CZ288398A3

CZ288398A3 - Médium pro konzervaci biologického materiálu, způsob jeho přípravy a jeho použití

Info

Publication number: CZ288398A3
Application number: CZ982883A
Authority: CZ
Inventors: ANDRé CRESPO; Henri-Michel Soria
Original assignee: Rhone-Poulenc Rorer S. A.
Priority date: 1996-03-12
Filing date: 1997-03-05
Publication date: 1998-12-16
Also published as: EP0910622B1; BR9707888A; SK124198A3; HUP9902373A1; AU2163397A; FR2746109B1; WO1997033975A1; NO325761B1; IL126153A0; ZA972101B; HUP9902373A3; AU720992B2; JP3735123B2; US6248588B1; HU226139B1; NO984053L; FR2746109A1; IL126153A; CZ297650B6; KR19990087663A

Description

MÉDIUM PRO KONZERVACI BIOLOGICKÉHO MATERIÁLU, ZPŮSOB JEHO PŘÍPRAVY A JEHO POUŽITÍ

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká média umožňujícího konzervaci a kryokonzervaci biologického materiálu, jako jsou živočišné buňky a virové částice, které se přímo injektují do organismu. Konkrétněji se vynález týká média pro konzervaci biologického materiálu, které tvoří roztok soli, modifikovaná tekutá želatina a lidský sérový albumin.

Dosavadní stav techniky

Při buněčné nebo genové terapii a krevních transfuzích nebo transplantacích kostní dřeně, je jedním ze základních problémů uchování biologického materiálu. Schopnost uchovávat biologický materiál v živém stavu po dostatečně dlouhou dobu je samozřejmě důležitá, a to po dostatečně dlouhou dobu odpovídající produkci a skladování v průmyslovém měřítku, a také umožňuje provést některé testy.

Nejběžněji používaným způsobem konzervace uvedeného materiálu je zmrazování. Při zmrazování buněk ale tyto například trpí velkou zátěží zejména vlivem jevu exosmózy a tvorby ledu uvnitř buněk. Tyto jevy způsobují zničení velkého množství buněk jednak během mražení a jednak během rozmrazování. Tím může dojít k nevratné ztrátě schopnosti oddělit nebo odlišit nepoškozené buňky. Je totiž velmi důležité mít možnost po rozmražení získat velké množství živých buněk, které se mají injektovat do živého organismu (například krevní transfuze, transplantace kostní dřeně nebo buněčná terapie), protože injektovat mrtvé nebo poškozené buňky je samozřejmě bezvýznamné. Podobně, pokud je třeba buňky rekultivovat, je stejně významné, aby byl vysoký podíl živých.

Λ Λ • ·

Dosud se do média kvůli ochraně proti poškození přidávala ochranná látka. Nejvíce používanou a nejúčinnější ochrannou látkou je dimethylsulfoxid neboli DMSO, který ale nelze injektovat. Dimethylsulfoxid vstupuje do buněčné membrány a stabilizuje ji, a tak brání poškození buněk. Takový systém pak umožňuje během rozmrazování zvýšit podíl živých nepoškozených buněk, které jsou schopné dělení, tato metoda ale trpí velkým nedostatkem - ve chvíli, kdy je třeba buňky zavést do organismu. Dimethylsulfoxid je totiž pro buňky při teplotě místnosti toxický, protože permeabilizuje membránu, což způsobí odumření buňky. Proto musí být před reimplantací, například buněk kostní dřeně nebo transfuzí krevních buněk, odstraněn.· Eliminace dimethylsulfoxidu se provádí po rozmražení obecně zředěním vzorku deseti objemy média bez dimethylsulfoxidu, následným odstředěním a oddělením rozpouštědla nad sraženinou. Tato operace se opakuje několikrát, dokud není odstraněn veškerý dimethylsulfoxid, což znamená ztrátu času a zvýšeni manipulace, což zvyšuje riziko kontaminace vnějšími patogenními činidly a ztráty uvedeného biologického materiálu.

V přítomnosti dimethylsulfoxidu je podíl živých buněk po rozmražení vyšší než sedmdesát procent při optimálním způsobu mražení/rozmrazování, jak je uvedeno dále. Bez dimethylsulfoxidu je tento podíl nižší než dvacet procent. Dosud bylo mražení v přítomnosti dimethylsulfoxidu nejúčinnější, a proto nejpoužívanější metodou.

Podstata vynálezu

Žadatel objevil nový typ média, které umožňuje po rozmražení vyloučit manipulaci za udrženi vysokého podílu živých buněk. Za tím účelem žadatel vyvinul médium pro mražení/uchování, které umožňuje dosáhnout při rozmražení vysokého podílu živého materiálu bez použití dimethylsulfoxidu nebo jiné cytotoxické ochranné látky. Výhoda takového média je dána faktem, že se • · · »

roztok injektuje po rozmražení přímo bez potřeby jakékoli další manipulace. Rozmražení je tak možné provést přímo na místě, čímž se zkrátí čas mezi rozmražením a použitím, což zároveň umožňuje nepřetržité sterilní podmínky, a tak minimalizaci rizika vnější kontaminace.

Předmětem předkládaného vynálezu je- médium pro uchování a/nebo mražení biologického materiálu, které se skládá ze solného roztoku, modifikované tekuté želatiny a albuminu lidského séra (HSA).

Jak je uvedeno výše, toto médium neobsahuje žádné toxické látky a lze je podávat přímo do organismu. Médium lze použít pro* uchování, s výhodou ve zmrazené formě, různých biologických materiálů, jako jsou viry, buňky, krevní destičky a podobně.

První součástí média v souladu s předkládaným vynálezem je roztok solí. Tento roztok solí je izotonický s plasmou. Soli vstupující do prostředku mohou být různé. S výhodou se jedná o chloridy jako chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid vápenatý a/nebo chlorid hořečnatý, a laktáty jako například laktát sodný. Konkrétněji isotonický roztok soli obecně obsahuje chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid hořečnatý a laktát sodný. V jiné variantě je chlorid hořečnatý nahrazen chloridem vápenatým. V tom případě jsou koncentrace roztoku solí stejné nebo prakticky stejné jako v Ringerově laktátovém roztoku. Takový roztok se běžně používá například pro promývání při kompenzaci dehydratace nebo nedostatku fyziologického roztoku soli .

V souladu se specifickým provedením vynálezu je roztok soli v podstatě tvořen chloridem sodným, chloridem hořečnatým, chloridem draselným a laktátem, jejichž konečné koncentrace v médium jsou uvedeny níže v tabulce 1.

• · • ·

Tabulka 1

Sůl	Minimální koncentrace (g/D	Maximální koncentrace (g/U	Specifický příklad
NaCl	2,0	9	5,7
MgCl₂	0,05	0,2	0,093
KC1	0,05	0,5	0,247
Laktát	0,5.	4	2,25

Druhou složkou vstupující do média v souladu s předkládaným vynálezem je želatina. Jedná se o protein složený z různých aminokyselin spojených sousedními aminovými a karbonylovými skupinami za vzniku normální peptidové vazby. Molární hmotnost želatiny je specifická a vysoká (průměrná molární hmotnost je 10 000 až 100 000) a želatina je z velké části pro danou kvalitu a typ heterogenní. Želatina se skládá z lineárních nebo asymetrických molekul, které vznikají hydrolýzou dlouhého řetězce polypeptidových zbytků v bílé pojivové tkáni. Zkušenosti ukázaly, že nedegradovaná podobná ideální želatinová molekula vzniká primární hydrolýzou kolagenu v intervalech na reaktivních místech řetězce. To pokračuje do různého stupně sekundární hydrolýzou v různých intervalech na méně reaktivních vazbách ideální želatinové molekuly. To vysvětluje, jak degradační reakce je odpovědná za náhodný heterogenní vzorec molekuly specifického vzorku želatiny. Podobně má každý protein tvořící želatinu definovaný isoelektrický bod, při kterém je jeho ionizace a následně fyzikální a chemická reaktivita minimální. Těmito vlastnostmi jsou zejména rozpustnost, viskozita a koloidní osmotický tlak. Asymetrie molekuly želatiny s heterogenním vzorcem proto definuje podstatné ·· fcfc • · · · · • fcfcfc · • · • fc

• fc fc • fcfc fc fc ·· fcfc • · • fcfc • · · · • fc vlastnosti tvorby gelu a viskozity želatinového roztoku připraveného pro médium v souladu s předkládaným vynálezem.

Samotná želatina (sterilizovaná a zbavená pyrogenních a antigenních látek) již byla použita jako produkt pro náhradu krevní plasmy, ale vyvolávalo to řadu problémů zejména při konzervaci, protože při teplotě místnosti geluje. To vedlo od želatiny k odvození jiných sloučenin, obecně označovaných termínem modifikovaná tekutá želatina, které umožňují překonat zejména uvedené nevýhody.

Mezi modifikovanými tekutými želatinami lze zmínit například oxypolyželatinu získanou polymerizaci želatiny s glyoxalem a* oxidací peroxidem vodíku. Další modifikované tekuté želatiny se získávají reakcí želatiny (s výhodou o molární hmotnosti 15 000 až 36 000) se sukcinanhydridem, citrakonanhydridem, itakonanhydridem, akonitanhydridem nebo maleinanhydridem nebo sukcinylchloridem nebo fumarylchloridem, jak je popsáno ve francouzském patentu 1,291,502. Všechny tyto deriváty želatiny jsou kompatibilní pro farmaceutické použití a lze je přímo zavést do krevního řečiště v isotonickém roztoku soli. Modifikované tekuté želatiny jsou dále popsány v patentech US 2,525,753, US 2,827,419 a US 3,108,995.

Obecněji sestávají modifikované tekuté želatiny v souladu s předkládaným vynálezem z chemicky modifikovaných produktů hydrolýzy kolagenu, které jsou vhodné pro farmaceutické použití. S výhodou jsou to produkty s průměrnou molární hmotností 10 kD až 100 kD, výhodněji 15 kD až 40 kD. S výhodou jsou modifikovány reakcí s anhydridem za získání konečného produktu s viskozitou upravenou požadovanému použití například patentu FR 1,291,502. S výhodou se jedná o sukcinanhydrid, citrakonanhydrid, itakonanhydrid, akonitanhydrid nebo maleinanhydrid. Zejména výhodná modifikovaná tekutá želatina sestává z produktů hydrolýzy kolagénu s průměrnou molární hmotností ·· ·» ·· • · · · ♦ • ·

kD až 40 kD modifikovaných reakcí se sukcinanhydridem. Modifikovaná tekutá želatina v souladu s předkládaným vynálezem může být připravena technikami, které odborníci v této oblasti znají, a které jsou popsány zejména ve výše uvedených patentech.

Třetí složkou vstupující do média v souladu s předkládaným vynálezem je albumin lidského séra. Albumin lidského séra (HSA) je neglykosylovaný monomerní protein 585 aminokyselin s molární hmotností 66 kD. Jeho globulární struktura je udržována 17 disulfidickými můstky, které tvoří postupně série 9 dvojitých smyček (Brown J.R., Albumin Structure, Function and Uses, Rosenoer, V.M. a další, Pergamon Press, Oxford (1977) 27-51). O genech kódujících albumin lidského séra se ví, že jsou vysoce polymorfní a za různých podmínek bylo elektroforézní analýzou identifikováno více 30 strukturně odlišných genetických variant (Weitkamp, L.R. a další, Ann. Hum. Genet. 3 7 (1973) 219-226) . Gen albuminu lidského séra se dělí na 15 exonů 14 intronovými sekvencemi a obsahuje 16 961 nukleotidů od předpokládaného místa „čepičky do prvního místa adice póly(A).

Albumin lidského séra je syntetizován v hepatocytech v játrech, a pak je vylučován do krevního řečiště. Tato syntéza vede v prvním případě k prekursoru prepro-HSA, který obsahuje signální sekvenci 18 aminokyselin směřující nascentní polypeptid do sekreční metabolické dráhy.

Albumin lidského séra je nejhojnější krevní protein s koncentrací kolem 40 g na litr séra. V každé chvíli proto v lidském těle . cirkuluje asi 160 g albuminu. Nejdůležitější úlohou albuminu lidského séra je udržovat v krevním řečišti normální osmolaritu. Zároveň má výjimečnou schopnost vázat různé látky a hraje důležitou roli v endogenním transportu hydrofobních látek (jako jsou steroidy a žlučové soli) a různých léčiv, které tak mohou být přepraveny na místo svého

··· ·

·« ·· • · · ♦ • ♦ · · φ · ·»· • · · ·· · · určení. Albumin lidského séra byl v poslední době dále zahrnut do poruch prostaglandinů.

Albumin lidského séra, použitý v souladu s předkládaným vynálezem, může být přírodního původu (čištěný albumin lidského séra) nebo rekombinovaný (rHSA).

V tomto ohledu se přírodní albumin lidského séra obecně získá čištěním biologického materiálu lidského původu. Zejména se získává běžnými technikami pro dělení plasmy získané od dárců krve (Cohn další, J. Am. Chem. Soc. 68 (1946) 459) nebo extrakcí z lidské placenty technikymi popsanými J. Liautaudem a dalšími (13. Mezinárodní IABS konference, Budapešť; A:* Purification of proteins. Development of biological standard, Karger (ed.), Bale, 27 (1973) 107) . Čištěný albumin použitý v souladu s předkládaným vynálezem je s výhodou plasmový albumin. Výhodněji lze použít komerční roztok plasmového albuminu.

Rozvoj genového inženýrství a nových extrakčních a izolačních technik otevřel cesty k získávání levnějších lepších produktů s vyšší čistotou a stabilitou a bez rizika kontaminace viry (například hepatitidou B a AIDS). Z důvodu důležitosti trhu s albuminem lidského séra byla široce studována možnost jeho produkce rekombinantním způsobem. Pro přípravu rekombinovaného albuminu lidského séra tak byla studována řada expresních systémů.

Konkrétněji, a s ohledem na bakteriální hostitele, byly pro první genově inženýrské pokusy použity jako hostitelský organismus bakterie E.coli. Způsoby produkce albuminu lidského séra bakteriemi E.coli s použitím různých expresních vektorů, různých transkripčních promotorů a různých sekrečních signálů jsou popsány v EP 236 210, EP 200 590, EP 198 745 nebo EP 1 929. Následně byly provedeny studie sekrece albuminu lidského

A A

A

• A • · A • A A

A A

AAA A A

A A

AA AA

A A A A

A A A A « A AAA A

A A A

AA AA séra kulturou Bacíllus subtilis (Saunders a další., J. Bacteriol. 169 (1987) 2917). S ohledem na eukaryotní hostitele byly pro produkci albuminu lidského séra vyvinuty postupy využívající jako hostitelských organismů kvasinky. Tak bylo možné dokázat produkci albuminu lidského séra za řízení chelatinového promotoru u S.cerevisiae (Etcheverry a další, Bio/Technology 4 (1986) 726). Produkce albuminu lidského séra byla zmíněna za použití post-fermentačních procesů (EP 201 239) rovněž u pivovarských kvasinek při výrobě piva. Později byl v patentové přihlášce EP 361 991 popsán velmi účinný systém používající jako hostitelský organismus kvasinky Kluyveromyces transformované vektory odvozenými od plasmidové pKDl. S tímto· systémem bylo dosaženo sekrece zejména velkého množství albuminu lidského séra. Produkce rekombinovaného albuminu lidského séra byla konečně popsána i u Pichia pastoris (EP 344 459) . A dále bylo předmětem řady studií i čištění albuminu lidského séra (EP 319 067).

Použitý rekombinovaný nebo přírodní albumin lidského séra s výhodou splňuje některá kritéria kvality (homogenitu, čistotu, stabilitu). Lékopis uvádí pro roztoky plasmového albuminu řadu parametrů zejména pH, obsah proteinu, obsah polymeru a agregátu, obsah alkalické fosfatasy a složení některých proteinů. Lékopis dále ukládá požadavky na splnění absorbance, test sterility, test na pyrogeny a toxicitu (viz. Albumini humani solutio v Evropském lékopisu (1984) 255) . Použití albuminu v souladu s těmito kritérii je velmi výhodné, i když ne nezbytné.

Prostředky v souladu s předkládaným vynálezem s výhodou obsahují čištěný albumin lidského séra nebo rekombinovaný albumin s výhodou produkovaný eukaryotním hostitelem. Termín albumin lidského séra dále pro účely vynálezu zahrnuje všechny přírodní varianty lidského albuminu dané polymorfismem tohoto • fc « fc fcfc • · fcfc « fcfc fc fcfc • · ♦ fc • fc fc • fcfc fc « fcfc fcfc • fcfc • fcfc « · • · fcfc • fcfc fc fc · fcfc • fcfc • fc • fcfcfc • · fcfc proteinu. Je možné použít i ekvivalent albuminu lidského séra, čímž se myslí všechny deriváty albuminu lidského séra, které si zachovávají vlastnosti albuminu lidského séra. Těmito deriváty mohou být zejména N-koncové fragmenty albuminu lidského séra.

Média v souladu s předkládaným vynálezem lze připravit různými způsoby. Jednotlivé složky lze smíchat dohromady a pak do směsi přidat biologický materiál. Také je možné smíchat jednu nebo dvě složky s biologickým materiálem a pak přidat zbylou nebo zbylé dvě složky. S výhodou se připraví médium obsahující všechny tři složky a k němu se pak přidá biologický materiál. Příprava média a přidání biologického materiálu se provádí za sterilních podmínek. V souladu se specifickým provedením se do roztoku soli přidá modifikovaná tekutá želatina, a pak se do média přidá albumin lidského séra. V tomto ohledu výhodné provedení sestává z použití specifické směsi se stejným složením jako má náhrada krevní plasmy Plasmion (patent FR 2,042,381), ke které se pak přidá albumin lidského séra. Plasmion je komerční roztok složený z roztoku soli a modifikované tekuté želatiny. Jeho složení je následující:

- modifikovaná tekutá želatina 30 g/1

- chlorid sodný 5,382 g/1

- chlorid hořečnatý 0,143 g/1

- chlorid draselný 0,373 g/1

- laktát sodný 3,360 g/1

- voda pro injekce do 1000 ml

Plasmion se obvykle používá jako vaskulární plnící roztok při obnově objemu krevního oběhu nebo při ředění krve kvůli snížení její viskozity a zvýšení mikrocirkulace nebo alternativně při obnovování iontové rovnováhy při prevenci acidózy. Výhodný předmět podle předkládaného vynálezu se týká média umožňujícího konzervaci a/nebo mražení biologického materiálu, při kterém plasmion slouží jako směs roztoku soli a modifikované tekuté želatiny. Takové médium obsahuje plasmion a albumin lidského séra.

ft ftft ft ftft • · ft · • ft • ftft • ft ·· ·· ftft · • ♦ · • ftftft ♦ • · ·· ftft ♦ · ♦ ♦ « ftft ♦ • · ftft • •ftft ·

Vzájemné poměry množství složek média v souladu s předkládaným vynálezem může odborník na tuto oblast přizpůsobit podle příslušného biologického materiálu. Přestože, jak ilustrují příklady, jsou některé koncentrační rozsahy výhodné, mohou být poměry modifikovány. V tomto ohledu jsou výhodné koncentrační rozsahy solí uvedených výše v tabulce 1. Co se týče želatiny a sérového albuminu, jejich hmotnostní poměr albumin/želatina je v rozsahu 0,5 až 100. Tento poměr je výhodnější mezi 0,5 a 60 a zejména výhodný mezi 3 a 15. Ve specifických příkladech jsou uvedeny poměry 0,74; 1,66; 3,3; 6,66; 13,4; 26,66 a 60. tyto různé poměry odpovídají médiu v souladu s předkládaným vynálezem obsahujícímu 10 % až 90 % objemových komerčního roztoku plasmionu a 90 % až 10 % objemových 2 0% roztoku albuminu lidského séra. Jiná složení jsou níže reprezentována příklady v tabulce 2.

0· • 0 · 0 · t ·

0 00 0

Tabulka 2

Plasmion % obj .	Hmotnost želatiny (g/D	Objemový podíl (%)20% albuminu lidského séra	Hmotnost albuminu lidského séra (g/1)	Empirický poměr albumin/želatina
10	3	90	180	60
90	27	10	20	0,74
80	24	20	40	1,66
20	6	80	160	2 6,66
50	15	50	100	6,66
67	20	33	66	3,3
33	10	67	134	13,4

Médium v souladu s předkládaným vynálezem obecně obsahuje od 10 do 90 % objemových plasmionu respektive 20% roztoku albuminu lidského séra. Specifickým provedením jsou média obsahující od 20 do 80 % plasmionu respektive 20% roztoku albuminu lidského séra, výhodněji od 33 do 67 % plasmionu respektive 20% roztoku albuminu lidského séra. V jiném specifickém provedení vynálezu se médium skládá ze směsi plasmionu a 20% roztoku albuminu lidského séra v objemovém poměru 50/50. Hmotnostní poměr albumin lidského séra/želatina je s výhodou od 2 do 7. Zejména pozoruhodné výsledky byly dosaženy s poměrem 3.

Mimoto lze do média v souladu s předkládaným vynálezem přidat další složky. Zejména lze použít biokompatibilní činidla stabilizující buňky, jako například sloučeniny ze skupiny glycerolu (glycin, glycerol, sacharosa, glukosa a podobně). Tato činidla jsou přítomna v médiu v souladu s předkládaným vynálezem v množství menším než 5 % hmotnostních. S výhodou

9« • 9

9 ·

9

• • 9 * 9 • 9 999 obsahují média v souladu s předkládaným vynálezem od 0,5 do 5 % hmotnostních glycinu nebo glycerolu.

Média v souladu s předkládaným vynálezem slouží pro skladování, konzervaci a mražení biologického materiálu. Biologický materiál obecně znamená jakýkoliv materiál obsahující genetickou informaci, který se může’ sám množit nebo je schopen reprodukce v biologickém systému. Uvedený biologický materiál mohou konkrétněji tvořit buňky, viry nebo obojí. Buňky, které lze mrazit, mohou být například krevní buňky, buňky kostní dřeně, buňky produkující virové částice („obalovací kmeny) nebo geneticky modifikované buňky.

Virové částice relevantní v souladu s předkládaným vynálezem jsou ty, které lze použít při genové terapii. Velká spousta virů může mít modifikovaný genom, takže na jednu stranu ztratí schopnost množení, ale ponechají si infekčnost, na druhou stranu po vložení terapeuticky zajímavé sekvence nukleové kyseliny do jejich genomu umožní její expresi v infikovaných buňkách. Mezi těmito viry lze zejména zmínit adenoviry, AAVs, retroviry, herpes viry a podobně.

Nejpoužívanější jsou adenoviry. Byly charakterizovány různé serotypy adenovirů, jejichž struktura a vlastnosti se poněkud liší. Pro genovou terapii je v souladu s předkládaným vynálezem vhodné použití lidského adenovirů typu 2 nebo 5 (Ad 2 nebo Ad 5) nebo adenovirů zvířecího původu (viz. přihláška WO 94/26914). Mezi použitelnými adenoviry zvířecího původu lze zmínit adenoviry psího, hovězího, myšího (příklad: MAV1, Beard a další, Virology 75 (1990) 81), ovčího, vepřového, ptačího nebo opičího původu (příklad: SAV) . Výhodný virus živočišného původu je psí adenovirus, výhodnější CAV2 adenovirus [například kmen manhattan nebo A26/61 (ATCC VR-800)]. S výhodou se používají adenoviry lidského nebo psího nebo smíšeného původu.

·· • ♦ · • * · • · • · ·· • · · • · · • ··· · • · ·♦ ·♦ ·« t

··· « ·· • » • ♦ ··· ·· • » ·· • · • · ♦ ♦

Defektní adenoviry zahrnují ITRs, sekvence umožňující enkapsidaci a předmětnou nukleovou kyselinu. V genomu těchto adenovirú je alespoň El region nefunkční. Uvažovaný gen viru lze vyřadit z funkce jakoukoliv technikou známou odborníkům na tuto oblast a zejména totálním potlačením, substitucí, částečným odstraněním nebo přidáním jedné nebo několika bází v uvažovaném genu. Takovou modifikaci lze provést in vitro (na isolované DNA) nebo in šitu, například technikami genového inženýrství nebo alternativně působením mutagenních činidel. Ostatní regiony lze rovněž modifikovat, a to zejména region E3 (WO95/02697), E2 (WO94/28938), E4 (WO94/28152, WO94/12649, WO95/02697) a L5 (WO95/02697). Dále lze zahrnout i odstranění, v regionu El region na úrovni, kdy se vloží terapeuticky předmětný region E4 a nukleová kyselina (cf FR 94 13355).

Defektní rekombinované adenoviry lze připravit jakoukoliv technikou známou odborníkům na tuto oblast (Levrero a další, Gene 101 (1991) 195, EP 185 573; Graham, EMBO J. 3 (1984) 2917). Zejména je lze připravit homologní rekombinací mezi adenovirem a plasmidem nesoucím mezi jiným předmětnou DNA sekvenci. Homologní rekombinace nastává po kotransfekci uvedeného adenovirú a plasmidu do vhodné buněčné linie. Použitá buněčná linie je s výhodou (i) transformovatelná uvedenými prvky a (ii) zahrnuje sekvence schopné doplnění defektní části genomu adenovirú, s výhodou v integrované formě za účelem odstranění rizika rekombinace.

Dále se adenoviry po rozmnožení čistí běžnými technikami molekulární biologie, obecně pomocí gradientu chloridu česného.

Co se týče adeno-asociovaných virů (AAV) , jedná se o DNA viry relativně malé velikosti, které se integrují do genomu buněk postižených infekcí stabilním a regionálně specifickým způsobem. Jsou schopné infikovat široké spektrum buněk bez vlivu na růst buněk, jejich morfologii nebo diferenciaci. Dále φ· φφφ φφ

ΦΦ • φ φ • · · • φ • φ φφ ·· φφφ φ • Φ • φ · • · φ • · • φ φφ «φ φφ φφφ φ φ φφ • φφ φ φ • φ φφ φφ se nepovažují pro člověka za patologické. AAV genom byl klonován, sekvencován a charakterizován - zahrnuje kolem 4 700 bází a obsahuje na každém konci invertovanou repetici (ITR) asi 145 bázi, které slouží jako replikační počátek viru. Zbytek genomu je rozdělen na 2 esenciální regiony s enkapsidačními funkcemi: levou část genomu, která obsahuje rep gen účastnící se replikace viru a exprese virového genu; pravou část genomu, která obsahuje uzavírací gen kódující virové obalové proteiny.

V literatuře je popsáno použití od AAV odvozených vektorů pro transfer genů in vitro a in vivo (viz. zejména WO 91/18088; WO 93/09239; US 4,797,388, US 5,139,941, EP 488 528). Tyto přihlášky popisují různé od AW odvozené konstrukce, při kterých se odstraňuji rep a/nebo cap geny a nahrazují se předmětnými geny a jejich použití pro transfer uvedeného předmětného genu in vitro (na buňky v koltuře) nebo in vivo (přímo na organismus). Defektní rekombinované AAV viry lze připravit kotransfekcí plasmidu obsahujícího předmětnou sekvenci nukleové kyseliny ohraničeného dvěma AAV obrácenými opakovacími regiony (ITR) a plasmidu nesoucího AAV enkapsidační geny (rep a cap geny) do buněčné linie infikované lidským pomocným virem (například adenovirem). Použitelná buněčná linie je například linie 293. Připravené rekombinované AAV se pak čisti běžnými technikami.

Co se týče herpes virů a retrovirů, konstrukce rekombinovaných vektorů byla podrobně popsána v literatuře; viz. zejména Breakfield a další, New Biologist 3 (1991) 203; EP 453242, EP 178220, Bernstein a další, Genet. Eng. 7 (1985) 235; McCormick, BioTechnology 3 (1985) 689, a podobně. Zejména retroviry jsou integrativními viry selektivně infikující dělící se buňky. Proto tvoří vektory, které jsou zajímavé pro nádorové aplikace. Genom retrovirů obsahuje esenciálně dva LTR, enkapsidační sekvenci a tři kódující regiony (gag, pol a env) .

• 9

Μ

4 4

4

444 4 «4 44 • 4 4 4

4 4 4

4 444

4 4

44 ··

4 9

4 44

444 4

4

4» 44

V rekombinantu vektoru odvozeném od retrovirů jsou geny gag, pol a env obvykle vymazány, úplně nebo částečně, a nahrazeny heterologní sekvencí nukleových kyselin, která je zajímavá. Tyto vektory mohou být připraveny z různých typů retrovirů jako je zejména MoMuLV („myší Moloneyův virus leukémie; také nezývaný MoMLV), MSV („myší Moloneyův sarkomový virus), HaSV („Harveyův sarkomový virus) SNV („nekrózní virus sleziny); RSV („Rousův sarkomový virus) nebo Friendův virus.

Pro vytvoření defektního rekombinantu retrovirů obsahujícího nukleovou kyselinu terapeutického významu se připraví plasmid obsahující zejména LTR, enkapsidační sekvenci a jmenovanou nukleovou kyselinu, a potom se použije pro transfekci takzvaného enkapsidačního buněčného kmene, který je schopen poskytnout in trans retrovirovou funkci, která je defektní v plasmidu. Obecně jsou proto enkapsidační kmeny schopny exprese gag, pol a env genů (níže).

Obecně mohou být rekombinované části virů (obsahující zajímavou nukleovou kyselinu) a defektní části virů (neschopné autonomní replikace) uchovány v médiu podle předkládaného vynálezu. Obecně se části virů (adeno, AAV, retro a posobně) používají v čisté formě, a potom se uloží do méda podle předkládaného vynálezu, aby se uchovaly s výhodou ve zmrazené formě. Obvykle se 10⁴ až 10¹⁴ virových částic může uložit do 1 ml média podle předkládaného vynálezu ve sterilní nádobě. Výhodněji se použije 10⁵ až 1O¹⁰ částic na 1 ml média a výhodněji 10³ nebo 10⁹ částic.

Buněčné kmeny nazvané enkapsidační (nebo obalovací) kmeny, které byly uvedeny výše, jsou buněčné kmeny používané pro přípravu defektních rekombinačních virů in vitro nebo in vivo (po implantaci). Mohou být uvedeny například pomocí příkladů kmenů pro přípravu adenovirů, lidského zárodečného ledvinového kmene 293 (Graham a kol., J. Gen. Virol. 36 (1977) 59), které obsahují zejména, integrovány do jejich genomu, levou část φ φ

ΦΦ φφ φφ • φ φ φ • φ φ φ • · ΦΦΦ » φ φ · φφ φφ φ φ φ φ φ · φ φ φ φ ΦΦΦ φ φ φ φ φφ φφ

Φ

ΦΦΦ genomu Ag5 adenoviru (12 %) nebo kmeny schopné komplementace El a E4 funkcí popsaných zejména v aplikacích číslo WO 94/26914 a WO 95/02697. Také mohou být uvedeny enkapsidační kmeny, které byly popsány pro přípravu retrovirů nebo herpes virů a zejména kmen PA317 (US 4,861,719); kmen PsiCRIP (WO 90/02806) a kmen GP+envAm-12 (WO 89/07150) nebo buněčné kmeny odvozené od retrovirů produkujícího rekombinant jako je kmen Mil (WO 94/13824). Jak je ilustrováno v příkladech, médium podle předkládaného vynálezu je zejména upravené pro uchování buněk produkujících částice virů.

Jiným typem buněčného materiálu, který může být s výhodou uchován v médiu podle předkládaného vynálezu, jsou geneticky modifikované buňky. Geneticky modifikované buňky jsou buňky, určené zejména pro genovou terapii, do kterých se zavádí zajímavá sekvence nukleových kyselin. V průběhu několika minulých let se . počet takových buněk zvyšoval a mezi takové buňky patří například buňky hematopoetického kmene (WO 88/08450, WO 93/20195, WO 93/09815, WO 93/11230), buňky endotelu (WO 89/05345, WO 90/06757, WO 92/09222), myoblasty (WO 93/03768, WO 93/24151, WO 94/01129), fibroblasty (US 5,219,740, WO 89/02468, WO 93/07906), hepatocyty (WO 89/07136, WO 92/12242, WO 93/03142), astrocyty (WO 94/01135), neuroblasty (WO 94/10292, WO 94/16059), keratinocyty (WO 94/11011), makrofágy (FR 93/10222). Tyto buňky mají obvykle schopnost produkovat zajímavé terapeutické produkty a mohou být implantovány in vivo. Mezi ktrevní buňky patří například erythrocyty, neutrofilní, basofilní a eosinofilní granulocyty, B a T lymfocyty, zejména CD4 lymfocyty, cytotoxické lymfocyty (CD8 CTL), nádorové infiltrační lymfocyty (TIL) a LAK, monocyty a makrofágy, dendritické buňky, megakaryocyty a krevní destičky. Aby tyto buňky získaly nové terapeutické vlastnosti, mohou být také geneticky modifikované.

• »

00 ·» *· ···· · · · i ? · · · ···« ♦ « · · · · ♦·

0 ♦·· · · · ··· · ··· · *

000 0 000 ·* ·» ·· ·· *· ··

Médium podle předkládaného vynálezu muže být také použito pro uchování primárních buněčných kultur a nádorových buněk nebo biosepsí nádorů. Tento typ materiálů se běžně studuje při klinických testech imuniadoptivní léčby, při které se pacientovi odstraní nádor, léčí se jinými imunopotenciálními činidly (zavedení genetického materiálu vylučujícího lymfokiny nebo nádorové protilátky) a potom se znovu podává pacientovi. Jedním z obtížných kroků je uchování buněk vyjmutých z pacienta nebo modifikovaných před opětovnou infusí. Médium podle předkládaného vynálezu výhodně umožňuje dobré uchování těchto materiálů s vysokou životaschopností.

Použití média podle předkládaného vynálezu umožňuje uchovat tyto buňky a injektovat je přímo do organismu, bez kroku odstředění nebo promytí, s dobrou životaschopností a bez ovlivnění jejich schopnosti produkovat terapeutické proteiny nebo viry, pokud je to vhodné.

Vzhledem k tomuto se předkládaný vynález také týká prostředků obsahujících konzervační médium podle předkládaného vynálezu a biologický materiál, stejně jako způsobu skladování biologického materiálu. Jmenovaný biologický materiál může být uložen přímo v médiu podle předkládaného vynálezu. Pokud jde o buňky, s výhodou se před uložením do média podle předkládaného vynálezu uvolní z kultivačního média (například se odstředí, sklidí a promyji v pufrovacím roztoku). Pokud jde o proliferativní buňky, s výhodou se použijí při subkonfluenci, ve fázi exponenciálního růstu. Jak je uvedeno v příkladech, za těchto podmínek lze získat největší životaschopnost. Je však možné použít buňky při konfluenci nebo po konfluenci. Obvykle se do 1 ml média uloží 10⁵ až 10⁹ buněk, s výhodou 10⁵ až 10⁸. V případě adherentních buněk se buňky nejprve oddělí pomocí běžného postupu, suspendují a potom se uloží do média podle předkládaného vynálezu. Buňky se mohou oddělit pomocí ·· • 88 · 8 88 · • 88 8 · 88 8 |ι ··« 8 8 8 888

*..· ..* ·..* • 8 88 8 8 8 «

8 88

8 8 8

8 8 enzymatického zpracování (například trypsin), pomocí chemického zpracování (detergenty) nebo mechanicky. V případě chemického nebo enzymatického zpracování se buňky potom před zmrazením odstředí a promyjí, aby se odstranil enzym nebo detergent. Obvykle se životaschopnost a sterilita buněk kontroluje před zmrazením. Pokud jde o viry, předem se čistí tak, jak je uvedeno výše (například odstředění na gradientu chloridu česného, chromatografie a podobně). Mohou se uložit v množství 10⁴ až 10¹⁴ částic na mililitr, s výhodou 10^s až IO¹⁰ částic na mililitr. Biologický materiál může být potom skladován v médiu podle předkládaného vynálezu ve vhodné nádobě. Může to být ampule, zkumavka, zejména kryozkumavka, sáček, viálka, lahvička· a podobně. Nádoba se předem sterilizuje a balení se provádí za sterilních podmínek.

Médium podle předkládaného vynálezu umožňuje zmrazení a rozmražení biologického materiálu za podmínek vysoké životaschopnosti. Média podle předkládaného vynálezu zejména umožňují zmrazení biologického materiálu při teplotě -200 až -4 °C. Materiál může být uchován zejména v kapalném dusíku nebo při vyšších teplotách po dobu, která je dostatečné dlouhá pro zajištění uchování průmyslových látek (například do jednoho roku). Procentuální množství rozmražení je definováno jako celkovým počtem buněk životaschopnost v médiu s výhodou vyšší než 50 %. S výhodou je tato procentuální hodnota vyšší než 60 %. Nejvýhodněji je tato procentuální hodnota vyšší než 70 %.

životaschopných buněk po počet živých buněk dělený násobeno stem. Tato podle předkládaného procentuální vynálezu je

Další výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé po přečtení následujících příkladů, které jsou pouze ilustrativní a vynález neomezuj i.

i ► · • · · • »·· • · <

i to ·· ··· · 4

Příklady provedení vynálezu

Latky a způsoby

Test životaschopnosti buněk

Životaschopnost buněk se určí pomocí techniky trypanová modři. Trypanová modř je barvivo, které' proniká pouze do mrtvých buněk. Pokud se pozoruje velmi pravidelná sít Malassezových buněk nebo Ková sklíčka, buňky, které jsou v malých čtvercích sítě jako celek jsou obsaženy ve velmi přesném objemu: 1 μΐ. Toto jsou buňky, které se sečtou při dodržení následujících pravidel:

- Buňky, které jsou na vnější hranici sítě se sečtou pouze tehdy, když jsou na horní a levé hraně (zelené) nebo na dolní a pravé hraně (červené);

- Aby bylo sečtení platné, sečtou se dvě sčítací komory a vypočítá se průměr.

Počet mrtvých buněk odpovídá počtu modrých buněk. Počet životaschopných buněk odpovídá počtu lámavých bílých buněk. Životaschopnost je vyjádřena poměrem počtu životaschopných buněk ku počtu životaschopných buněk plus mrtvých buněk.

Samozřejmě se pro sčítání nebo stanovení buněk mohou použít jiné techniky.

Použité buňky

Buňky použité v příkladech jsou geneticky modifikované fibroblasty schopné produkovat částice virů. Přesněji je to kmen Mil od Collection Nationale de Culture de Microorganismes, pod číslem 1-1278. Tento kmen je odvozen od PsiCRIP buněk.

•

4 4 4 4 • • 44 · • 4 ·· • 4 · 4 • 4 4 4

4 ·44 • 4 · ··

4 »

4

444 4

4 • 4 • 4 •

Ekvivalentními buňkami jsou 89/07150). Rozumí se, že aplikovatelné na jiné buňky, jsou to primární kultury nebo například buňky kmene Aml2 (WO popsané postupy jsou přímo zejména lidského původu, pokud uznávané kmeny.

Albumin

Albumin používaný v příkladech je dostupný od společnosti Armour pod názvem Albumin A nebo lidský plazmový Albumin 20 %. Rozumí se, že se může použít jakýkoli jiný zdroj albuminu.

Plasmion

Plasmion je komerčního původu (Roger Bellon, Francie).

Příklad 1: Postup pro zmrazení biologického materiálu

Pro zmrazení buněk se s výhodou používají subkonfluentní buňky v exponenciálním stádiu růstu. Aby se zlepšila kontrola biologického materiálu, rozdělení a mrazení buněčné suspenze v kryozkumavkách po přivedení do kontaktu s mrazícím médiem podle předkládaného vynálezu, mrazení se provádí tak rychle, jak je to jen možné.

Manipulace se provádí za sterilních podmínek (například v komoře s laminárním prouděním).

Tento příklad podrobněji popisuje způsob mrazení buněk (geneticky modifikovaných buněk, krevních buněk, buněk produkujících viry a podobně) . Rozumí se, že způsob může být odborníkem v této oblasti upraven pro mrazení virů nebo jiného materiálu.

Kultivační nádoba obsahující buňky, které mají být zmrazený, se vyjme z inkubátoru a umístí se pod mikroskop, aby se mohl kontrolovat vzhled kultury. Jestliže má jedna nebo více nádob nevyhovující vzhled (oddělené buňky, konfluentní buňky, mlhavá a podobně), nepoužije komory s laminárním • · · · • · · · • · ··· · • · · ·· ·· kultura, nelámavé buňky, poškozená nádoba se k mrazení:

Vyhovující nádoby se potom umístí do prouděním. Pokud jsou buňky přilnavé, upraví se tak, aby se agregáty oddělily a/nebo rozpustily. Pro tento účel je možné použít tripsin nebo jakékoli jiné disociační médium (detergent a podobně). Suspenze buněk se potom umístí do sterilní nádoby a opatrně se homogenizuje pomocí pipetování. Kvůli sečtení se oddělí alikvotní díl 1 ml. Pokud je životaschopnost kultury nižší než 80 %, buněčná suspenze se vyřadí.

Suspenze se potom rovnoměrně rozdělí (například pomocí pipety)' do stejných odstředbvacích zkumavek a odstředůje se 10 minut při 400 g.

Nádoby pro mrazení a nádoba s mrazícím médiem se za použití alkoholu přenesou do komory. Do sterilní nádoby se umístí objem mrazícího média potřebný pro získání koncentrace 10⁷ životaschopných buněk na ml.

Po odstředění se odstraní supernatant, a potom se pelety umístí do alikvotů studeného mrazícího média. Suspenze se homogenizuje a převede se do nádoby obsahující mrazící médium a znovu se homogenizuje. Odebere se vzorek a testuje se jeho sterilita.

Buněčná suspenze se potom rozdělí do kryozkumavek, které se potom okamžitě umístí za použití alkoholu do nádoby pro mrazení. Nádoby se udržují 1 hodinu při +4 °C, a potom se umístí do komory o teplotě -80 °C na nejméně 12 hodin, s výhodou na 24 hodin. Nejméně 24 hodin po mrazení se ampule vyjmou z nádob s alkoholem a skladují se v nádobách s kapalným dusíkem.

• · • ·· · · ·· · · · · • · · · ···· ftftftft ft · ftftft ftft · ftftft · ··· · · ~ · · ··· · ··· ·· ·· ·♦ ·· ·· ·*

Příklad 2: Postup pro rozmražení biologického materiálu

A. Použité látky

- Trypanová modř

- Sterilní fosfátový pufr (PBS), pH 7,2

- Ethanol 70%

- Kultivační médium

- Fetální telecí sérum (FCS)

- Sterilní nádoba s vodou o teplotě 37 °C ± 0,5 °C (50 až'

200 ml)

B. Postup

Mrazení se s výhodou provádí za sterilních podmínek, například v bezpečné komoře.

Do 50 ml sterilní zkumavky se připraví objem kultivačního média při 20% FCS odpovídajícím 9/10 objemu dávky (ampule), která má být rozmražena (rozmrazovací médium). V případě 1 ml ampule se tedy připraví 7 ml kultivačního média plus 2 ml FCS.

Ampule, která má být rozmražena, se ponoří (ne úplně) do nádoby se sterilní vodou při teplotě asi 37 °C a lehce se míchá dokud úplně nezmizí led. Ampule se rychle otře 70% ethanolem.

Z ampule se odpipetuje obsah a převede se do zkumavky obsahující rozmrazovací médium a potom se (bez výměny pipety) znovu nasaje stejný objem a ampule se jednou vypláchne. Suspenze se opatrně homogenizuje a do sterilní zkumavky se odebere 1 ml a spočítá se. V závislosti na výsledku sčítání se buněčná suspenze převede do kultivační nádoby, zředí se množstvím rozmrazovacího média, které je nutné pro získání • · původní buněčné koncentrace mezi 2,0 a 3,0 χ 10⁵ životaschopných buněk na mililitr kultivačního média.

Aby se mohla kontrolovat životaschopnost buněk po rozmražení v průběhu času, kultivační nádoba se potom umístí do CO₂inkubátoru při 37 °C ± 0,5 °C; nebo, v případě média pufrovaného HEPES, do vytopené komory při 37 °C ± 0,5 °C.

V případě terapeutických aplikací se pro testování životaschopnosti buněk a sterility použije pouze jeden alikvotní díl obsahu ampule. Jestliže je vyhovující, obsah rozmražené ampule se může potom přímo injektovat.

Příklad 3: Testování procentuální životaschopnosti po zmrazení a rozmražení buněk produkujících retrovirus v různých médiích podle předkládaného vynálezu

Buňky použité v tomto příkladu jsou rekombinanty retrovirů produkujících buňky kmene Mil. Buňky se použijí v exponenciálním stádiu růstu. Buňky se zmrazí podle obvyklého postupu popsaného v příkladu 1. Pro tento účel se buňky oddělí z misky pomocí disociačního média (lxPBS: 0,02 % EDTA): 3 ml na T75 misku; 5 ml na TI60 nebo T2 2 5 misku. Buňky se inkubuj i 5 minut v tomto médiu za opatrného míchání a potom se odeberou do zkumavky Falcon. Pro spočítání buněk se použije alikvotní díl. Suspenze se potom odstřeďuje 5 minut při 1000 otáčkách za minutu při 20 °C. Buňky se potom rozdělí do mrazících ampulí obsahujících 1 ml média podle předkládaného vynálezu v poměru Různá testovaná média jsou popsána níže

Ampule se zmrazí podle postupu popsaného Ve stanoveném dni se ampule rozmrazí podle postupu popsaného v příkladu 2 a buněčná suspenze se převede do kultivační nádoby při 37 °C, 5% CO₂. Životaschopnost buněk se určí tak, jak je popsáno v látkách a způsobech. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulkách 4 až 10. Jasně ukazují

10⁷ buněk na ml (tabulka 3) . v příkladu 1 vysokou procentuální životaschopnost v přítomnosti média podle předkládaného vynálezu. Pro určitá média podle předkládaného vynálezu je tedy více než 70 % buněk životaschopných. Obecně je životaschopnost buněk vždy vyšší než 50 %. Je třeba poznamenat, že žádná jednotlivá složka média podle předkládaného vynálezu neumožňuje získat stabilitu vyšší než 25 %.

Kontrola životaschopnosti a oživení kultury se prováděla na dávkách po 7 měsíčním zmrazení. 4 ampule buněk zmrazených v roztoku Plasmionu 67%/HSA 33% (viz příklad 1) se tedy rozmrazí po 7 měsících zmrazení podle postupu popsaného v příkladu 2. 4 ampule se kultivují v 75ml nádobě. Určí se životaschopnost a oživení v kultuře a výsledky jsou uvedeny v tabulce 11.

Tyto výsledky ukazují vysokou procentuální životaschopnost a dobré oživení buněk v kultuře. Buňky vykazují normální přilnavost a normální lámavý vzhled. Přechody Pl a P2 (175 ml) se provádí za normálních kultivačních podmínek.

Příklad 4: Zlepšení oživení v kultuře

Aby se mohlo testovat oživení v kultuře buněk zpracovaných podle předkládaného vynálezu, testy se prováděly na různých médiích doplněných stabilizačními činidly a zejména různými koncentracemi glycerolu.

4.1. Příprava média:

„Lakuna se připraví podle postupu popsaného výše a potom se přidá další glycerol v koncentracích uvedených v tabulce níže, nebo, u kontrolního testu, DMSO. Stručně jsou tedy na objem 10 ml mrazícího média při 67 % plasmionu, 33 % HSA a 2,5 % glycerolu objemové koncentrace složek následující:

HSA/Plasmion médium: 9,75 ml • · • ·· · · · · · · · · · • · ··· · · · ··· · ··· · • · · · · · · ·

......*.....

Glycerol: 0,25 ml nebo 0,321 g glycerolu ml HSA/Plasmion -» 6,7 ml plasmionu

9,75 ml HSA/Plasmion médium —» 6,53 ml plasmionu ml HSA/Plasmion médium —> 3,3 ml HSA

9,75 ml HSA/Plasmion médium —» 3,21 ml HSA

Tabulka 12: Prostředky doplněného média

Médium :10 ml	PLASMION	HSA	DMSO	GLYCEROL
	(ml)	(ml)	(ml)	(ml)
HP+5% DMSO	6,3	3,13	0,5
HP+2,5% DMSO	6,53	3,21	0,25
HP+1% DMSO	6,63	3,26	0,1
HP+10% GLYCEROL	6,03	2,97		1(1,25 g)
HP+5% GLYCEROL	6,3	3,13		0,5 (0,625 g)
HP+2,5% GLYCEROL	6,53	3,21		0,25 (0,321 g)
HP+1% GLYCEROL	6,63	3,26		0,1 (0,125 g)

4.2. Testování životaschopnosti buněk

Zmrazení se provádělo za podmínek popsaných v příkladu 1.

Výsledky získané po rozmražení po 7 dnech jsou uvedeny v tabulce 13. Ukazují, že v přítomnosti glycerolu v množství menším než 5 % je pozorovaná střední životaschpnost buněk po rozmražení vyšší než 70 %. Zejména v přítomnosti 1 % glycerolu byla pozorována střední životaschopnost buněk 84 %.

4.3. Testování oživení v kultuře

Oživení v kultuře je proměnná charakterizující stav proliferativních buněk po rozmražení. V tomto příkladě se odhaduje pomocí času, který buňky potřebují pro dosažení konfluence. Aby se určil tento parametr, po rozmražení se koncentrace buněk upraví na 2,5xl0⁵ až 3,5xlO^s buněk/ml, potom se buňky udržují v kultuře. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulce 14. Ukazují, že oživení v kultuře probíhá mnohem rychleji, pokud byly buňky zmrazený v médiu doplněném o glycerol (3,5 až 4 dny) , potom* v médiu bez glycerolu (4 až 5 dní). Tyto výsledky také ukazují, že stabilizační činidlo pro buňky se s výhodou zavádí v množství 0,5 až 2,5 %.

Příklad 5: Programované zmrazovaci testy

Programované zmrazovaci testy se provádí proto, aby se zjistilo, jestli lepší parametry kontroly mrazení mohou mít vliv na kvalitu biologického materiálu. Zejména se testoval postup mrazení, který umožňuje zabránění superfúzi média. Tiby se tohoto dosáhlo, prováděly se mrazící testy za pomoci mrazícího zařízení na kapalný dusík Kryosave planar od firmy Flobio ve srovnání s mrazícími testy za použití alkoholu (isopropanolu) podle příkladu 1. Mrazení se provádělo v mrazícím médiu při 67 % plasmionu, 33 % HSA a 2,5 % nebo 1 % glycerolu. Výhodou tohoto systému je dosažení rychlého zmrazení buněk (nebo materiálu) a kontrolovaný pokles teploty buněk a média, což umožňuje zabránit teplotě tání jakéhokoli zmrazeného média. Proto se teplota tání určí před pozorováním, během mrazení za použití alkoholu, její poloha vzhledem k teplotě a času. V tomto příkladu se teplota snížila na -40 °C během 10 minut z -8 °C, protože teplota tání pro použitý materiál při ·· ·♦ ·· ·· ·· *·

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 ··· • 9 9 99 9 9 9 999 9 99 9 · 9

9 9 9 9 9 9 9 9 této hladině a médiu vzrůstala k 0 °C. Po 7 dnech mrazení se určila životaschopnost buněk a oživení v kultuře po 24 hodinách. Získané výsledky jsou uvedeny v tabulkách 15 a 16.

Tyto výsledky jasně ukazují vysokou životaschopnost buněk ve všech mrazících schématech a médiích, které byly ve vynálezu testovány. Dále ukazují dobré oživení buněk v kultuře, zejména pro médium obsahující 1 % glycerolu. V tomto případě se po 24 hodinách po rozmražení pozoroval výtěžek vyšší než 70 %. Dále v případě kontrolovaného programovaného mrazení (Kryosave) byly pozorované vrstvy buněk po 24 hodinách dobré a objevil se velmi omezený počet mrtvých buněk.

Tabulka 3: Složeni a prostředky média

Médium	20% roztok HSA	Plasmion	g/i HSA	g/i Želatina	H/G Hmotn. poměr	Prostře- dek (10 ml)
10H/90P	10 % obj	90 % obj	20	27	0,740	1 ml HSA 9 ml P
20H/80P	20 % obj	80 % obj	40	27	1,666	2 ml HSA 8 ml P
30H/70P	30 % obj	70 % obj	60	21	2,857	3 ml HSA 7 ml P
40H/60P	40 % obj	60 % obj	80	18	4,444	4 ml HSA 6 ml P
50H/50P	50 % obj	50 % obj	100	15	6,666	5 ml HSA 5 ml P
60H/40P	60 % obj	40 % obj	120	12	10	6 ml HSA 4 ml P
70H/30P	70 % obj	30 % obj	140	9	15,555	7 ml HSA 3 ml P
80H/20P	80 % obj	20 % obj	160	6	26,666	8 ml HSA 2 ml P
90H/10P	90 % obj	10 % obj	180	3	60	9 ml HSA 1 ml P

·· ·· ·· ·· • · · · · · · · • 9 · · 9 9 9 9 • 9 9 99 9 · 9 999 • · 9 · · ·

9· 99 99 ··

9 9 ·

9 9 9

99

Tabulka 4: Pokus #1 - Rozmražení po 5 dnech

Mrazící médium	% života- schopnosti Po rozmražení	Počet buněk na ampuli (*10⁷)	Kultivace
67H/33P	50,8	0,975	Ano
50H/50P	63,2	0,51	Ano
33H/67P	71,4	0,42	Ano
H/P + Glycin 5 %	49,4	0,51	Ano
H/P + Glycin 1%	54,8	0,54	Ano

Tabulka 5: Pokus #1 - Rozmražení po 6 dnech

Mrazící médium	% života- schopnosti po rozmražení	Počet buněk na ampuli (*10⁷)	Kultivace
67H/33P	76,2	0,69	Ano
50H/50P	65,9	0,69	Ano
33H/67P	55,1	0,76	Ano
H/P + Glycin 5 %	63,2	0,21	Ano
H/P + Glycin 1 %	55,6	0,25	Ano

• · • · · * · · • · • ·

99 ···

99 ·9 99

9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 99

9 9999 9999 ·

9 9 9 9 9

99 99 99

Tabulka 6: Pokus #2 - Rozmražení po XX dnech

Mrazící médium	% života- schopnosti PO rozmražení	Počet ampuli	buněk (*10⁶)	na	Kultivace
67H/33P	55,2	10,4			ano
	43,2	13,2			ano
50H/50P	60,9	28,8			ano
	63,7	26			ano
	70,5	12,1			ano
	71,7	9			ano
33H/67P	73,5	12,8			ano
	82	8,55			ano

00

0 0 0 * ·· ·

0 000

0 0 • 0

• · ·

Φ *00

Tabulka 7: Pokus #3 - Rozmražení po 5 dnech

Mrazící médium	% života- schopnosti PO rozmražení	Počet na (*10⁷)	buněk ampuli	Kultivace
10H/90P	nd	nd	nd
20H/80P	53,4	1,10	ano
30H/70P	54,4	0,86	ano
40H/60P	53,5	1,29	ano
50H/50P	4 6,3	1,00	ano
60H/40P	48	1,13	ano
70H/30P	nd	nd	nd
80H/20P	59,2	1,14	ano
90H/20P	61,7	0,90	ano

··' toto toto toto toto toto • · > · ···· ···· • ••to ···· · · ·· • · ··· ·· · ··· to to·· · · • · · ·· · ··· ·· toto ·· ·· ·· ♦·

Tabulka 8: Pokus #3 - Rozmražení po 13 dnech

Mrazící médium	% života- schopnosti po rozmražení	Počet na (*10⁷)	buněk ampuli	Kultivace
10H/90P	49,2	0,94	ano
20H/80P	54,5	1,12	ano
30H/70P	nd	nd	nd
40H/60P	50,6	1,20	ano
50H/50P	58	0,73	ano
60H/40P	49,4	1,20	ano
7ΌΗ/30Ρ	54,8	0,90	ano
80H/20P	64,7	0,99	ano
90H/20P	50	0,79	ano

φ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φ φ

φ φφφ φ φ φφ φφ φ

φ φ

φ φφ φ · φ φ φφφ φ φφ φφ φφ φ φ « φ φ φ φφ φ φφφφ φ φ · φ φφ φφ φ

Tabulka 9: Pokus #4 - Rozmražení po 8 dnech

Mrazící médium	% života- schopnosti po rozmražení	Počet na (*10⁷)	buněk ampuli	Kultivace
50H/50P	61,8	0,83	ano
30H/70P	68	0,75	ano
70H/30P	59,2	0,74	ano
100P	21,9	0,96	ne

Tabulka 10: Pokus #4 - Rozmražení po 19 dnech

Mrazící médium	% života- schopnosti Po rozmražení	Počet buněk na ampuli (*10⁷)	Kultivace
50H/50P	77,3	0,66	ano
30H/70P	61,2	0,735	ano
70H/30P	62,7	0,85	ano
100P	6,5	0,69	ne

A

AA

A · · • A A • · • A

A A

AAA • A

AA AA AA AA • A A A A A A

AAt A A AA A AAAA AAAA A A A AAA

AA AA AA AA

• 4 »4

4 4 4 • 4 4 · • 4 444 »4 4

44 «4 44 44 44

44 4 4 4 4 4

4*44 4 4 4*

4 444 · ··· 4 ·

4 4 ·4·

44 44 44

Tabulka 13: Média doplněná glycerolem

	VI	V2	V3	Střední životaschopnost
HP+10% Glycerol	41%	50%	48,5%	46,5%
HP+5% Glycerol	70%	70%	64%	68%
HP+2,5% Glycerol	80,5%	80%	79%	79,8%
HP+1% Glycerol	84%	82%	87%	84%

HP	78%	75%	73%	75%

HP+5% DMSO	81%	91%	93%	88%
HP+2,5% DMSO	94%	89%	92%	91%
HP+1% DMSO	93%	92%	89%	91%

Tabulka 14: Testování oživení v kultuře

	Konfluence 1 7 5 cm²	Konfluence 2 7 5 cm²	Konfluence 3 25 cm²
HP+10% Glycerol	žádná	žádná	žádná
	subkultivace	subkultivace	subkultivace
HP + 5% Glycerol	4	4	3,5
HP + 2,5% Glycerol	4	4	3,5
HP + 1% Glycerol	4	4	3,5

HP	5	5	4

«· · · * · · · *· • · · · · * · · · * · « ···· ♦ ♦ · · · * ·* • · ··· · · · ♦*· · ··· · « » · ··· Φ · · I ·· ·· ·* »· ·♦ ·*

Tabulka 15: Programované mrazící testy v médiu HP + 1% glycerol

Λ!

Φ

>Μ

λ; φ >Ν >φ

>Φ U

οΥ³

«Υ>

ό\ο

(Χ>

0*5

οΥ³

αΥ³

Ω

ο γΩ

ΙΩ ΙΩ

ο ΙΩ

4J

¢5

Ο

CN

>

Γ

Ι>

Λ

•rl

•

Ν

Λ

β

LD

Ή

φ

ν>

Ιί>

<0

Ο

Ν

ft

Ο

ο

Ο

ι—Ι

'Φ

03

ι—

ι—1

ι—Ι

X

Ρ

ΙΟ

Γ»

Γ>

ρ

X

LQ

Φ

Ο

Μ>

Ο

4J

03

05

ΓΝ

'Φ >

Λ

rd

Ο

rd

μ

SUS

X ΙΩ 05

32χ

3x1

12χ

a

>

Ω

ΓΩ

ΙΩ

Μ

-

-X

a

>

rd

ΓΩ

γ^-1

Λ ο

Λ

τ)

'tú

'Φ

η

β

>

Ο

γ*

Ο

rt

ι—1

Ο

rd

Λ

1-1

0 Μ

Ρ r—1

X

X ΓΩ

Η X

X ΙΩ

ε

•rl

Λ

ο

Ο

05

'Φ

ρ-

0)

>n

X

χ.

►

Ο

L0

υ

Ρ<

<Ν

(Ν

ι—

CN

rd

Φ

ι—1

rd

ι—1

ι—Ι

X

β

X

rd

ΙΩ

(Ν

0

6ι

•rl

ι>

ΓΩ

σ\

Ο

>Μ

-

π

rd

ι—1

rd

ο\ο

Λ

33

0

LT>

Γ* Ο

γ- Ο

ρ· Ο

ρ> Ο

□

Π3

X»

s

Λ

(—1

Η

rd

>

<Ν

φ

υ

X

λ:

'b

<Ν

Ω

00

γ—1

•Η >Ν

4J

+

Η Φ

> •Η

Ω

ΓΩ

(Ν

05

> ο

ο

ρ» ο

r—1 3

a

ο

>Ν

ΓΩ

ΙΩ

CN

β

t—1

rd

ι—Ι

λ:

a

φ

X

34

σ>

rd

ΓΩ

ι—Ι

I^-1 φ Ο

Λ

t—f CN

ΟΟ rd

Ω CN

(Ν

>μ a

•ΓΗ Ό

ι—1 €

IŮ Ο

VO Ο

'ο

ιη Ο

'0

Λ!

χ

>1

ε

υ

>Φ

(Ν

Ώ

X

α

Ρ

Ω

ι—1

•Η

0 W

Ρ Λ

rd

ι—Ι

Η

05

g

ιη Ο

ια

Ο

ω

•

34

ι—1

rd

Ή

•U

υ

>φ

X

ο

X

Ο

ε

W

β

γω

rd

ι—1

<υ

0

β

-

X

X.

X

4J

-U

W

Λ

ω

00

<υ

1

03

Μ

rt

ο

ω

4J

Ρ

υ

0

&

QJ

Ή

>

Λ

οΥ>

οΥ³

θΥ5

ύΡ

Ν <ΰ

•rl

υ

Ω

(Ν

00

05

ι

4J η

β

>Ν

03

00

ΟΟ

<0

φ

ο

a

4J

β

οΥ»

ε

0

β.

ιη

Π3

>

Λ

οΥ³

οΥ»

οΡ

Ό

Η

ϋ

C0

ο

ΓΩ

ι—1

r*d £

β Ρ

>Ν

03

00

ι>

00

xi

>

ϋ

0

ω

ε

χη

(0

rd

CN

>

ε

ίθ

a

Η

(Ν

0

β

ε

r—1

ι—1

rd

rt

(Ν

rt

>1

a

rd

0

CN

0

Λ

(¾

β

φ

0

1)

0

>β

Φ

rt

Φ

rt

>

β

>

Li

··

>

ο.

>

ft

rt

&

rt

ft

β

νο

rt

υ

rt

0

ω

Ο

ω

0

Λ

γΗ

ω

β

ω

β

0

ω

0

ω

0

a

0

a

-Η

Κ*Ί μ

•Η

ιϋ

υ ω

►>Ί Μ

0 ω

ο

£

Λί

Η

η

r—1

o

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

Médium pro uchování a/nebo zmrazení biologického materiálu vyznačující se tím, že obsahuje solný roztok, modifikovanou kapalnou želatinu a lidský sérový albumin.
2 . Médium podle nároku lvyznačující se tím, že solný roztok je isotonický s plasmou.
3. Médium podle nároku 2vyznačující se tím, že solný roztok obsahuje chlorid sodný, chlorid draselný, chlorid hořečnatý a laktát sodný.
4. Médium podle nároku 3vyznačující se tím, že solná roztok obsahuje 2 až 5 g/1 chloridu sodného, 0,05 až 0,5 g/1 chloridu draselného, 0,5 až 0,2 g/1 chloridu hořečnatého a 0,5 až 4 g/1 laktátu sodného.

Médium podle nároku 2vyznačující se tím. solný roztok obsahuje chlorid sodný, chlorid draselný chlorid vápenatý a laktát sodný.

ze

Médium podle nároku 5vyznačující se solným roztokem je Ringerův laktát.

tím, že
7. Médium podle nároku lvyznačující se tím, že modifikovaná kapalná želatina je chemicky modifikovaný produkt hydrolýzy kolagenu vhodný pro farmaceutické použití.
8. Médium podle nároku 7vyznačující se tím, že modifikovaná kapalná želatina má střední molární hmotnost mezi 10 kD a 100 kD a výhodněji mezi 15 kD a 40 kD.
9. Médium podle nároku 8vyznačující se tím, že produkt hydrolýzy je modifikován reakcí s anhydridem • ft • ft ftft ·· ·* ·· ftftft ft··· ftftftft ·· · · · · · ft ftftft • ftftft ftft · ftftft · ftftft · ft • ft ftft · ftftft • ft ft· ftft ·· ftft kyseliny jantarové, anhydridem kyseliny citrakonové, anhydridem kyseliny itakonové, anhydridem kyseliny akonitové nebo anhydridem kyseliny maleinové.
10. Médium pro zmrazování a/nebo uchování biologického materiálu vyznačující se tím, že obsahuje plasmion a lidský sérový albumin.
11. Médium podle kteréhokoli z nároků 1 až 10 vyznačující se tím, že lidský sérový albumin je plasmatického původu.
12. Médium podle kteréhokoli z předcházejících nároků 1 až 11 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr' lidský sérový albumin/želatina se pohybuje mezi 0,5 až 100.
13 . Médium podle nároku 12 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr lidský sérový albumin/želatina se pohybuje mezi 0,74 až 60.
14. Médium podle nároku 12 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr lidský sérový albumin/želatina je roven 0,74, 1,66, 3,3, 6,66, 13,4, 26,66 nebo 60.
15. Médium podle kteréhokoli z předcházejících nároků 1 až 14 vyznačující se tím, že dále obsahuje 0,5 až 5 % hmotnostních biokompatibilního buněčného stabilizačního činidla s výhodou vybraného ze skupiny, kterou tvoří glycin, glycerol, sacharóza a glukóza.
16. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje populaci geneticky modifikovaných buněk a médium podle kteréhokoli z nároků 1 až 15.
17. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje populaci krevních buněk a médium podle kteréhokoli z nároků 1 až 15.

ΦΦ «φ φ« φφ ·* φφ • · · · · · φ φ φ · φ · liti ΦΦΦΦ ΦΦΦΦ • φ Φφφ · · · φφφ · ·»*φ φ

4 4 4 9 9 « Φ · ·

ΦΦ Φ· ΦΦ ΦΦ ΦΦ ΦΦ
18. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje krevní destičky a médium podle kteréhokoli z nároků 1 až 15 .

19 . Prostředek v y znač u j í c í s e tím, že obsahuje populaci buněk kostní dřeně a médium podle kteréhokoli z nároků 1 až 15. 20 . Prostředek v y znač u j í c í s e tím, že obsahuje

částice virů a médium podle kteréhokoli z nároků 1 až 15.
21. Prostředek podle nároku 20 vyznačující se tím, že virové částice jsou defektní rekombinanty virových částic.
22. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje populaci buněk produkujících virové částice a médium podle kteréhokoli z nároků 1 až 15.
23. Médium podle kteréhokoli z nároků 1 až 15 vyznačující se tím, že může být injektováno do organismu.
24. Prostředek, který může být použit pro podávání biologického materiálu, 1 až 15 vyznačující se tím, že obsahuje jmenovaný biologický materiál, plasmion a lidský sérový albumin.
25. Způsob pro skladování biologického materiálu vyznačující se tím, že jmenovaný biologický materiál je vystaven médiu podle nároku 1.
26. Způsob podle nároku 25 vyznačující se tím, že jmenovaný biologický materiál je vystaven plasmionu a lidskému sérovému albuminu.
27. Způsob podle nároku 25 a 26 vyznačující se tím, že se prostředek vzniklý kombinací složek zmrazí.

4-4 ·· ·· ·· ·· ··

4 4 4 4 · · · · 4 4 4 ·

4 4 4 4 · · · 4 4 4 ··

4 4 444 4 4 4 444 4 4 4 4 4 4

44 444 · 4··

44 44 44 44 44 44
28. Způsob podle nároku 27 vyznačující se tím, že procentuální obsah životaschopných buněk po zmrazení a rozmražení je vyšší nebo roven 50 %.
29. Způsob podle nároku 28 vyznačující se tím, že procentuální obsah životaschopných buněk po zmrazení a rozmražení je vyšší nebo roven 60 %.
30. Způsob podle nároku 29 vyznačující se tím, že procentuální obsah životaschopných buněk po zmrazení a rozmražení je vyšší nebo roven 70 %.