CZ299232B6 - Izolovaná protilátka, která se specificky váže nacást RG1 polypeptidu, a imunokonjugát obsahující tuto protilátku - Google Patents

Abstract

Rešení se obecne týká nových humánních polypeptidu extracelulární matrix oznacených jako RG1, polynukleotidu kódujících tyto polypeptidy, zpusobu prípravy techto polypeptidu, expresních vektoru a geneticky modifikovaných hostitelských bunek pro expresi techto polypeptidu. Vynález se dále týká zpusobu využití techto polynukleotidu a polypeptidu ve výzkumu, v diagnostice a pri lécení. Konkrétne je predmetem izolovaná protilátka nebo fragment protilátky, které se specificky váží na polypeptidový fragment mající aminokyselinovou sekvenci, která jezcela stejná jako cást avšak nikoliv celá aminokyselinová sekvence RG1 polypeptidu. Dalším predmetem rešení je imunokonjugát obsahující tuto izolovanou protilátku nebo její fragment, jež jsou konjugované s terapeutickým cinidlem.

Description

Předkládaný vynález se týká jednak nově identifikovaných polynukleotidů a polypeptidů; variant a derivátů těchto polynukleotidů a polypeptidů; způsobu přípravy těchto polynukleotidů a polypeptidů, jejich variant a derivátů; protilátek proti těmto polypeptidům, jejich variantám a derivá10 tům, a také požití těchto polynukleotidů a polypeptidů, jejich variant, derivátů a protilátek proti nim. Předkládaný vynález se konkrétně týká nových humánních polypeptidů extracelulámí matrix (označených jako RG1), polynukleotidů, které tyto polypeptidy kódují, protilátek proti těmto polypeptidům a protisměrným („antisense“) polynukleotidům blokujícím expresi RG1.

Dosavadní stav techniky

Rakovina prostaty je často se vyskytující chorobou u mužů, kterou je postiženo okolo třetiny mužů do 45 let věku. Bylo prokázáno, že její vznik souvisí jak s genetickými vlivy, tak s vlivy prostředí, přičemž většina případů je výsledkem kombinace obou těchto faktorů. Studie rodinného výskytu této choroby naznačily, že genetická predispozice hraje roli asi u 5-10% všech případů rakoviny prostaty a asi u 45 % případů postižených mužů mladších 55 let.

Bylo prokázáno, že ke vzniku rakoviny prostaty dochází v několika krocích, přičemž jednou z prekurzorových lézí je intraepiteliální neoplázie (PIN). Časná stádia choroby jsou závislá na androgenu, zatímco pozdější fáze jsou na tomto hormonu nezávislé. Často je klinicky zjištěna proliferační porucha prostaty známá jako benigní prostatická hyperplazie, ale zřejmě není jedním z vývojových stadií rakoviny. S výskytem rakoviny prostaty je však spojena. U rakoviny prostaty je častý výskyt více ložisek, obvyklý je pomalý růst a heterogenita nádorů. V pozdějších stadiích dochází k častému výskytu metastáz v lymfatických uzlinách a v kostech.

Rakovina prostaty je obvykle diagnostikována při běžném fyzikálním vyšetření a dále na základě zvýšené hladiny prostatického specifického antigenu (PSA) v séru. U lokalizované choroby je optimální léčbou radikální prostatektomie. Pokročilá metastatická choroba je obvykle léčena potlačením výskytu androgenu orchiektomií či léčbou pomocí GnRH (hormon uvolňující gonadotropin), anebo protiandrogenní léčbou. V pokročilých stadiích se však choroba stává rezistentní k tomuto hormonu a rozvinutá choroba není léčitelná. Navíc jak radikální prostatektomie, tak léčba potlačením výskytu androgenu má závažné vedlejší účinky. Mezi ně patří vysoké riziko inkontinence a impotence spojené s radikální prostatektomií a lámavost kostí a osteoporóza spojená s ablativní léčbou na androgen.

Je zde proto silná potřeba najít nové terapeutické způsoby pro léčbu časných i pozdních stadií rakoviny prostaty. Je také třeba získat nové diagnostické prostředky, zejména prostředky, jimiž by bylo možno rozpoznat různá stadia této choroby, jelikož je tím výrazně ovlivněn výběr léčeb45 ných způsobů. Např. pokud choroba překročí hranice prostaty a metastázuje do lymfatických uzlin, radikální prostatektomie se neprovádí, protože způsob choroby nezastaví, ale může mít nežádoucí vedlejší účinky. Prostředek, kterým by bylo možno zjistit výskyt metastáz in vivo, by tudíž byl velmi cenný.

U rakoviny prostaty byly zaznamenány změny v expresi specifických proteinů, včetně exprese p53 u pozdních stadií této choroby, snížené hladiny receptorů pro TGF-β, snížené hladiny E-cadherinu, C-Cam (buněčná adhezivní molekula) a několika různých integrinů. Exprese onkogenu bcl-2 je u pozdních nádorů závislých na androgenu výrazně zvýšena a prognóza pacientů se zvýšenou expresí bcl-2 je poměrně nepříznivá. Zatímco výše zmíněné změny genové exprese byly dobře doloženy, nebylo prokázáno žádné příčinné spojení těchto změn s danou

-1 CZ 299232 B6 chorobou. Bylo by tedy užitečné identifikovat nové proteiny, jejichž exprese je spojena s výskytem či vývojem prostatických nádorů a jež by mohly sloužit jako molekulární cíle pro diagnostiku a léčbu rakoviny prostaty.

Předkládaný vynález popisuje nový homolog vyšší rodiny proteinů extracelulární matrix. Tento homolog, zvaný RG1, je exprimován v prostatické tkáni a jeho exprese může být v prostatických nádorech zvýšena.

Extracelulární matrix je komplexní síťovitý útvar, tvořený kolagenem a elastinem, uložený ve viskózně-elastické základní hmotě z proteoglykanů a glykoproteinů. Matrix tvoří třírozměrnou podpůrnou konstrukci oddělující jednotlivé buněčné kompartmenty, zprostředkující buněčné vazby a určující strukturu tkání (Bissel et al., J. Theor. Biol. 99:31-68, 1982; Carlson et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 78:2403-2406, 1981). Matrix funguje jako makromolekulámí filtr (Hay, E. D., Cell Biologicy of Extracellular Matrix, New York, Plenům, Press, 1982) a má též vliv na buněčnou diferenciaci, mitogenezi a morfogenezi (Gospodarowicza, D., Cancer Res. 38:4155-171, 1978). Biochemické interakce mezi normálními buňkami a matrix mohou být při neoplazii pozměněny a mohou tak ovlivňovat nádorový růst. Nádorové buňky mohou s matrix interagovat různým způsobem. Jednak se mohou přichytit k matrix prostřednictvím specifických plazmatických membránových receptorů (Terranova et al., Cancer Res. 42:2265-2269, 1982).

Dále může být matrix degradována kaskádou enzymů dodávaných nádorovými i hostitelskými buňkami (Eisen et al., Biochem. Biophys. Acta 151:637-645, 1968). A konečně mohou nádorové buňky v diferencovaných částech nádoru syntetizovat a hromadit matrix nebo vyvolávat hromadění nadbytečné matrix v hostitelských buňkách (Brownstein et al., Cancer 40:2979-2986, 1977).

RG1 vykazuje homologii s vyšší rodinou proteinů extracelulární matrix, které jsou kódovány geny Mindin/F-spondin. Tato rodina má společné dvě konzervativní spondinové domény FS1 a FS2 poblíž N konce a nejméně jeden opakující se úsek trombospondinu typu 1 (TSR1) na C konci (Shimeld, S. M., Mol. Biol. Evol. 15(9): 1218-1223, 1998). Motiv TSR byl původně nalezen u proteinů extracelulární matrix obratlovců (Bomstein, P., J. Cell. Biol. 130:503-506, 1995) a byl posléze nalezen i u dalších proteinů extracelulární matrix. Existuje řada různých důkazů, že oblasti TSR zprostředkují buněčnou adhezi a hrají klíčovou úlohu při vzniku nádorů. Bylo např. prokázáno, že proteolytické fragmenty trombospondinu obsahující oblast TSR a syntetické peptidy o sekvencích odpovídajících TSR oblasti trombospondinu podporují adhezi nádorových buněk a vytváření metastáz (Prater et al., J. Cell Biol. 112:1031-1040, 1991; Tuszynski and Nicosia,

BioEssays 18:71-76, 1996), vykazují antiangiogenní aktivitu (Tolsma et al., J. Cell. Biol. 122:497-511, 1993) a inhibují shlukování krevních destiček a metastázování melanomů (Tuszynski et al., J. Cell. Biol. 116:209-217, 1992).

V současné době patří do této vyšší rodiny genů jeden gen Caenorhabditis elegans, jeden gen

Drosophily a několik genů obratlovců. U C. elegans gen F10E7.4 kóduje kromě domén FS1 a FS2 pět oblastí TSR (Higashijima et al., Dev. Biol. 192:211-227, 1997). Člen této rodiny u Drosophily zvaný M-spondin (mspo) obsahuje domény FS1 a FS2 a jedinou oblast TSR (Umemiya et al., Dev. Biol. 186-165-176, 1997). Gen pro M-spondin kóduje sekretovaný protein, který se nachází v místech svalových úponů a slouží jako protein extracelulární matrix udržující připojení svalu kapodemu. Členy této rodiny genů u obratlovců zahrnují geny izolované zparmičky pruhované (Danio, „zebrafish“) (Mindinl a Mindin2, F-spondinl a F-spondin2), krysí (potkaní) F-spondin, F-spondin žab Xenopus a krysí Mindin. Mindinl a Mindin2 jsou navzájem blízce příbuzné a jejich genová struktura je podobná M-spondinu Drosophily. Oba tyto geny kódují kromě domén FS1 a FS2 jedinou oblast TSR (Higashijima et al., Dev. Biol. 192:211-27, 1997). Geny pro F-spondinl a F-spondin2 parmičky „zebrafish“, krysí F-spondin (Klár et al., Cell 69:95-110, 1992) a F-spondin žab Xenopus (Altaba et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90:8268-8272) mají všechny podobnou strukturu a kódují kromě domén FS1 a FS2 šest kopií oblasti TSR. U obratlovců lze vyšší rodinu genů Mindin/F-spondin rozdělit do dvou skupin: geny blízce příbuzné původním krysím genům pro F-spondin a Mindin a geny blízce příbuzné genu pro M-spondin Drosophily. Jak gen pro Mindin, tak i gen pro F-spondin

-2CZ 299232 B6 u obratlovců kódují proteiny, které jsou primárně exprimovány buňkami dna neurální trubice během embryonálního vývoje.

Nedávno byl z kopinatce Amphioxus izolován jediný gen příbuzný F-spondinu, AmphiF-spondin (Shimeld, S. M., Mol. Biol. Evol. 15(9):1218-1223, 1998). Na základě molekulární fylogenetiky je AmphiF-spondin blízce příbuzný určité skupině genů obratlovců pro F-spondin, které kódují šest oblastí TSR. AmphiF-spondin kóduje tři oblasti TSR a dva opakující se úseky fibronektinu typu III, z nichž jeden vykazuje silnou podobnost s opakujícím se úsekem fibronektinu typu III produktu genu DCC („Deleted in Colorectal Cancer“). Expresi tohoto proteinu lze najít ve ío většině oblastí centrálního nervového systému a ne jen ve středové linii, jak bylo popsáno u proteinů Mindin a F-spondin obratlovců.

Tato fakta napovídají, že proteiny extracelulámí matrix, jako např. nový protein RG1, který je homologem vyšší rodiny Mindin/F-spodnin, by mohly být dobrými kandidáty k využití pro diagnostiku rakoviny a pro použití při léčení.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález popisuje polynukleotidovou sekvenci, která kóduje výhradně nový protein označovaný zde jako RG1. Polypeptid RG1 vykazuje homologii s krysím proteinem extracelulámí matrix Mindinem. Obsahuje hydrofobní signální sekvenci na N konci, dvě spondinové domény (FS1 a FS2) a opakující se úsek („repeat“) trombospondinu typu 1 na C konci. RG1 vykazuje 89,7% podobnost s krysím Mindinem. Polynukleotidová sekvence označovaná zde jako rgl a uvedená na obr. 1 (a v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. C. 1) kóduje aminokyselinovou sekvenci RG1, která je uvedena na obr. 2 (v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2).

Předmětem předkládaného vynálezu jsou kromě jiného polypeptidy, které byly identifikovány jako nové proteiny homologní s rodinou proteinů extracelulámí matrix zvanou Mindin, jak ukazuje srovnání aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 2 (SEKVENCE ID. C. 2) se známými aminokyselinovými sekvencemi jiných proteinů extracelulámí matrix.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou polynukleotidy kódující tyto polypeptidy, zejména polynukleotidy kódující polypeptidy označované zde jako RG1.

V souladu s tímto aspektem předkládaného vynálezu jsou zde popsány izolované polynukleotidy kódující RG1, včetně mRNA a cDNA, a v dalších provedeních tohoto záměru vynálezu i jejich biologicky, diagnosticky, klinicky či terapeuticky využitelné varianty, analogy a deriváty, včetně fragmentů jejich variant, analogů a derivátů.

Mezi zvláště výhodná provedení tohoto aspektu vynálezu patří přirozeně se vyskytující alelické varianty polynukleotidů kódujících varianty polypeptidů označovaných zde jako RG1.

V souladu s tímto aspektem předkládaného vynálezu jsou zde popsány nové polypeptidy lidského původu označované zde jako RG1, jakož i jejich biologicky, diagnosticky či terapeuticky využitelné fragmenty, varianty a deriváty, varianty a deriváty jejich fragmentů, včetně jejich analogů.

Mezi zvláště výhodná provedení tohoto záměru vynálezu patří varianty RG1 kódované přirozeně se vyskytujícími alelickými variantami polynukleotidu rgl.

Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob přípravy výše zmíněných polypeptidů, jejich fragmentů, variant a derivátů, fragmentů variant a derivátů a jejich analogů. Ve výhodném provedení tohoto záměru vynálezu jsou popsány způsoby přípravy výše zmíněných polypeptidů

RG1, zahrnující kultivaci hostitelských buněk, do nichž byl vložen exogenně odvozený poly-3 CZ 299232 B6 nukleotid kódující RG1 exprimovatelný za podmínek pro expresi lidského RG1 v hostiteli, s následnou izolací exprimovaného polypeptidu.

V souladu s dalším předmětem tohoto vynálezu jsou popsány přípravky, sloučeniny a způsoby využívající výše zmíněné polypeptidy a polynukleotidy kromě jiného pro výzkumné, biologické, klinické a terapeutické účely.

V souladu s určitými výhodnými provedeními tohoto aspektu předkládaného vynálezu jsou popsány kromě jiného přípravky, sloučeniny a způsoby sloužící k vyhodnocení exprese RG1 v buňkách stanovením polypeptidů RG1 a mRNA kódující RG1; a dále stanovením genetických variací a aberací, např. defektů, v genech rgl.

V souladu s určitými výhodnými provedeními tohoto a dalších aspektů předkládaného vynálezu jsou popsány sondy, které hybridizují se sekvencemi rgl.

Dalším předmětem tohoto vynálezu jsou protilátky vysoce selektivní pro polypeptidy RG1 nebo fragmenty těchto protilátek, které je možno využít pro diagnostiku a/nebo detekci exprese RG1, jež by mohla být spojena s rakovinou prostaty. V souladu s určitými výhodnými provedeními tohoto záměru vynálezu jsou tyto protilátky značeny tak, aby poskytly detekovatelný signál.

Zvláště výhodné jsou protilátky značené radioaktivně, enzymaticky, pomocí chromoforu nebo fluorescenčně.

V dalším aspektu tohoto vynálezu jsou popsány protilátky konjugované s terapeutickou látkou určené pro podání do buněk in vitro, ex vivo nebo in vivo, nebo pro podání do mnohobuněčného organismu. V tomto ohledu jsou zvláště výhodné terapeutické látky (terapeutická agens, terapeutická činidla) které jsou cytotoxické. V určitých provedeních výhodných z tohoto hlediska se jedná o podání takových konjugovaných protilátek lidským pacientům k léčbě chorobného stavu charakterizovaného aktivitou či expresí RG1, jako např. rakoviny prostaty.

V dalším aspektu tohoto vynálezu jsou popsány peptidy a anti-idiotypové protilátky, které lze využít ke stimulaci imunitní odpovědi.

V dalším aspektu tohoto vynálezu jsou popsány ribozymy a polynukleotidy komplementární k polynukleotidům rgl (tj. „antisense“ polynukleotidy) určené pro podání do buněk in vitro, ex vivo nebo in vivo, nebo do mnohonásobného organismu. Zvláště výhodné z tohoto hlediska je podání „antisense“ molekul lidským pacientům k léčbě chorobného stavu, jako např. rakoviny prostaty či benigní prostatické hyperplazie, který se zmírní snížením úrovně aktivity RG1.

Další předměty, vlastnosti, výhody a aspekty předkládaného vynálezu vyplynou pro odborníky z následujícího popisu. Mělo by však být zřejmé, že následující popis a specifické příklady, které ukazují výhodná provedení tohoto vynálezu, slouží pouze pro ilustraci. Různé varianty a modifikace v rámci celkového záměru a rozsahu předkládaného vynálezu vyplynou pro odborníky při čtení následujícího popisu a při čtení dalších částí tohoto vynálezu.

Definice

Tak jak se užívají v popisu vynálezu, příkladech a připojených nárocích, mají následující termíny význam stanovený níže, pokud není výslovně určeno jinak.

„RG1“ označuje polypeptid, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena na obr. 2 (SEKVENCE

ID. C. 2); jeho varianty, analogy, deriváty a fragmenty a fragmenty těchto variant, analogů a derivátů. Termíny „fragment“, „derivát“ a „analog“, pokud se vztahují k polypeptidu na obr. 2 (SEKVENCE ID. C. 2), označují polypeptid, který vykazuje v podstatě tutéž biologickou a/nebo imunologickou aktivitu jako polypeptid na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2).

-4CZ 299232 B6 „rgl“ označuje polynukleotid, jehož sekvence je uvedena na obr. 1 (SEKVENCE ID. Č. 1) a polynukleotidy kódující polypeptidy, jejichž aminokyselinová sekvence je uvedena na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2); a dále polynukleotidy kódující varianty, analogy, deriváty a fragmenty RG1 a fragmenty těchto variant, analogů a derivátů. Rgl také označuje tyto polynukleotidy ve formě RNA a polynukleotidy, které jsou komplementární k polynukleotidům kódujícím polypeptidovou sekvenci uvedenou na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2).

Termín „polynukleotid“ obvykle označuje jakýkoli polyribonukleotid či polydeoxyribonukleotid, kterým může být nemodifikovaná RNA či DNA nebo modifikovaná RNA či DNA. Tak např.

polynukleotidy, jak jsou zde zmiňovány, označují kromě jiného jednovláknovou a dvouvláknovou DNA, DNA složenou z jedno- a dvouvláknových oblastí, jedno- a dvouvláknovou RNA a RNA složenou z jedno- a dvouvláknových oblastí, hybridní molekuly obsahující DNA a RNA, které mohou být jednovláknové nebo, což je typičtější, dvouvláknové, nebo se mohou skládat z jedno- a dvouvláknových oblastí. Navíc, termín polynukleotid jak je zde použit označuje i oblasti troj vláknové RNA či DNA nebo troj vláknové oblasti obsahující jak RNA, tak i DNA. Vlákna těchto oblastí mohou pocházet jak z téže molekuly, tak z různých molekul. Tyto oblasti mohou zahrnovat úseky pocházející ze všech těchto molekul, ale v typičtějším případě jsou míněny úseky pouze některých těchto molekul. Jednou z molekul takové trojvláknové oblasti často bývá oligonukleotid.

Jak je zde užíván, označuje termín „polynukleotid“ také molekuly DNA či RNA, jak byly popsány výše a obsahující jednu či více modifikovaných bází. To znamená, že molekuly DNA či RNA, jejichž cukr-fosfátová kostra byla pozměněna ke zvýšení stability nebo z jiných důvodů, jsou zde také označovány termínem „polynukleotidy“. Navíc, molekuly DNA či RNA obsahující neobvyklé báze jako např. inosin či modifikované báze jako báze značené tritiem, abychom uvedli alespoň dva příklady, se také označují zde používaným termínem polynukleotidy.

Je zřejmé, že u molekul DNA a RNA byla provedena celá řada modifikací za účelem sloužit pro různé užitečné cíle známé odborníkům. Termín „polynukleotid“, jak je zde užíván, zahrnuje kromě jiného takovéto chemicky, enzymaticky či metabolicky modifikované formy polynukleotidů, jakož i chemické formy DNA či RNA charakteristických pro viry či buňky, a to pro buňky jednoduché i složité.

Termínem „polypeptidy“, jak je zde užíván, jsou míněny všechny polypeptidy, jež jsou popsány níže. Základní struktura polypeptidů je dobře známa a byla popsána v celé řadě učebnic a jiných odborných publikací. V kontextu předkládaného vynálezu označuje tento termín jakýkoli peptid či protein obsahující dvě či více aminokyselin vzájemně spojené do lineárního řetězce peptidovou vazbou. Jak je zde užíván, označuje tento termín jak krátké řetězce, jež jsou také obvykle ve stavu techniky označovány např. jako peptidy, oligopeptidy a oligomery, tak i dlouhé řetězce, které se ve stavu techniky běžně označují jako proteiny, jichž je mnoho typů.

Je zřejmé, že polypeptidy často obsahují aminokyseliny jiné než 20 aminokyselin obvykle označovaných jako 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin a že mnoho aminokyselin, včetně koncových, může být v daném polypeptidu modifikováno, a to buď přirozenou cestou jako glykosylací nebo jinými posttranslačními modifikacemi, nebo chemickými modifikačními způsoby dobře známými odborníkům. Dokonce i běžné modifikace, které se v polypeptidech přirozeně vyskytují, jsou příliš početné, aby bylo možno je zde vyčerpávajícím způsobem vyjmenovat, ale jsou dobře popsány v základních příručkách a detailnějších monografiích, jakož i v rozsáhlé odborné literatuře, a jsou dobře známy odborníkům. Mezi známé modifikace, které se mohou vyskytovat v polypeptidech zmíněných v předkládaném vynálezu, patří, abychom vyjmenovali alespoň několik ilustrativních příkladů, acetylace, acylace, ADP-ribosylace, amidace, kovalentní navázání flavinu, kovalentní navázání hernu, kovalentní navázání lipidu či derivátu lipidu, kovalentní navázání fosfatidylinositolu, tvorba příčných vazeb, cyklizace, tvorba disulfidových můstků, demethylace, tvorba příčných kovalentních vazeb, tvorba cystinu, tvorba pyroglutamátu, formylace, gama-karboxylace, glykace, glykosylace, tvorba kotvy GPI, hydroxylace, jodace,

-5CZ 299232 B6 methylace myristylace, oxidace, proteolytické úpravy, fosforylace, prenylace, racemizace, navázání selenu, navázání síry, adice aminokyseliny prostřednictvím transferové RNA jako např. arginylace a navázání ubikvitinu.

Tyto modifikace jsou odborníkům dobře známy a byly detailně popsány v odborné literatuře. Rada zvláště známých modifikací, jako např. glykosylace, navázání lipidů, navázání síry, gamakarboxylace, navázání zbytků glutamové kyseliny, hydroxylace a ADP-ribosylace, byla popsána ve zcela základních příručkách, jako např. I. E. Creighton, Proteins - Structure and Molecular Properties, 2^nd Ed., W. H. Freeman and Company, New York, 1993. Na toto téma existuje mnoho ío přehledných článků, jako např. texty, které publikovali Wold, F., in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Ed., Academie Press, New York, pp 1-12, 1983; Seifter et al., Meth. Enzymol. 182:626-646, 1990, a Rattan et al., Protein Synthesis: Posttranslational

Modifications and Aging, Ann. N. Y. Acad. Sci. 663:48-62, 1992.

Jak je všeobecně známo a zmíněno výše, je zřejmé, že polypeptidy nejsou vždy lineární. Např. polypeptidy mohou být rozvětvené důsledkem navázání ubikvitinu, mohou být cirkulámí, s rozvětveném či bez něj, obvykle jako důsledek posttranslačních úprav, včetně přirozených úprav či procesů způsobených lidskou manipulací, knimž normálně nedochází. Cirkulámí, větvené a cirkulámí větvené polypeptidy mohou být syntetizovány netranslačními přirozenými procesy i čistě syntetickými způsoby.

Modifikace se mohou vyskytovat kdekoli v polypeptidu, včetně peptidové kostry, postranních řetězců aminokyselin či N a C konce. Ve skutečnosti je blokování aminoskupiny či karboxyskupiny či obou těchto skupin prostřednictvím kovalentní modifikace běžně se vyskytujícím jevem v přirozeně se vyskytujících i syntetických polypeptidech a tyto modifikace se mohou v polypeptidech uvedených v předkládaném vynálezu vyskytovat také. Např. N-koncovým aminokyselinovým zbytkem polypeptidů produkovaných E. coli před proteolytickou úpravou bude vždy N-formylmethionin.

Modifikace vyskytující se v polypeptidu jsou často výsledkem způsobu, jakým tento polypeptid vznikl. El polypeptidů vzniklých např. expresí genu klonovaného v hostiteli bude podstata a rozsah modifikací z větší části určen posttranslační kapacitou hostitelské buňky a modifikačními signály nacházejícími se v aminokyselinové sekvenci polypeptidu. Např. jak je dobře známo, glykosylace se často nevyskytuje u bakteriálních hostitelů jako E. coli. Pokud je tedy glykosylace požadována, polypeptid by měl být exprimován v glykosylujícím hostiteli, obvykle v eukaryotické buňce. Hmyzí buňky často provádějí tytéž posttranslační glykosylace jako savčí buňky, a proto byly např. vyvinuty hmyzí expresní systémy k účinné expresi savčích proteinů, které vykazují nativní formu glykosylace. Podobně je tomu i u jiných modifikací.

Je zřejmé, že tentýž typ modifikace se může vyskytovat v téže či různé míře na různých místech daného polypeptidu. Daný polypeptid také může obsahovat mnoho typů modifikací.

Termín polypeptid jak je zde užíván obvykle zahrnuje všechny takové modifikace, zejména ty, které se nacházejí v polypeptidech syntetizovaných expresí polynukleotidu v hostitelské buňce.

Termín „polynukleotid kódující polypeptid“, jak je zde užíván, zahrnuje polynukleotidy obsahující sekvenci kódující polypeptid uvedený v předkládaném vynálezu, v konkrétním případě polypeptid RG1, jehož aminokyselinová sekvence je uvedena na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2). Tento termín zahrnuje polynukleotidy obsahující jednu souvislou oblast nebo nesouvislé oblasti kódující polypeptid (přerušené např. introny) spolu s dalšími oblastmi.

„Biologická aktivita“ označuje strukturální, regulační či biochemické funkce přirozeně se vyskytujícího polypeptidu RG1.

-6CZ 299232 B6 „Imunologická aktivita“ označuje schopnost přirozeného, rekombinantního či syntetického RG1 nebo jakéhokoli jeho fragmentu vyvolat specifickou imunitní odpověď v odpovídajícím živočichu či buňce a vázat specifické protilátky.

Termín „oligonukleotid“ označuje poměrně krátké polynukleotidy. Tento termín se často vztahuje na jednovláknové deoxyribonukleotidy, ale může také označovat kromě jiného jedno- či dvouvláknové ribonukleotidy, hybridy RNA a DNA a dvouvláknové DNA. Oligonukleotidy, jako např. jednovláknové oligonukleotidy sond DNA, se často syntetizují chemickými způsoby, např. pomocí automatických syntetizátorů oligonukleotidů. Oligonukleotidy však lze připravit i řadou jiných způsobů, včetně způsobů in vitro využívajících rekombinantní DNA a exprese DNA v buňkách a organismech. „Oligonukleotidy“ či „oligomery“ nebo polynukleotidový „fragment“, „úsek“ či „segment“ označuje polynukleotidovou sekvenci o nejméně 10 nukleotidech a nejvíce přibližně 60 nukleotidech, výhodně asi 15 až 30 nukleotidů a nejvýhodněji přibližně 20-25 nukleotidů.

„Přirozeně se vyskytující RG1“ označuje RG1 produkovaný lidskými (humánními) buňkami, které nebyly geneticky modifikovány, a specificky označuje různé formy RG1, které vznikly posttranslačními úpravami polypeptidu, zahrnujícími kromě jiného acetylace, karboxylace, glykosylace, fosforylace, lipidace, acylace a štěpení.

Termín „varianta(y)“ polynukleotidů či polypeptidů, jak je užíván v tomto textu, označuje polynukleotidy ěi polypeptidy lišící se od referenčního polynukleotidu či polypeptidu. Takto míněné varianty jsou podrobně popsány níže a na jiných místech v předkládaném vynálezu.

(1) Polynukleotid, který se liší svou sekvencí od jiného, referenčního polynukleotidu. Tyto rozdíly jsou obvykle omezené, takže sekvence referenčního polynukleotidu a jeho variant jsou velmi podobné a v mnoha oblastech jsou shodné.

Jak bude zmíněno níže, změny v sekvenci varianty polynukleotidu mohou být bez vnějšího proje30 vu. To znamená, že nemusí ovlivnit aminokyselinovou sekvenci polypeptidu kódovaného polynukleotidem. Tam, kde jsou změny omezené na tento typ bez vnějšího projevu, varianta kóduje polypeptid o téže aminokyselinové sekvenci jako referenční polypeptid. Jak bude též zmíněno níže, změny v sekvenci varianty polynukleotidu mohou vést ke změnám v aminokyselinové sekvenci polypeptidu kódovaného referenčním polynukleotidem. Takové změny polynukleotidu mohou vést k substituci, adici, deleci či fúzi aminokyselin nebo ke zkracování aminokyselinové sekvence kódované referenční sekvencí, jak bude popsáno níže.

(2) Polypeptid, který se aminokyselinovou sekvencí liší od jiného, referenčního polypeptidu. Tyto změny jsou obvykle omezené, takže sekvence referenčního polypeptidu a jeho varianty jsou velmi podobné a v mnoha oblastech jsou shodné. Referenční polypeptid a jeho varianta se mohou lišit v aminokyselinové sekvenci jednou či více substitucí, adicí, deleci, fúzí či zkrácením sekvence, přičemž tyto změny mohou být přítomné v různých kombinacích. Rekombinantní varianty kódující tyto či podobné polypeptidy mohou být syntetizovány nebo selektovány na základě tzv. „redundance“ genetického kódu. Různé substituce kodonů, jako např. ty, které se navenek nepro45 jeví, ale vedou ke vzniku různých restrikčních míst, mohou být využity k optimalizaci klonování do plazmidu či virového vektoru nebo exprese v určitém prokaryotickém ěi eukaryotickém systému. Ke změnám vlastností polypeptidu, jeho afinity k ligandům, afinity mezi řetězci, degradovatelnosti či rychlosti obratu lze také využít vnesení mutací.

Termín „alelická varianta“ označuje alternativní formu polynukleotidu rgl. Alely jsou výsledky mutace, tj. změny v sekvenci polynukleotidu, a obvykle vedou ke vzniku pozměněných mRNA či polypeptidů, jejichž struktura nebo funkce může i nemusí být pozměněna. Jakýkoli gen může mít žádnou, jednu či více alelických forem. Běžné mutační změny vedoucí ke vzniku alel jsou připisovány přirozeným delecím, adicím či substitucím nukleotidů. Každý typ těchto změn může v dané sekvenci proběhnout buď samostatně nebo v kombinaci s ostatními, jednou či vícekrát.

-7CZ 299232 B6 „Derivát“ označuje polynukleotid či polypeptid odvozený z přirozeně se vyskytujícího rgl či RG1 chemickými modifikacemi jako navázání ubikvitinu, značení (např. radionuklidy, různými enzymatickými modifikacemi), „pegylací“ (tvorbou derivátů pomocí polyetylenglykolu, PEG), nebo inzerce či substituce aminokyselin jako omitin (nebo substitucí nukleotidů kódujících tuto aminokyselinu), které se normálně v humánních proteinech nevyskytují.

„Delece“ je definována jako změna sekvence polynukleotidu či aminokyselinové sekvence, kde chybí jeden nebo více nukleotidů či aminokyselinových zbytků.

„Inzerce“ či „adice“ je taková změna sekvence polynukleotidu či aminokyselinové sekvence, kdy dochází k přidání jednoho nebo více nukleotidů či aminokyselinových zbytků ve srovnání s přirozeně se vyskytující sekvencí polynukleotidu či polypeptidů.

„Substituce“ je výsledkem nahrazení jednoho nebo více nukleotidů či aminokyselin odlišným nukleotidem či aminokyselinou.

Substituce aminokyselin jsou výhodně výsledkem nahrazení jedné aminokyseliny jinou aminokyselinou vykazující podobné strukturní a/nebo chemické vlastnosti, např. nahrazení leucinu izoleucinem či valinem a aspartátu glutamátem, nebo threoninu serinem, tj. konzervativní nahra20 zení aminokyseliny. Inzerce ěi delece probíhají v rozmezí od 1 do 5 aminokyselin. Povolená variace může být experimentálně určena prováděním systematických inzercí, delecí či substitucí aminokyselin v polypeptidů pomocí způsobů rekombinantní DNA a testování aktivity vzniklých rekombinantních variant.

„Fragment“ je polypeptid o aminokyselinové sekvenci totožné s částí, ale ne s celkem aminokyselinové sekvence výše zmíněných polypeptidů RG1 a jejich variant či derivátů.

Polypeptidový „fragment“, „úsek“ či „segment“ představuje spojené aminokyselinové zbytky v minimálním počtu 5, často alespoň 7, typicky aspoň 9 až 13 aminokyselin, a v různých provedeních předkládaného vynálezu alespoň 17 či více aminokyselin.

„Rekombinanta“ či „rekombinantní molekula DNA“ označuje sekvenci polynukleotidu, která se přirozeně nevyskytuje neboje připravena umělou kombinací dvou jinak oddělených segmentů či sekvencí. „Rekombinantně připravený“ znamená připravený umělou kombinací oddělených segmentů polynukleotidů, často s využitím buď chemických prostředků nebo umělých manipu35 lácí, např. způsoby genového inženýrství. Tyto manipulace se obvykle provádějí proto, aby jeden kodon byl nahrazen jiným, redundantním kodonem kódujícím tutéž či konzervativní aminokyselinu, přičemž je typicky vneseno či odstraněno místo rozpoznávající nějakou sekvenci. Jindy se provádějí s cílem pospojovat segmenty polynukleotidů s požadovanou funkcí, aby byla vytvořena jediná genetická entita obsahující požadovanou kombinaci funkcí, která se jinak v přirozené formě nevyskytuje. Takto mohou být cíleně vložena rozpoznávací místa pro restrikční enzymy, regulační sekvence či jiné využitelné oblasti. „Rekombinantní molekuly DNA“ zahrnují klonovací a expresní vektory. „Rekombinanta“ může také označovat polynukleotid kódující polypeptid a připravený pomocí způsobů rekombinantní DNA.

„Izolovaný“ znamená pozměněný „lidským zásahem“ ze svého přirozeného stavu, tj. pokud se vyskytuje v přírodě, byl pozměněn či odstraněn ze svého přirozeného prostředí, nebo obojí. Např. přirozeně se vyskytující polynukleotid nebo polypeptid přirozeně se vyskytující v živém zvířeti ve svém přirozeném stavu není „izolován“, ale tentýž polynukleotid či polypeptid oddělený z materiálu, s nímž koexistuje v přirozeném stavu, je „izolován“, tak jak se tento termín užívá v předkládaném vynálezu. Např. pokud jde o polynukleotidy, termín izolovaný znamená, že je oddělen od chromozomu a buňky, ve které se přirozeně vyskytuje.

Polynukleotidy a polypeptidy se mohou vyskytovat ve složených látkách jako např. v médiích, roztocích pro vnášení polynukleotidů či polypeptidů např. do buněk, ve směsích či roztocích pro

-8CZ 299232 B6 chemické či enzymatické reakce, jež nejsou přirozeně se vyskytujícími látkami, a jsou zde míněny izolované polynukleotidy či polypeptidy ve smyslu jak je užíván v předkládaném vynálezu.

„V podstatě čistý“ a „v podstatě homogenní“ jsou vzájemně nahraditelné termíny a označují polypeptid RG1 ěi jeho fragmenty nebo segment polynukleotidu, který je kóduje, přičemž tento polypeptid či polynukleotid je oddělen od látek, se kterými se vyskytuje přirozeně. Polypeptid RH1 či jeho fragmenty nebo segment polynukleotidu, který je kóduje, je v podstatě prostý všech komponent, se kterými se přirozeně vyskytuje, pokud je oddělen od nativních kontaminant, se kterými se vyskytuje v přirozeném stavu. To znamená, že polypeptid, který je syntetizován chemicky nebo buněčným systémem odlišným od buňky, z níž přirozeně pochází, je v podstatě prostý komponent, se kterými se přirozeně vyskytuje.

„Homologní“, pokud se tento termín týká polynukleotidu, znamená, že při polynukleotidu či jejich vyznačené sekvence jsou při optimálním lineárním srovnání („alignement“) totožné, s od15 povídajícími inzercemi či delecemi nukleotidů, alespoň v 70 % nukleotidů, obvykle v 75 až 99 % a výhodněji v minimálně 98 až 99 % nukleotidů.

„Podobnost“, pokud se týká polypeptidu, je určena srovnáním aminokyselinové sekvence a nahrazených konzervativních aminokyselin jednoho polypeptidu se sekvencí druhého polypeptidu.

„Polymerázová řetězová reakce“ čili „PCR“ označuje způsob, při kterém jsou specifické úseky DNA amplifikovány jak bylo popsáno v patentu US 4 683 195 uděleném 28. 7. 1987. Obvykle je potřebné znát koncové či delší sekvence fragmentu požadovaného polypeptidu, aby bylo možno navrhnout oligonukleotidové primery; tyto primery budou antiparalelní a budou mít totožnou či podobnu sekvenci jako opačná vlákna templátu, který má být amplifikován. Nukleotidy 5'-konce obou primerů se budou krýt s konci amplifikovaného materiálu. PCR lze využít k amplifikaci specifických sekvencí DNA z celkové genomové DNA, cDNA transkribované z celkové buněčné RNA, z plazmidových sekvencí atd. (viz obecně Mullis et al., Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 51:263, 1987; Erlich, ed., PCR Technology, Stockton Press, NY, 1989).

„Stringence“ (hybridizačních podmínek) se obvykle vyskytuje v rozmezí T_m (teplota tání) -5 °C (5 °C pod T_m sondy) do přibližně 20 °C až 25 °C pod T_m. Odborníkům bude zřejmé, že stringentní hybridizaci lze použít k identifikaci či detekci shodných sekvencí polynukleotidů nebo k dentifikaci či detekci podobných či příbuzných sekvencí polynukleotidů. Tak jak je zde užíván znamená termín „stringentní podmínky“, že hybridizace bude probíhat pouze pokud bude mezi sekvencemi nejméně 95% a výhodně nejméně 97% identita.

„Hybridizace“ jak je zde užívána zahrnuje Jakýkoli proces, kterým je polynukleotidové vlákno spojeno s komplentámím vláknem na principu párování bází“ (Combs, J., Dictionary of Bio40 technology, Stockton Press, New York, N. Y., 1994).

„Terapeuticky účinná dávka“ označuje takovou dávku polypeptidu či protilátek proti němu, jeho antagonistů či inhibitorů, včetně „antisense“ molekul a ribozymů, která zlepší příznaky či podmínky chorobného stavu. Terapeutická účinnost a toxicita těchto látek může být určena stan45 dardními farmaceutickými způsoby v buněčných kulturách ěi experimentálních zvířatech, např. jako ED₅₀ (dávka terapeuticky účinná v 50% populace) nebo LD₅₀ (dávka letální pro 50% populace). Poměr dávek s terapeutickým a toxickým účinkem se nazývá terapeutický index a dá se vyjádřit jako poměr ED50/LD50.

„Léčení“ ěi „léčba“, jak je zde tento termín užíván, znamená léčbu chorobného stavu (nemoci) u lidského pacienta, přičemž tento chorobný stav je spojen s růstem nádoru prostaty a zahrnuje chorobné stavy, při nichž je u pacienta třeba snížit hladinu RG1.

-9CZ 299232 B6

Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález se týká kromě jiného nových polypeptidů RG1, polynukleotidů rgl a protilátek zaměřených proti polypeptidům RG1, jak bude podrobněji popsáno níže. Konkrétně se tento vynález týká nových polypeptidů RG1 a polynukleotidů kódujících tyto polypeptidy RG1, zejména se pak týká RG1 o aminokyselinové sekvenci uvedené na obr. 2 (SEKVENCE ID. C. 2) a rgl o polynukleotidové sekvenci uvedené na obr. 1 (SEKVENCE ID. Č. 1). Tento vynález také zahrnuje varianty RG1. Výhodná varianta RG1 je varianta vykazující nejméně 70% podobnost (výhodně nejméně 70% identitu) s polypeptidovou sekvencí uvedenou na obr. 2 (SEKVENCE ío ID. Č. 2) a výhodněji nejméně 90% podobnost (výhodněji nejméně 90% identitu) s polypeptidem uvedeným na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2) a ještě výhodněji nejméně 95% podobnost (ještě výhodněji nejméně 95% identitu) s polypeptidovou sekvencí uvedenou na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2) a také zahrnuje úseky těchto polypeptidů, přičemž tyto úseky polypeptidů obvykle obsahují nejméně 30 aminokyselin a výhodněji nejméně 50 aminokyselin.

Sekvence kódující predikovaný polypeptid RG1 začíná 296 párů bází od 5'-konce nukleotidové sekvence uvedené na obr. 1 (SEKVENCE ID. Č. 1). RG1 obsahuje tři strukturální domény charakteristické pro vyšší rodinu proteinů extracelulámí matrix Mindin/F-spondin: dvě spondinové domény (FS1 a FS2) zahrnující aminokyseliny 31 až 103 a 138 až 221 a trombospon20 dinovou doménu zahrnující aminokyseliny 278 až 330.

Předkládaný vynález je částečně založen na strukturální homologii mezi RG1 a krysím Mindinem, dalším členem rodiny proteinů extracelulámí matrix, uvedené na obr. 3. Aminokyselinová sekvence RG1 vykazuje přibližně 89,7% podobnost s krysím Mindinem.

Předkládaný vynález je také založen na expresním profdu RG1, jehož exprese byla prokázána v knihovnách prostatických tkání a zvýšená exprese v knihovnách prostatických nádorů. Tento expresní profil v tkáních byl pozorován při analýze exprese mRNA ve vzorcích normálních a nádorových tkání zjištěné analýzou PCR pomocí Taqman. Tento analytický způsob prokázal, že exprese mRNA kódující RG1 je v prostatických tkáních oproti jiným tkáním zvýšena.

Polynukleotidy

V souladu s jedním aspektem předkládaného vynálezu jsou popsány izolované polynukleotidy kódující polypeptid RG1 s dedukovanou aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2).

Pomocí zde uvedených informací, jako např. polynukleotidová sekvence uvedená na obr. 1 (SEKVENCE ID. C. 1), lze získat polynukleotid kódující polypeptid RG1 uvedený v předkládaném vynálezu pomocí standardních klonovacích a testovacích způsobů, jako např. klonování cDNA pomocí mRNA z buněk humánních tkání jako výchozího materiálu. Jako příklad lze uvést fakt, že polynukleotidová sekvence uvedená na obr. 1 (SEKVENCE ID. Č. 1) byla identifikována v klonech cDNA získaných z humánních prostatických tkání. Rgl byl identifikován jako gen exprimovaný v prostatě prohledáváním databáze Incyte LifeSeq. Tato nukleotidová sekvence byla identifikována prohledáváním anotací v databázi pomocí nástroje „Funkce proteinu“ poskyt45 nutého společnosti Incyte. Tato nukleotidová sekvence byla nalezena v anotované databázi v kategorii buněčných adhezivních molekul a byla popsána jako homolog f-spondinu. Elektronická Northern analýza distribuce polynukleotidových sekvencí rgl v souboru knihoven v databázi prokázala, že vysoké hladiny exprese rgl byly zjištěny v knihovnách prostatických tkání a nižší hladiny v knihovnách mnoha jiných tkání, včetně normálních a nádorových.

Po sestavení souboru klonů rgl z databáze do soustavy kontigů polynukleotidových sekvencí a po jejich úpravě na souvislou sekvenci byla identifikována úplná kódující sekvence predikovaného sestaveného polynukleotidů. Tato sekvence kóduje protein homologní s krysím mindinem.

- 10CZ 299232 B6

Klony databáze Incyte 1640796, 1712252 a 180265 byly získány zlncyte pro experimentální účely a klon 3360733 byl identifikován jako obsahující největší část nukleotidové sekvence 5'-konce. Byla získána úplná sekvence tohoto klonu, která obsahuje úplnou kódující sekvenci pro uměle odvozený protein RG1. Tato sekvence je uvedena na obr. 1 (SEKVENCE ID. C. 1).

Polynukleotidy v předkládaném vynálezu mohou být ve formě RNA, např. mRNA, či ve formě DNA, včetně např. cDNA a genomové DNA získané klonováním, nebo připravené způsoby chemické syntézy či kombinací těchto způsobů, nebo způsoby popsanými v tomto vynálezu. DNA může být jednovláknová či dvouvláknová. Jednovláknová DNA může být kódujícím vlákio nem, též zvaným „sense“ vlákno, nebo to může být nekódující vlákno, též zvané „antisense“ vlákno.

Sekvence kódující polypeptid může být shodná s kódující sekvencí polynukleotidu uvedeného na obr. 1 (SEKVENCE ID. C. 1). Může to také být polynukleotid s odlišnou sekvencí, který díky redundanci (degenerativnosti) genetického kódu kóduje polypeptid uvedený na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2).

Polynukleotidy předkládaného vynálezu kódující polypeptid uvedený na obr. 2 (SEKVENCE ID.

C. 2) mohou obsahovat kromě jiného sekvence kódující tento samotný polypeptid; sekvence kódující tento polypeptid s dalšími nekódujícími 5' a 3' sekvencí, jako např. transkribované ale netranslatované sekvence účastnící se transkripce a úpravy mRNA (např. signály pro sestřih a polyadenylaci) či další kódující sekvence, které kódují další aminokyseliny, jako např. aminokyseliny zajišťující další funkce. Tak může být polypeptid např. fúzován s markerovou sekvencí, jako např. s peptidem usnadňujícím purifikaci fúzního polypeptidu. V určitých výhodných provedeních tohoto záměru předkládaného vynálezu je markerovou sekvencí hexahistidinový peptid sloužící jako značka přidaná pomocí vektoru pTrcHisB (Invitrogen, Carlsbad, CA) a další, z nichž mnoho je komerčně dostupných. Jak bylo popsáno např. v publikaci Gantz et al. (Proč. Nati. Acadl. Sci. USA 86:821-824, 1989), hexahistidin umožňuje snadnou purifikaci fúzovaného proteinu.

Polynukleotidy mohou kódovat polypeptid, který kromě daného polypeptidu obsahuje další ami30 nokyselinové zbytky na C a N konci nebo uvnitř tohoto polypeptidu (např. když jeho aktivní forma obsahuje více než jeden polypeptidový řetězec). Tyto sekvence mohou hrát roli v úpravě polypeptidu z prekurzorové na konečnou formu, mohou usnadňovat pohyb polypeptidu, mohou prodlužovat či zkracovat jeho poločas nebo mohou usnadňovat manipulaci s polypeptidem při testování či produkci, atd. Jak je obvyklé v situaci in šitu, tyto další aminokyseliny mohou být z polypeptidu odstraněny proteolytické enzymy.

Předkládaný vynález se dále týká variant zde popsaných polynukleotidů kódujících fragmenty, analogy a deriváty polypeptidu s dedukovanou sekvencí uvedenou na obr. 2 (SEKVENCE ID. C. 2). Variantou polynukleotidu může být přirozeně se vyskytující varianta jako např. přirozeně se vyskytující alelická varianta, nebo to může být varianta, o níž není známo, že by se vyskytovala přirozeně. Tyto varianty polynukleotidů nevyskytující se přirozeně lze získat způsoby mutageneze, včetně těch, kterých se využívá pro polynukleotidy, buňky či organismy.

Mezi takto míněné varianty patří varianty, které se od výše popsaných polynukleotidů liší substitucemi, delecemi či adicemi nukleotidů. Tyto substituce, delece či adice se mohou týkat, jednoho nebo více nukleotidů. Varianty mohou být pozměněny jak v kódujících, tak i v nekódujících oblastech. Změny v kódujících oblastech mohou vést k substitucím, delecím či adicím konzervativních i nekonzervativních aminokyselin.

Mezi zvláště výhodná provedení předkládaného vynálezu patří z tohoto hlediska polynukleotidy kódující polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí RG1, jak je uvedena na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2); jejich varianty, analogy, deriváty či fragmenty a fragmenty těchto variant, analogů a derivátů.

-11 CZ 299232 B6

Dalším zvláště výhodným provedením z tohoto hlediska jsou polynukleotidy kódující varianty, analogy, deriváty a fragmenty RG1 a varianty, analogy a deriváty těchto fragmentů, jejichž aminokyselinová sekvence odpovídá sekvenci polypeptidu RG1 uvedené na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2) a kde u většího počtu, několika, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 nebo žádné aminokyseliny došlo k substituci, deleci, adici či jakékoli kombinace těchto jevů. Zvláště výhodnými jsou substituce, adice a delece bez vnějšího projevu, jež nemění vlastnosti a aktivity polypeptidu RG1. Zvláště výhodnými z tohoto hlediska jsou také konzervativní substituce. Nej výhodnějšími jsou polynukleotidy kódující polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2) bez substitucí.

ío Dalšími výhodnými provedeními předkládaného vynálezu jsou polynukleotidy vykazující alespoň 70% identitu (identitu) s polynukleotidem kódujícím polypeptid RG1 s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 2 (SEKVENCE ID. C. 2) a polynukleotidy komplementární k těmto polynukleotidům. Kromě nich jsou vysoce výhodné polynukleotidy obsahující oblast vykazující alespoň 80% identitu s polynukleotidem kódujícím polypeptid RG1 a polynukleotidy k nim komis plementámí. Z tohoto hlediska jsou zvláště výhodná polynukleotidy s alespoň 90% identitou s tímto polynukleotidem a mezi nimi jsou zvláště výhodné ty, které s ním vykazují alespoň 95% identitu. Navíc, polynukleotidy vykazující alespoň 97% identitu jsou zvláště výhodné mezi těmi, které vykazují alespoň 95% identitu, a z nich jsou zvláště výhodné ty, které vykazují alespoň

98% a 99% identitu, přičemž ty s 99% identitou jsou nejvýhodnější.

Z tohoto hlediska jsou navíc výhodnými provedeními polynukleotidy kódující polypeptidy, které vykazují v podstatě tutéž biologickou aktivitu jako polypeptid kódovaný polynukleotidovou sekvencí uvedenou na obr. 1 (SEKVENCE ID. Č. 1).

Předkládaný vynález se dále týká polynukleotidů, které hybridizují se zde výše popsanými sekvencemi. Z tohoto hlediska se tento vynález týká zvláště polynukleotidů, které hybridizují za stringentních podmínek se zde výše popsanými polynukleotidy.

Jak zde bude ještě dále uvedeno v souvislosti s testováním polynukleotidů popsaných v předklá30 daném vynálezu, polynukleotidy z tohoto vynálezu jak jsou popsány výše mohou sloužit např. jako hybridizační sondy pro cDNA a genomovou DNA k izolaci kompletních klonů cDNA a genomové DNA kódujících RG1 a k izolaci klonů cDNA a genomové DNA jiných genů vykazujících vysokou podobnost sekvence s genem rgl. Tyto sondy obvykle obsahují nejméně 15 bází. Výhodně tyto sondy obsahují nejméně 30 bází a mohou mít i nejméně 50 bází.

Tak např. kódující oblast genu rgl lze izolovat plošným testováním knihoven pomocí syntetických oligonukleotidových sond, které byly navrženy podle známé sekvence DNA. Např. značený oligonukleotid o sekvenci komplementární k sekvenci polynukleotidu uvedeného v předkládaném vynálezu může být využít k plošnému testování knihovny cDNA či genomové DNA za účelem identifikace klonů hybridizujících s danou sondou.

Lze tedy shrnout, že polynukleotid popsaný v předkládaném vynálezu může kódovat polypeptid a polypeptid s tzv. „leader“ sekvencí (který může být označen jako „prepolypeptid“).

Je zřejmé, že předkládaný vynález se kromě jiného týká polynukleotidů kódujících fragmenty polypeptidů, polynukleotidů hybridizujících s polynukleotidy kódujícími fragmenty polypeptidů, zejména těch, které hybridizují za stringentních podmínek, a polynukleotidů sloužících k amplifikaci polynukleotidů kódujících fragmenty polypeptidů jako např. primery PCR. Z tohoto hlediska jsou výhodné polynukleotidy odpovídající výhodným fragmentům polypeptidů jak budou popsány níže.

Polypeptidy

Předkládaný vynález se dále týká polypeptidu RG1, jehož dedukovaná aminokyselinová sekvence je uvedena na obr. 2 (a v seznamu sekvencí jako SEKVENCE ID. Č. 2).

- 12CZ 299232 B6

Tento vynález se také týká fragmentů, analogů a derivátů těchto polypeptidů. Termíny fragment, derivát a analog, pokud označují polypeptid uvedený na obr. 2 (SEKVENCE ID. C. 2) znamenají polypeptid vykazující v podstatě tutéž biologickou aktivitu jako uvedený polypeptid.

Polypeptidem uvedeným v předkládaném vynálezu může být rekombinantní polypeptid, přirozený polypeptid nebo syntetický polypeptid. V některých výhodných provedeních je jím rekombinantní polypeptid.

ío Fragmentem, derivátem či analogem polypeptidu uvedeného na obr. 2 (SEKVENCE ID. C. 2) může být (i) polypeptid, v němž jeden či více aminokyselinových zbytků bylo nahrazeno konzervovanou či nekonzervovanou aminokyselinou (výhodně zbytkem konzervované aminokyseliny) a tento substituovaný aminokyselinový zbytek může či nemusí být kódován genetickým kódem, nebo (ii) polypeptid, v němž jeden či více aminokyselinových zbytků má substituovanou skupinu, nebo (iii) polypeptid, který je fúzován s jinou látkou, např. s látkou zvyšující poločas polypeptidu (jako např. polyetylenglykol), nebo (iv) polypeptid, k němuž jsou fúzí připojeny další aminokyseliny jako „leader“ sekvence, sekreční sekvence nebo sekvence usnadňující purifikaci polypeptidu. Podle údajů uvedených v předkládaném vynálezu by odborníci měli být schopni pracovat s těmito fragmenty, deriváty a analogy.

Mezi zvláště výhodná provedení předkládaného vynálezu patří z tohoto hlediska polypeptidy o aminokyselinové sekvenci RG1 uvedené na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2), jejich varianty, analogy, deriváty či fragmenty a varianty, analogy či deriváty těchto fragmentů.

Výhodnými variantami jsou ty, které se od referenčního polypeptidu liší substitucí konzervativních aminokyselin. Jde o takové substituce, které nahradí danou aminokyselinu v polypeptidu jinou aminokyselinou s podobnými charakteristikami. Typickými konzervativními substitucemi jsou vzájemná nahrazení alifatických aminokyselin Ala, Val, Leu a Ile, výměna hydroxylových zbytků Ser a Thr, výměna kyselých zbytků Asp a Glu, substituce amidových zbytků Asn a Gin, výměna bazických zbytků Lys a Arg a výměny mezi aromatickými zbytky Phe a Tyr.

Dalšími výhodnými variantami, analogy, deriváty či fragmenty a fragmenty těchto variant, analogů či derivátů jsou z tohoto hlediska ty, jejichž aminokyselinová sekvence odpovídá sekvenci RG1 uvedené na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2), v níž u většího počtu, několika, 5 až 10, 1 až 5, 1 až 3, 2, 1 nebo žádného aminokyselinového zbytku došlo k substituci, deleci či adici nebo jakékoli kombinaci. Zvláště výhodnými jsou zde substituce, adice či delece bez vnějších projevů, které nemění vlastnosti a aktivity polypeptidu RG1. Z tohoto hlediska jsou také zvláště výhodné konzervativní substituce. Nejvýhodnější jsou polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí uvedenou na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2) bez substitucí.

Polypeptidy a polynukleotidy uvedené v předkládaném vynálezu jsou výhodně v izolované formě a purifikované do homogenity.

Polypeptidy v předkládaném vynálezu také zahrnují polypeptid uvedený na obr. 2 (SEKVENCE

ID. Č. 2), jakož i polypeptidy vykazující alespoň 70% podobnost (výhodně alespoň 70% identitu) s polypeptidem uvedeným na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2) a výhodněji alespoň 90% podobnost (výhodněji alespoň 90% identitu) s polypeptidem uvedeným na obr. 2 (SEKVENCE ID. C. 2), a ještě výhodněji alespoň 95% podobnost (ještě výhodněji alespoň 95% identitu) s polypeptidem uvedeným na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2), a také zahrnují úseky polypeptidu obsahující obvykle nejméně 30 aminokyselin a výhodněji nejméně 50 aminokyselin.

Jak je známo ve stavu techniky, „podobnost“ mezi dvěma polypeptidy je určena srovnáním aminokyselinové sekvence a jejích konzervativních aminokyselinových substituentů jednoho polypeptidu se sekvencí druhého polypeptidu.

- 13CZ 299232 B6

Fragmenty nebo úseky polypeptidů popsaných v předkládaném vynálezu lze využít k přípravě odpovídajících kompletních polypeptidů peptidovou syntézou; těchto fragmentů lze proto využít jako meziproduktů přípravy kompletních polypeptidů.

Fragmenty

Výhodným provedením tohoto záměru předkládaného vynálezu jsou také polypeptidy obsahující fragmenty RG1, a to zejména fragmenty RG1 uvedeného na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2) a fragmenty variant a derivátů RG1 uvedeného na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2).

ío Z tohoto hlediska je fragmentem polypeptid, jehož celková aminokyselinová sekvence je shodná s částí ale ne s celkem aminokyselinové sekvence výše uvedených polypeptidů RG1 a jejich variant a derivátů.

Tyto fragmenty mohou být „samostatné“ nebo „volné“, tj. nejsou součástí jiných polypeptidů nebo fúzovány s dalšími aminokyselinami, nebo mohou být součástí většího polypeptidu, jehož jsou úsekem či oblastí. Pokud jsou součástí většího polypeptidu, tyto zde uvedené fragmenty nejvýhodněji tvoří jedinou souvislou oblast. Jediný větší polypeptid však může obsahovat více fragmentů. Např. některá určitá provedení se týkají fragmentu polypeptidu RG1, uvedeného v předkládaném vynálezu, který je obsažen v prekurzoru polypeptidu určeného k expresi v hosti20 teli a jehož pre- a propolypeptidové oblasti jsou fúzovány s N koncem fragmentu RG1 a další oblast je fúzována s C koncem tohoto fragmentu. Fragment v jednom určitém významu míněném v tomto záměru vynálezu tedy označuje úsek nebo úseky fúzního polypeptidu či fúzního proteinu odvozeného z RG1.

Reprezentativní příklady polypeptidových fragmentů uvedených v tomto vynálezu mohou být ty, které obsahují přibližně 25 až přibližně 331 aminokyselin.

V tomto kontextu „přibližně“ označuje konkrétně výše uvedené rozmezí a rozmezí užší či širší o větší počet, několik 5, 4, 3, 2 či 1 aminokyselin na každé hranici rozmezí nebo na obou jeho hranicích. Např. přibližně 331 aminokyselin v tomto kontextu znamená polypeptidový fragment od 25 plus nebo minus větší počet, několik, 5, 4, 3, 2 či 1 aminokyselin do 331 plus nebo minus větší počet, několik, 5, 4, 3, 2 či 1 aminokyselinových zbytků, tj. rozmezí široké od 25 minus větší počet aminokyselin do 331 plus větší počet aminokyselin a úzké od 25 plus větší počet aminokyselin do 331 minus větší počet aminokyselin.

Vysoce výhodná z tohoto hlediska jsou výše uvedená rozmezí plus nebo minus až 5 aminokyselin na kterékoli z obou hranic rozmezí nebo na obou hranicích rozmezí. Zvlášť vysoce výhodná jsou uvedená rozmezí plus nebo minus až 3 aminokyseliny na kterékoli z obou hranic rozmezí nebo na obou hranicích rozmezí. Velmi vysoce výhodná jsou rozmezí plus nebo minus jedna aminoky40 selina na jedné či obou hranicích výše uvedených rozmezí bez adicí či delecí. Nej výhodnějšími z tohoto hlediska jsou fragmenty od přibližně 25 do přibližně 331 aminokyselin.

Zvláště výhodnými fragmenty v předkládaném vynálezu jsou zkrácené mutanty RG1. Mezi zkrácené mutanty RG1 patří varianty či deriváty sekvence uvedené na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2) kromě těch, které vykazují deleci souvislé série zbytků (tj. souvislé oblasti, části či úseku) pokrývající N konec sekvence uvedené na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2), nebo souvislé série zbytků pokrývající C konec, anebo, jako je tomu u dvojnásobných mutant, deleci dvou souvislých sérií zbytků, z nichž jedna pokrývá N konec a jedna C konec. Fragmenty o velikosti v rozmezí uvedeném výše jsou také výhodnými provedeními zkrácených fragmentů, které jsou mezi fragmenty obecně považovány za zvláště výhodné.

Zvláště výhodnými pro tento záměr předkládaného vynálezu jsou fragmenty vyznačující se biologickými a/nebo imunologickými charakteristikami RG1. Tyto fragmenty zahrnují fragmenty obsahující předem stanovené strukturální domény RG1, které pokrývají alespoň aminokyseliny

-14CZ 299232 B6 až 103, 138 až 221, resp. 278 až 330 či fragmenty využité k přípravě protilátek, např. ty, které jsou popsány v příkladu 4.

Některé oblasti výhodné z tohoto hlediska jsou uvedeny na obr. 2 (SEKVENCE ID. C. 2) a zahrnují kromě jiného oblasti zmíněné výše a identifikované analýzou aminokyselinové sekvence uvedené na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2).

Mezi vysoce výhodné z tohoto hlediska patří ty, které obsahují oblasti RG1, ve kterých jsou kombinovány určité strukturální charakteristiky, jako např. ty, jež jsou popsány výše. Z tohoto ío hlediska jsou zvláště výhodnými oblastmi dvě spondinové a jedna trombospondinová oblast, pokrývající přibližně aminokyseliny 31 až 103, 138 až 221, resp. 278 až 330, které jsou charakteristické pro vyšší rodinu proteinů extracelulární matrix Mindin/spondin. Tyto oblasti mohou být součástí většího polypeptidu nebo mohou samy o sobě představovat výhodný fragment předkládaného vynálezu, jak bylo popsáno výše. Je zřejmé, že termín „přibližně“ jak je použit v tomto odstavci má význam uvedený výše v textu zabývajícím se obecně fragmenty.

Dalšími výhodnými oblastmi jsou oblasti zajišťující aktivity RG1. Nej výhodnějšími z tohoto hlediska jsou fragmenty vykazující chemickou, biologickou či jinou aktivitu RG1, včetně těch, které vykazují podobnou či vyšší aktivitu tohoto typu nebo mají sníženou nežádoucí aktivitu.

Vysoce výhodné z tohoto hlediska jsou fragmenty obsahující oblasti se sekvencí či pozicí, nebo sekvenci i pozici homologní s aktivními oblastmi příbuzných polypeptidů, jako např. jiné proteiny rodiny Mindinů, včetně RG1.

Vektory, hostitelské buňky a expresní systémy

Předkládaný vynález se také týká vektorů, mezi něž patří polynukleotidy uvedené v tomto vynálezu, hostitelské buňky, které jsou obvykle geneticky modifikovány pomocí vektorů uvedených v tomto vynálezu, a přípravy polypeptidů uvedených v tomto vynálezu rekombinantními metodami. Tyto metody jsou popsány v publikacích Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, Plainview, N. Y., 1989, a Ausubel, F. M. et al., Current

Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, New York, N. Y., 1989.

Hostitelské buňky mohou být geneticky modifikovány pro vnášení polynukleotidů uvedených v tomto vynálezu a jejich expresi. Polynukleotidy mohou být vneseny do hostitelských buněk např. pomocí dobře známých způsobů infekce, transdukce, transfekce, transvekce a transformace.

Polynukleotidy mohou být vneseny samostatně nebo sjinými polynukleotidy. Tyto další polynukleotidy mohou být vneseny nezávisle, společně či ve spojení s polynukleotidy tohoto vynálezu.

Tak mohou např. být pomocí standardních způsobů kotransfekce a selekce např. v savčích buňkách vneseny polynukleotidy uvedené v tomto vynálezu do hostitelských buněk s jiným, odděleným polynukleotidem kódujícím selektovatelný markér. V tomto případě budou obvykle polynukleotidy stabilně zabudovány do genomu hostitelské buňky.

V jiném případě mohou být polynukleotidy určené k propagaci v hostiteli spojeny s vektorem obsahujícím selektovatelný markér. Vektorový konstrukt může být vnesen do hostitelské buňky výše zmíněnými způsoby. Plazmidový vektor se obvykle vnáší jako DNA v precipitátu, např. jako precipitát fosforečnanu draselného, nebo v komplexu s lipidickým iontem. K vnesení polynukleotidu do hostitele může být také využita elektroporace. Pokud je vektorem virus, může být zabalen do kapsidy in vitro nebo vnesen do zahalující buněčné linie a zabalený virus může být transdukcí vnesen do buněk. Odborníkům je dobře známa celá řada rutinně využívaných způsobů přípravy polynukleotidů a vnášení polynukleotidů do buněk podle potřeb tohoto záměru předkládaného vynálezu. Tyto způsoby jsou podrobně popsány v publikaci Sambrook et al. uvedené výše, jež je příkladem z řady laboratorních příruček detailně popisujících tyto způsoby. V souladu s tímto aspektem předkládaného vynálezu může být vektorem např. plazmidový vektor,

- 15CZ 299232 B6 jednovláknový či dvouvláknový fágový vektor, jednovláknový či dvouvláknový RNA či DNA virový vektor. Tyto vektory mohou být vnášeny do buněk jako polynukleotidy, výhodně jako DNA, dobře známými způsoby pro vnášení DNA a RNA do buněk. V případě fágových a virových vektorů mohou být a výhodně také jsou tyto vektory vnášeny do buněk jako přirozeně či uměle zabalený virus dobře známými způsoby infekce či transdukce. Virové vektory mohou být schopné či neschopné samostatné replikace. Pokud jsou replikačně defektivní, propagace viru obvykle probíhá pouze v komplementujících hostitelských buňkách.

Výhodnými vektory jsou v určitých ohledech vektory pro expresi polynukleotidů a polypeptidů uvedených v předkládaném vynálezu. Tyto vektory obvykle obsahují intramolekulámě působící kontrolní oblasti pro expresi v hostiteli podle potřeby spojené s polynukleotidem, který má být exprimován. Odpovídající intermolekulámě působící faktory jsou poskytnuty buď hostitelem nebo komplementujícím vektorem, či samotným vektorem při vnášení do hostitele.

V určitých z tohoto hlediska výhodných provedeních vektory umožňují specifickou expresi. Takovou specifickou expresí může být indukovatelná exprese ěi exprese pouze v určitých typech buněk nebo obojí, exprese indukovatelná pouze v určitých typech buněk. Mezi zvláště výhodné indukovatelné vektory patří vektory, jejichž expresi lze indukovat faktory prostředí, které lze snadno ovlivňovat, jako např. teplota a nutriční přídavky. Rada vektorů vhodných pro tento záměr předkládaného vynálezu, včetně vektorů pro konstitutivní nebo indukovatelnou expresi v prokaryotických či eukaryotických buňkách, je dobře známa a rutinně využívána odborníky.

Geneticky modifikovaná hostitelská buňka může být kultivována v odpovídajícím kultivačním médiu, jež může být podle potřeby upraveno např. pro aktivaci promotorů, selekci transformant či amplifikaci genů. Kultivační podmínky, jako např. teplota, pH apod., které byly dříve využívány ke kultivaci hostitele vybraného pro expresi, jsou obvykle vhodné pro expresi polypeptidů uvedených v předkládaném vynálezu a odborníci je snadno odvodí.

K expresi polypeptidu předkládaného vynálezu lze využít celou řadu expresních vektorů. Mezi tyto vektory patří vektory chromozomální, epizomální či virové, např. vektory odvozené z bakteriálních plazmidů, z bakteriofágů, zkvasničných epizomů, zkvasničných chromozomálních elementů, z virů jako bakuloviry, viry papova jako SV40, viry vaccinia, adenoviry, viry drůbežích neštovic, viry pseudorabies, retroviry a alfaviry jako virus Sindbis, a dále vektory odvozené z jejich kombinací jako např. vektory odvozené z plazmidových a bakteriofágových genových elementů jako kosmidy a tzv. „phagemidy“; všechny tyto vektory lze využít pro expresi v souladu s tímto aspektem předkládaného vynálezu. Z tohoto hlediska lze využít k expresi polypeptidu v hostiteli jakýkoli vektor schopný nést, množit či exprimovat nějaký polynukleotid.

Odpovídající sekvence DNA může být vložena do vektoru jakýmkoli z celé řady dobře známých a rutinně využívaných způsobů. Sekvence DNA, která má být exprimována, je obvykle spojena s expresním vektorem pomocí štěpení sekvence DNA a expresního vektoru jednou či více restrikčními endonukleázami a poté spojením restrikčních fragmentů pomocí DNA ligázy T4. Způsoby restrikce a ligace, které lze pro tento účel využít, jsou dobře známy a rutinně využívány odborníky. Způsoby vhodné pro tyto účely a pro konstrukci expresních vektorů pomocí jiných způsobů, jež jsou též dobře známy a rutinně využívány odborníky, jsou popsány v publikaci Sambrook et al., která je zde uvedena na jiném místě.

Sekvence DNA v expresním vektoru je podle potřeby spojena s vhodnou sekvencí (vhodnými sekvencemi) pro kontrolu exprese, jako např. promotoru řídicího transkripci mRNA. Příklady takových promotorů jsou promotor fága lambda PL, promotory E. coli lac, trp, tac a trc, časný a pozdní promotor SV40 a promotory retrovirových LTR, abychom uvedli alespoň několik dobře známých promotorů. Je zřejmé, že mnoho promotorů, které zde nejsou uvedeny, je využitelných pro účely tohoto záměru předkládaného vynálezu, jsou dobře známy a mohou být snadno využity odborníky podle popisu a příkladů uvedených v tomto vynálezu.

- 16CZ 299232 B6

Expresní vektory obvykle obsahují místa pro iniciaci transkripce a terminaci a v transkribované oblasti mají ribozomální vazebné místo pro translaci. Kódující úsek transkriptů exprimovaný konstrukty obsahuje na začátku kodon AUG pro iniciaci transkripce a na konci vhodně umístěný terminační kodon pro polypeptid, který má být translatován.

Kromě toho mohou konstrukty obsahovat kontrolní oblasti, které regulují i vyvolávají expresi. V souladu s mnoha běžně užívanými způsoby tyto oblasti obvykle fungují tak, že zajišťují kontrolu transkripce, jako např. vazebná místa pro represory a enhancery.

Vektory pro množení (propagaci) a expresi obvykle obsahují selektovatelné markéry. Tyto markéry mohou být také využity k jejich amplifikaci nebo mohou za tímto účelem obsahovat jiné markéry. Z tohoto hlediska expresní vektory obsahují výhodně jeden či více selektovatelných markerových genů, poskytujících fenotypovou charakteristiku pro selekci transformovaných hostitelských buněk. Výhodnými markéry jsou pro eukaryotické buňky např. rezistence k di15 hydrofolát-reduktáze, neomycinu, puromycinu či hygromycinu a pro kultivaci E. coli a jiných bakterií geny pro rezistenci k tetracyklinu, theomycinu, kanamycinu či ampicilinu.

Vektor obsahující vhodnou sekvenci DNA, jak je popsána jinde v předkládaném vynálezu, a dále vhodný promotor a další kontrolní sekvence může být vnesen do vhodného hostitele pomocí řady dobře známých vhodných způsobů pro zajištění exprese požadovaného polypeptidu v tomto hostiteli. Mezi reprezentativní příklady vhodných hostitelů patří bakteriální buňky jako např. E. coli, Streptomyces, Salmonella typhimurium; buňky hub jako kvasničné buňky; hmyzí buňky jako Drosophila S2 a Spodoptera Sf9; živočišné buňky jako CHO, COS a buňky Bowesova melanomů; a rostlinné buňky; výhodné jsou hmyzí buňky BTI-TN-5B1-4. Je známa celá řada hostitelů pro expresní konstrukty a odborníci by měli být schopni pomocí zde uvedených informací vybrat hostitele k expresi polypeptidů pro účely tohoto záměru předkládaného vynálezu.

Pro expresi lze využít i řadu savčích systémů tkáňových kultur. Mezi příklady savčích expresních systémů patří buněčné linie opičích ledvinných fibroblastů COS-7 (Gluzman et al., Cell 23:175,

1 991). Další buněčné linie schopné exprimovat kompatibilní vektor jsou např. buněčné linie

Cl27, 3T3, CHO, HeLa, lidské ledvinné buňky 293 a BHK. V savčích hostitelských buňkách může být využita řada virových expresních systémů. Pokud se jako expresní vektor použije adenovirus, polynukleotidová sekvence kódující RG1 může být ligována do adenovirového komplexu pro transkripci/translaci, složeného z pozdního promotoru a trojdílné „leader“ sekvence.

Vnesením do postrádátelných oblastí virového genomu El či E3 bude získán životaschopný virus schopný exprimovat RG1 v infikovaných hostitelských buňkách (Logan a Shenk, Proč. Nati. Acad. Sci. EISA 81:3655-59, 1984). Navíc mohou být k zesílení exprese v savčích hostitelských buňkách využity enhancery transkripce, jako např. enhancer viru Rousova sarkomu (RSV).

Předkládaný vynález také konkrétněji uvádí rekombinantní konstrukty, jako např. expresní konstrukty obsahující jednu nebo více sekvencí popsaných výše. Tyto konstrukty obsahují vektor, např. plazmidový či virový, do kterého byla vložena sekvence uvedená v tomto vynálezu. Sekvence může být vložena v přímém či opačném směru. V některých z tohoto hlediska výhodných provedeních konstrukt dále obsahuje regulační sekvence jako např. promotor, podle potřeby spojený s danou sekvencí. Odborníkům je známa celá řada vhodných vektorů a existuje mnoho komerčně dostupných vektorů využitelných pro účely předkládaného vynálezu.

Pro příklad jsou zde uvedeny následující komerčně dostupné vektory. Mezi vektory výhodně využitelné v bakteriích patří pQE70, pQE60 a pQE-9 od firmy Qiagen USA (Valencia, CA);

vektory pBS, Phagescript®, Bluescript®, pNH8A, pNHI6a, pNH18A, pNH46A od firmy Stratagene (LaJolla, CA); a ptrc99a, pK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 od firmy Pharmacia Biotech (Piscataway, NJ). Nejvýhodnější je vektor pTrcHisB od firmy Invitrogen. Mezi výhodné eukaryotické vektory patří pWLNEO, pSV2CAT, pOG44, PXTUI a pSG od firmy Stratagene; a PSVK3, pBPV, pMSG a pSVL od firmy Pharmacia Biotech. Nejvýhodnější je vektor pCIneo od firmy Promega. Tyto vektory jsou uvedeny pouze jako ilustrativní příklady mnoha komerčně

- 17CZ 299232 B6 dostupných a dobře známých vektorů, které mají odborníci k dispozici a mohou je využít pro účely předkládaného vynálezu. Je zřejmé, že jakýkoli jiný plazmid nebo vektor vhodný např. k vnesení, uchování, propagaci či expresi polynukleotidů nebo polypeptidu uvedeného v tomto vynálezu v hostiteli lze využít pro účely předkládaného vynálezu.

Promotorovou oblast lze selektovat z jakéhokoli požadovaného genu pomocí vektorů obsahujících reportérovou transkripční jednotku s chybějící promotorovou oblastí, jako např. chloramfenikol-acetyltransferázová („cat“) transkripční jednotka, umístěnou za restrikčním místem nebo místy pro vložení kandidátského promotorového fragmentu, tj. fragmentu, který by mohl obsaho10 vat promotor. Jak je dobře známo, vložení fragmentu obsahujícího promotor do restrikčního místa vektoru před gen cat působí, že se projeví aktivita CAT, která může být stanovena standardními testy na CAT. Vektory vhodné pro tento účel jsou dobře známé a dostupné. Dvěma takovými vektory jsou pKK232-B a pCM7. Promotory pro expresi polynukleotidů předkládaného vynálezu jsou tedy nejen dobře známé a dostupné promotory, ale také promotory, které lze připravit existujícími způsoby pomocí reportérových genů.

Mezi známé bakteriální promotory vhodné pro expresi polynukleotidů a polypeptidů pro účely předkládaného vynálezu patří promotory E. coli láci a lacZ, promotory T3 a T7, promotor T5 tac, lambda PR, promotory PR, promotor trp a hybridní promotor trc, který je odvozen z promotorů trp a lac. Známými eukaryotickými promotory vhodnými pro tyto účely jsou velmi časný promotor CMV, thymidin-kinázový promotor HSV, časný a pozdní promotor SV40, promotory retrovirových LTR, jako např. viru Rousova sarkomu (RSV), a metalothioneionové promotory, jako např. myší promotor metalothionein-I.

Selekce vhodných vektorů a promotorů pro expresi v hostitelské buňce je dobře známá a potřebné způsoby pro konstrukci expresních vektorů, vnesení vektoru do hostitele a expresi v hostiteli jsou odborníky rutinně využívány.

Rekombinantní expresní vektory obvykle obsahují počátek replikace, promotor odvozený z vyso30 ce exprimovaného genu k řízení transkripce strukturální sekvence nacházející se za ním a selektovatelný markér umožňující izolaci buněk obsahujících vektor po jejich vystavení působení vektoru.

Předkládaný vynález se také týká již popsaných hostitelských buněk obsahujících výše zmíněné konstrukty. Hostitelskou buňkou může být vyšší eukaryotická buňka, např. savčí, nebo nižší eukaryotická buňka, např. kvasinka, nebo může být hostitelskou buňkou prokaryotická buňka, např. bakteriální. Konstrukty vnesené do hostitelských buněk mohou být využity konvenčním způsobem k produkci genového produktu kódovaného rekombinantní sekvencí.

Polypeptidy mohou být exprimovány v savčích buňkách, kvasinkách, bakteriích nebo jiných buň40 kách pod kontrolou vhodných promotorů. K produkci těchto proteinů pomocí RNA odvozených z konstruktů DNA uvedených v předkládaném vynálezu lze také využít bezbuněčné translační systémy. Vhodné klonovací a expresní vektory k využití v prokaryotických a eukaryotických hostitelích jsou popsány v publikaci Sambrook et al., která je zde uvedena na jiném místě.

Transkripce DNA kódující polypeptid uvedený v předkládaném vynálezu vyššími eukaryotickými buňkami může být zesílena vložením enhancerové sekvence do vektoru. Enhancery jsou intramolekulámě působící elementy DNA, obvykle o 10- 300 bp, jejichž funkcí je zesilovat transkripční aktivitu promotoru v daném hostitelském buněčném typu. Příkladem enhancerů je enhancer SV40, který je umístěn v pozdní části od počátku replikace mezi bp 100 a 270, dále časný cytomegalovirový enhancer, enhancer polyomového viru umístěný v pozdní části od počátku replikace, a dále adenovirové enhancery.

Polynukleotidy uvedené v tomto vynálezu, kódující heterologní strukturní sekvence polypeptidu z tohoto vynálezu, se obvykle vkládají do vektoru pomocí standardních způsobů, přičemž jsou

-18CZ 299232 B6 podle potřeby spojeny s expresním promotorem. Polynukleotid je umístěn tak, aby počátek transkripce byl umístěn ve správné pozici 5' od vazebného místa ribozomu. Vazebné místo ribozomu je umístěno v pozici 5' od kodonu AUG pro iniciaci transkripce polypeptidu, který má být exprimován. Mezi vazebným místem ribozomu a iniciačním kodonem AUG obvykle není žádný další otevřený čtecí rámec začínající iniciačním kodonem, obvykle AUG. Na konci polypeptidu je také obvykle umístěn kodon pro terminaci translace a na 3' konci transkribované oblasti se též nachází odpovídajícím způsobem umístěný polyadenylační signál a signál pro terminaci transkripce.

Pro sekreci translatovaného proteinu do lumen endoplazmatického retikula, do periplazmatického prostoru či do extracelulámího prostředí mohou být do exprimovaného polypeptidu zabudovány odpovídající sekreční signály. Těmito signály mohou být endogenní signály daného polypeptidu, nebo to mohou být heterologní signály. Polypeptid může být exprimován v pozměněné formě, např. jako fúzní protein, a může obsahovat nejen sekreční signály, ale také další heterologní funkční oblasti. Tak může být např. k N konci polypeptidu připojena oblast dalších aminokyselin, zejména těch, které nesou náboj, aby tak byla zvýšena stabilita a schopnost přetrvání v hostitelské buňce při purifikaci nebo při další manipulaci a skladování. Mohou být také připojeny další speciální oblasti k usnadnění purifikace polypeptidu. Tyto oblasti mohou být před konečnou přípravou polypeptidu odstraněny. Připojení peptidových oblastí k polypeptidům např. za účelem vyvolání sekrece či exkrece, ke zlepšení stability a k usnadnění purifikace jsou běžně známé a rutinní způsoby. Např. v případě potřeby většího množství RG1 k indukci protilátek mohou být zapotřebí vektory, které zajišťují vysokou hladinu exprese snadno purifikovatelných fúzních proteinů. Mezi těmito vektory lze uvést kromě jiného multifunkční klonovací a expresní vektory E. coli, jako např. Bluescript® (Stratagene), kde kódující sekvence rgl může být do vektoru ligována v čtecím rámci se sekvencí N-koncového Met a dalších 7 zbytků β-galaktosidázy, takže vzniká hybridní protein; vektory pIN (Van Heede a Shuster, J. Biol. Chem. 264:5503-5509, 1989) apod. Vektory PtrcHis (Invitrogen, Carlsbad, CA) lze využít k expresi cizorodých polypeptidů a fúzních proteinů obsahujících polyhistidinovou (6x His) značku pro snadnou purifikaci. Proteiny produkované v těchto systémech jsou navrženy tak, aby obsahovaly štěpná místa, např. štěpné místo pro enterokinázu, takže klonovaný polypeptid může být vyštěpen z fúzní peptidové části podle potřeby.

Po transformaci vhodného hostitelského kmenu a namnožení hostitelského kmenu do potřebné buněčné hustoty lze odpovídajícím způsobem (např. změnou teploty či přidáním chemického induktoru) a poté buňky dále kultivovat.

Poté jsou buňky obvykle sklizeny centrifugací, rozrušeny fyzickou nebo chemickou cestou a výsledný hrubý extrakt je uchován pro další purifikaci.

Mikrobiální buňky využité k expresi proteinů mohou být rozrušeny jakýmkoli vhodným způso40 bem, včetně cyklického zmrazování a rozmrazování, ultrazvuku, mechanického rozrušení, či využití látek vyvolávajících lyži buněk; tyto způsoby jsou odborníkům dobře známy.

Polypeptid RG1 může být získán a purifikován z kultur rekombinantních buněk dobře známými způsoby, např. precipitací síranem amonným či ethanolem, kyselou extrakcí, chromatografií na iontoměničích, na fosfocelulóze, chromatografií využívající hydrofobní interakce, afinitní chromatografií, chromatografií na hydroxyapaptitu a lektinovou chromatografií. Nej výhodnější purifikací je chromatografie HPLC (high performance liquid chromatography). Pokud je polypeptid během izolace a purifikace denaturován, lze pro obnovu jeho aktivní konformace využít dobře známé způsoby obnovy molekulárního uspořádání proteinů. Mezi řadou dobře popsaných způso50 bů purifikace proteinů lze uvést publikace Deutscher, M., Methods in Enzymology, Vol. 182, Academie Press, San Diego, 1982; a Scopes, R., Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York, 1982.

Polypeptidy uvedené v předkládaném vynálezu lze také připravit přímou syntézou peptidů způsoby využívajícími látky v pevné fázi (Stewart et al., Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H.

-19CZ 299232 B6

Freeman Co., San Francisco, 1969; Merrifield, J., J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2154, 1963). Syntézu proteinů in vitro lze provádět ručně nebo automatizovaně. Automatickou syntézu lze např. provádět pomocí syntetizátoru Applied Biosystems 413A Peptide Synthetizer (Perkin Elmer, Foster City, Calif) podle návodu výrobce. Různé fragmenty RG1 mohou být chemicky syntetizovány každý zvlášť a pak kombinovány chemickými způsoby na kompletní molekuly.

Mezi polypeptidy uvedené v předkládaném vynálezu patří přirozené purifikované produkty, produkty chemických syntetických způsobů a produkty získané rekombinantními způsoby z buněk prokaryotických či eukaryotických hostitelů, např. z bakterií, kvasinek, buněk vyšších rostlin, ío hmyzích buněk či savčích buněk. V závislosti na hostiteli použitém při způsobu rekombinantní přípravy mohou být polypeptidy uvedené v tomto vynálezu glykosylované či neglykosylované.

Navíc mohou tyto polypeptidy také obsahovat modifikovaný počáteční methioniový zbytek, někdy jako důsledek procesů, za které je odpovědný hostitel.

Použití polypeptidů RG1 a polynukleotidů, které je kódují

Polynukleotidy rgl a polypeptidy RG1 mohou být využity pro účely předkládaného vynálezu v řadě aplikací, zejména těch, které využívají chemických a biologických vlastností RG1. Další aplikace se týkají diagnostiky a léčby chorob zhoubného bujení, např. rakoviny prostaty. Tyto záměry předkládaného vynálezu jsou diskutovány v následujícím textu a jsou také popsány dále v podrobném oddíle.

Podkladem pro využití polynukleotidových a polypeptidových sekvencí v předkládaném vynálezu je částečně chemická a strukturální homologie mezi RG1 popsaným zde a jinými molekulami extracelulámími matrix, a dále převládající exprese RG1 v prostatických tkáních ve srovnání sjinými tkáněmi. RG1 lze využít k diagnostice a léčbě stavů, poruch či chorob spojených s abnormálním růstem prostatické tkáně. Těmi jsou např. rakovina a metastatické nádorové bujení, ale i jiné choroby.

Polynukleotidové sekvence rgl lze využít jako sondy DNA a jako cíle pro „antisense“ či ribozymovou léčbu, nebo jako templáty pro přípravu „antisense“ polynukleotidů.

Polypeptidy RG1 lze využít k přípravě protilátek proti RG1, které mohou sloužit k detekci hladiny polypeptidů RG1 v buňkách a tkáních a k cílení léčiv do primárních a metastatických nádorů.

Polypeptidy RG1 lze využít ke stimulaci imunitní odpovědi buněk obsahujících RG1.

Polynukleotidy kódující RG1 lze využít při diagnostických testech k detekci hladiny polynukleotidů kódujících RG1 v buňkách a tkáních.

U stavů spojených s expresí RG1, např. při rakovině prostaty, může být výhodné potlačit expresi či aktivitu RG1. Exprese RG1 může být potlačena podáním „antisense“ oligonukleotidů nebo ribozymů. Lze také podávat protilátky specificky rozpoznávající oblasti polypeptidů RG1 odpovědné za jeho aktivitu, a tak léčit choroby či stavy spojené s aktivitou RG1.

Polynukleotidové testy

Předkládaný vynález se také týká použití polynukleotidů příbuzných rgl k detekci komplementárních polynukleotidů např. jako diagnostické látky (diagnostické agens). Detekce polynukleotidů rgl spojených s chorobným stavem může sloužit jako nástroj pro vývoj diagnostických způsobů in vivo a in vitro, které mohou zlepšit nebo určit diagnózu choroby nebo náchylnost k chorobě, jež je výsledkem tkáňové specifické exprese RG1.

Jedinci s mutacemi genu kódujícího RG1 mohou být identifikování na úrovni DNA řadou způsobů. Vzorky polynukleotidů k diagnostice mohou být získány z pacientových buněk, např.

-20CZ 299232 B6 z krve, moče, slin, biopsie tkání či z pitevních materiálů. Genomovou DNA lze využít k přímé detekci nebo ji lze před analýzou enzymaticky amplifikovat pomocí PCR (Saiki et al., Nátuře 324:163-166, 1986). Takto lze také využít RNA či cDNA. Jako příklad lze uvést využití PCR primerů komplementárních k polynukleotidové sekvenci kódující RG1 pro identifikaci a analýzu exprese a mutací rgl. Delece a inzerce lze např. zjistit změnami velikosti amplifikovaného produktu oproti normálnímu genotypu. Bodové mutace lze určit hybridizaci amplifikované DNA s radioaktivně značenou RNA rgl nebo pomocí radioaktivně značených „antisense“ sekvencí DNA rgl. Dokonale si odpovídající sekvence mohou být odlišeny od neodpovídajících duplexů štěpením RNázou A či rozdíly v teplotě tání.

Rozdíly v sekvenci mezi referenčním genem a mutovanými geny mohou být také zjištěny přímým sekvenováním DNA. Klonované segmenty DNA lze také využít jako sondy k detekci specifických segmentů DNA. Citlivost těchto způsobů může být značně zvýšena vhodným využitím PCR nebo jiných amplifikačních způsobů. Např. sekvenovací primer se užívá s dvou15 vláknovým produktem PCR nebo jednovláknovou molekulou templátu připravenou modifikovanou reakcí PCR. Sekvence je určena konvenčními způsoby pomocí radioaktivně značených polynukleotidů či automatickými sekvenačními způsoby pomocí fluorescenčních značek.

Genetické testy založené na rozdílech sekvencí DNA mohou být prováděny na základě detekce změn elektroforetické pohyblivosti fragmentů DNA v gelech, za přítomnosti denaturačních činidel či bez nich. Malé sekvenční delece a inzerce mohou být zviditelněny gelovou elektroforézou s vysokou odlišitelností. Fragmenty DNA různých sekvencí mohou být odlišeny na denaturačních formamidových gradientových gelech, kde pohyblivost různých fragmentů DNA je v gelu zpomalena v různých místech odpovídajících jejich specifické teplotě tání nebo částečného tání (viz např. Myers et al., Science 230:1242, 1985).

Změny sekvencí v různých místech mohou být také identifikovány nukleázovou protekční reakcí, např. pomocí RNázy a Sl, nebo způsoby chemického štěpení (viz např. Catton et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 85:4397^1401, 1985).

Detekce specifické sekvence DNA tedy může být prováděna způsoby jako je hybridizace, nukleázová protekční reakce pomocí RNázy, chemické štěpení, přímé sekvenování DNA nebo využitím restrikčních enzymů (např. testování polymorfismů délky restrikčních fragmentů (RFLP) a Southern blotting genomové DNA).

Kromě konvenčnějších způsobů jako je gelová elektroforéza nebo sekvenování DNA lze provádět detekci mutací také analýzou in šitu.

Polypeptidové testy

Předkládaný vynález se také týká diagnostických způsobů jako jsou kvantitativní a diagnostické testy pro detekci hladiny polypeptidů RG1 v buňkách, tkáních a tělních tekutinách, zahrnující určení normální a abnormální hladiny. Tak např. diagnostický test podle předkládaného vynálezu sloužící k detekci zvýšené exprese polypeptidů RG1 oproti normálním vzorkům tkání může být využit k detekci výskytu neoplazie, např. rakoviny prostaty. Tyto diagnostické testy lze také využít k detekci metastatického nádorového růstu. Testovací způsoby, jichž lze využít k určení hladiny nějakého polypeptidů, např. polypeptidů RG1 uvedeného v tomto vynálezu, ve vzorku odvozeného z hostitele, jsou odborníkům dobře známy. Tyto testovací způsoby zahrnují radioimunologické testy (RIA), kompetitivní vazebné testy, analýzu Western blot a testy ELISA („enzyme-linked immunoabsorbant assays“), a dále fluorescenční buněčné třídění (FACS).

Z nich se nejčastěji používá test ELISA. Při testu ELISA se nejprve připraví protilátka specifická pro RG1, výhodně monoklonální protilátka. Kromě toho se obvykle připraví reportérová protilátka, která se váže na monoklonální protilátku. Reportérová protilátka se připojí k identifikovatelné látce, jako např. radioaktivní, fluorescenční či enzymatické látce, v tomto případě k enzymu křenová peroxidáza.

-21 CZ 299232 B6

Při provádění testu ELISA se z hostitele odebere vzorek a inkubuje se na pevném nosiči, např. na polystyrénové destičce, kde se ukotví polypeptidy ze vzorku. Všechna volná vazebná místa na destičce se pak blokují inkubací s nespecifickým proteinem jako bovinní sérový albumin. Poté se monoklonální protilátka inkubuje na destičce, přičemž se na polypeptidy RG1 ukotvené na polystyrénové destičce navážou monoklonální protilátky. Nenavázaná monoklonální protilátka se vymyje pufrem. Reportérové protilátka vázaná na křenovou peroxidázu se nanese na destičku, takže reportérové protilátka se naváže na kteroukoli monoklonální protilátku vázanou na RG1. Nenavázaná reportérová protilátka se poté vymyje. Pak se na destičku přidají látky pro zjištění peroxidázové aktivity, včetně substrátu pro barevnou reakci. Imobilizovaná peroxidáza vázaná na RG1 přes primární a sekundární protilátky vyvolá barevnou reakci. Síla barevné reakce v určitých časových intervalech označuje množství polypeptidu RG1 přítomného ve vzorku. Kvantitativní výsledky se obvykle vyhodnocují referenčním srovnáním se standardní křivkou.

Kompetitivní test lze provádět kdykoli, kdy je protilátka specifická pro RG1 ukotvena na pevném nosiči a kdy značený RG1 a vzorek odvozený z hostitele se nanese na pevný nosič, přičemž množství značící látky ukotvené na pevném nosiči lze poté korelovat s množstvím RG1 ve vzorku.

Tento test a další jsou popsány mimo jiné v publikacích Hampton et al. (Serological Methods, a

Laboratory Manual, APS Press, St Paul, Minn, 1990) a Maddox et al. (J. Exp. Med. 158: 12111, 1983).

Protilátky

Předkládaný vynález se dále týká protilátek, které specificky vážou RG1 a jsou zde označené jako protilátky proti RG1. Zvýšená exprese RG1 v prostatických tkáních a jeho výskyt na povrchu buňky jsou výbornými markerovými charakteristikami (značkami) pro plošné testování, diagnostiku, určení prognózy, testování při dlouhodobém sledování a pro zobrazovací způsoby. Navíc tyto charakteristiky naznačují, že by RG1 mohl být výborným cílem pro terapeutické způsoby jako je cílená léčba protilátkami, imunoterapie a genová terapie. Jak je zde užíván, znamená termín „specificky váže“ interakci protilátky s polypeptidem, kde tato interakce závisí na přítomnosti konkrétní struktury (tj. antigenní determinanty či epitopu) na polypeptidu; jinými slovy, protilátka rozpoznává a váže spíše specifickou polypeptidovou strukturu nežli proteiny obecně.

Polypeptidy RG1, jejich fragmenty či jiné deriváty, jejich analogy nebo buňky, které je expri35 mují, mohou být využity jako imunogeny k produkci protilátek proti nim (Harlow, Antibodies, Cold Spring Harbor Press, NY (1989)). Těmito protilátkami mohou být např. polyklonální či monoklonální protilátky. Předkládaný vynález také zahrnuje chimémí ajednořetězcové protilátky, humanizované a lidské protilátky, a dále fragmenty Fab či produkty expresních knihoven Fab. K přípravě těchto fragmentů a protilátek lze využít řadu způsobů známých odborníkům.

Protilátky připravené proti polypeptidům odpovídajícím sekvenci uvedené v předkládaném vynálezu lze získat přímou injekcí polypeptidů do živočišného jedince nebo podáním polypeptidů živočišnému jedinci, nejlépe jiného druhu než člověk. Takto získaná protilátka pak bude sama vázat tyto polypeptidy. Tak se i pomocí sekvence kódující pouze fragment těchto polypeptidů dají získat protilátky vázající celý nativní polypeptid. Tyto protilátky pak lze využít k izolaci polypeptidů z tkání exprimujících požadovaný polypeptid.

Při přípravě monoklonálních protilátek lze využít jakýkoli způsob, který zajistí tvorbu protilátek kulturami permanentních buněčných linií. Jako příklad lze uvést přípravu hybridomů (Kohler a

Milstein, Nátuře 256:495^497, 1975), přípravu humánních hybridomů B buněk (Kozbor et al., Immunology Today č: 72, 1983) a přípravu EBV-hybridomů k produkci humánních monoklonálních protilátek (Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer, Alan R. Liss, Inc., 77-96, 1985).

-22CZ 299232 B6

Lze také využít způsobů vyvinutých pro přípravu „chimémích protilátek“, založených na spojení myších genů pro protilátky s lidskými geny pro protilátky a získat tak molekulu s odpovídající antigenní specifickou a biologickou aktivitou (Morrison et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984; Neuberger et al., Nátuře 312:604-608, 1984; Takeda et al., Nátuře

314:452 454, 1985). Kromě toho lze využít i způsobů pro přípravu jednořetězcových protilátek (US 4 946 778) a přizpůsobit je k přípravě jednořetězcových protilátek specifických pro RG1.

Dále lze připravit „humánní“ („lidské“) protilátky způsoby popsanými v patentech US 5 877 397 a US 5 569 825, které jsou zde uvedeny v plném znění formou odkazu.

Protilátky lze také připravit indukováním produkce iv vivo v populaci lymfocytů nebo plošným testováním rekombinantních imunoglobulinových knihoven či souborů vysoce specifických vazebných látek jak je popsáno v publikaci Orlandi et al. (Proč. Nati. Acad. Sci. USA 86:3833— 3837, 1989) a Winter a Milstein (Nátuře 349:293-299, 1991).

Lze také připravit fragmenty protilátek obsahující specifická vazebná místa pro RG1. Tyto fragmenty zahrnují kromě jiného např. fragmenty F(ab')2, které lze připravit pepsinovým štěpením molekuly protilátky, a fragmenty Fab, které lze připravit redukcí disulfidických můstků fragmentů F(ab')2. Lze také připravit expresní knihovny Fab k rychlé a snadné identifikaci fragmentů monoklonálních Fab s požadovanou specifickou (Huse et al., Science 256:1270-1281, 1989).

Aminokyselinová sekvence RG1 uvedená v tomto vynálezu může sloužit k selekci specifických oblastí polypeptidu RG1 pro přípravu protilátek. Odborníkům je známo, že výběr oblasti nebo epitopů polypeptidu RG1, proti kterým je protilátka zaměřena, se může lišit podle zamýšleného využití. Např. protilátky určené k imunologickému testování RG1 vázaného na membránu prostatických buněk by měly být zaměřeny proti přístupným epitopům na polypeptidu RG1. Oblasti polypeptidu RG1 vykazující imunogenní strukturu a další oblasti a domény lze snadno identifikovat pomocí řady dalších způsobů známých odborníkům, jako např. analýza podle ChouFasmana, Gamier-Robsona či Jameson-Wolfa. Fragmenty obsahující tyto aminokyselinové zbytky jsou zvláště výhodné pro přípravu protilátek proti RG1. Mezi zvláště výhodné fragmenty patří kromě jiného sekvence PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEKVENCE ID. Č. 8); HSSDYSMWRKNQYVS (SEKVENCE ID. Č. 10); DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEKVENCE ID. Č. 11); a NEIVSASVPET (SEKVENCE ID. Č. 12). Příprava protilátek proti těmto oblastem je popsána v příkladu 4.

Protilátky proti RG1 popsané v předkládaném vynálezu mohou být zvláště výhodné pro diagnostické testování, zobrazovací způsoby a terapeutické způsoby při léčbě rakoviny prostaty. Tento vynález navrhuje řadu imunologických testů pro detekci polypeptidů RG1 a pro diagnostiku rakoviny prostaty. Tyto testy obvykle zahrnují jednu či více protilátek proti RG1 schopnou rozpoznávat a vázat polypeptid RG1. Nej výhodnějšími protilátkami jsou ty, které vážou RG1 a nevážou (nebo vážou jen slabě) jiné polypeptidy než RG1. Tyto testy zahrnují různé formy imunologických testů dobře známé odborníkům, včetně kromě jiného různých typů radioimunologických testů, testů ELISA apod. Kromě toho předkládaný vynález také uvádí imunologické zobrazovací způsoby k detekci rakoviny prostaty, včetně kromě jiného radioscintigrafických zobrazovacích způsobů pomocí značených protilátek proti RG1. Tyto testy mohou být využitelné klinicky pro detekci, sledování a určení prognózy rakoviny prostaty.

Výše popsané protilátky mohou sloužit k izolaci a identifikaci klonů exprimujících polypeptid uvedený v předkládaném vynálezu nebo k purifikaci tohoto polypeptidu ukotvením protilátky na pevný nosič pro izolaci a/nebo purifikaci afinitní chromatografií.

Protilátky proti RG1 mohou dále sloužit k izolaci buněk pozitivních na RG1 pomocí způsobů založených na třídění buněk a purifikaěními způsoby. Protilátky proti RG1 mohou být využity zvláště k izolaci prostatických nádorových buněk z nádorové tkáně xenograftů či z buněk tkáňo55 vých kultur apod. tříděním buněk protilátkami či způsoby afinitní purifikace. Dále lze protilátky

-23 CZ 299232 B6 proti RG1 uvedené v tomto vynálezu využít k přípravě anti-idiotypových protilátek napodobujících polypeptid RG1.

Protilátky proti RG1 mohou sloužit k detekci výskytu rakoviny prostaty či nádorových metastáz. 5 Přítomnost těchto buněk obsahujících RG1 v různých biologických vzorcích jako je sérum, vzorky biopsií prostaty a jiné tkáně lze stanovit pomocí protilátek proti RG1. Protilátky proti

RG1 lze také využít pro různé zobrazovací způsoby jako imunoscintigrafie pomocí ^99mTc (ěi jiného izotopu) konjugovaného s protilátkou. Např. zobrazovací protokol podobný protokolu nedávno popsanému v literatuře využívajícímu ”'l konjugovaný s protilátkou proti PSMA lze ío využít k detekci opakovaných a metastatických nádorů prostaty (Sodee et al., Clin. Nuc. Med.

21:759-766, 1997).

Protilátky proti RG1 uvedené v předkládaném vynálezu lze značit markérem schopným detekce či konjugovat s další molekulou, jako např. s cytotoxickou látkou, a využít k cílení této další molekuly proti buňce pozitivní na RG1 (Vitetta, E. S. et al., Immunotoxin Therapy, in DeVitta, Jr., V. T. et al., eds., Cancer: Principles and Practice of Oncology, 4^th ed., J. B. Lippincott Co., Philadelphia, 2624-2636, 1993). Příklady cytotoxických látek zahrnují kromě jiného ricin, doxorubicin, daunorubicin, taxol, ethidiumbromid, mitomycin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolchicin, dihydroxyanthracin-dion, aktinomycin D, difterický toxin, exotoxin Pseudomonas (PE) A, PE40, abrin, a dále glukokortikoidové a jiné chemoterapeutické látky, jakož i radioizotopy. Markéry vhodnými pro detekci jsou kromě jiného radioizotopy, fluorescenční sloučeniny, bioluminiscenční sloučeniny, chemiluminiscenční sloučeniny, kovové chelátory či enzymy. Mezi vhodné radioizotopy patří následující izotopy: ¹²⁴Sb, ¹²⁵Sb, ⁷⁴As, ¹⁰³Ba, ¹⁴⁰Ba, ⁷Be, ^j206Bi, ²⁰⁷Bi, ¹⁰⁹Cd, ^,15mCd. ⁴⁵‘ ¹⁵²Eu, ¹⁵³Gd, ¹⁹⁵Au, ^,99Au.

Ca, ¹³⁹Ce, ^l41Ce, ¹⁴⁴Ce, ^l37Cs, ⁵¹Cr, ⁵⁶Co, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁶⁰Co, ⁶⁴Co, ¹⁶⁹Er, ¹⁷⁵Hf ^{181,,f 123t 131t}

I, ^1J,I, ¹⁹²Ir, ⁵⁵Fe, ⁵⁹Fe, ⁸⁵Kr, ²¹⁰Pb, ⁵⁴Mn, ¹⁹⁷Hg, ²⁰³Hg, Mo, ¹⁴⁷Nd, ²³⁷Np, ⁶³Ni, ⁹⁵Nb, ^l85+1910s, ¹⁰³Pd, ^195mPt, ¹⁴³Pr, ¹⁴⁷Pm, ²³³Pa, ²²²⁶Ra, ¹⁸⁶Re, 'Hf, In,

Rb, 'Ru, ²Te, ^17OT1,

Ru, Sc, ^TOSc, Se, *T1, ²²⁸Th, ²³²Th, ”³Sn, ¹¹ Ag, Ag, ²²Na, ⁸⁵Sr, ⁸⁹Sr, ^wSr, S, ^,82Ta, ^99mTc, ^,25Te, ’Ti, ^IMW, ‘“V, ^WV, ^l09Yb, ⁸⁸Y, ⁹Ύ, ^9IY, “Zn, ⁹⁵Zr

Imunoterapie rakoviny prostaty

Předkládaný vynález uvádí různé imunoterapeutické způsoby léčby rakoviny prostaty, jako např. terapii protilátkami, vakcínami in vivo, či imunoterapickými způsoby ex vivo. V jednom způsobu uvádí tento vynález k léčbě rakoviny prostaty systémové využití protilátek proti RG1. Např. nekonjugované protilátky proti RG1 lze do pacienta vnášet tak, že protilátka se naváže na RG1 nacházející se na prostatické nádorové buňce nebo v ní, popř. připojený k ní, a zprostředkuje pak destrukci této buňky i celého nádoru mechanismy jako např. cytolýza zprostředkovaná komplementem, buněčnou cytotoxicitou způsobenou protilátkou či změnou fyziologické funkce RG1, a/nebo inhibici vazby k ligandu či drah přenosu signálu. Protilátky proti RG1 konjugované s toxickými látkami jako ricin či radioizotopy lze také využít terapeuticky k přímému vpravení toxické látky do prostatických nádorových buněk nesoucích RG1, čímž dojde k destrukci nádorových buněk.

K imunoterapii rakoviny prostaty pomocí protilátek proti RG1 lze využít řady převzatých způsobů, které byly využity v souvislosti s jinými typy rakoviny, kromě jiného např. s rakovinou tlustého střeva (Arlen et al., Crit. Rev. Immunol. 18:133-138, 1998), násobným myelomem (Ozaki et al., Blood 90:3179-3186, 1997; Tsunenari et al., Blood 90:2437-2444, 1997), rakovinou žaludku (Kasprzyk et al., Cancer Res. 52:2771-2776, 1992), B-buněčným lymfomem (Funakoshi et al., Immunother. Emphasis Tumor Immunol. 19:93-101, 1996), leukémií (Zhong et al., Leuk. Res. 20:581-589, 1996), kolorektálni rakovinou (Moun et al., Cancer Res. 54:616050 6166, 1994; Velders et al., Cancer Res. 55:4398—4403, 1995) a rakovinou prsu (Shepard et al., J.

Clin. Immunol. 11:117-127, 1991).

Předkládaný vynález dále poskytuje vakcíny navržené tak, aby obsahovaly polypeptid RG1 či jeho fragmenty. Využití nádorově specifického antigenů pro přípravu vakcín k vyvolání

-24CZ 299232 B6 humorální a buněčné imunity při léčbě rakoviny představuje velmi dobře známý způsob ve stavu techniky a byl využit pro léčbu rakoviny prostaty pomocí humánních imunogenů PSMA a imunogenů PAP hlodavců (Hodge et al., Int. J. Cancer 63:231-237, 1995; Fong et al., J. Immunol. 159:3113-3117, 1997). Tyto způsoby lze snadno provádět využitím polypeptidů

RG1 či jeho fragmentu, nebo molekuly nukleové kyseliny kódující RG1 a rekombinantních vektorů schopných exprimovat a správně prezentovat imunogen RG1.

Pro vnášení molekuly nukleové kyseliny kódující RG1 lze využít např. systémy založené na virových genech. Lze využít řadu takových systémů pro vnášení molekul virovými geny jako ío kromě jiného např. systémy vaccinia viru, viru drůbežích neštovic, kanářích neštovic, adenovirů, viru chřipky, viru obrny, viru asociovaného s adenovirem, lentivirů, či viru sindbus (Restifo, in

Curr. Opin. Immunol. 8:658-663, 1996). Lze také využít nevirových systémů využívajících vnesení holé molekuly DNA kódující polypeptid RG1 či jeho fragment do pacientova organismu (např. intramuskulámě) za účelem vyvolání protinádorové odpovědi. V jednom provedení tohoto vynálezu lze využít úplnou cDNA lidského rgl. V jiném provedení lze využít fragmenty cDNA rgl. V dalším provedení lze využít molekuly nukleové kyseliny rgl kódující specifické epitopy T lymfocytů (CTL). Epitopy CTL lze určit pomocí specifických algoritmů (např. Epimer, Brown University), aby byly identifikovány peptidy uvnitř polypeptidů RG1 schopné optimální vazby ke specifickým alelám HLA.

Lze také využít různé strategie ex vivo. Jeden způsob zahrnuje využití dendritických buněk, které prezentují polypeptid RG1 pacientovu imunitnímu systému jako antigen. Dendritické buňky exprimují molekuly MHC I a II, kostimulační molekulu B7 a IL—12, a jsou tedy vysoce specializované pro prezentaci antigenu. U rakoviny prostaty se využívají v klinických zkouškách 1.

stupně autologní dendritické buňky pulzované s peptidy membránového antigenu specifického pro prostatické buňky (PSMA) ke stimulaci imunitního systému pacientů s rakovinou prostaty (Tjoa et al., Prostatě 28:65-69, 1996; Murphy et al., Prostatě 29:371-380, 1996). Dendritické buňky mohou sloužit k prezentaci polypeptidů RG1 T buňkám v kontextu molekul MHC I a II. V jednom provedení tohoto vynálezu jsou dendritické buňky pulzovány s polypeptidy RG1 schopnými vázat molekuly MHC. V jiném provedení jsou dendritické buňky pulzovány s úplným polypeptidem RG1. Další provedení zahrnuje navození zvýšené exprese genu rgl v dendritických buňkách pomocí různých expresních vektorů známých ve stavu techniky, jako např. adenovirů (Arthur et al., Cancer Gene Ther. 4:, 17-25, 1997), retrovirů (Henderson et al., Cancer Res. 56: 3763-3770, 196), lentivirů, viru asociovaného s adenovirem, transfekce DNA (Ribas et al.,

Cancer Res. 57:2865-2869, 1997) a transfekce nádorově odvozené RNA (Ashley et al., J. Exp. Med. 186:1177-1182, 1997).

Anti-idiotypové protilátky proti RG1 lze také využít při protinádorové terapii jako vakcínu k vyvolání imunitní odpovědi proti buňkám exprimujícím polypeptid RG1. Zvláště příprava anti40 idiotypových protilátek je odborníkům dobře známa a tento způsob lze snadno přizpůsobit k přípravě anti-idiotypových protilátek anti-RGl, které napodobují epitop na polypeptidů RG1 (viz např. Wagner et al., Hybridoma 16:33 40, 1997; Foon et al., J. Clin. Invest. 96:334-342, 1995; Herlyn et al., Cancer Immunol. Immunother. 43:65-76, 1996). Takovou anti-idiotypickou protilátku pak lze využít při anti-idiotypové léčbě, podobně jako jiné protilátky zaměřené proti nádorovým antigenům.

K vyvolání proíýlaktické a terapeutické humorální a buněčné imunitní odpovědi proti nádorovým buňkách exprimujícím RG1 lze využít způsobů genové imunizace. S využitím výše popsaných molekul DNA kódujících RG1 lze konstrukty obsahující DNA kódující polypeptid/imunogen

RG1 s odpovídajícími regulačními sekvencemi přímo injikovat do svalu či kůže jedince, takže svalové či kožní buňky konstrukt přijmou a exprimují kódovaný polypeptid/imunogen RG1. Polypeptid/imunogen RG1 může být exprimován jako povrchový polypeptid nebo může být sekretován. Exprese polypeptidu/imunogenu RG1 vede k vyvolání proíýlaktické či léčebné humorální a buněčné imunity proti rakovině prostaty. Lze využít řady profylaktických a

-25CZ 299232 B6 léčebných způsobů genové imunizace známých ve stavu techniky (viz přehled informací a prací publikovaných na internetové adrese www.genweb.com).

„Antisense“ oligonukleotidy, „antisense“ vektory a ribozomy „Antisense“ polynukleotidy komplementární k rgl lze připravit synteticky.Tyto oligonukleotidy lze vpravit do buněk samotné nebo s lipidy, které napomáhají přijetí „antisense“ oligonukleotidů buňkami.

Také expresní vektory, vektory odvozené od retrovirů, adenovirů, herpesvirů, virů vaccinia či různých bakteriálních plazmidů mohou sloužit k přípravě a přenosu rekombinantních vektorů exprimujících „antisense“ rgl. Viz např. způsoby popsané v publikacích Sambrook et al. (viz výše) nebo Ausubel et al. (viz výše).

Polynukleotidy obsahující úplnou sekvenci cDNA a/nebo její regulační elementy umožňují pracovníkům ve výzkumu, aby využívali polynukleotidy rgl jako nástroj k prohledávání „sense“ vláken (Youssoufian and Lodish, Mol. Cell. Biol. 13:98-104, 1993) či „antisense“ vláken (Eguchi et al., Annu Rev. Biochem. 60:631-652, 1991) ke zjištění regulace funkcí tohoto genu. Tyto způsoby jsou již ve stavu techniky dobře známy a oligomery „sense“ a „antisense“ nebo větší fragmenty lze odvodit z různých oblastí kódujících i nekódujících oblastí.

Geny kódující RG1 mohou být vypnuty transfekční buněk nebo tkáně expresními vektory exprimující vysokou hladinu požadovaného fragmentu polynukleotidu rgl. Tyto konstrukty mohou zaplavit buňku netranslatovatelnými „sense“ či „antisense“ sekvencemi. I když nedojde k integraci do DNA, tyto vektory mohou dále transkribovat molekuly RNA, dokud nejsou všechny kopie vyřazeny endogenními nukleázami. U nereplikativních vektorů může přechodná exprese trvat měsíc nebo více a pokud jsou součástí vektorového systému odpovídající replikační elementy, může trvat i déle.

Jak bylo uvedeno výše, změny genové exprese lze dosáhnout pomocí „antisense“ molekul DNA ěi RNA, které kontrolují oblasti v rgl, např. promotory, enhancery a introny. Výhodné jsou oligonukleotidy odvozené z místa iniciace transkripce, tj. z oblasti mezi -10 a +10 „leader“ sekvence. Lze také připravit „antisense“ molekuly k blokování translace mRNA zabráněním vazby transkriptu k ribozomům. Inhibici lze také provést pomocí způsobu využívajícího párování bází do „trojité šroubovice“. Tvorbou trojité šroubovice dochází k zamezení schopností molekuly dostatečně se otevřít pro vazbu s polymerázami, transkripčními faktory či regulačními molekulami, kterou by jinak jako dvojitá šroubovice měla. Nejnovější léčebné způsoby využívající tvorbu trojitých šroubovic jsou shrnuty v publikaci Gee J. E. et al. (In Huber a Car, Molecular and Immunologic Approaches, Futura Publishing Co., Mt. Kisco, N. Y„ 1994).

Ribozymy jsou enzymatické molekuly RNA, které jsou schopné katalyzovat specifické štěpení RNA (patent US 4 987 071; WO 93/23057). Mechanismus působení ribozymu spočívá v sek40 venčně specifické hybridizaci molekuly ribozymu s komplementárními cílovou RNA a následném endonukleolytickém štěpení. V předkládaném vynálezu jsou připraveny tzv. „hammerhead“ motivy, které mohou specificky a účinně katalyzovat endonukleolytické štěpení RNA kódující RG1. Specifická štěpná místa pro ribozymy lze na každé potenciální cílové RNA předběžně identifikovat vyhledáním štěpných míst pro ribozymy obsahujících sekvence GUA, GUU a GUC na cílové molekule. Jakmile jsou tato místa identifikována, lze určit ty charakteristiky sekundární struktury krátkých sekvencí RNA o 15-20 ribonukleotidech, odpovídajících oblastem cílového genu obsahujícím štěpné místo, na základě kterých by bylo možno daný oligonukleotid vyřadit z funkce. Vhodnost potenciálních cílů lze také zhodnotit testováním přístupnosti pro hybridizace s komplementárními oligonukleotidy pomocí protekčních ribonukleázových testů (Irie et al.,

Advances Pharmacol. 40:207-257, 1997).

„Antisense“ molekuly a ribozymy uvedené v tomto vynálezu lze připravit jakýmkoli způsobem pro syntézu molekul RNA známým ve stavu techniky. Jsou to např. způsoby chemické syntézy

-26CZ 299232 B6 oligonukleotidů, jako syntéza s užitím fosforamiditu v pevné fázi. Molekuly RNA lze také připravit transkripci in vitro a in vivo nebo pomocí sekvencí DNA kódující RG1. Tyto sekvence DNA mohou být vneseny do celé řady vektorů s odpovídajícími promotory RNA polymerázy jako T7 či SP6. Lze také vnést konstrukty „antisense“ cDNA, které syntetizují „antisense“ RNA, do buněčných linií, do buněk či do tkání.

Molekuly RNA mohou být modifikovány za účelem zvýšení jejich stability uvnitř buňky či jejich poločasu. Možnými změnami jsou kromě jiného např. připojení přilehlých sekvencí na 5'-konec a/nebo 3'-konec molekul nebo využití fosforiothionátových či 2' O-methylových vazeb místo ío fosfodiesterových při tvorbě základní kostry molekuly. Stabilitu molekul lze také zvýšit vložením neobvyklých bází jako inosin nebo queosin, popř. pozměněných bází jako acetyl-, methyl-, thioa jiných forem adeninu, guaninu, thyminu a uridinu, jež nejsou tak snadno rozpoznány endogenními endonukleázami.

Mezi způsoby vnesení „antisense“ vektorů do buněk či tkání patří způsoby popsané výše, které jsou vhodné jak pro léčbu in vivo, tak i in vitro a ex vivo. Pro léčbu ex vivo jsou vektory vnášeny do buněk odebraných z pacientova organismu a klonálně pomnožených pro autologní transplantaci do téhož pacienta, jak je uvedeno v patentech US 5 399 493 a US 5 437 994, které jsou uvedeny v literatuře. Přenos transfekcí nebo lipozomy či jinými lipidickými a nelipidickými činidly je odborníkům též dobře znám.

Testy k identifikaci látek vázajících RG1

Předkládaný vynález se také týká testů a způsobů, které mohou sloužit k identifikaci látek (agens, činidel) vázajících RG1. Tyto látky vázající RG1 mohou být identifikovány zejména na základě schopnosti ligandu RG1 či jiné látky a složky vázat RG1 a/nebo schopnosti inhibovat/stimulovat aktivitu RG1.

Látky vázající polypeptid RG1 mohou být také identifikovány pomocí kvasinkového dvojhybridního systému a testu vazebné schopnosti. U kvasinkového dvojhybridního systému se expresní jednotka kódující fúzní protein skládající se z transkripčního faktoru o jedné podjednotce, transkripčního faktoru o dvou podjednotkách a polypeptidu RG1 vnese do kvasničné buňky a je v ní exprimována. Tato buňka je dále pozměněna tak, aby obsahovala (1) expresní jednotku kódující detekovatelný markér, kjehož expresi je třeba transkripční faktor o dvou podjednotkách a (2) expresní jednotku kódující fúzní protein skládající se z druhé podjednotky transkripčního faktoru a klonovaného segmentu DNA. Pokud klonovaný segment DNA kóduje protein vázající polypeptid RG1, výsledkem exprese je interakce RG1 a kódovaného proteinu. Tím se obě podjednotky a transkripční faktor dostanou do vazebné blízkosti a transkripční faktor se může obnovit. Tak je exprimován detekovatelný markér. Kvasinkový dvojhybridní systém je zvlášť výhodný při plošném testování knihovny cDNA kódující segmenty buněčných vazebných partnerů RG1.

Mezi polypeptidy RG1, které lze využít ve výše popsaných testech, patří kromě jiného např. izolovaný polypeptid RG1, fragment polypeptidu RG1, či buňka, která byla pozměněna tak, aby exprimovala polypeptid RG1. Polypeptidem RG1 může být dále celý tento polypeptid či jeho definovaný fragment. Běžnému odborníkovi bude zřejmé, že pokud je polypeptid RG1 testova45 telný na vazbu k nějaké látce, např. pomocí posunu molekulové váhy či aktivity, lze tento způsob testování využít.

Způsob, kterým bude určeno, zda látka/buněčná složka váže polypeptid RG1, bude primárně záviset na charakteru použitého polypeptidu RG1. K určení, zda látka váže RG1 nebo jeho fragment, může sloužit např. gelový retardační test. Pro testování polypeptidu RG1 lze také využít imunodetekci nebo způsoby založené na biočipech. Ke zjištění, zda určitá látka váže RG1, může zkušený odborník využít řady způsobů známých ve stavu techniky.

-27CZ 299232 B6

Látky a buněčné složky lze dále testovat, zda jsou schopné ovlivňovat aktivitu polypeptidu RG1, pomocí bezbuněčného testovacího systému či buněčného testovacího systému. Způsobně definované aktivity polypeptidu RG1 mohou být dále testovány funkčními testy.

V kontextu předkládaného vynálezu platí, že látka antagonizuje aktivitu RG1, pokud jeho aktivitu snižuje. Výhodný antagonista selektivně antagonizuje RG1 a neovlivňuje další buněčné proteiny. Výhodný antagonista dále snižuje aktivitu RG1 o více než 50 %, výhodněji o více než 90 % a nej výhodněji ruší veškerou aktivitu RG1.

ío Látky testované výše zmíněným způsobem mohou být vybrány náhodně nebo racionálně.

V kontextu předkládaného vynálezu platí, že látka je vybrána náhodně, pokud se nepřihlíží k specifickým sekvencím polypeptidu RG1. Příkladem náhodně vybraných látek je využití chemické knihovny nebo kombinatomí knihovny peptidů, živné půdy pro určitý organismus či rostlinného extraktu.

V kontextu předkládaného vynálezu platí, že látka je vybrána racionálně, pokud je vybrána nenáhodně v závislosti na sekvenci cílového místa a/nebo jeho konformace a v souvislosti s působením dané látky. Látky mohou být vybírány či navrhovány racionálně na základě peptidových sekvencí polypeptidu RG1. Racionálně vybranou peptidovou látkou může být např.

peptid, jehož aminokyselinová sekvence je shodná s fragmentem polypeptidu RG1.

Látkami testovanými užitím způsobů podle předkládaného vynálezu mohou být např. peptidy, protilátky, oligonukleotidy, malé molekuly a deriváty vitaminů, a také uhlovodíky. Zkušenému odborníku je jasné, že výběr látek pro uvedený testovací způsob není nijak omezen jejich struktu25 rální povahou. Jedním typem látek pro tento vynález jsou peptidové látky, jejichž aminokyselinová sekvence je vybrána na základě aminokyselinové sekvence polypeptidu RG1.

Peptidové látky lze připravit pomocí standardních syntetických způsobů využívajících látek v pevné (nebo kapalné) fázi, které jsou ve stavu techniky známé. Navíc lze syntetizovat DNA kódující tyto peptidy pomocí komerčně dostupných přístrojů pro syntézu oligonukleotidů a připravit je rekombinantně pomocí standardních rekombinantních produkčních systémů. Přípravu pomocí syntézy v pevné fázi je nutno využít tam, kde se vyskytují aminokyseliny nekódované žádným genem.

Jinými látkami uvedenými v předkládaném vynálezu jsou protilátky imunoreaktivní s kritickými místy polypeptidu RG1. Jak bylo popsáno výše, protilátky se získávají imunizací vhodných savčích organismů peptidy obsahujícími jako antigenní oblast ty části polypeptidu RG1, proti kterým mají být protilátky zaměřeny. Tyto látky lze využít při studiích vazebných kompetic k identifikaci inhibičních látek druhé generace a k blokování aktivity RG1.

Buněčné extrakty testované způsoby uvedenými v předkládaném vynálezu mohou být např. vodné extrakty buněk či tkání, organické extrakty buněk či tkání, nebo částečně purifikované frakce buněk. Zkušenému odborníku je jasné, že výběr zdroje buněčného extraktu pro uvedený testovací způsob není nijak omezen jeho strukturální povahou.

Látky vázající polypeptid RG1, jako např. protilátku proti RG1, lze využít k ovlivňování aktivity RG1, k cílení protirakovinných látek do odpovídajících savčích buněk či k identifikaci látek blokujících interakci s RG1. Buňky exprimující RG1 lze zaměřit či identifikovat pomocí látky, která váže RG1.

To, jak bude látka vázající RG1 využita, závisí na její povaze. Látka vázající RG1 může být např. využita k: vnesení konjugovaných toxinů jako difterický toxin, toxin cholery, ricin nebo exotoxin pseudomonas do buňky exprimující RG1; modulaci aktivity RG1; přímému zabití buňky exprimující RG1; nebo při plošných testech k identifikaci látek s kompetitivní vazbou. Tak např. látka

-28CZ 299232 B6 inhibující RG1 může být využita k přímé inhibici buněk exprimujících RG1 a látku vázající RG1 lze využít jako diagnostické činidlo.

Farmaceutické přípravky a způsoby podávání

Předkládaný vynález se také týká farmaceutických přípravků, které obsahují polynukleotidy rgl, polypeptidy RG1, protilátky proti nim, jejich agonisty, antagonisty či inhibitory, a to samotné či v kombinaci s alespoň jednou látkou, jako např. stabilizační látkou, a které mohou být podány v jakémkoli sterilním, biokompatibiliním farmaceutickém nosiči, jako kromě jiného např. ve fyziologickém roztoku, v pufrovaném fyziologickém roztoku, dextróze či vodě. Kteroukoli z těchto molekul lze pacientovi podat samotnou či v kombinaci s jinými látkami, léčivy či hormony, ve farmaceutických přípravcích, kde jsou smíchány s vehikulem (vehikuly) nebo s farmaceuticky přijatelnými nosiči. V jednom provedení tohoto vynálezu je farmaceuticky přijatelný nosič farmaceuticky inertní.

Předkládaný vynález se také týká způsobu podání farmaceutických přípravků. Toto podání lze provádět perorálně nebo parenterálně. Mezi způsoby parenterálního podání patří podání lokální, intraarteriální (přímo do nádoru), intramuskulámí, subkutánní, intramedulámí, intrathekální, intraventrikulámí, intravenózní, intraperitoneální či intranazální. Kromě aktivních složek mohou tyto farmaceutické přípravky obsahovat vhodné farmaceuticky přijatelné nosiče jako vehikula či aditiva umožňující zpracování aktivních složek na preparáty, které lze využít farmaceuticky. Další podrobnosti o způsobech přípravy a podání těchto látek lze najít v posledním vydání Remington's Pharmaceutical Sciences (Ed. Mack Publishing Co, Easton, Pa).

Farmaceutické přípravky pro perorální podávání lze připravit pomocí farmaceuticky přijatelných nosičů dobře známých ve stavu techniky v dávkováních vhodných pro orální podání. Tyto nosiče umožňují přípravu farmaceutických přípravků v tabletách, pilulkách, jako dražé, tobolky, roztoky, gely, sirupy, husté suspenze, normální suspenze apod. určené k podání pacientům.

Farmaceutické přípravky k perorálnímu podávání lze získat kombinací aktivních složek s pev30 ným vehikulem, podle potřeby s rozemletím vzniklé směsi, a po případném přidání vhodných aditiv zpracováním této směsi granulí na tablety či dražé. Vhodnými vehikuly jsou sacharidová nebo proteinová plnidla jako cukry, např. laktóza, sacharóza, mannitol či sorbitol; kukuřičný, pšeničný, rýžový či bramborový škrob nebo škrob z jiných rostlin; celulóza ve formě methylcelulózy, hydroxypropylmethylcelulózy či karboxymethylcelulózy sodné; gumy jako arabská guma či tragakantová guma; a dále proteiny jako želatina a kolagen. Podle potřeby lze přidat dekompoziční či solubilizační činidla jako např. zesítěný polyvinylpyrrolidon, agar, alginovou kyselinu či její sůl, jako např. alginát sodný.

Jádra dražé se obalují do vhodných potahů jako jsou např. koncentrované cukerné roztoky, které mohou též obsahovat arabskou gumu, talek, polyvinylpyrrolidon, karbopolový gel, polyetylenglykol a/nebo dioxid titanu, roztoky laků a vhodná organická rozpouštědla či jejich směsi. Do potahů tablet či dražé lze přidat barviva či pigmenty k identifikaci výrobku či označení množství aktivní látky, tj. dávkování.

Mezi farmaceutické přípravky, které mohou být užívány perorálně, patří např. želatinové tobolky uzavřené „zastrčením“ („push-fit“), nebo zatavené želatinové tobolky s povrchovým filmem z glycerolu nebo sorbitolu. Tobolky mohou obsahovat aktivní složky smíchané s plnidlem či pojivém jako např. laktóza či škroby, lubrikanty jako talek či stearát hořčíku, popřípadě i stabilizátory. V měkkých tobolkách mohou být aktivní složky rozpuštěny ve vhodných roztocích, jako např. mastné oleje, kapalný parafín, či kapalný polyetylenglykol se stabilizátory nebo bez nich, nebo s nimi mohou tvořit suspenzi.

Mezi farmaceutické přípravky, které mohou být užívány parenterálně, patří např. vodné roztoky aktivních složek. Farmaceutické přípravky uvedené v tomto vynálezu určené k injekci mohou být

-29CZ 299232 B6 připraveny ve vodných roztocích, výhodně ve fyziologicky kompatibilních pufrech jako Hankův roztok, Ringerův roztok či pufrovaný fyziologický roztok. Vodné injekční suspenze mohou obsahovat látky, které zvyšují viskozitu suspenze, např. karboxymethylcelulózu sodnou, sorbitol či dextran. Suspenze aktivních složek mohou být také připraveny jako vhodné olejové suspenze.

Vhodnými lipofilními rozpouštědly či vehikuly jsou např. mastné oleje jako sezamový olej, nebo syntetické estery mastných olejů jako etyoleát, nebo dále triglyceridy či lipozomy. Suspenze mohou také případně obsahovat vhodné stabilizátory nebo látky zvyšující rozpustnost sloučenin, takže je možno připravit vysoce koncentrované roztoky.

Pro lokální či nazální podání se do přípravků přidávají penetranty pro odpovídající bariéru, kterou mají proniknout. Tyto penetranty jsou ve stavu techniky běžně známé.

Soupravy (Kity)

Předkládaný vynález se dále týká farmaceutických balení a souprav (kitů) zahrnujících jednu či více nádobek naplněných jednou či více složkami výše popsaných přípravků uvedených v tomto vynálezu. K této nádobce (nádobkám) může být přiložen leták ve formě předepsané příslušným vládním úřadem, v jehož kompetenci je výroba, užití či prodej farmaceutických či biologických výrobků, kde je vyjádřen souhlas tohoto úřadu s výrobou, užitím či prodejem daného výrobku pro lidské účely.

Výroba a skladování

Farmaceutické přípravky uvedené v předkládaném vynálezu lze připravit způsoby známými ve stavu techniky, tj. konvenčním mícháním, rozpouštěním, granulováním, přípravou dražé, drcením, tvorbou emulzí, uzavíráním do kapslí nebo jiných produktů, či lyofilizací.

Tyto farmaceutické přípravky mohou být získány ve formě solí mnoha kyselin jako kromě jiného např. kyseliny chlorovodíkové, sírové, octové, mléčné, šťavelové, jablečné, jantarové apod. Soli jsou často rozpustnější ve vodných či jiných protonických rozpouštědlech, jež jsou jejich odpovídající volnou bazickou formou. Jindy může být výhodným preparátem lyofilizovaný prášek v

1 mM - 50 mM histidinu, 0,1% - 2% sacharóze, 2% - 7% mannitolu v rozmezí pH 4,5 až 5,5, který se před použitím smíchá s pufrem.

Jakmile je farmaceutický přípravek obsahující látku uvedenou v předkládaném vynálezu připravenou ve vhodném nosiči hotov, může být uložen do vhodné nádobky a označen pro účely léčby za vyznačených podmínek. Pro podání RG1 toto označení zahrnuje množství, četnost a způsob podání.

Terapeuticky účinná dávka

Mezi farmaceutické přípravky vhodné pro užití v předkládaném vynálezu patří přípravky, kde aktivní složky jsou obsažené v účinném množství k docílení zamýšleného účelu, tj. léčbě určitého chorobného stavu charakterizovaného expresí RG1. Určení účinné dávky je zcela v kompetenci odborníků.

U každé látky může být terapeuticky účinná látka zpočátku stanovena testováním v buněčné kultuře, např. v neoplastických buňkách, nebo na zvířecím modelu, obvykle na myších, králících, psech či prasatech. Zvířecích modelů se také využívá k určení požadovaného koncentračního rozpětí a cesty podání. Na základě této informace pak lze stanovit užitečné dávky a cesty podání lidským jedincům.

Terapeuticky účinnou dávkou je míněna taková dávka proteinu nebo protilátek proti němu, jeho antagonistů či inhibitorů, která zlepší symptomy nebo stav pacienta. Terapeutická účinnost či toxicita těchto látek může být určena standardními farmaceutickými způsoby v buněčné kultuře nebo ve zvířecím modelu, např. jako ED₅₀ (terapeuticky účinná dávka v 50 % populace) a LD₅₀

-30CZ 299232 B6 (dávka letální pro 50 % populace). Poměr dávek s terapeutickým a toxickým účinkem se nazývá terapeutický index a dá se vyjádřit jako poměr ED₅o/LD₅o. Výhodné jsou farmaceutické přípravky vykazující vysoké terapeutické indexy. Údaje získané testováním buněčných kultur a zvířecích modelů lze využít k určení rozpětí pro dávkování lidským jedincům. Dávkování těchto látek se výhodně pohybuje v rozmezí oběhových koncentrací, při kterých má ED₅₀ nízkou nebo žádnou toxicitou. Dávkování se pohybuje v tomto rozmezí v závislosti na formě podání, citlivosti pacienta a cestě podání.

Přesné dávkování určí lékař podle toho, kterému pacientovi má být lék podán. Dávkování a způio sob podání se upraví tak, aby byla dosažena dostatečně vysoká hladina aktivní složky k docílení požadovaného účinku. Dalšími faktory, které mohou být vzaty v úvahu, jsou např. závažnost chorobného stavu, jako např. velikost nádoru a jeho umístění; věk, váha a pohlaví pacienta; dieta, doba a četnost podání, kombinace léčiv, citlivost reakce, a dále tolerance/odpověď na léčbu.

Farmaceutické přípravky s dlouhodobou účinností mohou být podávány každý 3.-4. den, každý týden, každých 14 dní, a to podle poločasu a rychlosti vymizení daného přípravku z organismu.

Velikost normální dávky se může pohybovat od 0,1 do 100 000 mikrogramů, až do celkové dávky 1 g, v závislosti na cestě podání. Vodítko ke zvolení určitého dávkování a způsoby podání jsou popsány v literatuře. Viz patenty US 4 657 760; US 5 206 344; nebo US 5 225 212. Odbor20 níci využij i j iných typů přípravků pro polynukleotidy a j iných pro proteiny nebo j ej ich inhibitory. Podobně bude podání polynukleotidů či polypeptidů specificky odpovídat určitým buňkám, podmínkám, umístění apod.

Popis obrázků

Obr. 1: Polynukleotidová sekvence rgl (SEKVENCE ID. Č. 1), kódující biologicky nebo imunologicky aktivní formu RG1.

Obr. 2: Odvozená aminokyselinová sekvence RG1 (SEKVENCE ID. Č. 2), kde domény

F-spondinu j sou podtrženy j ednoduše a doména trombospondinu dvoj itě.

Obr. 3: Lineární srovnání sekvence RG1 se sekvencí krysího Mindinu. Sekvence RG1 se nachází nahoře.

Obr. 4: Polynukleotidová a dedukovaná aminokyselinová sekvence RG1.

Obr. 5: Exprese rgl v humánních tkáních zjištěná PCR analýzou pomocí Taqman. RNA z hu35 mánních tkání, jak nádorových tak normálních, byla izolována standardními způsoby. Primery a sondy k detekci exprese rgl mRNA byly navrženy pomocí software Perkin Elmeťs Primer Express a syntetizovány pomocí Synthetic Genetics. Rgl mRNA byla stanovena v lidské prostatické tkáni. Mnohem nižší expresi rgl mRNA bylo možno zachytit v dalších tkáních, např. v játrech.

Obr. 6: Purifikace nativního proteinu RGt sekretovaného buňkami LNCaP. Analýza způsobem Western blot pomocí antiséra připraveného proti syntetické peptidové sekvenci RG1 (3C, SEKVENCE ID. Č. 10, viz příklad 4) k detekci nativního proteinu RG1 sekretovaného buňkami LNCaP. Frakce eluované chromatografií na Q-Sepharose z koncentrovaného média upraveného pro buňky LNCaP: (L) náplň kolony, (F) průtok kolony, (1-12) frakce eluované přes solný gradient. Předpokládaná molekulová váha RG1 je přibližně 36 kD, avšak bylo zjištěno, že proteiny RG1 exprimované bakteriemi, buňkami BHK a LNCaP všechny putují na gelu PAGE v pozici přibližně 45 kD (L, frakce 6-9).

Obr. 7: Imunohistochemické barvení exprese RG1 v lidské prostatické tkáni. Vzorky prostatické tkáně byly získány na Urologickém oddělení lékařské fakulty Stanfordovy univerzity. Barvení bylo provedeno pomocí soupravy Vector ABC-AP (AK5002). Barvení bylo zviditelněno pomocí soupravy Vector Red substráte a následného barvení hematoxylinem. Výsledky ukazují silné zbarvení perilumenální membrány ve formacích žlázy.

-31 CZ 299232 B6

Příklady provedení vynálezu

Předkládaný vynález je dále popsán následujícími příklady. Tyto příklady jsou uvedeny pouze pro ilustraci tohoto vynálezu jako příklady specifických provedení. Tyto příklady sice ilustrují určité specifické aspekty předkládaného vynálezu, ale vynález nijak neomezují a nevymezují rozsah tohoto vynálezu.

Všechny příklady byly provedeny standardními způsoby, které jsou odborníkům dobře známy a jsou jimi rutinně využívány, s výjimkou jinak podrobně popsaných případů. Rutinní způsoby molekulární biologie použité v uvedených příkladech lze provádět podle standardních laboratorních příruček, jako např. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2^nd Ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y„ 1989.

Příklad 1

Identifikace polynukleotidu lidského rgl

Rgl byl identifikován jako gen exprimovaný v prostatě prohledáváním databáze Incyte LifeSeq. Tato nukleotidová sekvence byla identifikována prohledáváním anotací v databázi pomocí nástroje „Funkce proteinu“ poskytnutého společností Incyte. Tato nukleotidová sekvence byla nalezena v anotované databázi v kategorii buněčných adhezivních molekul a byla popsána jako homolog f-spondinu. Elektronická Northern analýza distribuce polynukleotidových sekvencí rgl v souboru knihoven v databázi prokázala, že vysoké hladiny exprese rgl byly zjištěny v knihovnách prostatických tkání a nižší hladiny v knihovnách mnoha jiných tkání, včetně normálních a nádorových.

Po sestavení souboru klonů rgl ϊ databáze do soustavy kontigů polynukleotidových sekvencí a po jejich úpravě na souvislou sekvenci byla identifikována úplná kódující sekvence uměle odvozeného sestaveného polynukleotidu. Tato sekvence kóduje protein homologní se spondinem-f a

Mindinem-2.

Klony databáze Incyte 1640796, 1712252 a 1880265 byly získány z Incyte pro experimentální účely a klon 3360733 byl identifikován jako obsahující největší část nukleotidové sekvence 5'-konce. Byla získána úplná sekvence tohoto klonu, která obsahuje úplnou kódující sekvenci pro uměle odvozený protein RG1. Tato sekvence je uvedena na obr. 1 (SEKVENCE ID. C. 1).

Příklad 2

Exprese rgl mRNA

Exprese rgl mRNA v různých vzorcích normální a nádorové tkáně a v buněčných liniích byla určena semikvantitativní PCR pomocí testu Taqman (Perkin-Elmer). Vzorky normálních, benigních a maligních prostatických tkání, jejichž stadium (grading) bylo určeno podle Gleasonova systému, byly získány z Urologického oddělení lékařské fakulty Stanfordovy univerzity. Standardními způsoby z nich byla izolována RNA. RNA jiných nádorových a normálních tkání byla získána z komerčních zdrojů, včetně firem Biotech a Biochain. Prostatické nádorové buněčné linie (PC-3, LNCaP, DU145) byly získány z American Type Culture Collection a kultivovány standardními způsoby v médiu obsahujícím sérum. V nahých myších byl pomocí těchto buněčných linií vyvolán vznik nádorových xenograftů, které byly odebrány z těchto myší přibližně 4-6 týdnů po implantaci. Z nádorů byla standardními způsoby izolována RNA.

Analýza PCR pomocí Taqman byla provedena s využitím primerů: CGC GCA TAG CTC CGA CTA C (SEKVENCE ID. Č. 3) a GCC GCG TCC GCA AAG (SEKVENCE ID. Č. 4) a sondy

-32CZ 299232 B6

Taqman 6-FAM-AGG AAG AAC CAG TAC GTC AGT AAC GGG CTG-Tamra (SEKVENCE ID. Č. 5).

Tyto primery a sonda byly navrženy pomocí software Perkin Elmer Primer Express a syntetizo5 vány pomocí Synthetic Genetics. Reakce PCR byly provedeny ve 30 40 cyklech a kvantifikovány pomocí prostatické RNA k vytvoření standardní křivky pro relativní srovnávání. Touto analýzou bylo prokázáno, že nejvyšší množství rgl mRNA bylo nalezeno v prostatě a významně nižší hladiny v jiných tkáních (viz obr. 5).

ío Příklad 3

Klonování a exprese RG1 v buňkách BHK

Kódující oblast pro RG1 byla získána zplazmidu Incyte 3360733. Tato kódující sekvence byla amplifikována PCR pomocí primerů

SSTÍ15 (5'-TCCCTCTAGAGCCACCATGGAAAACCCCAGCCCGGC-3')(SEKVENCE

ID. Č. 6) a

SST113 (5'-AAGGCATCACGTGTTAGACGCAGTTATCAGGGACG-3') (SEKVENCE _1S id. e. 7) ve standardní reakci PCR (100 μΐ) s pufrem lx Pfu Turbo polymerase (Stratagene, La Jolla, CA)/200 μΜ každý dNTP/0,2 μΜ oligonukleotidové primery/2,5 U Pfu Turbo polymerase (Stratagene). Podmínky pro amplifíkaci PCR byly následující: 3 min při 95 °C (15 s při 95 °C, 30 s při 60 °C, 2 min při 72 °C) x35, 72 °C po 7 min. Výsledný amplifikovaný produkt byl přečištěn na koloně QIAquick PCR (Qiagen, Valencia, CA) a štěpen restrikčními enzymy Xbal a PmlI na fragment o 1010 bp, který byl vyčištěn na 1% agarózovém gelu pomocí soupravy BIO 101 GeneClean Kit (Vista, CA). Vyčištěný fragment byl ligován (pomocí Epicientre Fast Link Kit (Epicenter, Madison, WI)) do necytopatického expresního vektoru Sindbis pSINrep21 (Agapov et al., 1998, PNAS 95: 12989-12994) štěpeného Xbal a PmlI, použit pro transformaci kompentních buněk DH5 alfa (Life Technologies, Gaithersburg, CA) a selektován na plotnách s LB agarem obsahujícím ampicilin (100 pg/ml). Jedna z těchto kolonií rezistentních na ampicilin byla pomnožena v médiu LB obsahujícím ampicilin a sekvenční analýzou v ní byla prokázána přítomnost kódující sekvence pro RG1. Tento plazmid byl nazván pPEG6.

Dva mikrogramy pPEG6 byly použity k transfekci 1-3 x 10⁵ buněk BHK (bovine hamster kidney cells) pomocí látky Lipofectamine Plus (Life Technologies, Gaithersburg, MD) podle návodu výrobce. Po transfekci byly buňky inkubovány v médiu DMEM obsahujícím fetální sérum po dobu 24-48 hod, poté byly 1 Okřát zředěny a selekce buněk obsahujících plazmid byla iniciována přidáním puromycinu (konečná koncentrace 2,5 pg/ml) a média DMEM obsahujícího sérum.

Když byly buňky konfluentní (4-5 dní po přidání puromycinu), byly promyty PBS, 1 Okřát zředěny a bylo přidáno médium DMEM obsahující sérum a 5 pg/ml puromycinu. Po dalších 2-3 dnech bylo médium vyměněno za DMEM bez séra obsahující 5 pg/ml puromycinu, buňky dále rostly 2-3 dny a poté byla přítomnost proteinu RG1 v médiu stanovena Western analýzou pomocí protilátek proti RG1. Stanovené množství proteinu RG1 bylo 1 pg/ml.

Příklad 4

Příprava protilátek

Byla připravena králičí polyklonální antiséra proti pěti syntetickým polypeptidovým sekvencím odvozeným ze sekvence proteinu RG1. Tyto sekvence byly vybrány podle jejich předem odhadnuté polohy na povrchu proteinu, aby vytvořily antiséra, která by snáze rozpoznala povrchové epitopy. K usnadnění syntézy byly cysteinové zbytky nahrazeny aminobutanovou kyselinou

-33CZ 299232 B6 (Abu). Specifické aminokyselinové sekvence, jejich poloha v proteinu RG1 a označení všech pěti peptidů jsou uvedeny níže.

Označení	Poloha	Aminokyselinová sekvence
C	28-46	PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEKV. ID. Č. 8)
2C	46-64	TFTGKWSQTAFPKQYPLFR (SEKV. ID. Č. 9)
3C	77-91	HSSDYSMWRKNQYVS (SEKV. ID. Č. 10)
4C	188-210	DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (S.ID. Č.ll)
5C	263-274	NEIVDSASVPET (SEKVENCE ID. Č. 12)

Peptidy byly kovalentně vázány přes další C-koncový cystein na barvivo KLH (keyhole limpet hemocyanin), aby jich bylo možno využít jako imunogenů. Podobně byly připraveny konjugáty s bovinním sérovým albuminem (BSA) pro analýzu titru antisér testem EL1SA.

Každým peptidem byla imunizována dvě zvířata. Počáteční imunizace byly prováděny ve Freundově kompletním adjuvans (0,5 mg/zvíře) a následné podpůrné imunizace byly prováděny v třítýdenních intervalech pomocí dávky 0,25 mg/zvíře ve Freundově nekompletním adjuvans intramuskulámě. Byly prováděny pravidelné odběry a titr protilátek proti specifickým konjugátům BSA-peptid byl měřen testem ELISA a srovnáván s preimunním sérem. Bylo prokázáno, že antiséra proti peptidům 1C a 3C jsou aktivní. Antiséra proti peptidu 2C nerozpoznávala polypeptid RG1. Antiséra proti peptidům 4C a 5C nebyla testována.

Lidské monoklonální protilátky proti RG1 byly připraveny imunizací transgenních myší proti peptidům RG1 a fúznímu proteinu označenému 6-histidinovou značkou exprimovanému v E.

coli. Splenocyty těchto zvířat byly fúzovány s myleomovými buňkami, čímž vznikly hybridomové buňky. Výsledné hybridomy byly plošně testovány testem ELISA, aby byly získány hybridomy produkující protilátky proti peptidům a proteinu RG1.

Příklad 5

Analýza protilátek metodou Western blot

Specificita antisér pro RG1 byla testována způsobem Western blot. Antiséra specifická pro RG1 (získaná proti sekvencím 1C a 3C uvedeným výše) byla testována pomocí RG1 přechodně exprimovaného v buňkách COS, nativního RG1 sekretovaného buňkami LNCaP a RG1 produko30 váného buňkami BHK (baby hamster kidney cells). Antiséra specifická pro RG1 byla dále testována lyzáty připravenými z: nádorů LNCaP, buněk LNCaP, nádorů PC3, buněk PC3 a dalších klinických vzorků humánních nádorů prostaty. Buňky a tkáně byly lyžovány v detergentovém pufru. Po 5min povaření bylo 10 μΐ každého lyzátu naneseno na 12% SDS-polyakrylamidový gel k rozdělení proteinů. Rozdělené proteiny pak byly přeneseny na nitrocelulózovou membránu. Vazebná specificita protilátek proti RG1 byla ověřena vazbou v přítomnosti homologních a heterologních proteinů. Pomocí antisér specifických pro RG1 byla přítomnost proteinu prokázána ve všech vzorcích kromě buněk PC-3 a nádorů PC-3.

Příklad 6

Purifikace nativního proteinu RG1 sekretovaného buňkami LNCaP

Analýza způsobem Western blot prokázala, že buňky LNCaP sekretu) nativní protein RG1. K purifikaci nativního proteinu byly buňky ponechány po 48 hodin růst v médiu bez séra. Toto médium bez séra bylo pak odebráno, centrifugováno tak, aby byly odstraněny všechny buňky a

-34CZ 299232 B6 přibližně 50x koncentrováno ultrafiltrací. Koncentrované médium bylo pak lOx zředěno 20 mM pufrem octanu sodného, pH 6,5, a naneseno na kolonu pro výměnu aniontů Q-Sepharose. Eluce z kolony byla provedena gradientem chloridu sodného (0,5 % za min), přičemž byly odebírány 2,0 ml frakce. Jak bylo potvrzeno způsoby Western blot a SDS PAGE, frakce obsahující protein

RG1 byly vymyty při koncentraci přibližně 75 mM NaCl. Nativní protein RG1 se pohybuje při mírně nižších molekulových váhách než fúzní protein 6-histidin-RGl exprimovaný v bakteriích, zřejmě protože neobsahuje fúzovaný peptid.

Příklad 7 ío Imunohistochemické barvení exprese RG1

Exprese proteinu RG1 byla stanovena firmou LifeSpan Biosciences, lne., v řadě humánních tkání jako ledviny, plíce, slinivka, svaly, mozek a prostata. Další prostatické tkáně byly získány z Urologického oddělení lékařské fakulty Stanfordovy univerzity a testovány v Berlex. Tkáňové řezy byly zbaveny parafínu pomocí standardních způsobů. Polyklonální protilátka RG1-3C byla použita jak primární protilátka a jako detekční systém byla použita souprava Vector ABC-AP (AK5002) se soupravou Vector red substráte (Sk5002). Jako negativní kontrola bylo barvení provedeno v nepřítomnosti primární protilátky.

Všechny publikace a patenty zmíněné výše v popisu jsou v plném rozsahu zahrnuty do popisu formou odkazu. Zatímco předkládaný vynález je zde popsán s odkazem na specifická provedení, odborníkovi je zřejmé, že je v něm možno provádět různé změny a ekvivalentní nahrazení, aniž by došlo k odchýlení od vynálezecké myšlenky a rozsahu tohoto vynálezu. Navíc může být provedeno mnoho modifikací k přizpůsobení určité situace, materiálu, sloučeniny nebo látky, způsobu, kroku či kroků určitého způsobu pro účely, záměr a rozsah tohoto vynálezu. Všechny tyto modifikace spadají do rozsahu vynálezu vymezeného připojenými patentovými nároky.

SEZNAM SEKVENCÍ <160> 12 <170> Patent In Ver. 2..0 <210> 1 <211> 1785 <212> DNA <213> Homo sapiens <220>

<221> COS <222> (296)..(1291) <400> 1 agaaěggggt gcggcagcác tgccagggga agagggtgat ccgacccggg gaaggtcgct 60 gggcagggcg agttgggaaa.gcggcagccc ccgccgcccc cgeagcccct tctcctcctt 120 tctcccacgt cctatctgcc tctcgctgga ggccaggccg tgcagcatcg aagacaggag 180 gaactggagó ctcattggcc ggcccggggc gccggectcg ggcttaaata ggagctccgg 240 'gctctggctg ggacccgacc gctgccggcc gcgctcccgc tgctcctgcc gggtg atg 298 Met

gaa

aac

CCC

ago

ccg.gcc

gcc

gcc

ctg

ggc

aag

gcc

ctc

tgc

gct ctc

34 6

Glu

Asn

Pro

Ser

Pro Ala

Ala

Ala

Leu Gly

Lys

Ala

Leu

Cys

Ala Leu

5

10

15

ctc

ctg

gcc

act

ctc ggc

gcc

gcc

ggc

cag

cct

ctt

999

ggá

gag tcc

394

Leu

Leu

Ala

Thr

Leu Gly

Ala

Ala

Gly

Gin

Pro

Leu

Gly

Gly

Glu. Ser

20

25

30

atc

tgt

tcc

gcc

gga 'gcc

ccg

gcc

aaa

tac

agc

atc

acc

ttc

acg ggc

442

Ile

Cys

Ser

Ala

Gly Ala

Pro

Ala

Lys

Tyr

Ser

Ile

Thr

Phe

Thr Gly

35

40

45

-35CZ 299232 B6

aag Lys 50

tgg Trp

agc cag Ser· Gin

acg Thr

gcc ttc ccc aag

cag Gin

tac ccc ctg ttc cgc ccc

4 90

Ala 55

Phe

Pro

Lys

Tyr 60

Pro

Leu

Phe

Arg

Pro 65

cct

gcg

cag

tgg

tet

tcg

ctg

ctg

ggg

gcc

gcg

cat

agc

tcc

gac

tac

538

Pro

Ala

Gin

Trp

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala

Ala

His

Ser

Ser

Asp

Tyr

70

75

80

agc

atg

tgg

agg

aag

aa-c

cag

tac

gtc

agt

aac

ggg

ctg

cgc

gac

ttt

586

Ser

Met

Trp

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

Ser

Asn

Gly

Leu

Arg

Asp

Phe

85

90

95

gcg

gag

cgc

ggc

gag

gcc

tgg

gcg

ctg

atg

aag

gag

atc

gag

gcg

gcg

634

Ala

Glu

Arg

Gly

Glu

Ala

Trp

Ala

Leu

Met

Lys

Glu

Ile

Glu

Ala

Ala

100

105

110

ggg

gag

gcg

ctg

cag

agc

gtg

cac

gcg

gtg

ttt

tcg

gcg

ccc

gcc

gtc

682

Gly

Glu

Ala

Leu

Gin

Ser

Val

His

Ala

Val

Phe

Ser

Ala

Pro

Ala

Val

115

120

125

ccc

agc

ggc

acc

ggg

cag

acg

tcg

gcg

gag

ctg

gag

gtg

cag

cgc

agg

730

Pro

Ser

Gly

Thr

Gly

Gin

Thr

Ser

Ala

Glu

Leu

Glu

Val

Gin

Arg

Arg

130

135

140

145

cac

tcg

ctg

gtc

tcg

ttt

gtg

gtg

cgc

atc

gtg

ccc

agc

ccc

gac

tgg

778

His

Ser

Leu

Val

Ser

Phe

Val

Val

Arg

Ile

val

Pro

Ser

Pro

Asp

Trp

150

155

160

ttc

gtg

ggc

gtg

gac

agc

ctg

gac

ctg

tgc

gac

ggg

gac

cgt

tgg

cgg

826

Phe

Val

Gly

Val

Asp

Ser

Leu

Asp

Leu

Cys

Asp

Gly

Asp

Arg

Trp

Arg

165

170

175

gaa

cag

gcg

gcg

ctg

gac

ctg

tac

ccc

tac

gac

gcc

ggg

acg

gac

agc

874

Glu

Gin

Ala

Ala

Leu

Asp

Leu

Tyr

Pro

Tyr

Asp

Ala

Gly

Thr

Asp

Ser

180

185

190

ggc

ttc

acc

ttc

tcc

tcc

ccc

aac

ttc

gcc

acc

atc

ccg

cag

gac

acg

922

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Pro

Asn

Phe

Ala

Thr

Ile

Pro

Gin

Asp

Thr

195

200

205

gtg

acc

gag

ata

acg

tcc

tcc

tet

ccc

agc

cac

ccg

gcc

aac

tcc

ttc

970

Val

Thr

Glu

Ile

Thr

Ser

Ser

Ser

Přo

Ser

His

Pro

Ala

Asn

Ser

Phe

210

215

220

225

tac

tac

cca

cgg

ctg

aag

gcc

ctg

cct

ccc

atc

gcc

agg

gtg

aca

ctg

1018

Tyr

Tyr

Pro

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Pro

Pro

Ile

Ala

Arg

Val

Thr

Leu

230

235

240

gtg

cgg

ctg

ega

cag

agc

ccc

agg

gcc

ttc

atc

cct

ccc

gcc

cca

gtc

1066

Val

Arg

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Arg

Ala

Phe

Ile

Pro

Pro

Ala

Pro

Val

245

250

255

ctg

ccc

agc

agg

gac

aat

gag

att

gta

gac

agc

gcc

tea

gtt

cca

gaa

1114

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Asn

Glu

Ile

Val

Asp

Ser

Ala

Ser

Val

Pro

Glu

260

265

270

-36CZ 299232 B6

acg Thr

ccg Pro 275

ctg Leu

gac tgc gag gtc

tcc ctg tgg tcg tcc tgg gga

ctg Leu

tgc Cys

1162

Asp

Cys

Glu

Val 280

Ser

Leu Trp

Ser Ser Trp 285

Gly

gga

ggc

cac

tgt

ggg

agg

ctc

ggg

acc aag

agc agg act

cgc

tac

gtc

1210

Gly

Gly

His

Cys

Gly

Arg

Leu

Gly

Thr Lys

Ser Arg Thr

Arg

Tyr

Val

290

295

300

305

cgg

gtc

cag

CCC

gcc

aac

aac

ggg

agc ccc

tgc ccc gag

ctc

gaa

gaa

1258

Arg

Val

Gin

Pro

Ala

Asn

Asn

Gly

Ser Pro

Cys Pro Glu

Leu

Glu

Glu

310

315

320

gag

gct

gag

tgc

gtc

cct

gat

aac

tgc gtc

taa gaccagagcc ccgcagcccc

1311

Glu

Ala

Glu

Cys

Val

Pro

Asp

Asn

Cys Val

325

330

tggggccccc	cggagccatg	gggtgtcggg	ggctcctgtg	caggctcatg	ctgcaggcgg	1371
ccgagggcac	agggggtttc	gcgctgctcc	tgaccgcggt	gaggccgcgc	cgaccatctc	14.31
tgcactgaag	ggccctctgg	tggccggcac	gggcattggg	aaacagcctc	ctcctttccc	1491
aaccttgctt	cttaggggcc	cccgtgtccc	gtctgctctc	agcctcctcc	tcctgcagga	1551
taaagtcatc	cccaaggctc	cagctactct	aaattatgtc	tccttataag	ttattgctgc	1611
tccaggagat	tgtccttcat	cgtccagggg	cctggctccc	acgtggttgc	agatacctca	1671
gacctggtgc	tctaggctgt	gctgagccca	ctctcccgag	ggcgcatcca	agcgggggcc	1731
acttgagaag	tgaataaatg	gggcggtttc	ggaagcgtca	aaaaaaaaaa	aaaa	1785

<210> 2 <211> 331 <212> PRT <213> Homo sapiens <4OO> 2

Met 1

Glu Asn

Pro

Ser Pro Ala Ala Ala Leu Gly Lys

Ala

Leu

cys 15

Ala

5

10

Leu

Leu

Leu

Ala

Thr

Leu

Gly

Ala

Ala

Gly

Gin

Pro

Leu

Gly

Gly

Glu

20

25

30

Ser

Ile

Cys

Ser

Ala

Gly

Ala

Pro

Ala

Lys

Tyr

Ser

Ile

Thr

Phe

Thr

35

40

45

Gly

Lys

Trp

Ser

Gin

Thr

Ala

Phe

Pro

Lys

Gin

Tyr

Pro

Leu

Phe

Arg

50

55

60

Pro

Pro

Ala

Gin

Trp

Ser

Ser

Leu

Leu

Gly

Ala

Ala

His

Ser

Ser

Asp

65

70

75

80

Tyr

Ser

Met

Trp

Arg

Lys

Asn

Gin

Tyr

Val

Ser

Asn

Gly

Leu

Arg

Asp

85

90

95

-37CZ 299232 B6

Phe Ala Glu Arg Gly

Glu

Ala

Trp

Ala 105

Leu Met Lys Glu

Ile 110

Glu

Ala

100

Ala

Gly

Glu

Ala

Leu

Gin

Ser

Val

His

Ala

Val

Phe

Ser

Ala

Pro

Ala

115

120

125

Val

Pro

Ser

Gly

Thr

Gly

Gin

Thr

Ser

Ala

Glu

Leu

Glu

Val

Gin

Arg

130

135

140

Arg

His

Ser

Leu

Val

Ser

Phe

Val

val

Arg

Ile

Val

Pro

Ser

Pro

Asp

145

150

155

160

Trp

Phe

Val

Gly

Val

Asp

Ser

Leu

Asp

Leu

Cys

Asp

Gly

Asp

Arg

Trp

165

170

175

Arg

Glu

Gin

Ala

Ala

Leu

Asp

Leu

Tyr

Pro

Tyr

Asp

Ala

Gly

Thr

Asp

180

185

190

Ser

Gly

Phe

Thr

Phe

Ser

Ser

Pro

Asn

Phe

Ala

Thr

Ile

Pro

Gin

Asp

195

200

205

Thr

Val

Thr

Glu

Ile

Thr

Ser

Ser

Ser

Pro

Ser

His

Pro

Ala

Asn

Ser

210

215

220

Phe

Tyr

Tyr

Pro

Arg

Leu

Lys

Ala

Leu

Pro

Pro

Ile

Ala

Arg

Val

Thr

225

230

235

240

Leu

Val

Arg

Leu

Arg

Gin

Ser

Pro

Arg

Ala

Phe

Ile

Pro

Pro

Ala

Pro

245

250

255

Val

Leu

Pro

Ser

Arg

Asp

Asn

Glu

Ile

Val

Asp

Ser

Ala

Ser

Val

Pro

250

265

270

Glu

Thr

Pro

Leu

Asp

Cys

Glu

Val

Ser

Leu

Trp

Ser

Ser

Trp

Gly

Leu

275

280

285

Cys

Gly

Gly

His

Cys

Gly

Arg

Leu

Gly

Thr

Lys

Ser

Arg

Thr

Arg

Tyr

290

295

300

Val

Arg

Val

Gin

Pro

Ala

Asn

Asn

Gly

Ser

Pro

Cys

Pro

Glu

Leu

Glu

305

310

315

3-20

Glu

Glu

Ala

Glu

Cys

Val

Pro

Asp

Asn

Cys

Val

325 330 <210> 3 <2ll> 19 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 3 cgcgeatagc tccgactac

-38CZ 299232 B6 <210> 4 <211> 15 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 4 gccgcgtccg caaag <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: sonda <40Q> 5 aggaagaacc agtacgtcag taacgggctg 30 <210> 6 <211> 36 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 6 tccctctaga gccaccatgg aaaaccccag cccggc 36 <210> Ί <211> 35 <212> DNA <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: primer <400> 7 aaggcatcac gtgttagacg cagttatcag ggacg 35 <210> 8 <211> 19 <212> PRT <213> Umělá sekvence

-39CZ 299232 B6 <220>

<223> Popis umělé sekvence: peptid <400> 8

Pro Leu Gly Gly Glu Ser Ile Cys Ser Ala Gly Ala Pro Ala Lys Tyr 15 10 15

Ser Ile Thr <210> 9 <211> 19 <2l2> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: peptid2 <4 00> 9

Thr Phe Thr Gly Lys Trp Ser Gin Thr Ala Phe Pro Lys Gin Tyr Pro

10 15

Leu Phe Arg <210> 10 <2ll> 15 <212> PRT <213> Umělá sekvence <220>

<223> Popis umělé sekvence: peptid <400> 10

His Ser Ser Asp Tyr Ser Met Trp Arg Lys Asn Gin Tyr Val Ser

10 15

<210> <211> <212> <213>	11 23 PRT Umělá	sekvence
<220>
<223>	Popis	umělé sekvence: peptid
<400>	1Ί

Asp Ala Gly Thr Asp Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Pro Asn Phe Ala 15 10 15

Thr Ile Pro Gly Asp Thr Val 20

-40CZ 299232 B6 <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213> Umělá sekvence <22 0>

<223> Popis umělé sekvence: peptid <4O<3> 12

Asn Glu Ile Val Asp Ser Ala Ser Val Pro Glu Thr

Claims (30)

1. Izolovaná protilátka nebo fragment protilátky, které se specificky váží na polypeptidový ío fragment mající aminokyselinovou sekvenci, která je zcela stejná jako část avšak nikoliv celá aminokyselinová sekvence RG1 polypeptidů uvedená na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2), a její varianty nebo deriváty, kde se izolovaná protilátka, nebo fragment této protilátky, specificky váže na člen vybraný ze skupiny sestávající z:

(a) aminokyselina 28 až aminokyselina 46 ze SEKVENCE ID. Č. 2;

15 (b) aminokyselina 188 až aminokyselina 210 ze SEKVENCE ID. Č. 2; a (c) polypeptid, který má alespoň 70% identitu s polypeptidem podle (a) nebo (b).

2. Protilátka podle nároku 1, která se specificky váže na aminokyselinovou sekvenci PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEKVENCE ID. Č. 8).

3. Protilátka podle nároku 1, která se specificky váže na aminokyselinovou sekvenci DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEKVENCE ID. Č. 11).

4. Protilátka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde protilátka je polyklonální protilátka.

5. Protilátka podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3, kde protilátka je monoklonální protilátka.

6. Imunokonjugát obsahující izolovanou protilátku, nebo fragment protilátky, jak je definovaná v nároku 1, konjugovanou s terapeutickým činidlem.

7. Imunokonjugát podle nároku 6, kde terapeutické činidlo je cytotoxické činidlo.

8. Imunokonjugát podle nároku 7, kde cytotoxické činidlo je vybráno ze skupiny sestávající z následujících činidel: ricin, doxorubicin, daunorubicin, taxol, ethidium bromid, mitomycin, eto35 posid, tenoposid, vincristin, vinblastin, colchicin, dihydroxyanthracindion, aktinomycin D, difterický toxin, Pseudomonas exotoxin (PE) A, PE40, ricin, abrin, glukokortikoid a radioizotopy.

9. Imunokonjugát podle nároku 6, kde protilátkové fragmenty jsou vybrány ze skupiny sestávající z Fv, F(ab') a F(ab')₂ fragmentů.

10. Použití imunokonjugátu obsahujícího terapeutické činidlo a izolovanou protilátku nebo fragment protilátky, které se specificky váží na polypeptidový fragment mající aminokyselinovou sekvenci, která je zcela stejná jako část avšak nikoliv celá aminokyselinová sekvence RG1 polypeptidů uvedená na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2), a její varianty nebo deriváty, kde se

-41 CZ 299232 B6 izolovaná protilátka, nebo fragment této protilátky, specificky váže na člen vybraný ze skupiny sestávající z:

(a) aminokyselina 28 až aminokyselina 46 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. C. 2;

(b) aminokyselina 77 až aminokyselina 91 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. C. 2;

5 (c) aminokyselina 188 až aminokyselina 210 jakjsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

(d) aminokyselina 263 až aminokyselina 274 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

(e) polypeptid, který má alespoň 70% identitu s polypeptidem (a), (b), (c) nebo (d), pro výrobu kompozice, která selektivně ničí buňku exprimující RG1 polypeptid SEKVENCE ID. C. 2 tím, že imunokonjugát reaguje s buňkou tak, že terapeutické činidlo imunokonjugátu ío zničí buňku.

11. Použití terapeuticky účinného množství imunokonjugátu obsahujícího terapeutické činidlo a izolovanou protilátku, nebo fragment protilátky, které se specificky váží na polypeptidový fragment mající aminokyselinovou sekvenci, která je zcela stejná jako část avšak nikoliv celá amino15 kyselinová sekvence RG1 polypeptidů uvedená na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2), a její varianty nebo deriváty, kde se izolovaná protilátka, nebo fragment této protilátky, specificky váže na člen vybraný ze skupiny sestávající z:

(a) aminokyselina 28 až aminokyselina 46 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. C. 2;

(b) aminokyselina 77 až aminokyselina 91 jakjsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

20 (c) aminokyselina 188 až aminokyselina 210 jakjsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

(d) aminokyselina 263 až aminokyselina 274 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2; a (e) polypeptid, který má alespoň 70% identitu s polypeptidem (a), (b), (c) nebo (d), pro výrobu kompozice pro léčení patologického stavu u lidí, který je spojen s expresí RG1.

25

12. Použití podle nároku 10 nebo 11, kdy se protilátka specificky váže na aminokyselinovou sekvenci PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEKVENCE ID. Č. 8).

13. Použití podle nároku 10 nebo 11, kdy se protilátka specificky váže na aminokyselinovou sekvenci HSSDYSMWRKNQYVS (SEKVENCE ID. Č. 10).

14. Použití podle nároku 10 nebo 11, kdy se protilátka specificky váže na aminokyselinovou sekvenci DAGTDSGFTFSSPNFAT1PQDTV (SEKVENCE ID. Č. 11).

15. Použití podle nároku 10 nebo 11, kdy se protilátka specificky váže na aminokyselinovou

35 sekvenci NEIVDSASVPET (SEKVENCE ID. Č. 12).

16. Způsob detekce, vyznačující se tím, že detekce zahrnuje analýzu vzorku získaného od pacienta na přítomnost polypeptidů obsahujícího člen vybraný ze skupiny sestávající z následujících polypeptidů:

40 (a) polypeptid obsahující aminokyselinu 28 až aminokyselinu 46 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

(b) polypeptid obsahující aminokyselinu 188 až aminokyselinu 210 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2; a (c) polypeptid, který má alespoň 70% identitu s polypeptidem (a) nebo (b)

45 kdy analýza obsahuje uvedení vzorku do kontaktu s protilátkou, nebo fragmentem protilátky, jak jsou definovány v kterémkoliv z nároků 1 až 9, které se váží k jednomu z polypeptidů a detekují vazbu protilátky s polypeptidem ve vzorku.

-42CZ 299232 B6

17. Použití protilátky nebo fragmentu protilátky, které se specificky váží na polypeptidový fragment mající aminokyselinovou sekvenci, která je zcela stejná jako část avšak nikoliv celá aminokyselinová sekvence RG1 polypeptidů uvedená na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2), a její varianty

5 nebo deriváty, kde se izolovaná protilátka, nebo fragment této protilátky, specificky váže na člen vybraný ze skupiny sestávající z:

(a) aminokyselina 28 až aminokyselina 46 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

(b) aminokyselina 77 až aminokyselina 91 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

(c) aminokyselina 188 až aminokyselina 210 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

10 (d) aminokyselina 263 až aminokyselina 274 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2; a (e) polypeptid, který má alespoň 70% identitu s polypeptidem (a), (b), (c) nebo (d), pro výrobu kompozice pro diagnostikování metastáz u pacienta, spojených s polypeptidem SEKVENCE ID. Č. 2.

15

18. Použití protilátky, nebo fragmentu protilátky, které se specificky váží na polypeptidový fragment mající aminokyselinovou sekvenci, která je zcela stejná jako část avšak nikoliv celá aminokyselinová sekvence RG1 polypeptidů uvedená na obr. 2 (SEKVENCE ID. Č. 2), a její varianty nebo deriváty, kde se izolovaná protilátka, nebo fragment této protilátky, specificky váže na člen vybraný ze skupiny sestávající z:

20 (a) aminokyselina 28 až aminokyselina 46 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

(b) aminokyselina 77 až aminokyselina 91 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

(c) aminokyselina 188 až aminokyselina 210 jakjsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2;

(d) aminokyselina 263 až aminokyselina 274 jak jsou obsaženy v SEKVENCI ID. Č. 2; a (e) polypeptid, který má alespoň 70% identitu s polypeptidem (a), (b), (c) nebo (d),

25 pro výrobu kompozice pro léčení nebo detekci metastáz u pacienta s rakovinou prostaty.

19. Použití podle nároku 17 nebo 18, kdy se protilátka specificky váže na aminokyselinovou sekvenci PLGGESICSAGAPAKYSIT (SEKVENCE ID. Č. 8).

30

20. Použití podle nároku 17 nebo 18, kdy se protilátka specificky váže na aminokyselinovou sekvenci HSSDYSMWRKNQYVS (SEKVENCE ID. Č. 10).

21. Použití podle nároku 17 nebo 18, kdy se protilátka specificky váže na aminokyselinovou sekvenci DAGTDSGFTFSSPNFATIPQDTV (SEKVENCE ID. Č. 11).

22. Použití podle nároku 17 nebo 18, kdy se protilátka specificky váže na aminokyselinovou sekvenci NEIVDSASVPET (SEKVENCE ID. Č. 12).

23. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 22, kdy kompozice je určena pro zobrazovací

40 metody.

24. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 22, kdy kompozice je určena pro imunoscintigrafii s Tc-99m konjugováným santi-RGl protilátkou nebo sln-lll konjugováným santi-RGl protilátkou.

25. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 24, kdy protilátka je značena tak, že přímo či nepřímo vytváří detekovatelný signál se sloučeninou vybranou ze skupiny sestávající z radioaktivně značeného enzymu, chromoforu nebo fluorescentu.

-43CZ 299232 B6

26. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 25, kdy protilátka je značena detekovatelným markérem nebo je konjugována s druhou molekulou pro cílení druhé molekuly na RG1 pozitivní buňky.

5

27. Použití podle nároku 26, kdy druhá molekula je cytotoxické činidlo vybrané ze skupiny sestávající z následujících činidel: ricin, doxorubicin, daunorubicin, Taxol (paclitaxel), ethidium bromid, mitomycin, etoposid, tenoposid, vincristin, vinblastin, kolchicin, dihydroxyanthracindion, aktinomycin D, difterický toxin, Pseudomonas exotoxin (PE) A, PE40, ricin, abrin a glukokortikoid.

28. Použití podle nároků 26, kdy detekovatelný markér je vybrán ze skupiny sestávající z následujících: antimon-124, antimon-125, arzen-74, baryum-103, baryum-140, beryllium-7, bizmut-j206, bizmut-207, kadmium-109, kadmium-115m, vápník-45, cer-139, cer-141, cer-144, cezium-137, chrom-51, kobalt-56, kobalt-57, kobalt-68, kobalt-60, kobalt-64, erbium-169,

15 europium-152, gadolinium-153, zlato-195, zlato-199, hafnium-175, hafnium-181, indium-111, jod—123, jod—131, iridium-192, železo-55, železo-59, krypton-85, olovo-210, lutecium-177, mangan-54, rtuť-197, rtuť-203, molybden-99, neodym-147, neptunium-237, nikl-63, niob-95, osmium-185+191, palladium-103, platina-195m, prazeodym-143, promethium-147, protaktinium-233, rhenium-186, rubidium-86, ruthenium-103, ruthenium-106, skandium^44, skan20 dium-46, selen-75, stříbro-llOm, sodík-22, stroncium-85, stroncium-89, stroncium-90, síra35, tantal-182, technecium-99m, tellur—125, tellur-132, thallium-170, thallium-204, thorium228, thorium-232, cín—113, titan-44, wolfram-185, vanad-48, vanad-49, ytterbium-169, yttrium-88, yttrium-90, yttrium-'91, zinek-65 a zirkon-95.

25

29. Protilátka podle nároku 1,2, 3, 4 nebo 5 pro použití jako léčivo.

30. Imunokonjugát podle nároku 6, 7, 8 nebo 9 pro použití jako léčivo.