeného čtecího rámce (ORF - open reading frame) rad3 je uvedena jako Seq ID No. 3. Výsledek translace genu - 2386 aminokyselin dlouhá sekvence (nukleotidy 585 až 7742 seq ID NO: 3) je uvedena jako Seq. ID No. 4;

Stejně tak je důležité to, že vynález poskytuje protein ATF podle Seq. ID 2, jeho homology, jeho polypeptidové fragmenty a také protilátky schopné vázat protein ATF nebo jeho polypeptidové fragmenty. ATF protein, jeho homology a fragmenty jsou dále uváděny jako polypeptidy vynálezu.

Dalším aspektem předkládaného vynálezu jsou polynukleotidy ve značně izolované formě schopné selektivní hybridizace k Seq ID No. 1 nebo k jeho komplementu (tj. opačnému prameni). Předkládány jsou také polynukleotidy kódující polypeptidy vynálezu. Takovéto polypeptidy budou uváděny jako polynukleotidy vynálezu. Polynukleotidy vynálezu zahrnují DNA ze Seq. ID No. 1 a její fragmenty, schopné selektivní hybridizace k tomuto genu.

Další stránkou vynálezu jsou předkládané rekombinantní vektory nesoucí polynukleotid vynálezu, včetně expresních vektorů a metody kultivace těchto vektorů ve vhodných hostitelských buňkách, například za podmínek, ve kterých dochází k expresi proteinu nebo polypeptidů kódovaných sekvencí vynálezu.

Dále vynález poskytuje soupravy obsahující polynukleotidy, polypeptidy nebo protilátky vynálezu a metody použití takovýchto souprav při diagnóze přítomnosti nebo absence ATR a jeho homologů, nebo jeho variant včetně škodlivých mutantů ATR.

-2CZ 292808 B6

Vynález dále poskytuje metody testů pro vyhledávání potenciálních substancí využitelných pro inhibici nebo aktivaci ATR aktivity, nebo aktivity mutovaných forem ATR, které postrádají kontrolní aktivitu (checkpoint activity). Vynález také popisuje testovací metody pro vyhledávání vhodných substancí použitelných k inhibici interakcí mezi ATR a ostatními sloučeninami, které reaguji s ATR, včetně samotného ATR.

V této souvislosti vynález také poskytuje polynukleotidovou sekvenci Seq ID No. 3 ve značně izolované formě a protein Seq ID No. 4 ve značně izolované formě a jejich nové fragmenty a varianty.

Detailní popis vynálezu

A. Polynukleotidy

Polynukleotidy vynálezu mohou zahrnovat DNA nebo RNA. Také se mohou vyskytnout polynukleotidy, které obsahují ve své struktuře syntetické nebo modifikované nukleotidy. Odborníci značí řadu různých typů modifikací oligonukleotidů. Patří mezi ně metylfosfonátová a fosforothioátová páteř (methylphosphonate and phosphorothioate backbone), přidání akridinového nebo polylysinového řetězce na 3' a/nebo 5' konec molekuly. Pro účely prezentovaného vynálezu je nutné pochopit, že polynukleotidy zde popsané mohou být modifikované jakoukoliv metodou známou odborníkům. Takovéto modifikace mohou být provedeny za účelem zvýšení aktivity in vivo nebo životnosti polynukleotidů vynálezu.

Polynukleotidy vynálezu schopné selektivní hybridizace kDNA Seq ID No. 1 budou obecně nejméně ze 70 % (lépe ale nejméně z 80-90 % a ještě lépe nejméně z 95 %) homologní s odpovídající DNA Seq ID No. 1 v oblasti nejméně 20, nebo lépe nejméně 25-30 (například nejméně 40, 60 nebo 100 nebo i více) sousedících nukleotidů.

Je nutné uvědomit si, že odborně školené osoby můžou s použitím rutinních technik provést náhradu nukleotidů, které neovlivní polypeptidovou sekvenci kódovanou polynuldeotidy vynálezu proto, aby se projevilo použití kodonů určitého hostitelského organismu, ve kterém mají být polypeptidy vynálezu exprimované.

Jakákoliv kombinace výše uvedených stupňů homologie a minimálních velikostí může být použita k definování polynukleotidů vynálezu, přičemž preferovaná je stringentnější kombinace (tj. větší homologie u delších úseků). Tak například polynukleotid s nejméně 80 % homologií u 25, nebo lépe 30 nukleotidů představuje jeden aspekt vynálezu, stejně jako polynukleotid s nejméně 90 % homologií u 40 nukleotidů.

Polynukleotidy vynálezu mohou posloužit k vytvoření primeru (např. PCR primeru, primeru pro jinou amplifíkační reakci), jako sonda (tj. označené značkou detekovatelnou běžnými prostředky - např. použitím radioaktivní nebo neradioaktivní značky), nebo mohou být polynukleotidy klonovány do vektorů. Takovéto primery, sondy a ostatní fragmenty budou dlouhé nejméně 15 nukleotidů (lépe nejméně 20 a typicky nejméně 25, 30 nebo 40 nukleotidů dlouhé) a jsou také zahrnuty do zde používaného termínu polynukleotidy vynálezu.

Polynukleotidy jako DNA polynukleotid a primery podle tohoto vynálezu mohou být produkovány rekombinantně, synteticky nebo jakýmkoliv jiným způsobem známým odborníkům. Mohou také být klonovány standardními technikami.

Primery budou většinou produkovány synteticky, postupným přidáváním jednoho nukleotidu až k dosažení žádoucí nukleotidové sekvence. Tyto techniky využívají automatů a jsou běžně známé.

-3CZ 292808 B6

Delší polynukleotidy budou většinou produkovány s použitím rekombinantních technik, například využitím techniky PCR klonování (polymerázová řetězová reakce - polymerase chain reaction). Ta zahrnuje vytvoření páru primerů (např. 15-30 nukleotidů dlouhých) v oblasti ATR genu, který chceme klonovat, aplikaci těchto primerů na mRNA nebo cDNA získané z lidských buněk (např. z dělících se buněk jako jsou leukocyty z periferní krve), vlastní PCR reakci za podmínek vedoucích k amplifikaci žádoucí oblasti, izolaci amplifikovaného fragmentu (např. purifikací reakční směsi na agarózovém gelu) a získání amplifikované DNA. Primery mohou být navrženy tak, aby obsahovaly vhodné cílové místo pro restrikční enzym, takže amplifikovaná DNA může být nakloňována do vhodného klonovacího vektoru.

Tyto techniky mohou být použity k získání celé nebo některé části sekvence ATR, která je zde popsána. Genomové klony obsahující gen ATR a jeho introny a promotorové oblasti může také získat analogickým způsobem, kdy jako výchozí materiál slouží genomová DNA z lidských buněk, např. jatemích buněk.

I když techniky zde zmíněné jsou obecně všeobecně známé, jejich popis je možné najít zejména v publikaci Molecular Cloning: A Laboratory Manual (Sambrook et al., 1989).

Polynukleotidy, které nejsou 100% homologní k sekvenci předkládaného vynálezu, ale spadají do rámce tohoto vynálezu, mohou být získány různými způsoby.

Jiné zde popsané alelické varianty sekvence lidského ATF mohou být získány například testováním genomových DNA knihoven, připravených z řady jedinců, například jedinců z různých populací.

Dále mohou být získány homology ATR např. ze zvířat, hlavně savců (např. myší, krys nebo králíků) a zejména primátů a tyto homology a jejich fragmenty budou zpravidla schopné selektivně hybridizovat kSeq. ID No. 1. Takovéto sekvence mohou být získány testováním cDNA knihoven připravených z dělících se buněk nebo pletiv nebo genomových DNA knihoven z jiných živočišných druhů a testováním takovýchto knihoven sondami zahrnujícími celou nebo část Seq. ID. 1 za vysoce stringentních podmínek (např. 0,03 M chlorid sodný a 0,03 M citrát sodný při teplotách asi od 50 °C do 60 °C).

Alelické varianty a druhové homology se mohou také získat s použitím „degenerované PCR“ (degenerate PCR), při které se použijí primeiy vytvořené tak, aby hybridizovaly s cílovými sekvencemi uvnitř variant a homologů kódujících konzervované aminokyselinové sekvence. Konzervované sekvence mohou být vytipovány porovnáním aminokyselinové sekvence ATR se sekvencí rad3. Primery budou obsahovat jednu nebo více degenerovaných pozic a budou použity za méně stringentních podmínek než jsou ty, které se použijí pro klonování sekvencí s jednosekvencovými primery proti známým sekvencím.

Takovéto polynukleotidy mohou být také získány místní řízenou mutagenezí sekvence ATR nebo příslušných alelických variant. To může být například užitečné tam, kde jsou nezbytné „tiché“ změny kodonů pro optimalizaci vhodnosti kodonů pro určitou hostitelskou buňku, ve které má být polynukleotidová sekvence exprimována. Jiné změny sekvence mohou být žádoucí, chceme-li vnést nové místo pro restrikční enzym nebo pro změnu vlastnost nebo funkce polypeptidu kódovaného polynukleotidem. Žádoucí můžou být i další změny, představující částečné změny kódování nalezené u ATR (které vedu ke vzniku mutantních ATR genů, které ztratily kontrolní funkci). Sondy založené na takovýchto změnách mohou být použity jako diagnostické sondy k detekci takovýchto ATR mutantů.

Vynález dále poskytuje dvojpramenné polynukleotidy zahrnující polynukleotidy vynálezu a jejich doplňky.

-4CZ 292808 B6

Polynukleotidy nebo primery vynálezu mohou obsahovat detekční značku. Vhodné značky zahrnují radioizotop jako ³²P nebo ³⁵S, enzymové značky, nebo jiné proteinové značky, jako např. biotin. Takovéto značky mohou být připojeny k polynukleotidům nebo primerům vynálezu a mohou být detekovány s použitím známých technik.

Značené nebo neznačené polynukleotidy nebo primery vynálezu nebo příslušné fragmenty mohou být použity osobami znalými technik detekce a sekvenování nukleových kyselin po detekci či sekvenování ATR v lidském nebo zvířecím těle.

Takovéto detekční testy obecně zahrnují aplikaci sondy obsahující polynukleotid nebo primer vynálezu na vzorek z lidí nebo zvířat obsahující DNA nebo RNA za hybridizačních podmínek a detekci jakýchkoliv duplexů vytvořených mezi sondou a nukleovou kyselinou vzorku. Detekci je možné provést s použitím technik jako je PCR nebo imobilizací sondy na pevný povrch, odstraněním nepřehybridizovaných nukleových kyselina a potom detekováním nukleových kyselin, které přihybridizovaly k sobě. Nebo můžou být nukleové kyseliny vzorku přichyceny na pevný povrch a pak se detekuje množství navázané sondy ke vzorku. Vhodné detekční metody pro tyto způsoby detekce jsou uvedené například v WO 89/03891 a WO 90/13667.

Při sekvenování ATR se aplikuje na cílový lidský nebo zvířecí tělní vzorek (obsahující DNA nebo NRA) sonda obsahující polynukleotid nebo primer vynálezu za hybridizačních podmínek a detekci sekvence například Sangerovou dideoxy terminační metodou (viz Sambrook et al.).

Takováto metoda zpravidla zahrnuje elongaci (za přítomnosti vhodných činidel) primem syntézou komplementární cílové DNA nebo RNA a selektivní ukončení elongační reakce u jednoho nebo více A, C, G nebo T/U teziduí. Dochází tedy k prodlužování pramene, které je ukončené terminační reakcí; dále následuje vlastní určení sekvence nukleotidů separací podle velikosti „prodloužených“ produktů (podle toho, kde došlo k selektivnímu ukončení prodlužování). Vhodná činidla zahrnují enzym DNA polymerázu, deoxynukleotidy dATP, dCTP, dGTP a dTTP, pufr a ATP. Pro selektivní terminaci se používají dideoxynukleotidy.

Testy pro detekci nebo sekvenování ATR v lidském nebo zvířecím organismu mohou být použity k určení sekvence ATR v buňkách individuální organismů, které mají (nebo u kterých se předpokládá) pozměněnou genovou sekvenci ATR, například u rakovinných buněk včetně buněk leukemických nebo pevných tumor, jako např. tumorů prsu, vaječníků, tračníku, pankreatu, varlat, jater, mozku, svalů a kostí.

Navíc, objevení ATR umožní nyní zkoumat vliv tohoto genu u dědičných poruch způsobem obdobným jako u genu ATM. Obecně to zahrnuje určení stavu ATR (např. použitím sekvenční analýzy pomocí PCR) v buňkách odvozených od pacientů nemocných chorobami, u kterých může docházet k poškození replikujících nebo buněk např. s rodinnou predispozicí k rakovině, chromazomálním změnám nebo nestabilitě fenotypu nebo s fenotypem s citlivostí vůči poškození reparačních funkcí.

Sondy vynálezu můžou být vhodně podávány ve formě testovací soupravy ve vhodném obalu. V takovéto soupravě (vyžaduje li to daný test) může být sonda navázána na pevný povrch. Souprava může také obsahovat vhodná reagenční činidla pro přípravu analyzovaného vzorku, hybridizaci sondy k nukleovým kyselinám vzorku, kontrolní činidla, instrukce a podobně.

Předkládaný vynález také poskytuje polyneukleotidy kódující dále popsané polypeptidy vynálezu. Protože takového polynukleotidy budou užitečné jako sekvence pro rekombinantní produkci polypeptidů vynálezu, není nezbytně nutné, aby selektivně hybridizovaly se sekvencí Seq ID No. 1, i když by to obecně bylo žádoucí. Jinak takovéto polynukleotidy mohou být - je-li to potřeba - značené, použité a připravené tak, jak bylo uvedeno výše. Polypeptidy vynález jsou popsány dále.

-5CZ 292808 B6

Zvláště preferované polynukleotidy vynálezu jsou ty, které jsou odvozené od lipid kinázové domény ATR, jejích alelických variant a druhových homologů. Lipid kinázová doména je reprezentována nukleotidy 7054 až 8011 Seq. ID 1. Polynukleotidy vynálezu, které obsahují tuto doménu, jsou zejména preferovány. Termín „lipid kinázová doména“ se vztahuje k doméně, která má homologii s ostatními lipid kinázami, zejména s podjednotkou pl 10 PI-3 kinázy (stanoveno srovnáním sekvencí).

Ostatní preferované polynukleotidy vynálezu jsou ty, které obsahují nukleotidy kódující aminokyseliny 181-302 Seq ID No. 2 (nukleotidy 620-985 Seq. ID No. 1) o kteiých se předpokládá, že tvoří oblast leucinového zipu (leucine zipper region), místo předkládané interakce protein-proteín, a aminokyseliny 1358-1336 (nukleotidy 4151-4177), které jsou také konzervované.

Další stránka vynálezu - byly připraveny polynukleotidy vynálezu obsahující Seq ID NO: 3 a její fragmenty schopné selektivní hybridizace ktéto sekvencí (jiné než fragmenty obsahující nukleotidy 2482-6599) u kterých byly provedeny tyto změny: odstranění reziduí 2499, 2501, 2507 a 2509 a vložení C mez 5918/5919.

Zvlášť preferované fragmenty představují ty, které obsahují rezidua 6826-7334 (lipid kinázová doména) a oblast leucinového zipu (1476-1625 a 2310-2357). Dále jsou preferované fragmenty obsahující konzervovanou oblast nukleotidů 3891-3917. Tyto polypeptidy a fragmenty mohou být připraveny postupy popsanými výše.

B. Polypeptidy

Polypeptidy vynálezu zahrnují polypeptidy ve značně izolované formě, které obsahují sekvenci uvedenou v Seq ID No. 2.

Polypeptidy dále zahrnují varianty těchto sekvencí, včetně přirozeně se vyskytujících alelických variant a syntetických variant, které jsou vysoce homologní k daným polypeptidům. V tomto kontextu je značná homologie chápána jako sekvence, která má alespoň 70%, (například 80% nebo 90%) homologii (shodnost) nukleových kyselin na úseku přes 30 aminokyselin se sekvencí Seq. ID No. 2 kromě lipid kinázové domény a C-koncové části (rezidua 2326-2644), kde podstatná homologie je chápána jako nejméně 80% homologie, ale lépe 90% homologie (identita) úseku přes 50 aminokyselin.

Mezi polypeptidy patří i jiné polypeptidy kódované homology ATR z jiných druhů včetně zvířat, jako jsou savci (např. myši, krysy nebo králíci) a zejména primáti, a jejich varianty definované výše.

Polypeptidy vynálezu také zahrnují fragmenty výše zmíněných kompletních polypeptidů a jejich variant, včetně fragmentů sekvence uvedené v Seq ID no. 2.

Mezi preferované fragmenty patří zejména ty, které obsahují epitop, zejména epitop (whch include an epitop, especially an apitop). Vhodné fragmenty budou mít velikost alespoň 5, např. 10, 12, 15 nebo 20 aminokyselin. Polypeptidové fragmenty proteinu ATR a jeho alelických a druhových variant můžou obsahovat jednu nebo více (např. 2, 3, 5 nebo 10) substitucí, delecí nebo inzercí včetně konzervovaných substitucí.

Konzervované substituce se můžou provádět podle následující tabulky uvádějící konzervativní substituce, kde aminokyseliny ve stejném bloku ve druhém sloupci a je-li to možné i ve stejné řádce ve třetím sloupci můžou být nahrazeny jedna za druhou.

-6CZ 292808 B6

ALIFATICKÉ	Nepolární	GAP
ILV
Polární	CSTM
NQ
Polární - nabité	DE
KR
AROMATICKÉ		HFWY
OSTATNÍ		NQDE

Varianty polypeptidů vynálezu mohou také obsahovat polypeptidy, kde je jedna nebo více specifikovaných (tj. přirozeně kódovaných) aminokyselin odstraněna nebo nahrazena nebo kde je přidána jedna nebo více nespecifikovaných aminokyselin:

1) bez ztráty kinázové aktivity specifické pro polypeptidy vynálezu, nebo 2) se ztrátou kinázové aktivity specifické pro polypeptidy vynálezu, nebo 3) se ztrátou schopnosti interakce s jednotlivými členy nebo regulátory kontrolních bodů průměru buněčného cyklu.

Epitopy mohou být například určeny technikami vyhledávání polypeptidů, které jsou popsány např. v publikaci Geysen et al. Mol. Immunol., 23: 709-715 (1986).

Polypeptidy vynálezu mohou být ve značně izolované formě. Je nutné vysvětlit, že polypeptidy mohou být smíseny s nosiči nebo ředidly, které nebudou interferovat se zamýšleným účelem polypeptidů a stále budou považovány za značně izolované. Polypeptidy vynálezu mohou být také ve značně vyčištěné (purifikované) formě, kdy polypeptidy vynálezu představují zpravidla více než 90 %, tedy např. 95 %, 98 % nebo 99 % polypeptidů v přípravku. Polypeptidy vynálezu mohou být modifikovány například přidáním histidinových reziduí s cílem usnadnit jejich purifikaci nebo přidáním signální sekvence s cílem usnadnit jejich sekvenci z buněk.

Polypeptidy vynálezu mohou být označeny detekční značkou. Detekční značka může být vhodná značka, která umožní detekci proteinu. Mezi vhodné značky patří například radioizotopy, např. ¹²⁵I, enzymy, protilátky, polynukleotidy a další látky, jako například biotin. Značené polypeptidy vynálezu mohou být použity v diagnostických postupech jako jsou imunotesty s cílem určit množství polypeptidů vynálezu ve vzorku. Polypeptidy nebo značené polypeptidy vynálezu mohou být také použity v sérologických nebo buněčných imunologických testech pro detekci imunitní reakce k daným polypeptidům u zvířat a lidí s použitím standardních protokolů.

Polypeptidy nebo značené polypeptidy vynálezu nebo jejich fragmenty mohou být také přichyceny k pevné fázi, například k povrchu jamky pro imunotesty, nebo na testovací proužky.

Takovéto značené a/nebo imobilizované polypeptidy mohou být dodávány ve formě souprav ve vhodném obalu společně s příslušnými činidly, kontrolami, instrukcemi atp.

Takovéto polypeptidy a soupravy mohou být použity v metodách pro imunodetekci protilátek proti ATR proteinu nebo jeho alelickým variantám nebo druhovým variantám.

Imunometody jsou odborníkům známé a obecně zahrnují:

a) zajištění polypeptidů obsahujícího epitop zachytitelný protilátkou proti danému proteinu,

b) inkubaci biologického vzorku s daným polypeptidem za podmínek, které umožní tvorbu komplexu protilátka-antigen a

-7CZ 292808 B6

c) určení, jestli došlo k tvorbě komplexu protilátka-antigen obsahující daný polypeptid.

Polypeptidy vynálezu mohou být připraveny synteticky (např. podle Geyse et al.) nebo rekombinantně, jak je popsáno dále.

Mezi zvláště preferované polypeptidy vynálezu patří ty, které překlenují nebo jsou v lipid kinázové doméně, jmenovitě aminokyseliny 2326-2644 Seq ID 2. nebo sekvence vykazující s ní podstatou homologii. Výše definované fragmenty z těchto oblastí jsou zvláště preferované. Polypeptidy a jejich fragmenty mohou obsahovat změny aminokyselin jak je uvedeno výše, včetně substitucí na jedné nebo více pozicích z pozic 2475, 2480, 2494, které odpovídají poloze rad3 substitucí popsaných v následujících příkladech. Mezi preferované substituce patří D2475A, N2480K a D2494E.

Polypeptidy vynálezu mohou být použity v in vitro nebo in vivo systémech buněčných kultur pro studium role ATR jako kontrolního genu. Například zkrácené nebo modifikované (např. modifikované v oblasti lipid kinázové domény) polypeptidy ATF mohou být včleněny do buňky s cílem narušit normální kontrolní funkce, které jsou v buňce.

Polypeptidy vynálezu mohou být zavedeny do buněk in šitu exrapsí polypeptidu z rekombinantního expresního vektoru (viz dále). Expresní vektor může obsahovat indukovatelný promotor pro řízení exprese polypeptidu.

Použití savčích hostitelských buněk je možné předpokládat tehdy, jestliže se chce dosáhnou různých post-translačních modifikací (např. myristoilace (myristolation), glykosylace, zkrácení, lapidace (lapidation) a fosforylace tyrosinu, šeřinu nebo threoninu) což může být nutné pro dosažení optimální biologické aktivity rekombinantních produktů exprese vynálezu.

Takovéto systémy buněčných kultur, ve kterých jsou exprimovány polypeptidy vynálezu, mohou být použity v testovacích systémech k identifikaci možných substancí, které interferují s nebo zesilují kontrolní funkce v buňce (viz dále).

V dalším pohledu polypeptidy vynálezu zahrnují protein Seq ID No. 4 a jeho fragmenty z jiné oblasti než fragment složený z aminokyselin 713 až 1778. Mezi zvláště preferované fragmenty patří ty, které zahrnují rezidua 2082 až 2386 (lipid kinzová doména) a oblast leucinového zipu (leucine zipper) 298-347 a 576-591. Dále je preferován fragment obsahující konzervovanou oblast 1103-1111. Takovéto polypeptidy a fragmenty mohou být připraveny a použity jak je popsáno výše.

Vynález také poskytuje polypeptidy s významnou homologii k proteinu Seq ID NO. 4 a jeho fragmentům. V této souvislosti se za významnou (podstatnou) homologii pokládá sekvence s minimálně 70 %, např. 80 % nebo 90 % aminokyselinovou homologii (identitou) úseku 30 aminokyselin se sekvencí Seq. ID No. 4 kromě lipid kinázové domény a C-konce (rezidua 2082-2386), kde se za podstatnou homologii pokládá minimálně 80%, nebo lépe alespoň 90 % homologie (identita) v úseku 50 aminokyselin.

C. Vektory

Polynukleotidy vynálezu mohou být včleněny do rekombinančních vektorů schopných replikovat se. Vektor se může použít pro replikaci nukleové kyseliny v kompatibilní hostitelské buňce. Vynález proto také poskytuje metodu pro tvorbu polynukleotidů vynálezu včleněním polynukleotidu vynálezu do replikačního vektoru, vpravením vektoru do kompatibilní hostitelské buňky a pěstováním hostitelské buňky za podmínek, které vyvolají replikaci vektoru. Vektor se může z hostitelských buněk znova získat. Vhodné hostitelské buňky jsou popsány dle v souvislosti s expresními vektory.

-8CZ 292808 B6

D. Expresní vektory

Je žádoucí, když polynukleotidy vynálezu ve vektoru jsou funkčně spojené (operably linked) s řídicí sekvencí, která je schopná zajistit expresi kódující sekvence hostitelskou buňkou, tj. když vektor je expresním vektorem.

Termín „funkčně spojený“ se vztahuje k vzájemné pozici, kde jsou popsané složky v takovém vztahu, který umožňuje jejich zamýšlenou funkci. Řídicí sekvence „funkčně spojená“ s kódující sekvencí je přiligována, tak, že za podmínek vhodných pro řídicí sekvenci dojde k expresi kódující sekvence.

Takovýmito vektory může být transformována výše popsaná vhodná hostitelská buňka s cílem exprimovat polypeptid vynálezu. Vynález tedy dále poskytuje postup pro přípravu polypeptidů podle vynálezu, který zahrnuje kultivaci hostitelské buňky transformované nebo transfektované expresním vektorem jak je popsáno výše za podmínek, kdy dochází k expresi kódující sekvence vektoru, která kóduje polypeptid a získání vytvořeného proteinu.

Vektory mohou být například plazmidy, virové nebo fágové vektory poskytnuté s počátkem replikace (origin of replication) a případně i promotorem pro expresi daných polynukleotidů a případně i regulátorem promotoru. Vektory mohou obsahovat jeden nebo více genů selekčních markérů, například gen rezistence na ampicilin v případě bakteriálních plazmidů nebo rezistenci na neomycin v případě savčích vektorů. Vektory mohou být použity in vitro, například pro tvorbu RNA nebo použity k transfekci nebo transformaci hostitelských buněk. Vektory také může být upraven pro použití in vivo, například v metodách využívaných při genové terapii.

Vynález dále poskytuje hostitelské buňky transformované nebo transfekované vektory pro replikaci a expresi polynukleotidů vynálezu. Buňky budou vybrány tak, aby byly kompatibilní s daným vektorem a mohou to být například buňky bakteriální, kvasniční, hmyzí nebo savčí.

Polynukleotidy vynálezu mohou být také včleněny do výše popsaných vektorů v opačném (antisense) směru s cílem získat antisense RNA. Antisence RNA nebo jiné „antisense“ polynukleotidy mohou být také připraveny synteticky. Takovéto antisense nukleotidy se mohou použít pro řízení hladiny ATR nebo jeho variant nebo druhových homologů.

Promotory a ostatní expresní regulační signály mohou být vybrány tak, aby byly slučitelné s hostitelskou buňkou, pro kterou byl expresní vektor navržen. Například kvasniční promotoiy zahrnují S. cerevisiae GAL4 a ADH promotory, S pombe nmtl a adh promotory. Savčí promotory zahrnují methanolthioneinový promotor (metallothionein promotér), který reaguje na ionty těžkých kovů, například kadmia. Virové promotory jako např. „SV40 large T antigen“ promotor nebo promotory adenovirů mohou být také použity. Všechny tyto promotory jsou snadno dostupné.

E. Protilátky

Vynález také poskytuje monoklonální nebo polyklonální protilátky proti polypeptidům vynálezu nebo jejich fragmentům. Vynález také popisuje proces pro produkci monoklonálních nebo polyklonálních protilátek proti polypeptidům vynálezu. Monoklonální protilátky mohou být připraveny konvenční hybridomovou technologií s využitím polypeptidů vynálezu nebo jejich polypeptidových fragmentů jako imunogenů. Polyklonální protilátky mohou být také připraveny konvenčními způsoby, které zahrnují imunizaci hostitelského zvířete (například krysy nebo králíka) polynukleotidy vynálezu nebo jejich peptidovými fragmenty a získání imunního séra.

-9CZ 292808 B6

Aby mohly být takovéto protilátky připraveny poskytuje vynález polypeptidy vynálezu nebo jejich fragmenty připojené (haptenisad to) kjinému polypeptidu. Takovéto komplexy jsou použity jako imunogeny u savců nebo lidí.

Preferované protilátky vynálezu jsou schopné selektivní vazby proteinu lidského ATR, tj. s afinitou nejméně lOx ale lépe alespoň lOOx větší než s rad3 proteinem. Takovéto protilátky mohou být získány rutinními experimenty např. výběrem oblastí proteinu ATF se sekvencemi odlišnými od odpovídajících oblastí rad3, přípravou peptidů obsahujících takovéto sekvence a použitím takovýchto peptidů jako imunogenů. Po produkci daných protilátek se ověří jejich vazebné vlastnosti, referované protilátky vynálezu zahrnují ty, které mají schopnost selektivní vazby na lipid kinázovou doménu (definovanou výše) lidského ATF proteinu. Navíc protilátky, které jsou schopné vazby lidské a kvasniění (S. pombe) lipid kinázové domény s podobnou afinitou ale ne k doménám ATM rodiny proteinů, pak představují další stránku vynálezu. Takovéto protilátky mohou být připraveny proti peptidům z lipid kinázové domény, která odpovídá oblastem, které byly shledány shodnými nebo podstatně shodnými v lidských a kvasničních genech.

Pro účely tohoto vynálezu termín „protilátka“, pokud není uvedeno jinak, zahrnuje fragmenty celých protilátek, které si zachovávají svoji vazebnou aktivitu k cílovému tumorovému antigenu. Takovéto fragmenty zahrnují Fv, F(ab') a F(ab)₂ fragmenty a také jedno-řetězcové protilátky. Kromě toho protilátky a jejich fragmenty mohou být polidštěné protilátky (humanised antibodies) jak je to popsáno v EP-A-239400.

Protilátky mohou být použity v metodách detekce polypeptidů vynálezu přítomných v biologických vzorcích metodami, které zahrnují:

a) přípravu protilátek vynálezu;

b) inkubaci biologického vzorku s danou protilátkou za podmínek, které umožňují tvorbu komplexu protilátka-antigen; a

c) určení, jestliže došlo k tvorbě komplexu antigen-protilátka s danou protilátkou.

Mezi vhodné vzorky patří extrakty z dělicích se buněk, např. leukocytů nebo rakovinných buněk, zahrnující leukemické buňky a pevné nádory, jako například tumory prsu, vaječníku, plic, tračníku pankreatu, varlat, jater, mozku, svalů a kostí.

Protilátky vynálezu mohou být navázány na pevný povrch a/nebo připraveny ve formě soupravy ve vhodném obalu společně s příslušným činidly, kontrolami, instrukcemi atd.

F. Zkoušky

Potenciální strategií pro návrh a vývoj léčiv pro protirakovinnou léčbu je narušení kontrolních bodů buněčného cyklu, ať už by se jednalo o nový postup nebo v kombinované terapii s cílem zvýšit specifickou toxicitou současných chemoterapeutických látek. Například alkylační látky (např. nitrogen mustard) se používají jako chemoterapeutické látky, které poškodí DNA v rychle se dělících buňkách, což vede k smrti buňky. Toxicita takovéto látky může být snížena mechanismy opravujícími DNA a cestami kontrolních bodů. Narušení takovýchto mechanismů zvýší tedy účinnost terapeutických sloučenin navržených pro poškození DNA. Narušení ATR kontrolních bodů bude zejména užitečné tehdy, když tumorové buňky již ztratily ostatní kontrolní body nebo na poškození reagující geny, protože tyto ostatní geny můžou být schopné doplnit ztrátu funkce ATF v netumorových buňkách, což vede k dalšímu zvýšení účinnosti chemoterapeutických látek.

-10CZ 292808 B6

Cílem při vývoji proti rakovinných sloučenin je lipid kinázová aktivita ATF, protože výsledky prezentované v následujících příkladech naznačují, že kinázová doména je nezbytná pro funkci ATR. Předkládaný vynález tedy poskytuje testovací metodu pro zjišťování možných látek pro proti-rakovinnou léčbu, která zahrnuje:

a) přípravu polypeptidu vynálezu, který neztratil lipid kinázovou aktivitu a substrátu pro danou kinázu za podmínek a s takovými reagenciemi, za kteiých bude kinázová aktivita působit na substrát,

b) smíchání daného polypeptidu a substrátu s testovanou látkou,

c) měření stupně poklesu kinázové aktivity daného polypeptidu, a

d) výběr vhodné látky, která snižuje aktivitu.

Test může být proveden in-vitro, například v jamkách mikrotitrační desky. Takovýto formát může být snadno adaptován pro automatizaci, která umožňuje testování velkého množství potenciálních substancí.

Substrátem může být protein nebo lipidový substrát přírodního nebo syntetického původu, na který bude působit polypeptid vynálezu. Polypeptid vynálezu bude substrát obvykle fosforylovat.

Odborníci si mohou vybrat jakýkoliv vhodný formát výkonných testů. Typicky polypeptid vynálezu, který vykazuje lipid kinázovou aktivitu, se zachytí k pevnému povrchu za přítomnosti substrátu a buněčný a další komponent, které jsou většinou nezbytné pro aktivitu. Značený fosfát a testovaná látka se přidají do směsi současně nebo po sobě v obojím pořadí. Po uplynutí příslušné reakční doby (většinou několik minut, ale v každém případě dostatečně dlouho pro to, aby došlo k fosforylaci substrátu za nepřítomnosti testované látky) se stanoví množství volného fosfátu, např. precipitací fosfátu. Testovaná látka, která inhibuje kinázovou aktivitu bude inhibovat inkorporaci volného fosfátu do substrátu a tak když je nalezen volný fosfát, naznačuje to přítomnost inhibice.

Odborníci můžou využít i jiné metody.

Testované látky můžou být při počátečním testování navzájem seskupené, takže je možné v jedné reakci otestovat třeba 10 vzorků a v případě pozitivního výsledku provést individuální testování.

Vhodné látky pro testování zahrnují peptidy, zejména o velikosti 5-20 aminokyselin, založené na sekvenci kinázové domény nebo variantách tohoto peptidu, kde je nahrazeno jedno nebo více reziduí tak, jak je opsáno výše. Mohou být použity peptidy ze skupiny peptidů s náhodnými sekvencemi nebo sekvencemi,které byly upraveny v souladu s cílem získat maximálně rozsáhlý soubor peptidů. Další možné látky zahrnují inhibitoiy kináz, což jsou malé molekuly jako cyklosporinům a staurosporinům příbuzné látky (Cyklosporin-like and stauroporin-like compouds), nebo další komerčně dostupné látky ze skupiny malých molekul inhibitorů.

Testované látky, které vykazují aktivitu v in vitro pokusech popsaných výše mohou být následně testované v systémech in vívo, jako například v kvasničních nebo savčích buňkách, které se vystaví působení inhibitorů a testují na aktivitu kontrolních bodů.

Ukázali jsme také, že Rad3 vykazuje protein kinázovou aktivitu. Cílové substráty Rad3 protein kinázové aktivity se můžou zjistit zahrnutím testovaných sloučenin do testů na kinázovou aktivitu. Rad3 protein je resuspendován v kinázovém pufřu a inkubován buď za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky (např. kasein, histon H1 nebo příslušný substrátový peptid). Přenesené množství (v molech) fosfátu kinázami se zjišťuje autoradiografíí nebo scintilačně. Přenos fosfátu na testovanou látku svědčí o tom, že testovaná látka je kinázou.

-11 CZ 292808 B6

Látky pozměňující Rad3/ATR lipid kinázovou nebo Rad3 protein kinázovou aktivitu se můžou zjišťovat inkubací testované látky a

Rad3/ATR získaného imunitní purifíkací z buněk přirozeně produkujících Rad3/ATR, s Ras3/ATR získaným z rekombinantních prokaryotních nebo eukaryotních buněk produkujících enzym, nebo s pufirikovaným Rad3/ATR, a určením vlivu testované látky na aktivitu Rad3/ATF. Aktivita Rad3/ATR lipid kinázové nebo Rad3 protein kinázové domény může být měřena určením množství (v molech) ³²P-fosfátu přeneseného kinázami z gama-P-ATP na sebe samu (autofosforylace) nebo na vnější substrát, jako např. lipid nebo protein. Množství fosfátu včleněného do substrátu se měří scintilačně nebo autoradiografií. Zvýšení množství přeneseného fosfátu (počtu molů) na substrát v přítomnosti testované látky v porovnání s množstvím přeneseného fosfátu (počtu molů) bez testované látky ukazuje, že testovaná látka působí jako aktivátor dané kinázové aktivity. A opačně snížené množství přeneseného fosfátu (počtu molů) na substrát v přítomnosti testované látky v porovnání s množstvím přeneseného fosfátu (počtu molů) bez testované látky ukazuje, že testovaná látka působí jako inhibitor dané kinázové aktivity.

V testu, který je nyní preferován, je protilátka proti Rad3/ATR připojená k agarózovému nosiči (agaróze beads) inkubována s buněčným lyzátem připraveným z hostitelských buněk produkujících Rad3/ATR. Nosič se pak opláchne (aby se odstranily na nosič nespecificky navázané proteiny) a nosič je potom resuspendován v kinázovém pufru (např. 25 mM K-HEPES pH 7,7, 50 mM chlorid draselný, 10 mM chlorid hořečnatý, 0,1 % Nonidet-P-40, 20% glycerol, 1 mM DTT). Přidáním 100 μΜ gama-³²P-ATP (4 pCi/mM) a exogenního substrátu (např. lipidu nebo minut. Aktivita kinázy je měřena určením množství (v molech) ³²P-V preferovaném případě hostitelské buňky postrádají vnitřní Rad3/ATR aktivitu. Selektivita látky, která upravuje lipis kinázovou aktivitu Rad3/ATR, může být stanovena porovnáním aktivity na Rad3/ATR sjejí aktivitou na např. jiným známým fosfatidylinositol-3 (PI—3) příbuzných kinázách. Kombinace rekombinantních Rad3/ATF produktů vynálezu s jinými rekombinantními PI-3 příbuznými kinázovými produkty v řadě nezávislých pokusů poskytne systém pro vývoj selektivních modulátorů Rad3/ATR kinázové aktivity. Podobně, selektivita sloučeniny, která moduluje protein kinázovou aktivitu Rad3, může být určena ve vztahu k jiným proteinovým kinázám, např. DNA dependentním protein kinázám nebo ATM:

Důkaz, že rad mutant rad.D2249E (viz příklady) může působit jako dominantní negativní mutant navíc naznačuje účast v jednom nebo více proteinových komplexech, a takovéto komplexy samy o sobě mohou být cílem pro terapeutické působení. Ukázali jsme, např. Rad3 se může jednak spojit sám se sebou nebo spojit sATR. Je tedy pravděpodobné, že Jtatf/ATR působí jako multimemí (multimeric) molekuly. Mutantní kvasniční rad nebo lidské ATR geny nebo jejich odvozeniny (které také postrádají rad/ATR aktivitu) mohou být včleněny do buňky, aby působily jako dominantní negativní mutanty. Jestliže tedy například exprese dominantního negativního mutantu (např. ATR D2475A, N2480K nebo D2494E) v tumorových buňkách vede ke zvýšené citlivosti k ozáření, ukazuje to, že přírodní ATR je stále aktivní a tedy cílem pro terapeutické látky.

Vzájemně se ovlivňují proteiny včetně komponent multimemích proteinových komplexů zahrnujících Rad3 nebo ATR mohou být identifikovány v následujících experimentech.

První roztok uvažovaný ve vynálezu je dvouhybridní test. Dvouhybridní systém byl vyvinut pro kvasnice (Chie et al., 1991) a je založen na funkční in vivo rekonstituci transkripčního faktoru,

- 12CZ 292808 B6 i

který aktivuje reporterový gen. Konkrétně polynukleotid kódující protein, který vzájemně reaguje s Rad3/ATR je izolován:

- transformací nebo transfekcí vhodné hostitelské buňky konstruktem DNA, který obsahuje reporterový gen řízení promotorem regulovaným transkripčním faktorem s DNA vazebnou doménou a aktivující doménou,

- expresí první hybridní DNA sekvence v hostitelské buňce kódující první syntézu (fusion) části nebo celého Rad3/ATR a bud’ DNA vazebné oblasti nebo aktivující oblasti transkripčního faktoru,

- expresí knihovny (v hostitelské buňce) druhé hybridní DNA sekvence kódující druhou syntézu části nebo celého domnělého Rad3/ATR vazebného proteinu a DNA vazebnou doménou nebo aktivační doménu transkripčního faktoru, který není inkorporován v první syntéze,

- detekcí vazby proteinu reagujícího sRad3/ATR kRad3/ATR vdané hostitelské buňce detekcí produktu reporterového genu v hostitelské buňce,

- izolací druhé hybridní DNA sekvence kódující interagující protein z dané hostitelské buňky.

V současné době jsou při tomto postupu preferované: lexA promotor křížení exprese reporterového genu, lacZ reporterový gen, transkripční faktor obsahující lexA DNA vazebnou oblast a GAL4 transaktivační doménu a kvasniční hostitelské buňky.

Další testy pro identifikaci proteinů, které reagují s Rad3 nebo ATR, mohou zahrnovat imobilizaci Rad3/ATR nebo testovaného proteinu, detekční značení nepřichyceného vazebného partnera, společnou inkubaci vazebných partnerů a určení množství navázané značky. Nesvázaná značka naznačuje, že testovaný protein reaguje s Rad3/ATR.

Jiný typ testu pro identifikaci proteinů reagujících s Rad3 nebo ATR může zahrnovat imobilizaci Rad3/ATR nebo jejich fragmentu na pevný povrch potažený (nebo nasycený) fluorescenční látkou, značení testovaného proteinu sloučeninou schopnou excitace flourescenční látky, aplikaci značeného testovacího proteinu na imobilizovaný Rad3/ATR, detekci světelné emise produkované fluorescenční látkou a identifikaci vzájemně reagujících proteinů jako testovaných proteinů, které vyvolaly emisi světla fluorescenční látkou. Případně může být testovaná protein imobilizovaný a v testu může být značený Rad3/ATR.

Sloučeniny, které mění vzájemné působení mezi Rad3/ATR a ostatními buněčnými komponenty mohou být použity při různých metodách léčení rakoviny. Jestliže například specifická forma rakoviny je výsledkem mutace jiného genu než genu ATR (např. P53 genu), látka, která inhibuje transkripci nebo enzymatickou aktivitu ATR a tedy kontrolní místo G2 fáze buněčného cyklu, může být použita k zvýšení citlivosti rakovinových buněk k chemoterapii nebo ozařování. Terapeutická hodnota takovéto látky spočívá ve faktu, že současná radioterapie nebo chemoterapie nedělá ve většině případů nic pro překonání schopnosti p53 mutovaných rakovinných buněk opravit poškození DNA vyvolané jako výsledek léčby. Výsledkem je, že rakovinná buňka může jednoduše opravit poškození DNA. Modulující látky vynálezu mohou být tedy použity pro zesílení činnosti chemoterapie a radioterapie, nebo se můžou použít přímo jako chemoterapeutika.

Testy pro identifikaci sloučenin, které ovlivňují interakci Rad3/ATR s jinými proteiny můžou zahrnovat:

- transformaci nebo transfekci vhodných hostitelských buněk konstruktem DNA, který obsahuje reporterový gen řízený promotorem regulovaným transkripčním faktorem s DNA vazebnou doménou a aktivující doménou,

-13CZ 292808 B6

- expresi první hybridní DNA sekvence v hostitelských buňkách kódující první syntézu (fusion) části nebo celého Rad3/ATR a buď DNA vazebné oblasti nebo aktivující oblasti transkripčního faktoru,

- expresi druhé hybridní DNA sekvence v hostitelských buňkách kódující část nebo celý protein, který interaguje s Rad3/ATR a buď DNA vazebnou oblast nebo aktivující oblast transkripčního faktoru, který není inkorporován v první syntéze,

- vyhodnocení vlivu testované látky na interakci mezi Rad3/ATR a interagujícím proteinem detekcí vazby interagujícího proteinu k Rad3/ATR v dané hostitelské buňce měřením tvorby produktu reporterového genu v hostitelské buňce měřením tvorby produktu reporterového genu v hostitelské buňce za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky, a

- identifikace modulujících sloučenin jako těch testovaných sloučenin, které ovlivňují tvorbu produktu reporterového genu v porovnání s tvorbou produktu reporterového genu za nepřítomnosti modulující látky.

V současné době jsou při tomto postupu preferované: lexA promotor k řízení exprese reporterového genu, lacZ reporterový gen, transkripční faktor obsahující lexA DNA vazebnou oblast v GAL4 transaktivační doménu a kvasniční hostitelské buňky.

Další typy testů pro identifikaci sloučenin, které mění interakci mezi Rad3/ATR a ovlivňujícím proteinem zahrnují imobilizaci Rad3/ATR nebo přirozeného proteinu reagujícího s Rad3/ATR, detekční značení neimobilizovaného vazebného partnera, společnou inkubaci vazebných partnerů a určení vlivu testované látky na množství navázané značky. Snížení množství značky navázané za přítomnosti testované látky v porovnání s množstvím navázané značky za nepřítomnosti testované látky ukazuje, že testovaná látka je inhibitorem interakce mezi Rad3/ATR a proteinem. Opačně, zvýšené množství navázané značky za přítomnosti testované látky v porovnání s množstvím značky navázané za nepřítomnosti testované látky ukazuje, že testovaná látka je aktivátorem interakce mezi Rad3/ATR a proteinem.

Další metoda používaná vynálezem pro identifikaci sloučenin, které ovlivňují vazbu mezi Rad3/ATRa interagujícím proteinem zahrnuje imobilizaci Rad3/ATR nebo jejich fragmentu na pevný povrch potažený (nebo nasycený) fluorescenční látkou, označení interagujícího proteinu sloučeninou schopnou excitace fluorescenční látky, inkubaci imobilizovaného Rad3/ATR se značeným interagujícím proteinem za přítomnosti nebo nepřítomnosti testované látky, detekci světelné emise produkované fluorescenční látkou a identifikaci modulující sloučeniny jako té testované látky, která ovlivní emisi světla fluorescenční látkou v porovnání s emisí světla fluorescenční látkou za nepřítomnosti testované látky. Případně může být sRad3/ATR interagující protein zmobilizovaný a v testu může být značený Rad3/ATR.

Ukázali jsme, že Rad3 vzájemně reaguje s ATR. Proto výše zmíněné metody mohou být také použity k identifikaci látek, které ovlivňují interakci mezi Ra3 a ATR, kde interagující protein popsaný v testovacích metodách je buď Rad3 nebo ATR.

Dále jsme ukázali, že Rad3 se může vázat mezi sebou, což by velmi pravděpodobně naznačovalo, že také ATR se mezi sebou může vázat. Proto výše zmíněné metody mohou být také použity k identifikaci látek, které ovlivňují interakci mezi Rad3-Rad3 a také interakce ATR-ATR.

Takovéto látky mohou být použity terapeuticky k rozrušení ATR-ATR interakcí a zvýšení citlivosti tumorových buněk k chemoterapii a/nebo radioterapii. Vynález tedy poskytuje také metodu pro vyhledávání vhodných substancí pro proti-rakovinou terapii, která zahrnuje:

a) (i) inkubaci polypeptidu vynálezu s jiným polypeptidem vynálezu (který může být ten samý nebo jiný) za podmínek, které umožňují navázání prvního polypeptidu na druhý a tvorbu komplexu,

-14CZ 292808 B6 (ii) inkubaci tohoto komplexu a testované látky,

a) inkubaci polypeptidu vynálezu s jiným polypeptidem vynálezu (který může být ten samý nebo jiný) za podmínek, které umožní navázání prvního polypeptidu na druhý a tvorbu komplexu za přítomnosti testované látky, a

b) určení, jestli testovaná látka inhibuje vazbu prvního polypeptidu na druhý polypeptid, a

c) výběr vhodné substance, která inhibuje vazbu prvního polypeptidu na druhý polypeptid.

Je-li to možné, první a druhý polypeptid by měly být navzájem rozlišené. Například první polypeptid a druhý polypeptid mohou být oba ATR, nebo oba Rad3, nebo jeden může být ATR a jeden Rad3, nebo odvozeny bud’ ATR nebo Rad3, které se uchovaly vazebnou aktivitu. Když jsou oba polypeptidy ATR nebo Rad3, měly by být v těchto testech použity pokud možno odlišitelné formy ATR/Rad3. Odlišeny můžou být například značením jednoho z polypeptidů. Jako značka se může použít radioaktivní značka, epitopové nebo jiné polypeptidové značky (tags), jako například glutation-S-transferáza (glutain-S-transferase). Například jedna forma Rad3 může mít jeden typ epitopové značky a druhá forma by pak měla jiný typ, což by umožňovalo jejich imunologické rozlišení, takže navázání jednoho z nich k druhému může být zjištěné kvantitativně nebo kvalitativně. Preferovaná metoda zahrnuje imobilizaci prvního polypeptidu například na agarózový nosič (agarózové beads) nebo na pevný povrch a druhý polypeptid může být volně v roztoku. Vazba je potom určena metodami popsanými výše, které jsou odborníkům známé.

Vynález se také týká protilátek (např. monoklonálních a polyklonálních protilátek, jednořetězcových protilátek, chimérické protilátky, CDR-štěpové protilátky (CDR-grafted antibodies) a podobně) a jiných vazebných proteinů (jako jsou například ty identifikované pomocí testů popsaných výše), které jsou specifické pro Rad3 protein kinázovou doménu nebo Rad3/ATR lipid kinázovou doménu. Vazebné proteiny jsou užitečné zase pro purifikaci rekombinantních nebo přirozeně se vyskytujících enzymů a identifikaci buněk produkujících takové enzymy. Testy pro detekci a kvantifikaci proteinů v buňkách a v tekutinách můžou zahrnovat systémy s jednou protilátkou nebo více protilátkami v „sendvičovém“ formátu. Vazebné proteiny jsou také zřejmě účinné v ovlivňování (např. blokování, inhibice nebo stimulace) interakcí enzym/substrát nebo enzym/regulátor.

Modulátory Rad3/ATR můžou mít vliv na kinázovou aktivitu, její lokalizaci v buňkách a/nebo jejich interakci s členy kontrolních míst buněčného cyklu. Mezi selektivním modulátoiy můžou patřit například polypeptidy nebo peptidy, které se specificky váží na Rad3/ATR nebo nukleové kyselině Rad3/ATR a/nebo jiné nepeptidové sloučeniny (např. izolované nebo syntetické organické molekuly), které specificky reagují s Rad3/ATR nebo nukleové kyselinou Rad3/ATR. Mutantní formy Rad3/ATR, které ovlivňují enzymatickou aktivitu nebo buněčnou lokalizaci nemutovaného Rad3/ATR, jsou také uvažovány v tomto vynálezu.

Kromě toho jako modulátory Rad3/ATR kinázové aktivity a Rad3/ATR interakcí můžou být testovány kombinační knihovny (combinatotial libraries), peptidy a kopie peptidů, definované chemické entity, oligonukleotidy, knihovny přírodních produktů (natural product libraties) s pomocí výše popsaných testů.

F. Terapeutické použití

Modulátory aktivity Rad3/ATR, včetně inhibitorů jejich lipid kinázové a protein kinázové aktivity, mohou být použity při protinádorové terapii. Zvláště mohou být tyto látky použity ke

-15CZ 292808 B6 zvýšení citlivosti rakovinových buněk k chemoterapii a/nebo radioterapii na základě jejich schopnosti narušit regulační funkce Rad3/ATR v buněčném cyklu.

Vynález tedy zajišťuje použití sloučenin, které mají aktivitu Rad3/ATR a které jsou identifikovány na základě vyhledávacích pokusů popsaných výše, v metodách léčby rakoviny.

V jednom případě jsou zmíněné látky schopné inhibice rad3/ATR lipid kinázové aktivity a/nebo Rad3 protein kinázové aktivity. V jiném případě jsou zmíněné látky schopné inhibovat interakci mezi samotným ATR a/nebo mezi ATR a jiným interagujícím proteinem, kteiý může například tvořit část multimemího proteinového komplexu.

Je nutné uvědomit si, že termínem „sloučenina“ jsou v tomto kontextu myšleny také látky, které byly vybrány výše popsanými testy.

V typickém případě jsou sloučeniny upraveny pro klinickou aplikaci jejich smísením s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo rozpouštědlem. Vyvinuta mohou být například pro místní, mimostřevní (parenteral), intravenózní, nitrosvalový, podkožní, intraokulámí nebo transdermální aplikaci. Přednostně je sloučenina používána ve formě vhodné pro injekční aplikaci. Je vhodná přímá injekce do pacientova tumoru, protože tak je možné koncentrovat terapeutický efekt na úrovni postižené tkáně. Sloučeniny proto mohou být kombinovány s jakýmkoliv nosičem, který je farmakologicky akceptovatelný pro injekovatelnou formu, přednostně pro přímou injekci na místo ošetření. Farmaceutickým nosičem nebo ředicí látkou mohou být například sterilní nebo izotonické roztoky.

Výše dávky sloučeniny může být upravena podle různých parametrů, zvláště podle použité sloučeniny, podle věku, váhy a stavu ošetřovaného pacienta, podle použitého způsobu aplikace, patologičnosti tumoru a požadovaného klinického režimu. Jako vodítko lze říci, že množství sloučeniny, použité k aplikaci injekčně je přiměřené v dávce od 0,01 mg/kg do 30mg/kg, přednostně pak od 0,1 mg/kg do 10 mg/kg.

Popsané stanovení způsobu aplikace a velikosti dávky je zamýšleno pouze jako vodítko, jelikož zručný praktik bude schopen stanovit snadno optimální způsob aplikace a dávku pro jakéhokoliv jednotlivého pacienta a jeho stav.

Aplikované sloučeniny mohou zahrnovat polypeptidy nebo nukleové kyseliny. Nukleové kyseliny mohou kódovat polypeptidy nebo mohou kódovat „antisense“ konstrukty, které inhibují expresi buněčných genů. Nukleové kyseliny mohou být například aplikovány lipofekcí (lipofection) nebo pomocí virových vektorů. Nukleová kyselina může tvořit například část virového vektoru jako je adenovirus. Pokud jsou použity virové vektory, je aplikována velikost dávky v zásadě mezi 10⁴ a 10¹⁴ pfú/ml, přednostně 10⁶ až 10¹⁰ pf/ml. Termín pfú (z anglického plague forming unit) odpovídá infekčnosti roztoku viru a je stanoven infekcí vhodné buněčné kultury a měřením (obecně po 48 hodinách) počtu skvrn infekčních buněk. Postupy pro stanovení titru pfú virového roztoku jsou dobře popsány v literatuře.

Těmito metodami může být ošetřen jakýkoliv typ rakoviny, například leukemie nebo pevné nádory jako jsou nádory prsu, vaječníků, plic, tračníku, pankreatu, varlat, jater, mozku, svalů a kostí. Přednostně pak nádorů, které mají normální funkci ATR.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Vztah mezi ATR, rad3, mei-41, MEČI, TELÍ a ATM.

Celkové struktury ATR, Rad3, Mei-41, Meclp, Tellp a ATM.

Legenda: otevřený čtvereček - domény Rad3, šrafovaná políčka -kinázová doména.

-16CZ 292808 B6

Dendrogram založený na porovnání sekvencí (sequence alingments) vytvořený metodou Clustal (PAM250) s použitím softwaru DNA stár. Rad3/ESRl/mei-41/ATR jsou si vzájemně bližší než vůči ATM a TELÍ. Sekvence rad3 a ATM)sou dostupné v databázi EMBL.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Gen rad3 S. pombe je jeden ze šesti genů absolutně nezbytných pro strukturu kontrolních bodů (for the DNA structure checkpoints) u S. pombe (Al-Khodairy and Carr, 1992; Al-Khodairy et al., 1994). Sekvence reprezentující část genu rad3 byla popsána Seatonem et al. (1992). Při pokusech objasnit strukturu tohoto genu z hlediska intronů a exonů jsme zjistili sekvenční anomálie na obou (5' a 3') koncích. Sekvenovali jsme celý gen (viz experimentální postupy) a zjistili, že rad3 je schopný kódovat produkt dlouhý 2386 aminokyselin. C-koncová oblast obsahuje vhodné sekvence (concensus sequences), typické po podtřídu kináz známých jako lipidové kinázy, skupiny, jejíž zakládající člen (founder membre) je pl 10 katalytická podjednotka PI3 kinázy (Hiles et al., 1992).

Bylo popsáno, že zkrácený klon rad3, postrádající amino-konec a kinázovou oblast, doplňuje (complement) genově narušený mutant rad3 - mutant rad3\:p53H1.0 (Jimenez et al., 1992). Takovýto poškozený mutant neodstraňuje potenciální kinázovou doménu. K objasnění role této domény jsme vytvořili neúčinného mutanta metodou záměru genu. Tento mutant má aminokyseliny 1477-2271 rad3 včetně shodné kinázové domény nahrazeny ura4⁺. Tento kmen rad3.d má identické defekty kontrolního místa a citlivost k ozáření a hydroxymočovině jako mutant rad3i. 136 (Našim and Smmith, 1992) a také jako původní mutant rad3::pR3Hl. 0 (Jimenez et al., 1992; Seaton et al., 1992) (data nejsou uvedena). Vytvořili jsme tři samostatné bodové mutanty s mutacemi v předpokládané kinázové doméně rad3 a tyto mutanty jsme použili při experimentech se záměnou genů ke konstrukci kmenů s definovanými kinázovými neúčinnými (null) mutacemi. Všechny tři kmeny rad3.D2230A, rad3.N2235K a rad3.D2249E mají identické fenotypy jako neúčinný mutant rad3.d (data nejsou uvedena), což naznačuje, že je kinázová aktivita potřebná k funkci Rad3. Ve světle našich zjištění se nabízí jedno z vysvětlení výsledků Seatona et al. (1992) a Jimeneze et al. (1992) a to, že částečný sklon může vykazovat interagenní komplementaci mezi zkráceným genem vytvořeným v plazmidu a částečnou genomickou delecí, která zachovává kinázovou funkci. Takováto interpretace by byla v souladu s tím, že Rad3 působí jako dimer nebo multimer.

Jestliže byla neúčinně kinázová elela rad3.D2249E lehce „přeexprimována“ v divokých typech buněk pod řízení modifikovaného promotoru nmtl (Maundrell, 1990), způsobilo to extrémní citlivost k ozáření, což bylo prokázáno proužkovým UV testem a působila jako dominantně negativní mutant (data nejsou uvedena). Jestliže byl stejný kinázový neúčinný konstrukt exprimován ve vyšších hladinách, inhiboval růst (data nejsou uvedena). Prohlídka buněk naznačila, že dělení probíhalo velmi pomalu a u menších buněk. Divoký typ buněk a buňky obsahující prázdný vektor se dělí při velikosti přibližně 15 mikronů, kdežto buňky s vyšší expresí rad3 a rad3.D2249E se dělí při velikosti přibližně 11,2 mikronů (data nejsou uvedena). U S. pombe znamená toto většinou zrychlení mitózy.

Lidský homolog rad3 -ATR

K identifikaci lidské formy rad3 byla použita kombinace metod. Těmito metodami jsme nakloňovali celou kódující oblast lidského genu (viz materiál a metody), který jsme nazvali ATR (z anglického ataxia and rad related). ATR kóduje protein skládající se z 2644 aminokyselin, který je o mnoho bližší produktu rad3 S. pombe, ESR1 S. cerevisiae (Kato and Ogawa, 1994),

-17CZ 292808 B6 a genům mei-41 D. melanogaster (Hari et al., 1995) než lidskému proteinu ATM nebo proteinu Telí £ cerevisiae (Savitsky et al., 1995; Greenwell et al., 1995) a je pravděpodobné, že je to skutečný homolog rad3. ESR1 je alelický k mecl/sad3 mutantů kontrolních bodů (Allen et al., 1994; Weinert et al., 1994), které mají ekvivalentní fenotyp jako rad3. ATR je méně příbuzný lidskému genu kontrolního bodu ATM, obsahujícímu na C konci pravděpodobně lipid kinázovou doménu a mající podobnou celkovou struktur. Sekvenční porovnání jasně ukázala, že geny rad3/ESRl(MECl/SAD3)/mei-41/ATR jsou si vzájemně více příbuzné než jakýkoliv žních s geny ATM či TELÍ, a že ATM je více homologní s TELÍ (Obr. 1).

Gen ATM je exprimován v široké škále tkání (Savitsky et al., 1995). U S. cerevisiae vykazuje ESR1 v motorických buňkách nízkou hladinu exprese, gen je však rychle indukován během meióza I (Kato a Ogawa, 1994). S použitím Norhem blot analýz jsme ukázali, že ATR je také slabě exprimován v mnoha tkáních, ale že je daleko více exprimován ve varlatech (data nejsou uvedena). Jestliže platí, že proteiny ATR, Rad3 a Esrlp jsou si vzájemně více příbuzné než s proteinem ATM, pak vyšší exprese ATR ve varlatech je ve shodě s pozorováním, že Esrlp hraje roli při meiotické rekombinaci (Kato a Ogawa, 1994). S použitím FISCH a PCR analýzy jsme lokalizovali ATR na chromozomu 3q22-3q25 (data nejsou uvedena). Tento region není asociován se známými syndromy se sklony k rakovině.

Pro další výzkum možnosti, že Rad3 působí jako multimer jsme vytvořili dva odlišné konstrukty se značkou (tag) plné délky u rad3 v inducibilním vektoru založeném na pREP. V prvním z nich probíhá translace Rad3 se dvěma myc epitopovými značkami na N konci kdežto ve druhém případě jsou tyto nahrazeny trojnásobnou HA epitopovou značkou. Jestliže jsou oba konstrukty exprimovány najednou v divokém typu buněk, je možné společně vysrážet Rad3 s HA značkami protilátkami specifickými proti myc a Rad3 s myc značkami protilátkami specifickými proti HA (data nejsou uvedena). To ukazuje že protein Rad3 je schopen in vivo asociace se sebou samým. Tyto výsledky jsou plně ve shodě s komplementačními daty Jimenezy et al. (1992).

Ačkoliv gen ATR nemohou doplnit fenotyp mutantů rad3, zkoumali jsme schopnost ATR vytvářet proteinový komplex s Rad3 £ pombe, při expresi ATR a Rad3 £ pombe s myc značkou ve stejné kvasinkové buňce. S použitím protilátek proti ATR (které nesrážejí Rad3 £ pombe, viz materiál a metody) jsme byli schopni současně vysrážet kvasinkový protein. S pomocí specifických protilátek proti myc, které rozeznávají Rad3 £ pombe, jsme byli také schopni vysrážet lidský protein ATR (data nejsou uvedena). Tato data naznačují, že lidský a kvasinkový protein mohou tvořit heteromemí komplexy, což podporuje tvrzení založená na sekvenční podobnosti o blízkém funkčním vztahu mezi těmito homology.

Rad3 proteiny vykazují také kinázovou aktivitu

Zdá se, že kinázová aktivita proteinů Rad 3 in vivo je nepostradatelná pro její funkci, což naznačovali mutační experimenty. Tuto aktivitu jsme studovali detailněji. S použitím buněk £ pombe rad3::ura4 exprimující £ pombe Rad3 s HA značkou jsme byli schopni detekovat významnou protein kinázovou aktivitu, která precipituje s HA specifickými protilátkami pouze v případě, že je Rad3 indukován a která není změněna následným ozářením (data nejsou uvedena). Tato aktivita, která je specifická pro Rad3 či kinázy precipitující společně s Rad3, zřejmě odráží fosforylaci samotného Rad3, jelikož významný proužek o molekulové hmotnosti okolo 200 kD, který je fosforylován, může být detekován pomocí HA protilátek technikou western blotu (data nejsou uvedena). Pokusy identifikovat vhodné in vitro substráty, jako např. základní protein myselinu (myelin basic protein), RP-A či několik purifikovaných proteinů kontrolních míst £ pombe, byly doposud neúspěšné. Jestliže je IP test na detekci kinázy in vitro prováděn s buňkami zvýšeně exprimujícími kinázově neúčinnou (kinase-null) D2249E verzi Rad3, je spojena kinázová aktivita, která precipotuje sHA specifickými protilátkami, velmi snížena (data nejsou uvedena). Tento jev lze vysvětlit několika možnými způsoby. Měřená kinázová aktivita může odrážet přímo aktivitu Rad3. V tomto případě může zbytková aktivita pozorovaná i v případě nefunkčního Rad3 odrážet fakt, že nejsou neznámé případy, kdy

-18CZ 292808 B6 ekvivalenty mutací D až E u jiných proteinových kináz produkovali bilogicky inertní proteiny se zbytkovou in vitro biochemickou aktivitou. Nebo může být kinázová aktivita, která fosforyluje Rad3, způsobena asociovanými proteiny a tyto proteiny mohou interagovat s D2249E mutantním proteinem s menší účinností.

Diskuze

Kontrolní místa drah, kontrolujících postup buněčným cyklem, který následuje po poškození DNA nebo po zásahu v jednotlivých případech ze kterých se skládá buněčný cyklus, jsou značně důležitá pro udržení genetické stability a mohou být považována jako cesty, které potlačují vznik tumorů. Několik genů potlačujících vznik nádorů je těsně spjato s částí kontrolních cest (viz přehledná práce Hartwell a Kaštan, 1994). Jsou to zvláště ty, které ovlivňují přechod z fáze G1 do fáze S a jsou tedy plně odpovědné za buněčný cyklus. Sbližování dvou kvasničních modelových systémů v otázce kontrolních míst jasně naznačuje, že geny podílející se na těchto cestách jsou konzervované. Naše práce rozšířila tuto konzervaci na metazoické buňky a vysvětluje vztah mezi rad3. ESR1 (MEC1/SAD3), mei41 a ATM genem.

V této práci jsme ukázali, že bezchybná sekvence genu rod3 řadí jeho produkt do rodiny protein/lipid kináz vztahujících se kATM. Zvýšená exprese u mutanta rad3 (kinázově defektního) v 5. pombe způsobí dominantně negativní fenotyp, což naznačuje, že Rad3 působí jako člen proteinového komplexu, jehož celistvost je nezbytná pro kontrolní funkci. To je v souladu se zjištěním že všechny deleční mutanty radí, rad9, radí7, rad26 a husí mají fenotyp nerozpoznatelné od rad3.d (Sheldrick a Carr, 1993). Neočekávaný je fakt, že na rozdíl od zbylých kontrolních rad genů, vysoká úroveň zvýšené exprese divokých či mutantních rad3 alel inhibuje buněčný růst a způsobuje, že dochází k mitóze buněk menší velikosti, což naznačuje předčasný vstup do mitozy. Tento drobný (semi wee) fenotyp není pozorován u neúčinných mutantů a může naznačovat interferenci s druhou cestou, jejíž funkce se překrývají s cestou Rad3 a působí inhibičně na mitózu. Kandidátem takové cesty je ATM/TEL1 cesta, u které byly ukázány některé překiývající se funkce s ESR1(MEC1/SAD1) cestou (Morrow et al., 1995).

Struktura ATM je nejvíce příbuzná struktuře proteinu Tllp, který se podílí na údržbě délky telemery (Greenwell et al., 1995), ačkoliv se též zdá, že se funkce ATM vztahuje k produktům Rad3/Esrlo/mei-41. Po prvním objevu genu ATM a zjištění jeho sekvenční příbuznosti k rad3!ESRl genům a k TELÍ nebylo jasné, zdali (jako je tomu v mnoha případech u kvasinek) gen duplikoval a oddělil v kvasinkách nebo zdali tyto dva kvasinkové proteiny popisují konzervované podrodiny těsně příbuzných genů. Důležitým objevem této práce je identifikace lidského genu ATR, kteiý je úzce příbuzný genům rad3IESRllme\-4\. To vymezuje dvě strukturně odlišné podrodiny protein/lipid kináz, vztahující se ke kontrolním cestám, které jsou konzervovány v celé eukaryotické evoluci. Ačkoliv proteiny těchto dvou podrodin mohou mít některé vzájemně se překrývající funkce, kontrolují zřejmé rozdílné procesy. Tak například podrodina rad3 kontroluje v kvasinkách všechny poškození DNA v kontrolních bodech G1 a G2 a to jako odpověď na UV a radiační záření a dále také kontrolní bod S fáze, který zabraňuje mitóze následující po inhibici replikace (Al-Khodaiiy a Carr, 1992, Allen et al., 1994, Weinert et al., 1994). Naproti tomu A-T buňky vykazují nenormální reakce na úzce specifickou skupinu látek poškozující DNA včetně ionizující radiace, bleomycinu a neocarzinostatinu. Tyto látky vyvolávají zlomy pramene DNA jako následek radikálního napadení. Reakce na UV a většinu chemických karcinogenů je normální, stejně jako reakce na inhibici syntézy DNA. Je možné, že některé či všechny zbývající kontrolní body poškození DNA a kontrolní body S fáze jsou kontrolovány ATR.

-19CZ 292808 B6

Experimentální postupy

Kmeny, plazmidy a média

V práci Gutz et al. (1974) jsou popsány standardní genetické techniky, růstové podmínky a média pro 5. pombe. Kmeny spOll S. pombe (ura4.D18, leul.32, ade6.704 h) jsou popsány v práci Murray et al., 1992. Plazmid pSUB41 byl dar S. Subramani (Seaton et al., 1992).

Klonováni rad3 S. pombe

Fragment Kpnl dlouhý 4,0 kb byl oddělen od pSUB41 a sekvenován v obou směrech tak, aby byla získána 5'sekvence rad3. Klon 3' byl identifikován v genomové knihovně hybridizací kolon (Babet et al., 1992) s použitím 3' sondy dlouhé 1 kb odvozené od publikované sekvence rad3. poté byl tento klon sekvenován v obou směrech. Tímto způsobem byla určena úplná sekvence genu rad3.

„Null“ (nuloví) a „kinase dead“ (kinázově mrtví) mutanti rad3

S použitím metodik popsaných v práci Barbet et al., (1992) byl vytvořen konstrukt rad3, ve kterém bylo 794 aminokyselin mezi aminokyselinami 1477 a 2271 (zahrnující kinázovou doménu) nahrazeno genem ura4+. Lineární fragment tohoto konstruktu byl použit k transformaci spOl 1 k uráčil prototropu (to uráčil protoropy). Integrace jediné kopie na lokusu rad3 byla v takto vytvořeném kontrolována Southemovým přenosem. K vytvoření místně (site) specifických kinázových null mutací byl BamHI-Sall fragment rad3 dlouhý 3,él kb na C konci mutován:

A: GTTTCGCCATGGCGCGCTCCCAAACCCAA

B: TTCATCAAACAATATCTTTTCGCATGGCG

C: CAAAAAGACAGTTCAATTCGACATGGATAG s cílem vložit do kinázové domény mutace D2230A, N2235K nebo D2249E. Analogické změny byly již použity dříve při analýze PI3 kinázy VPS34 S. cerevisiae (Schu et al., 1993). Tyto fragmenty byl poté použity k transformaci radfi.d null mutanta a nahrazení genu selektované jejich schopností růst na médiích obsahujících FOA (Grimm et al., 1988). Všechny linie byly kontrolovány Southemovým přenosem. Expresní konstrukty plné délky rad3.D2230A byly vytvořeny v PREP1 a PREP41 (Maundrell, 1990) standardním subklonováním následujícím po vnesením Ndel místa na ATG a vyjmutí tří interních míst Ndel.

Proužkový test citlivosti k UV záření

Exprese z REP1 (vysoká) a REP41 (střední) byla indukována nedostatkem thiaminu po 18 hodin před nanesením na misky. Misky byl ozářeny snižujícími se dávkami UV záření od 0 do 3000 Jm’² podle nastavení na Stratagene Stratalinker.

Klonování a extprese ATR

K izolaci vhodné sondy pro identifikaci cDNA korespondující proti aminokyselinám LGLGDRH (5' oligo; 0DHI8) a HVDF[D/N] (3' oligo; oDH-16) Rad3/Esrlp. Inosin byl inkorporován na pozice čtyřnásobné degenerace a primery byly zakončeny BamVQ. (0DHI8) a EcoRI (0DHI6) pro usnadnění klonování. Sekvenční analýza DNA produktu PCR dlouhého přibližně 100 bp, získaného amplifikací cDNA z periferních krevních leukocytů, ukázala významné shody s NEC/rad3. Tato sekvence byla použita k syntéze nedegenerovaného primeru (oDH-23; GACGCAGAATTCACCAGTCAAAGAATCAAAGAG) pro PCR s dalším degenerovaným primerem (oDH17) navrženým proti aminokyselinové sekvenci KFPP[I/V][L/F]Y[Q/E]WF

-20CZ 292808 B6

Rad3/Esrlp. 174 párů bází dlouhý produkt této reakce byl použit přímo k prozkoumání cDNA knihovny makrofágu. Byly izolovány čtyři pozitivní klony (největší z nich byl cca 3 kb velký).

Souběžně byly prohledávány databáze pomocí genu rad3 S. pombe plné délky. Toto prohledávání získalo z databáze EMBL klon lidské cDNA- HSAAADPDG - potenciálního homologu rad3 (jestliže byl povolen jeden posun čtecího rámce pro 233 bp sekvenci). Tato sekvence velká 233 bp je obsažena v klonu o velikosti 1,6 kb obdrženém od Dr. N. Affara, Human Molecular Genetics Group, Cambridge University, UK.Celý klon (1,6 kb) byl sekvenován a leží uvnitř cDNA klonů identifikovaných na základě degenerované PCR a zkoumání knihoven. Pro identifikaci celého genu byla provedena RACE PCR s cDNA odvozené z placentální a thymové mRNA s použitím instrukcí poskytovaných s Clontech Marathon Kit. Genově specifické markéry byly odvozené z cDNA klonů. Z těchto experimentů byla sestavena sekvence cDNA o velikosti 8239 bp s interními ORF (2644 aminokyselin), 79 bp 5' nekódující oblasti, 194 bp 3' nekódujícím regionem a polyA' koncem. Část této sekvence byla stanovena pouze pomocí PCR. K vyloučení chyb byly sekvenovány klony z minimálně třech nezávislých PCR reakcí v obou směrech.

233 párů bází dlouhá sekvence odpovídá sekvenci nukleotidů 6809 až 7042 (celkem 234 neukleotidů) Seq. ID No. 1 s výjimkou delece jedné báze na pozici 6942. Tato sekvence kóduje aminokyseliny 2244 až 2320 Seq. ID No. 2.

Sekvence 1,6 kb dlouhého inzertu koresponduje s nukleotidy 5725 až 7104 (celkem 1353 nukleotidů) Seq. ID No. 1 a kóduje aminokyseliny 1892 až 2340 Seq. ID No. 2

Nothem blot hybridizace: 1,3 kb produktu PCR byl amplifikován v přítomnosti ³²P-dCTP s použitím primerů 279-3 (TGGATGATGACAGCTGTGTC) a 279-6 (TGTAGTCGCCTGCTCAATGTC). Nylonová membrány obsahující 2 pg polyA⁺ RNA (frakcionované dle velikosti) z kolekce zdrojů lidských tkání (Clontech Laboratories) byla hybridizována podle doporučení výrobce s výjimkou posledního promytí, které bylo provedeno při 55 °C (a ne při 50 °C) k minimalizaci možnosti křížové hybridizace s podobnou sekvencí.

Mapování ATR

Gen ATR jsme lokalizovali na chromozomu 3 kombinací metod založených na fluorescenční hybridizaci in šitu a polymerázové řetězové reakci (PCR). FISH analýza s použitím cDNA klonu identifikovala gen ATR na chromozom 3, přibližně na pozici q22-23. PCR analýza rovněž identifikovala gen ATR na chromozomu 3. Dva primery (oATR23: GACGCAGAATTCACCAGCTAAAGAATCAAAGAG a oATR26: TGGTTTCTGAGAACATTCCCTGA), které amplifikují fragment (257 bp) genu ATR, byly použity na DNA získané z hybridních somatických buněk (člověk/hlodavec) obsahujících různé skupiny lidských chromozomů dostupných v HIGMS Human Genetic Mutant Cell Resository (Drwinga et al.. 1993). K sublokalizaci ATR na specifickou oblast chromozomu 3 bylo použito PCR se stejnými primery. Templáty pro tyto amplifikace představovaly vzorky DNA pacientů se zkráceními na chromozomu 3 (Leach et al., 1994).

Imunoprecipitace (IP) a stanovení kinázové aktivity s Rad3

Ke komplementačním studiím byly geny rad3 S. pombe a lidského ATR klonovány do expresního vektoru pREP41. K označení proteinů byly použity verze vektoru obsahující uvnitř rámce N-koncové tag sekvence - dvojitý myc nebo trojitý HA tag (Griffiths et al., 1995). Označené proteiny byly exprimovány pěstováním v různých médiích neobsahujících thimian (Maudrell, 1990). Buňky kvasinek lyžovaly vlyzovacím pufru (25mM tris. Cl pH 7,5, 60mM B-glycerofosfát, 0,lmM Na3VO4, 1% triton X-100, 50mM NaCl, 2mM EDTA, 50mM NaF, lmM fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF), 5pg/ml leupeptin, 5pg/ml aprotinin, 1 mM DTT) po přídavku skleněných kuliček a následné dvouriiinutové demembranaci. Při imunoprecipitaci bylo

-21 CZ 292808 B6

300 pg celkového proteinového experimentu inkubováno při 4 °C s vhodnou protilátkou po 30 minut. Imunokomplexy se srážely po smíchání s kuličkami s navázaným proteinem G po dalších 30 minut při 4 °C. Při stanovení kinázové aktivity byly imunokomplexy promyty čtyřikrát lyzovacím pufrem a jednou kinázovým pufrem (25 mM Hepes pH 7,7, 50 mM KC1. 10 mM MgC12, 0,1% NP-40, 2% glycerol, 1 mM DTT). Poté byly inkubovány vkinázovém pufru s 10 μΜ ATP (50 Ci/mmol) po dobu 15 minut při 30 °C. Reakce byla zastavena přídavkem 20 μΐ 2X SDS vzorkového pufru. Vzorky byly dále rozděleny na 6% polyakrylamidovém gelu. IP Rad3 obsahovaly několik fosforylovaných produktů, včetně jednoho, který postupoval společně se samotným proteinem Rad3 při westernové analýze.

Použitá literatura

AI-Khodairy, and Car, A.M. (1992). DNA repair mutants defíning G2 checkpoint pathways in Schizosaccharomycespombe. EMBO J. 11, 1343-1350

Al-Khodairy, F., Fotou, E., Sheldrick, K.S., Griffiths, D.J.F., Lehman, A.R. and Carr, A.M. (1994). Identification and charakterization of new elements involved in checkpoints and feedback controls in fission yeast. Mol Biol. Cell 5,147 - 160

Allen, J. T., Zhou, Z., Siede, W., Friedberg, E. C. and Elledge, S.J. (1994). The SAD1/RAD53 protein kinase comntrols multiple checkpoints and DNA damage-induced transcription in yeast. Genes Dev. 8., 2416 - 2428

Barbet, N.C., Muriel, W.J. and Carr, A.M. (1992) Versatile shuttle vetors and genomic libraries for ude with Schizosachaccharomyces pombe. bene 144, 59 - 66

Beamish, H. and Lavin. M.F. (1994). Radiosensitivity in ataxia - telangiectasia: anomailes in radiaton-induced cell cycle delay. Int. J. Radiat, Biol. J. Radiat, Biol. 65, 175-184

Carr. A.M. and Hoekstra, M. F. (1995) The Cellular Responses to DNA Damage. Trends in Cell Biology 5, 32 - 40.

Chien et al., (1991) Proč. Nati. Acad Sci USA 88, 9578-9582

Deng, C., Zhang, P., Harper, J. W. Elledge, S., J. and Leder; P.J. (1995) Mike lacking p2jcn>i/WAFi gjjjjgjgQ _normai development, but are defective in G1 checkpoint control. Cell, (in press).

Drwinga. H. L. Tojia, L.H., Kim, C.H., Greene, A.E., and Mulovor, R.A. (1993), NIGMS Human/Rodent Somatic Cell Hybrid Mapping Panels 1 and 2. Genomics 16:311-314.

El-Deiry, W.S., Tokino, T., Velculescu. V.E., Levý, d.B., Parson, R., Trent, J.M., Lin. D., Mercer, W.E., Kinzler, K.W, and Vogeůstein, B. (1993) WAF1, a potential mediator of p53 tumoour suppression.CeLl 75, 817-825

Enoch, T., Carr, A.M. and Nurse, P. (1992). Fission yest genes involved in coupling mitosis to completion of DNA-replication. Genes Dev. 6,2035-2046.

Greenwell, P.W., Kronmal. S.L., Porter, S.E., Gassenhuber, J., Obermaier. B. and Petes, T.D. (1995) TEL 1, a gene invelved in controlling telomere length in Saccharomyces cerevisiae, in homologous to the human ataxia telangiectasia (ATM) gene Cell submitted

Grinmm, C., Kholi, J. Murray, J.M. and Maundrell, K. (1988) Genetic enginerring of schizosacharomycespombe·. a systém for gene disruption and replacement using the ura4 gene as a selectable merker. Mol. Gen. Genet. 275, 81-86.

-22CZ 292808 B6

Gutz. H., Heslot, H. Leupold, U. and Loprieno, N. (1974), In „Handbook of Genetics“, King R. C., End., Plenům Press, New York, Vol. 1, 395-446.

Hari, K.L., Santerre, A., Sekelsky, J.J., McKim, K.S., Boyd, J.B. and Hawley, RS. (1995) The mei-4 1 gene of Drosophila melanogaster is functionally homologous to the human ataxia telangiec

Harper, J.W., Adami, G., Wei, N., Keyomarsi, K. and Elleedge, S.J. (1993) The 21 dK Cdk interacting protein Cip is a potent inhibitor of G1 cyclin dependent kinases. Cell 75, 805-816.

Hartwell, L.H., and Kasten. M.B., (1994), Cell cycle contrl and Carcer. Science 266, 1821-1828.

Hiles, LD., Otsu., M., Yolinia, S., Fry, M.J., Gout, L, Dhand, R. Panayotou, G., Ruin Larrea., F., Thompson, AI, Totty, N.F., Hsuan, J.J. Countneidge, S.A., Parker, P.J. and. Waterfield M.D. (1992) Phosphatidylinositol 3. kinase: structure and expression of the llOkd catalytic subunit. Cell 70,419-429.

Jimenez, G., Yucel, J., Rowley, R and Subramini S. (1992) 'The rad3; gene of Schizosaccaromyces pombe is involved in mutiple checkpoint functions and in DNA repair. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87,4952-4956

Kato, R. and Ogawa, H. (1994) And essential gene, ESR1, is required for mitotic cell growth, DNA repair and Meiotic recombination in Saccharomyces cerevisiae. Nucleic Acids Res. 22, 3104-3112.

Lamb, J. R., Petit-Frere, C., Groughton, B.C., Leitmann, A.R. and Green, M.H.L. (1989) Inhibition of DNA replication by ionizing radiation is mediated by a trans acting factor. Int. J. Radiat. Biol. 56,125-130.

Leach, R.I., Chině, R., Reus, B.E., Hayes. S., Schantz, L., Dubois, B., Overhauser, J., Ballabiol, A., Drabkín, H., Lewis, B.T., Mendgen, G., and Naylor, S.L. (1994) Regional Localisation of 188 Sequence Tagged Sites on a Somatic Cell Hybrid Mapping Panel for Human Chromosome 3 Genomics 24, 549-556

Maudrell, K. (1990). nmtl of fission yeast. A highly transcribed gene completely repressed by thiamine: J. Biol. Chem. 265. 10857-10864.

Morrow. D.M., Tagle, D.A., Shiloh, Y., Colling F.S. and Hieter. P. (1995) HAT1/TEL1, a Saccharomyces cerevisiae homololgue of the human gene mutated in ataxia telangiectasia, is functionally related to the yeast checkpoint gene MEC1/ESR1. Cell submitted.

Murray, J.M., Doe, C. Schenk, P. Carr, A.M., Lehmann, A.R. and Watts, F.Z. (1992) Cloning and characterization of the 5. pombe radí 5 gene, a homologue to the S cerevisiae RAD3 and human ERCC2 genes Nucleic Acids Res 20,2673-2678

Našim, A. and Smith, B.P. (1975), Genetic control of radiation sensitivity in Schizosaccharomycespombe. Genetics 79, 573-582.

Painter, R-B., and Young, B.R (1980) Radiosensitivity in ataxiatelangiestasia: A new explanation. Proč. Nati. Acad. Sci. USA. 77, 7315-7317

Rowley, R., Subratnani, S. and Young, P.G. (1992). Checkpoint controls in Schizosaccaromyces pombe, radí. EMBO J. 11. 1335-1342.

-23CZ 292808 B6

Savitsky, K., Bar-Shim, A., Gilad, S., Rotman, G., Ziv, Y., Vanagaite L, Tagle, D.A., Smith, S., Uziel. T., Sfez, S., Ashkenazi, M., Pecker, I., Frydman, M., Hamik, R., Patanjali, S.R., Simmons, A., Clines. G.A., Sartiel, A., Gatti, R.A.. Chessa. L., Sanal, O., Lavině, M.F., Jaspers, N.G.J., Taylor, M.R., Arlett, C.F., Miki, T., Weissman, S.M. Lovett, M., Collins, F.S. and Shiloh, Y. (1995). A single ataxia telangiectasia gene with a product similar to PI-3 kinase. Science 286, 1749-1753.

Seaton. B.L., Yucel, J., Sunnerhagen P. and Subrannani, 5. (1992). Isolation and characterisation od the Schizosaccharomyces pomber rad3 gene which in involved in the DNA damage and DNA synthesis checpoints. Gene 119, 83-89.

Schu., P.V., Takegawa, K., Fry, M.J., Stack, J. H., Waterfield, M.D., and Emr, S.D. (1993) Phosphatidylinositol 3-kinase encoded by yeast VPS34 gene essential for protein sorting. Scinece 260, 88-91.

Sheldrick, K.S. and Carr. A.M. (1993). Feedback controls and G2 checkpoints, físsion yeast as a model systém. BioEssays 75, 775-782.

Falworth, N., Davey, S, and Beach, D. (1993). Fission yeast chkl protein kinase links the rad checkpoint pathway to cds2. Nátuře 363, 368-371.

Weinert, T.A., and Hartwell, L.H. (1988). The RAD9 gene controls the cell cycle response to DNA damage in Saccharomyces serevisiae. Science 241, 317-322.

Weinert, T.A., Kiser, G.L. Hartwell, L.H. (1994). Mitotic checkpoint genes in budding yeast and the dependance of mitosis ond DNA replication and repair. Genes Dev. 8,652-665.

Claims (11)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Purifikovaný a izolovaný ATR polypeptid s lipid kinázovou aktivitou mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO. 2.
2. 2. Purifikovaný a izolovaný ATR polypeptid s lipid kinázovou aktivitou mající aminokyselinovou sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 4.
3. 3. Purifikovaný a izolovaný polypeptid kódující ATR polypeptid podle nároku 1 nebo 2.
4. 4. Polynukleotid podle nároku 3 mající sekvenci uvedenou v SEQ ID NO: 1.
5. 5. Polynukleotid podle nároku 3 mající sekvenci uvedenou v SEQ ID NO:3.
6. 6. Purifikovaný a izolovaný polynukleotid kódující polypeptid s lipid kinázovou aktivitou, přičemž tento polynukleotid je zvolen ze souboru sestávajícího z

   a) polynukleotidů charakterizovaného v SEQ ID NO: 1,

   b) polynukleotidů charakterizovaného v SEQ ID NO:3 a

   c) polynukleotidů, který hybridizuje ke komplementu polynukleotidů (a) nebo (b) za podmínek zahrnujících finální promývání při 55 °C.

   -24CZ 292808 B6
7. 7. Purifikovaný a izolovaný ATR polypeptid kódovaný polynuleotidem podle nároku 6.
8. 8. Expresní vektor obsahující polynukleotid podle nároku 6.
9. 9. Protilátka, která se selektivně váže k polypeptidu podle nároku 7.
10. 10. Způsob podle detekce přítomnosti polynukleotidu podle nároku 6 ve vzorku z těla člověka nebo zvířete, vyznačující se tím, že (a) vzorek z těla člověka nebo zvířete uvede za hybridizačních podmínek do styku se sondou obsahující polynukleotid podle nároku 6 nebo jeho fragment, a (b) v tomto vzorku se detekuje polynukleotid, který hybridizuje k sondě.
11. 11. Způsob detekce polypeptidu podle nároku 7 v biologickém vzorku, vyznačující se tím, že se (a) biologický vzorek uvede do styku s protilátkou podle nároku 9 za podmínek umožňujících tvorbu komplexu protilátka-antigen; a (b) určí se, zda se vytvořil komplex protilátka-antigen obsahující tuto protilátku.