CZ274699A3 - Preparation containing "hedgehog" protein - Google Patents
Preparation containing "hedgehog" protein Download PDFInfo
- Publication number
- CZ274699A3 CZ274699A3 CZ19992746A CZ274699A CZ274699A3 CZ 274699 A3 CZ274699 A3 CZ 274699A3 CZ 19992746 A CZ19992746 A CZ 19992746A CZ 274699 A CZ274699 A CZ 274699A CZ 274699 A3 CZ274699 A3 CZ 274699A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- composition
- ions
- hedgehog protein
- hedgehog
- protein
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title abstract description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title abstract description 14
- 241000289669 Erinaceus europaeus Species 0.000 title abstract description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 49
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims abstract description 15
- -1 anionic saccharide Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 10
- 229920000858 Cyclodextrin Polymers 0.000 claims abstract description 8
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims abstract description 8
- HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N schardinger α-dextrin Chemical compound O1C(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC(C(O)C2O)C(CO)OC2OC(C(C2O)O)C(CO)OC2OC2C(O)C(O)C1OC2CO HFHDHCJBZVLPGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 6
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N Calcium cation Chemical compound [Ca+2] BHPQYMZQTOCNFJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 5
- 102000003693 Hedgehog Proteins Human genes 0.000 claims description 69
- 108090000031 Hedgehog Proteins Proteins 0.000 claims description 69
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 14
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 8
- 229910021653 sulphate ion Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 4
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-O argininium(1+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCCC([NH3+])C([O-])=O ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 3
- 239000012052 hydrophilic carrier Substances 0.000 claims description 3
- COWYTPMAAISPHT-SWSWVKNJSA-A chembl411368 Chemical compound [K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].[K+].O1C(COS([O-])(=O)=O)[C@@H]2C(O)C(OS([O-])(=O)=O)[C@@H]1O[C@H](C(COS([O-])(=O)=O)O1)C(O)C(OS([O-])(=O)=O)[C@H]1O[C@H](C(COS([O-])(=O)=O)O1)C(O)C(OS([O-])(=O)=O)[C@H]1O[C@H](C(COS([O-])(=O)=O)O1)C(O)C(OS([O-])(=O)=O)[C@H]1O[C@H](C(COS([O-])(=O)=O)O1)C(O)C(OS([O-])(=O)=O)[C@H]1O[C@H](C(COS([O-])(=O)=O)O1)C(O)C(OS([O-])(=O)=O)[C@H]1O[C@H](C(COS([O-])(=O)=O)O1)C(O)C(OS([O-])(=O)=O)[C@H]1O2 COWYTPMAAISPHT-SWSWVKNJSA-A 0.000 claims 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims 1
- 230000000979 retarding effect Effects 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 12
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 7
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 7
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 7
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 6
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 6
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 5
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 5
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 5
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- LOFGQZYYARWABM-BYPYZUCNSA-N (2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl chloride Chemical compound ClC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N LOFGQZYYARWABM-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M sodium;2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid;hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+].OCCN1CCN(CCS(O)(=O)=O)CC1 ZNJHFNUEQDVFCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 4
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 3
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 3
- 229920001287 Chondroitin sulfate Polymers 0.000 description 2
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 2
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000616465 Homo sapiens Sonic hedgehog protein Proteins 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 210000003321 cartilage cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 2
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 2
- 102000044728 human SHH Human genes 0.000 description 2
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000003055 low molecular weight heparin Substances 0.000 description 2
- 229940127215 low-molecular weight heparin Drugs 0.000 description 2
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 2
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N palmitic acid group Chemical group C(CCCCCCCCCCCCCCC)(=O)O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004246 zinc acetate Substances 0.000 description 2
- NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L zinc sulfate Chemical compound [Zn+2].[O-]S([O-])(=O)=O NWONKYPBYAMBJT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960001763 zinc sulfate Drugs 0.000 description 2
- 229910000368 zinc sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-2-(trifluoromethoxy)pyridine Chemical compound FC(F)(F)OC1=CC=C(Br)C=N1 SQDAZGGFXASXDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000008940 Alkaline Phosphatase assay kit Methods 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 239000001116 FEMA 4028 Substances 0.000 description 1
- 241000027355 Ferocactus setispinus Species 0.000 description 1
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N Gly-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O BCCRXDTUTZHDEU-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N L-N-acetyl-Cysteine Chemical compound CC(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- AXDLCFOOGCNDST-UHFFFAOYSA-N N-methyl-DL-tyrosine Natural products CNC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 AXDLCFOOGCNDST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N Reactive blue 2 Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 1
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 1
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N acetic acid;zinc Chemical compound [Zn].CC(O)=O.CC(O)=O ZOIORXHNWRGPMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004308 acetylcysteine Drugs 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 229920001586 anionic polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 150000004836 anionic polysaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000002260 anti-inflammatory agent Substances 0.000 description 1
- 229940121363 anti-inflammatory agent Drugs 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000000468 autoproteolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N beta-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO WHGYBXFWUBPSRW-FOUAGVGXSA-N 0.000 description 1
- 235000011175 beta-cyclodextrine Nutrition 0.000 description 1
- 229960004853 betadex Drugs 0.000 description 1
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 238000007707 calorimetry Methods 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 1
- 230000022159 cartilage development Effects 0.000 description 1
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 1
- 229940059329 chondroitin sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 description 1
- 229940001468 citrate Drugs 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N monothioglycerol Chemical compound OCC(O)CS PJUIMOJAAPLTRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 230000000926 neurological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- LQNUZADURLCDLV-UHFFFAOYSA-N nitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=CC=C1 LQNUZADURLCDLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000004819 osteoinduction Effects 0.000 description 1
- 125000001312 palmitoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000004526 pharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 229940124531 pharmaceutical excipient Drugs 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920002704 polyhistidine Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940068965 polysorbates Drugs 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N suramin Chemical compound OS(=O)(=O)C1=CC(S(O)(=O)=O)=C2C(NC(=O)C3=CC=C(C(=C3)NC(=O)C=3C=C(NC(=O)NC=4C=C(C=CC=4)C(=O)NC=4C(=CC=C(C=4)C(=O)NC=4C5=C(C=C(C=C5C(=CC=4)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)S(O)(=O)=O)C)C=CC=3)C)=CC=C(S(O)(=O)=O)C2=C1 FIAFUQMPZJWCLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005314 suramin Drugs 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 1
- 229940035024 thioglycerol Drugs 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011686 zinc sulphate Substances 0.000 description 1
- 235000009529 zinc sulphate Nutrition 0.000 description 1
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Řešení se týká prostředku obsahujícího ?hedgehog" protein, který dále obsahujejako pomocná činidla ionty zinku, síranové ionty, ionty hořčíku, ionty vápníku, cyklodextrin, neiontové detergenční činidlo a/nebo aniontový sacharid, ktetyje stabilní při teplotě okolí.The present invention relates to a composition comprising a "hedgehog" protein, which further comprises zinc ions as auxiliaries, sulfate ions, magnesium ions, calcium ions, cyclodextrin, a nonionic detergent and / or anionic saccharide, is stable at ambient temperature.
Description
Prostředek obsahující hedgehog proteinA composition comprising a hedgehog protein
Oblast technikyTechnical field
Předkládaný vynález se týká prostředků, výhodně farmaceutických prostředků, obsahujících hedgehog proteiny a jejich použití.The present invention relates to compositions, preferably pharmaceutical compositions, containing hedgehog proteins and their use.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Hedgehog (hh) proteiny jsou známou rodinou secernovaných signálních peptidů, které jsou odpovědné za tvorbu různých struktur v průběhu embryogenese (J.C. Smith, Cell 76 (1994) 193 - 196; N. Perrimon, Cell 80 (1995), 517 - 520; C. Chiang et al., Nátuře 83 (1996), 407; M.J. Bitgood et al., Curr. Biol. 6 (1996) 298 - 304; A. Vortkamp et al., Science 273 (1996), 613; C.J. Lai et al., Devolopment 121 (1995) 2349). Během jejich biosyntézy jsou po štěpení signální sekvence a autokatalytickém štěpení získány 20 kDa N-koncová doména a 25 kDa C-koncová doména. Ve své přirozené formě je N-koncová doména modifikována cholesterolem a palmitoylem (J.A. Porter et al., Science 274 (1996), 255 - 259; Pepinsky et al., J. Biol. Chem. 273 (1998), 14037 - 14045) . U vyšších organismů je hh rodina složena nejméně ze tří členů, označených sonic, indián and desert hh (shh, ihh a dhh; M. Fietz et al., Devolopment (Suppl.) (1994)Hedgehog (hh) proteins are a known family of secreted signal peptides that are responsible for the formation of various structures during embryogenesis (JC Smith, Cell 76 (1994) 193-196; N. Perrimon, Cell 80 (1995), 517-520; Chiang et al., Nature 83 (1996), 407; MJ Bitgood et al., Curr Biol. 6 (1996) 298-304; A. Vortkamp et al., Science 273 (1996), 613; CJ Lai et al. al., Devolopment 121 (1995) 2349). During their biosynthesis, the 20 kDa N-terminal domain and the 25 kDa C-terminal domain are obtained after cleavage of the signal sequence and autocatalytic cleavage. In its natural form, the N-terminal domain is modified with cholesterol and palmitoyl (JA Porter et al., Science 274 (1996), 255-259; Pepinsky et al., J. Biol. Chem. 273 (1998), 14037-14045) . In higher organisms, the hh family is composed of at least three members, designated sonic, indian, and desert hh (shh, ihh, and dhh; M. Fietz et al., Devolopment (Suppl.) (1994))
- 51). Rozdílné aktivity hedgehog proteinů, které byly produkovány rekombinantní technikou, byly pozorovány po produkci v prokaryotických a eukaryotických organismech (M. Hyneš et al., Neuron 15 (1995) 35 - 44 a T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465 - 469).- 51). Different activities of hedgehog proteins produced by recombinant techniques have been observed after production in prokaryotic and eukaryotic organisms (M. Hynes et al., Neuron 15 (1995) 35-44 and T. Nakamura et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465-469).
Hyneš et al., srovnávali aktivitu hh v supernatantu transformovaných buněk lidské enbryonální ledviny 293 • ·· · · · · 9 • · 9 9 9 9 9 9 9 9 · » · •9 · · ·Hynes et al., Compared hh activity in the supernatant of transformed human enbryonic kidney cells 293 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9 9
99 9 9 ·· (eukaryotické hh) s hh produkovanými v E. coli a zjistili čtyřikrát vyšší aktivitu pro hh v supernatantu z ledvinně buněčné linie. Soudí se, že důvodem této vyšší aktivity je pravděpodobně další faktor, který je přítomen pouze v eukaryotických buňkách, posttranslační modifikace nebo odlišný N-konec, protože hh izolovaný z E. coli obsahuje 50% hh formy, která má dvě další N-koncové aminokyseliny (Gly-Ser) nebo je zkrácen o 5 - 6 aminokyselin nebo více agreguje (t.j. váže se na niklové-agarosové korálky).99 9 9 ·· (eukaryotic hh) with hh produced in E. coli and found a 4-fold higher activity for hh in the kidney cell line supernatant. It is believed that the reason for this higher activity is probably another factor that is present only in eukaryotic cells, post-translational modifications, or a different N-terminus because hh isolated from E. coli contains 50% hh form having two additional N-terminal amino acids (Gly-Ser) or is truncated by 5-6 amino acids or more aggregates (ie, binds to nickel-agarose beads).
Nakamura et al. srovnávali aktivitu shh v supernatantu transformovaných kuřecích embryonálních fibroblastů s shh fúsním proteinem izolovaným z E. coli, který stále ještě obsahoval N-koncovou polyhistidinovou část. Shh v supernatantu fibroblastů měl sedm-krát vyšší aktivitu než přečištěný protein E. coli při stimulaci alkalické fosfatasy (AP) v C3H10T1/2 buňkách. Soudí se, že tato zvýšená aktivita je způsobena molekulami jako jsou například kostní morfogenetické proteiny (BMP), které jsou přítomné pouze v supernatantu eukaryotických buněk a způsobují silnou indukci AP.Nakamura et al. compared shh activity in the supernatant of transformed chicken embryonic fibroblasts with a shh fusion protein isolated from E. coli still containing the N-terminal polyhistidine moiety. Shh in fibroblast supernatant had seven-fold higher activity than purified E. coli protein in stimulating alkaline phosphatase (AP) in C3H10T1 / 2 cells. This increased activity is believed to be due to molecules such as bone morphogenetic proteins (BMP), which are only present in the supernatant of eukaryotic cells and cause a strong induction of Aβ.
Pepinski et al. (J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037 - 14045) identifikovali shh formu, která je modifikována kyselinou palmitovou. Tento shh mutant je 30-krát účinější než nemodifikovaná forma v C3H10T1/2 testu.Pepinski et al. (J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037 - 14045) have identified a shh form that is modified with palmitic acid. This shh mutant is 30 times more potent than the unmodified form in the C3H10T1 / 2 assay.
Kinto et al. (FEBS Letters 404 (1997) 319 - 323) popsali, že fibroblasty, které secernují hh, indukují ektopickou tvorbu kosti na i.m. implantátech na kolagenu. Proto mají hedgehog proteiny osteoindukčvní aktivitu. Hedgehog proteiny mohou také stimulovat tvorbu buněk chrupavek (Stott et al., 1997) .Kinto et al. (FEBS Letters 404 (1997) 319-323) reported that fibroblasts that secrete hh induce ectopic bone formation on i.m. implants on collagen. Therefore, hedgehog proteins have osteoinduction activity. Hedgehog proteins can also stimulate cartilage cell formation (Stott et al., 1997).
Yang et al. (Devolopment 124 (1997) 4393 - 4404) popsali, že • 0 0 0 · 0 0 0 · · · · • · 0 0 0 0 0 0 0 0 • · · · · 0·· 0 000 0 0 0 • 0 0 0 0 0 0 •••0 ··· 00 00 0 0 00 vysoké lokální koncentrace hedgehog proteinů musí trvat po dobu alespoň 16 hodin v místě účinku v těle pro to, aby se projevila jejich farmaceuticky účinná in vivo aktivita. Nosič, který popsal Yang et al., t.j. chromatografické medium Affigel CM naplněné hedgehog proteinem, Ni agarosa, kterou popsal Marti et al., Nátuře 375 (1995) 322 - 325) nebo Affigel blue, který použil Lopez-Martinez et al., Curr. Biol. 5 (1995) 791 - 796 nebo heparinové agarosové částice, které byly použity, jsou méně vhodné pro farmaceutické aplikace, protože jsou imunogenní a mohou způsobit zánětlivé reakce.Yang et al. (Devolopment 124 (1997) 4393-4404) described that 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ••• 0 ··· 00 00 0 0 00 high local concentrations of hedgehog proteins must last for at least 16 hours at the site of action in the body in order to exhibit their pharmaceutically active in vivo activity. The carrier described by Yang et al., I.e. Affigel CM chromatographic medium loaded with hedgehog protein, Ni agarose, described by Marti et al., Nature 375 (1995) 322-325, or Affigel blue, used by Lopez-Martinez et al. Curr. Biol. 5 (1995) 791-796 or the heparin agarose particles that have been used are less suitable for pharmaceutical applications because they are immunogenic and can cause inflammatory reactions.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Předmětem předkládaného vynálezu je stabilní, výhodně vodný (výhodně farmaceutický) prostředek obsahující hedgehog proteiny.It is an object of the present invention to provide a stable, preferably aqueous (preferably pharmaceutical) composition comprising hedgehog proteins.
Tohoto předmětu je dosaženo ve farmaceutickém prostředku obsahujícím hedgehog proteiny, který obsahuje hedgehog proteiny ve farmaceuticky účinném množství a jako pomocná činidla obsahuje ionty zinku, ionty hořčíku, ionty vápníku, síranové ionty, cyklodextrin, neiontová detergentní činidla a/nebo aniontové sacharidy jako je chondroitinsulfat nebo heparin.This object is achieved in a pharmaceutical composition comprising hedgehog proteins, which comprises hedgehog proteins in a pharmaceutically effective amount and as adjuvants comprising zinc ions, magnesium ions, calcium ions, sulfate ions, cyclodextrin, nonionic detergents and / or anionic carbohydrates such as chondroitin sulfate or heparin.
Překvapivě bylo zjištěno, že jedno nebo více pomocných činidel vybraných ze skupiny zahrnující ionty zinku, ionty hořčíku, ionty vápníku, síranové ionty, cyklodextrin, neiontová detergentní činidla a/nebo aniontové sacharidy jako je chondroitinsulfat nebo heparin, je schopno stabilizovat hedgehog proteiny (ve farmaceutickém prostředku nebo v jiné formě), výhodně ve vodném roztoku. V důsledku toho může být aktivita hedgehog proteinů udržena delší dobu například při teplotě okolí a prostředek obsahující hedgehog proteiny může být skladován delší dobu při teplotě okolí. Pomocná činidla podle předkládaného vynálezu jsou také vhodná pro stabilizaci hedgehog proteinů v lyofilizované formě (výhodně jako zásobního nebo farmaceutického prostředku) a také jsou vhodná pro stabilizaci hedgehog proteinů během výroby prostředků obsahujících hedgehog proteiny jako jsou implantáty, mikročástice, gely, atd. a při vyšších teplotách (například při 37 °C).Surprisingly, it has been found that one or more adjuvants selected from the group consisting of zinc ions, magnesium ions, calcium ions, sulfate ions, cyclodextrin, nonionic detergents and / or anionic carbohydrates such as chondroitin sulphate or heparin are able to stabilize hedgehog proteins (in pharmaceuticals) composition or other form), preferably in aqueous solution. As a result, the activity of the hedgehog proteins can be maintained for a longer period of time, for example at ambient temperature, and the composition containing the hedgehog proteins can be stored for a longer period of time at ambient temperature. The adjuvants of the present invention are also suitable for stabilizing hedgehog proteins in lyophilized form (preferably as a stock or pharmaceutical composition) and also suitable for stabilizing hedgehog proteins during the manufacture of compositions containing hedgehog proteins such as implants, microparticles, gels, etc. and higher temperatures (e.g., 37 ° C).
Ve vodných roztocích hedgehog proteinů podle předkládaného vynálezu je pomocné činidlo v molárním nadbytku vzhledem k hedgehog proteinům. Tento nadbytek je výhodně 1 - 1000-násobný, lépe 1 - 100-násobný. Vodný roztok podle předkládaného vynálezu je zejména vhodný pro výrobu kombinací hedgehog proteinů s nosiči.In the aqueous solutions of hedgehog proteins of the present invention, the adjuvant is in molar excess relative to the hedgehog proteins. This excess is preferably 1-1000-fold, more preferably 1-100-fold. The aqueous solution of the present invention is particularly suitable for preparing combinations of hedgehog proteins with carriers.
Proto je dalším předmětem předkládaného vynálezu vodný roztok hedgehog proteinu, který obsahuje molární nadbytek pomocných činidel podle předkládaného vynálezu vzhledem k hedgehog proteinu. Tento roztok je výhodně pufrovaný a/nebo lyofílizovaný.Therefore, a further object of the present invention is an aqueous solution of a hedgehog protein which contains a molar excess of the adjuvants of the present invention relative to the hedgehog protein. This solution is preferably buffered and / or lyophilized.
Množství pomocných činidel podle předkládaného vynálezu je samo o sobě nedůležité a může se lišit ve velkém rozsahu. Výhodné množství závisí na farmaceutické kompatibilitě pomocného činidla a rozsahu stabilizačního účinku ve farmaceuticky přijatelné koncentraci. Ionty zinku jsou zejména vhodné jako stabilizační činidlo a mohou být výhodně použity v koncentraci například 0,01 až 100 mmol/l. Tato koncentrace má výrazný stabilizační účinek na hedgehog proteiny. Ionty zinku jsou přednostně přidány ve farmaceuticky kompatibilních dávkách.The amount of adjuvants of the present invention is in itself irrelevant and can vary widely. The preferred amount depends on the pharmaceutical compatibility of the adjuvant and the extent of the stabilizing effect at a pharmaceutically acceptable concentration. Zinc ions are particularly suitable as stabilizing agents and may be advantageously used at a concentration of, for example, 0.01 to 100 mmol / l. This concentration has a marked stabilizing effect on hedgehog proteins. Zinc ions are preferably added at pharmaceutically compatible doses.
«· · ♦ ♦ · · · · · · • · · · · · · · · φφ φ • · · · · · · · · · • · · · · · · · · «· · « · · • · · · · · · •··· ··· «· ·· φ· φφ«· · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · · Φ ·
Cyklodextrinem může být v předkládaném vynálezu výhodně cyklodextrinsulfat. Koncentrace jsou výhodně v rozmezí od 1 do 20% hmotnostních. Heparin o nízké molekulové hmotnosti (přibližně 3 kDa) je výhodně použit jako aniontový pólysacharid. Koncentrace je výhodně od 0,5 do 50 mg/ml pro heparin o nízké molekulové hmotnosti a odpovídající molární množství se použijí pro heparin o vysoké molekulové hmotnosti. Síranové ionty se přednostně použijí ve formě síranu zinečnatého. Koncentrace síranových iontů je výhodně od 0,01 do 100 mmol/1. Vápníkové a hořečnaté ionty se výhodně použijí v koncentracích 0,01 až 100 mmol/1. Neiontovými detergentními činidly jsou výhodně polyoxysorbaty (například TweenR20, TweenR80), výhodně v koncentracích od 0,01 do 0,1% (hmot./obj.).The cyclodextrin in the present invention may preferably be a cyclodextrin sulphate. The concentrations are preferably in the range of 1 to 20% by weight. Low molecular weight heparin (approximately 3 kDa) is preferably used as the anionic polysaccharide. The concentration is preferably from 0.5 to 50 mg / ml for low molecular weight heparin and the corresponding molar amounts are used for high molecular weight heparin. Sulfate ions are preferably used in the form of zinc sulfate. The sulfate ion concentration is preferably from 0.01 to 100 mmol / l. Calcium and magnesium ions are preferably used in concentrations of 0.01 to 100 mmol / l. Nonionic detergents are preferably polyoxysorbates (e.g., Tween R 20, Tween R 80), preferably at concentrations from 0.01 to 0.1% (w / v).
Hedgehog protein je výhodně přítomen na biologicky kompatibilním nosiči a v tomto případě se nosič váže na hedgehog protein v aktivním, složeném stavu a může lokálně uvolňovat hedgehog protein in vivo v jeho aktivní formě a kontrolovaným způsobem. Takové prostředky jsou zejména vhodné pro hojení defektů kostí a chrupavek, ale mohou být také použity pro hojení neuronálních defektů nebo pro systémové podání.The hedgehog protein is preferably present on a biocompatible carrier, in which case the carrier binds to the hedgehog protein in an active, folded state and can locally release the hedgehog protein in vivo in its active form and in a controlled manner. Such compositions are particularly suitable for healing bone and cartilage defects, but can also be used for healing neuronal defects or for systemic administration.
Ve výhodném provedení vynálezu obsahuje prostředek, lépe farmaceutický prostředek, hedgehog protein navázaný na hydrofilní nosič, který je biologicky kompatibilní a který může být použit například jako implantát. Nosičem je výhodně polymer, kterýIn a preferred embodiment of the invention, the composition, preferably the pharmaceutical composition, comprises a hedgehog protein coupled to a hydrophilic carrier that is biocompatible and which can be used, for example, as an implant. The carrier is preferably a polymer which:
- se váže na hedgehog protein jako nosič s negativním nábojem v důsledku iontových interakcí,- binds to the hedgehog protein as a negatively charged carrier due to ionic interactions,
- nezpůsobuje denaturaci hedgehog proteinu po navázání na nosič, • * · · · «· · * · · * · · · * • · · ···· ·« · 9 9 9 • · · · ·- does not induce denaturation of the hedgehog protein upon binding to the carrier, 9 9 9 9 9 9
- obsahuje alespoň 0,1 až 1, lépe 0,1 až 2 negativně nabité zbytky na monomer za neutrálních podmínek,- it contains at least 0.1 to 1, preferably 0.1 to 2, negatively charged residues per monomer under neutral conditions,
- nese náboj, který je způsoben acidickými skupinami, jako jsou síranové, karboxylové nebo fosfátové skupiny,- carries a charge caused by acidic groups such as sulphate, carboxyl or phosphate groups,
- má průměrnou molekulovou hmotnost alespoň 50000 Da.- has an average molecular weight of at least 50000 Da.
Bylo zjištěno, že po navázání na solubilní nebo insolubilní polymerovou matrici s negativním nábojem mohou být hedgehog proteiny reversibilně a aktivně uvolňovány kontrolovaným způsobem z nosiče in vivo. Takové matrice jsou popsány například v Evropské patentové přihlášce č. 98104416.7.It has been found that after binding to a negatively charged soluble or insolubile polymer matrix, the hedgehog proteins can be reversibly and actively released in a controlled manner from the carrier in vivo. Such matrices are described, for example, in European Patent Application No. 98104416.7.
Farmaceutický účinek označuje neurologické účinky na nervové buňky, účinek na chondrogenesi a/nebo chondroindukci a výhodně účinek na osteogenesi a/nebo indukci, jak je popsáno v Kinto et al., FEBS Letters 404 (1997) 319 - 323 pro kostní indukci, v Miao et al, J. Neurosci. 17 (1997) 5891 - 5899, pro účinek na nervové buňky a v Stott et al., J. Cell Sci. 110 (1997) 2691 2701 pro indukci buněk chrupavky.A pharmaceutical effect refers to neurological effects on nerve cells, an effect on chondrogenesis and / or chondroinduction, and preferably an effect on osteogenesis and / or induction as described in Kinto et al., FEBS Letters 404 (1997) 319-323 for bone induction, in Miao. et al., J. Neurosci. 17 (1997) 5891-5899, for an effect on nerve cells and in Stott et al., J. Cell Sci. 110 (1997) 2691 2701 for inducing cartilage cells.
Roztoky hedgehog proteinů s vysokými koncentracemi jsou nutné pro výrobu matricí, které jsou potažené hedgehog proteiny takovým způsobem, že vykazují odpovídající farmaceutickou účinnost při lokální aplikaci. Bylo zjištěno, že farmaceuticky vhodné nosiče potažené hedgehog proteiny by měly obsahovat koncentrace hedgehog proteinů od 0,1 do 10 mg/ml nosiče a vyšší. Zejména výhodné jsou takové nosiče, které obsahují hedgehog proteiny v koncentraci 0,1 až 10 mg/ml nosiče a vyšší, hedgehog proteiny jsou sami o sobě špatně rozpustné. Bylo nicméně překvapivě zjištěno, že rozpustnost hedgehog proteinů se významně zvyšuje, že hedgehog proteiny jsou chráněny před oxidací a že stabilita hedgehog proteinů je zlepšena při nízkých koncentracích (1 mg/ml a nižších) • · • · · * ♦ · 9 • *·· 4 «·· ·«· • * · · v roztocích, které obsahují arginin nebo argininiové ionty (výhodně argininiumsulfat). Dalším předmětem předkládaného vynálezu jsou proto vodné roztoky hedgehog proteinů podle předkládaného vynálezu v koncentracích 1 mg/ml a vyšších, které dále obsahují arginin nebo argininiové ionty a které jsou výhodně pufrované. Dalším předmětem předkládaného vynálezu je způsob výroby nosičové matrice potažené hedgehog proteinem, který obsahuje inkubaci matrice s roztokem hedgehog proteinu podle předkládaného vynálezu v koncentraci 1-10 mg/ml hedgehog proteinu, který obsahuje pomocná činidla podle předkládaného vynálezu a arginin nebo argininiové ionty, výhodně jako argininiumsulfat a dále obsahuje izolaci matrice potažené uvedeným způsobem.Solutions of hedgehog proteins with high concentrations are necessary for making matrices that are coated with hedgehog proteins in such a way that they exhibit adequate pharmaceutical efficacy when topically applied. It has been found that pharmaceutically acceptable carriers coated with hedgehog proteins should contain hedgehog protein concentrations of from 0.1 to 10 mg / ml carrier and above. Particularly preferred are those carriers which contain the hedgehog proteins at a concentration of 0.1 to 10 mg / ml carrier and above, the hedgehog proteins themselves being poorly soluble. However, it has surprisingly been found that the solubility of hedgehog proteins significantly increases, that hedgehog proteins are protected from oxidation and that the stability of hedgehog proteins is improved at low concentrations (1 mg / ml and below). In solutions containing arginine or arginine ions (preferably arginine sulphate). Therefore, a further object of the present invention are aqueous solutions of the hedgehog proteins of the present invention at concentrations of 1 mg / ml and above, which further comprise arginine or argininium ions and which are preferably buffered. A further object of the present invention is a method of making a hedgehog protein coated matrix matrix comprising incubating the matrix with a hedgehog protein solution of the present invention at a concentration of 1-10 mg / ml hedgehog protein comprising the adjuvants of the present invention and arginine or argininium ions, preferably as argininium sulphate and further comprises isolating a matrix coated with said method.
Takové roztoky jsou vhodné pro výrobu nosičových matricí, které obsahují hedgehog proteiny ve farmaceuticky účinných koncentracích a které jsou vhodné pro farmaceutické aplikace. Koncentrace argininu nebo argininiových iontů nebo argininiumsulfatu jsou výhodně mezi 10 a 700 mmol/1, nejlépe mezi 10 a 500 mmol/1 a výhodně je pH mezi 5 a 8, lépe je pH mezi 6 a 8.Such solutions are suitable for the production of carrier matrices which contain hedgehog proteins at pharmaceutically effective concentrations and which are suitable for pharmaceutical applications. The concentrations of arginine or argininium ions or arginine sulphate are preferably between 10 and 700 mmol / l, most preferably between 10 and 500 mmol / l, and preferably the pH is between 5 and 8, more preferably the pH is between 6 and 8.
Termín aktivita, jak je zde použit, znamená aktivitu alkalické fosfatasy (stimulaci exprese alkalické fosfatasy), kterou může polypeptid indukovat v savčích buňkách (aktivita v testu na alkalickou fosfatasu). V tomto testu je myší fibroblastová buněčná linie kultivována v mediu, které obsahuje fetální telecí sérum. Následuje přidání sterilního filtrovaného vzorku a buňky jsou lyžovány po asi 5 dnech a v buněčném lyzátu se určí alkalická fosfatasa podle štěpení chromogenního substrátu (pNP, p-nitrofenolu) (J. Asahina, Exp. Cell Res. 222 (1996) 38 - 47 a T. Nakamura (1997)).The term activity as used herein means the activity of an alkaline phosphatase (stimulating the expression of an alkaline phosphatase) that a polypeptide can induce in mammalian cells (activity in an alkaline phosphatase assay). In this assay, the mouse fibroblast cell line is cultured in a medium containing fetal calf serum. Following the addition of a sterile filtered sample, the cells are lysed after about 5 days and alkaline phosphatase is determined in the cell lysate by cleavage of the chromogenic substrate (pNP, p-nitrophenol) (J. Asahina, Exp. Cell Res. 222 (1996) 38-47 and T. Nakamura (1997)).
Termín hedgehog protein označuje secernovaný signální protein, který je odpovědný za tvorbu mnoha struktur v embryogenesi. Zejména výhodné jsou sonic, indián a desert hh (M. Fietz et al., Devolopment (Suppl.) (1994) 43 - 51). Výhodně se použije zpracovaná forma (zralá N-koncová signální doména) sonic hh proteinu (sekvence: EMBL databanka, č. L38518). Proteiny hedgehog rodiny vykazují výraznou homologii aminokyselinové sekvence a proto je také výhodná exprese takových nukleových kyselin kódujících hedgehog proteiny, které jsou z 80% nebo více homologní s výše uvedenou sekvencí hedgehog proteinu. Výhodně jsou použity deriváty hedgehog proteinů, které jsou popsány například v Evropské patentové přihlášce č. 98102095.1 a 98107911.4.The term hedgehog protein refers to a secreted signal protein that is responsible for the formation of many structures in embryogenesis. Particularly preferred are sonic, indian, and desert hh (M. Fietz et al., Devolopment (Suppl.) (1994) 43-51). Preferably, the processed form (mature N-terminal signaling domain) of the sonic hh protein (sequence: EMBL databank, # L38518) is used. The hedgehog family proteins exhibit significant amino acid sequence homology and therefore it is also preferred to express nucleic acids encoding hedgehog proteins that are 80% or more homologous to the above hedgehog protein sequence. Preferably, derivatives of hedgehog proteins are used, as described, for example, in European Patent Application Nos. 98102095.1 and 98107911.4.
Prekursorový protein lidského sonic hedgehog proteinu obsahuje aminokyseliny 1 - 462 sekvence popsané v EMBL databance pod č. L38518. Aminokyseliny 24 - 197 představují zralou signální doménu, aminokyseliny 32 - 197 představují signální doménu zkrácenou o osm aminokyselin a aminokyseliny 198 - 462 představují autozpracovanou C-koncovou doménu po autoproteolytickém štěpení.The human sonic hedgehog protein precursor protein comprises amino acids 1 - 462 of the sequence described in the EMBL databank under No. L38518. Amino acids 24-197 represent the mature signaling domain, amino acids 32-197 represent the signaling domain truncated by eight amino acids, and amino acids 198-462 represent the auto-processed C-terminal domain after autoproteolytic cleavage.
Prostředky podle předkládaného vynálezu obsahují farmaceuticky účinné dávky hh proteinu a mohou být podány lokálně nebo systémově. Je výhodné použití proteinů podle předkládaného vynálezu v kombinaci s jinými proteiny hedgehog rodiny nebo kostními růstovými faktory, jako jsou například kostní morfogenetické proteiny (BMP) Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expresion (1993) Academie Press Inc., 131 - 167) nebo s parathyroidálními hormony (Karablis et al., Genes and Devolopment 8 (1994) 277 - 289) nebo s inzulínu-podobnými růstovými faktory (IGP-1 nebo 2) a se členy rodiny ·· ·· tata »· ···· ···# ···· «tatata ·· « ··« · ··« ··· • · · · «The compositions of the present invention contain pharmaceutically effective doses of the hh protein and can be administered locally or systemically. It is preferred to use the proteins of the present invention in combination with other hedgehog family proteins or bone growth factors such as bone morphogenetic proteins (BMP) Wozney et al., Cell. Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic Proteins and their Gene Expression (1993) Academic Press Inc., 131-167) or with parathyroid hormones (Karablis et al., Genes and Devolopment 8 (1994) 277-289) or with insulin-like growth factors (IGP-1 or 2) and family members ···· ata · · t t ata ata ata tat ata tat ata ata ata tat tat ata tat ata ata tat ata tat tat ata ata tat
99 · transformujících růstových faktorů (TGF-β, GDF).99 · transforming growth factors (TGF-β, GDF).
Prostředky podle předkládaného vynálezu výhodně obsahují polymer, který působí jako strukturální substance a zároveň má také adhesní funkci pro buňky. Kolagen je příkladem takové strukturální substance. V tomto případě je výhodné, že strukturální substance je přítomna v nižších koncentracích, než hydrofilní biologicky kompatibilní nosič podle předkládaného vynálezu.The compositions of the present invention preferably comprise a polymer that acts as a structural substance and also has a cell adhesion function. Collagen is an example of such a structural substance. In this case, it is preferred that the structural substance is present in lower concentrations than the hydrophilic biocompatible carrier of the present invention.
Dále je pro výrobu prostředků také výhodné přidání pomocných činidel jako jsou cukry (manitol, sacharosa, laktosa, glukosa, sacharosa, trehalosa, výhodně 20 - 100 mg/ml) nebo aminokyselin jako je glycin nebo arginin, methionin, cystein, stejně jako antioxidačních činidel, jako je citrát, thioglycerol, acetylcystein, polyethylenglykol (1 - 10% hmotnostních), deetergenční činidla, výhodně neiontová detergenční činidla (výhodně v koncentraci 0,01 - 0,1% hmotnostních), například polysorbaty (TweenR20 nebo TwennR80) nebo polyoxyethyleny, protizánětlivá činidla, lokální anestetika, antibiotika a/nebo stabilizační činidla, jako jsou lipidy, mastné kyseliny a glycerol.Furthermore, the addition of auxiliary agents such as sugars (mannitol, sucrose, lactose, glucose, sucrose, trehalose, preferably 20-100 mg / ml) or amino acids such as glycine or arginine, methionine, cysteine, as well as antioxidants such as citrate, thioglycerol, acetylcysteine, polyethylene glycol (1-10% by weight), de-detergents, preferably non-ionic detergents (preferably at a concentration of 0.01-0.1% by weight), for example polysorbates (Tween R 20 or Twenn R 80 ) or polyoxyethylenes, anti-inflammatory agents, local anesthetics, antibiotics and / or stabilizing agents such as lipids, fatty acids and glycerol.
V dalším výhodné provedení obsahují prostředky obsahující hedgehog proteiny podle předkládaného vynálezu dále suramin a takové prostředky mohou být výhodně použity.In another preferred embodiment, the compositions comprising the hedgehog proteins of the present invention further comprise a suramine, and such compositions may be advantageously used.
Prostředky mohou obsahovat další farmaceutická pomocná činidla.The compositions may contain other pharmaceutical excipients.
Ve výhodném provedení obsahuje prostředek hedgehog protein v koncentraci 0,1 - 100 mg/ml.In a preferred embodiment, the hedgehog composition comprises a protein in a concentration of 0.1-100 mg / ml.
4449 • 49 ·· 44 • ♦ * 4 * »9 94449 • 49 ·· 44 • ♦ * 4 * 9 9 9
949 949 « 9 · « ·956 956 «9 ·« ·
Ve výhodném provedení prostředek dále obsahuje farmaceuticky přijatelný pufr, který je biologicky kompatibilní, výhodně v rozmezí mezi pH 3 a pH 10, zejména v rozmezí mezi pH 5 a 8. Překvapivě bylo zjištěno, že pomocná činidla podle předkládaného vynálezu mohou také účinně stabilizovat hedgehog proteiny v kyselém prostředí. pH hodnota prostředku by měla být vyšší než 4, aby se zabránilo denaturaci a odštěpení zinku, který je v komplexu s hedgehog proteinem. Koncentrace pufru je výhodně 1 - 500 tnmol/1, lépe 5 - 150 mmol/1 a nejlépe 10 - 100 mmol/1. V nej výhodnějších provedeních je použito 300 mmol/1 pufru fosforečnanu draselného, pH 6,0 nebo 10 mmol/1 fosforečnanu draselného, 500 mmol/1 argininchloridu, pH 6,0.In a preferred embodiment, the composition further comprises a pharmaceutically acceptable buffer that is biocompatible, preferably in the range between pH 3 and pH 10, especially in the range between pH 5 and 8. Surprisingly, it has been found that the adjuvants of the present invention can also effectively stabilize hedgehog proteins in an acidic environment. The pH of the composition should be greater than 4 to prevent denaturation and cleavage of zinc that is complexed with the hedgehog protein. The buffer concentration is preferably 1 - 500 mmol / l, more preferably 5 - 150 mmol / l, and most preferably 10 - 100 mmol / l. In the most preferred embodiments, 300 mM potassium phosphate buffer, pH 6.0 or 10 mM potassium phosphate, 500 mM arginine chloride, pH 6.0 is used.
Následující příklady a publikace dále ilustrují vynález, jehož rozsah je určen patentovými nároky. Popsané způsoby jsou uvedeny jako příklady, které popisují předměty vynálezu i po provedení modifikací.The following examples and publications further illustrate the invention, the scope of which is determined by the claims. The methods described are given as examples that describe the subject matter of the invention after modifications have been made.
Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Příklad 1: DSC (diferenciální skenovací kalorimetrie) analýza různých prostředků obsahujících hedgehog proteinyExample 1: DSC (differential scanning calorimetry) analysis of various compositions containing hedgehog proteins
Roztoky hedgehog proteinů s koncentrací proteinů přibližně 0,5 mg/ml se analyzují v různých pufrech (50 mM HEPES-NaOH, pH 7,2 a 150 mM arginin-Cl, pH 7,4) s nebo bez stabilizačních činidel pomocí DSC (Nano Differential Scanning Calorimeter, Calorimetry Sciences Corporation, Utah, USA) při rychlosti ohřevu 2 K/min. Použijí se následující stabilizační činidla:Solutions of hedgehog proteins with a protein concentration of approximately 0.5 mg / ml are analyzed in various buffers (50 mM HEPES-NaOH, pH 7.2 and 150 mM arginine-Cl, pH 7.4) with or without stabilizers by DSC (Nano) Differential Scanning Calorimeter (Calorimetry Sciences Corporation, Utah) at a heating rate of 2 K / min. The following stabilizing agents are used:
- octan zinku (Merck)- Zinc acetate (Merck)
- síran zinečnatý (Merck) ·· « ·· 44 44 44 • · ·· 4 44 4 · 4 4 4 • · 4444 4444 * · · · 4444 4 444 444- zinc sulphate (Merck) 44 44 44 44 44 44 44 44 4444 4444 4444 444
4 4 4 · 4 44 4 4 4
4 4 4 444 44 4 « · · · ·4 4 4 445 44 4 «· · · ·
- heparin (o nízké molekulové hmotnosti, Sigma)- heparin (low molecular weight, Sigma)
- sulfatovaný β-cyklodextrin (Aldrich)- sulphated β-cyclodextrin (Aldrich)
- argininsulfat- arginine sulphate
Teploty přeměny (Tt) určené pro příslušné prostředky jsou shrnuty v tabulce. Z dat je možno pozorovat, že přidání substancí uvedených v textu zvyšuje teploty přeměny a proto zvyšuje stabilitu hedgehog proteinu. Měřené teploty by neměly být chápány jako absolutní hodnoty, ale spíše představují rozdíly ve stabilitě jednotlivých prostředků navzájem.The conversion temperatures (Tt) determined for the respective compositions are summarized in the table. From the data it can be seen that the addition of the substances mentioned above increases the transformation temperatures and therefore increases the stability of the hedgehog protein. Measured temperatures should not be understood as absolute values, but rather represent differences in the stability of the individual formulations.
Teploty přeměny pro hedgehog proteiny v různých prostředcíchConversion temperatures for hedgehog proteins in various formulations
Prostředek Tt (°C) mM HEPES-NaOH, pH 7,2 52,0 mM HEPES-NaOH, 1 mM octan zinku, pH 7,2 56,8 mM HEPES-NaOH, 1 mM síran zinečnatý, pH 7,2 60,6Formulation Tt (° C) mM HEPES-NaOH, pH 7.2 52.0 mM HEPES-NaOH, 1 mM zinc acetate, pH 7.2 56.8 mM HEPES-NaOH, 1 mM zinc sulfate, pH 7.2 60 , 6
150 mM argininchlorid, pH 7,4 53,5150 mM arginine chloride, pH 7.4 53.5
150 mM argininchlorid, 5% (hmot./obj.) sulfatovaný 55,6 β-cyklodextrin, pH 7,4150 mM arginine chloride, 5% (w / v) sulfated 55.6 β-cyclodextrin, pH 7.4
150 mM argininchlorid, 20 mg/ml heparin, pH 7,4 57,8150 mM arginine chloride, 20 mg / ml heparin, pH 7.4 57.8
150 mM argininsulfat, pH 6,0 63,4150 mM arginine sulphate, pH 6.0 63.4
Příklad 2: Stabilita sonic hedgehog proteinu při 37 °CExample 2: Stability of sonic hedgehog protein at 37 ° C
Lidský sonic hedgehog protein se inkubuje v různých prostředcích při 37 °C. Vzorky se odebírají v uvedených časech a analyzují se pomocí rpHPLC.Human sonic hedgehog protein is incubated in various compositions at 37 ° C. Samples were taken at the indicated times and analyzed by rpHPLC.
• 4• 4
4 44 4
444444
44444444
44
4 44 4
4 4 • 44 4 • 4
44
44 * 4 444 * 4 4
4 44 4
444 »44444 »44
44
4· 444 · 44
Prostředek A: PBS (10 mmol/1 fosforečnanu draselného, 150 mmol/1 chloridu sodného, pH 7,4)Formulation A: PBS (10 mmol / l potassium phosphate, 150 mmol / l sodium chloride, pH 7.4)
Je zřejmé, že hshh má v prostředku B vyšší stabilitu než v prostředku A. Oxidace shh je významně pomalejší v prostředku obsahujícím arginin a zpětný zisk je vyšší, protože je bráněno teplotou indukované agregaci hshh.Obviously, hshh has a higher stability in composition B than in composition A. Oxidation of shh is significantly slower in the arginine-containing composition and the recovery is higher because temperature-induced hshh aggregation is prevented.
• •99 ···• • 99 ···
Příklad 3: Stabilita sonic hedgehog proteinu při 37 °CExample 3: Stability of sonic hedgehog protein at 37 ° C
Lidský hydrofobně modifikovaný sonic hedgehog protein (palmitoylovaný shh, připravený podle EP 98116733.1) se inkubuje v různých prostředcích při 37 °C. Vzorky se odebírají v uvedené časy a analyzují se pomocí rpHPLC.Human hydrophobically modified sonic hedgehog protein (palmitoylated shh, prepared according to EP 98116733.1) is incubated in various compositions at 37 ° C. Samples were taken at the indicated times and analyzed by rpHPLC.
Prostředek A: PBS (10 mmol/1 fosforečnanu draselného, 150 mmol/1 chloridu sodného, pH 7,4)Formulation A: PBS (10 mmol / l potassium phosphate, 150 mmol / l sodium chloride, pH 7.4)
Prostředek B: 150 mM arginin-Cl, 0,01% Tween 80, pH 6,0 tt · tttttttt tttttttt tt · tttt tt tttttttt tttttt tttttt « tttttttt tttt •tttttt tttttt ·· ·« ·· ··Formulation B: 150 mM arginine-Cl, 0.01% Tween 80, pH 6.0 tt · tttttttt tttttttt tt · tttt tt tttttttt tttttt tttttt «tttttttt tttt • tttttt tttttt ·· ·« ·· ··
Je zřejmé, že hshh má v prostředku B vyšší stabilitu než v prostředku A. Zpětný zisk je vyšší, protože je bráněno teplotou indukované agregaci hshh.Obviously, hshh has a higher stability in composition B than in composition A. Recovery is higher because temperature-induced hshh aggregation is prevented.
Odkazy:Links:
Asahina, J. Exp. Cell Res. 222 (1996) 38 - 47Asahina, J. Exp. Cell Res. 222 (1996) 38-47
Bitgood, M.J. et al., Curr. Biol. 6 (1996) 298 - 304Bitgood, M.J. et al., Curr. Biol. 6 (1996) 298-304
Chiang, C. et al., Nátuře 83 (1996) 407Chiang, C. et al., Nature 83 (1996) 407
Evropská patentová přihláška č. 98102095.1European Patent Application No. 98102095.1
Evropská patentová přihláška č. 98107911.4European Patent Application No. 98107911.4
Fietz, M. et al., Devolopment (Suppl) (1994) 43 - 51Fietz, M. et al., Devolopment (Suppl) (1994) 43-51
Hyneš, M. et al., Neuron 15 (1995) 35 - 44Hynes, M. et al., Neuron 15 (1995) 35-44
Karablis et al., Genes and Devolopment 8 (1994) 277 - 289 Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319 - 323 Lai, C.J. et al., Devolopment 121 (1995) 2349 Lopez-Martinez et al v Curr. Biol. 5 (1995) 791 - 796 Marti et al., Nátuře 375 (1995) 322 - 325 Miao et al., J. Neurosci. 17 (1997) 5891 - 5899Karablis et al., Genes and Devolopment 8 (1994) 277-289 Kinto et al., FEBS Letters, 404 (1997) 319-323 Lai, C.J. et al., Devolopment 121 (1995) 2349. Lopez-Martinez et al in Curr. Biol. 5 (1995) 791-796 Marti et al., Nature 375 (1995) 322-325 Miao et al., J. Neurosci. 17 (1997) 5891-5899
Nakamura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465 - 469Nakamura, T. et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. 237 (1997) 465-469
Pepinski et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037 - 14045Pepinski et al., J. Biol. Chem. 273 (1998) 14037-14045
Perrimon, N., Cell 80 (1995) 517 - 520Perrimon, N., Cell 80 (1995) 517-520
Porter, J.A. et al., Science 274 (1996) 255 - 259Porter, J.A. et al., Science 274 (1996) 255-259
Smith, J.C., Cell 76 (1994) 193 - 196Smith, J.C., Cell 76 (1994) 193-196
StOtt et al., J. Cell Sci. 110 (1997) 2691 - 2701Stott et al., J. Cell Sci. 110 (1997) 2691-2701
Vortkamp, A. et al., Science 273 (1996) 613Vortkamp, A. et al., Science 273 (1996) 613
Wozney et al., Cell Mol. Biol. of Bone, Bone MorphogeneticWozney et al., Cell Mol. Biol. of Bone, Bone Morphogenetic
Proteins and their Gene Expression, (1993) Academie Press lne. 131 - 167Proteins and their Gene Expression, (1993) Academic Press Inc. 131-167
Yang et al., Devolopment 124 (1997) 4393 - 4404Yang et al., Devolopment 124 (1997) 4393-4404
Claims (16)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19992746A CZ274699A3 (en) | 1999-08-03 | 1999-08-03 | Preparation containing "hedgehog" protein |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ19992746A CZ274699A3 (en) | 1999-08-03 | 1999-08-03 | Preparation containing "hedgehog" protein |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ274699A3 true CZ274699A3 (en) | 2000-04-12 |
Family
ID=5465512
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ19992746A CZ274699A3 (en) | 1999-08-03 | 1999-08-03 | Preparation containing "hedgehog" protein |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ274699A3 (en) |
-
1999
- 1999-08-03 CZ CZ19992746A patent/CZ274699A3/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0978285B1 (en) | Stable pharmaceutical composition of hedgehog proteins and use thereof. | |
| JP3664373B2 (en) | Water-soluble pharmaceutical composition in ionic complex and use thereof | |
| EP0947201B1 (en) | Pharmaceutical composition of hedgehog proteins and use thereof | |
| CZ274699A3 (en) | Preparation containing "hedgehog" protein | |
| JP3092706B2 (en) | Hedgehog protein pharmaceutical compositions and uses thereof | |
| HRP990244A2 (en) | Pharmaceutical composition of hedgehog proteins and use thereof | |
| AU777729B2 (en) | Pharmaceutical composition of hydrophobically modified hedgehog proteins and their use | |
| HK1025740B (en) | Stable pharmaceutical composition of hedgehog proteins and use thereof. | |
| HK1026853A (en) | Water-soluble pharmaceutical composition in an ionic complex and the use thereof | |
| CZ308799A3 (en) | Water soluble pharmaceutical preparation in ion complex and use thereof |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PD00 | Pending as of 2000-06-30 in czech republic |