CZ269798A3 - Způsob čištění proteaz, podobných thrombinu, z hadího jedu - Google Patents

Description

Způsob čištění proteaz podobných thrombinu, z hadího jed u

Ob .L.a.s t........techniky

Předložený vynález se týká způsobu čištění proteáz, podobných thrombinu. z hadího jedu.

P9.s,a Vadní.........stav.......t e c hn i ky

Příkladem krotalazs a zejména ankord. který se izoluje z.

Merck-Index 1089, č. 664. popsáno již více metod, viz 6B-PS 1.293.793, US-PS 3 2.428.955, DE-OS 2.734.427.

na chromatografických krocích a připravují výtěžcích a čistotě.

takovýchto proteáz jsou batroxobin, Posledně uvedený je antikoagulant, jedu hada

agkistrodon	rhodostoma,	viz.
výrobě z	hadího jedu	bylo
1 .094.30 1,	6B-PS 1.177	. 506 ,
2, US“PS	3.879.369,	DE-OS

Tyto způsoby spočívají v podstatě ankrod v různých

Výroba velmi čistého ankrodu z hadího nepodařila, byla vždy izolována směs enzymů s hlavní komponentou, který byl po výrobě více či cizími proteiny.

jedu se dosud ankrodem jako méně zneč i štěn

Pods t a t a........vynálezu

Byla nalezena cesta vyrábět proteázy z hadích jedů ve velmi čisté podobě.

Předmětem vynálezu je způsob čištění proteaz, podobných thrombinu, z hadích jedů, která spočívá v tom, že se

a. proteazová surovina podrobí předčištění pomocí afinitní chromatografie nebo chromatografie s výměnou zásaditých

Φ ·· ·· φ φ Φ ΦΦΦΦ

ΦΦΦ Φ Φ ΦΦ

ΦΦΦΦ Φ · · Φ · φ Φ ΦΦΦΦ • ΦΦΦ Φ ·· ·*

ΦΦ ΦΦ φ φ φ · φ φ ΦΦ • ΦΦΦΦ Φ φ φ Φ

Φ · *

		- 2 -
iontů.
t a k t o	získaná frakce	s enzymy	podobnými	thrombinu se
podrobí	chromatografi i	s úzkou	vymě n o u	kat i onů nebo se
oddělí	adsorbcí na sklo	v zásadité	oblasti a

c. hlavní komponenta z kroku 2 se podrobí gelové chromatografii nebo se čistí chromatografii na sklo v kyselé oblasti.

přičemž však alespoň jeden z kroků 2 pomocí adsorpce, případně chromatograf na zahrnuje oddělování sklo.

Předmětem thrombinu z hadího vynálezu dále jedu v čistotě mezi jsou proteázy 95 až 100 &.

podobné

Doporučuje sklo a u stupně c s se u stupně b provádět Čistění adsorpcí pomocí gelové chromatografie.

na

Ve zvláště přednostním provedení vynálezu se jak ve stupni b, tak rovněž ve stupni c čistí pomoci adsorpce, případně chromatografii na sklo.

K čištění afinitní chromatografii jsou vhodné zejména agmatinsepharoza, argininsepharoza nebo heparinsepharoza.

Jako zásadité iontemě niče jsou pro čištění vhodné zejména DEAE-ce1u1oza a DEAE-sepharoza.

Jako pufr jsou pro iontovou výměnu při chromatografii uvedeny zejména tris-fosforečnan a fosforečnan sodný.

Chromatografie iontovou výměnou se provádí při hodnotě pH 5 až 9, přednostně 6 až 8,5.

···· * · ·· ·· • · <

• ·· • · 4 » 9 9 <

·· 99

99 » · · « » · ·· ·· · 9 <

• · 4

99

Při čištění se oddělí a jiných složek ze surového enzymu

0 % cizích d r o t e i η δ

Jestliže se druhý krok čištění provádí kat ionovou výměnou, pak přichází do úvahy následující úzká kyselá výměna: CM-SEPHASE. pH 5 až 9 a AMBERLITE CG50, pH 5 až 9.

při hodnotě pH matrici. Cca proteinů pří pádně

Chromatografie na sklo znamená, že se ankrod a použité enzymy podobné thrombinu a rovněž silně zásadité proteázy váží

7,5 až 9,0, přednostně 8,0 až 8,5 na skleněnou 80 % ze sloupce, především kyselých cizích nespojených s pufrem, přednostně tris-fosforečnanem, fosforečnanem sodným, se pere. Ankrod se v čistotě přes 90 %, frakci o novaný sklem, eluuje, tím že se zvýší iontová sί 1 a pufru pomocí přídavku kuchyňské soli na 0,3 až 1,0 M.

V dalším stupni čištění se enzym upravuje až na 90 %.

Pro gelovou chromatografii přichází zejména do úvahy čistící krok c: SEPHACRYL S-100HR, SUPERDEX, SEPHADEX, jako

UTROGEL a SUPEROSE pr o tento čistící krok chromatografie na sklo, tak se v kyselé pH oblasti 4 vo 1 í iž 6 adsorbují zásadité cizí proteiny ankrodového roztoku na povrch skla, zatímco lze ankrod v čistotě přes 95 e1uo va t přímo ze sloupce v pufru. Požadovaná iontová síla pufru reguluje přídavkem soli, jako je kuchyňská sůl.

Nový způsob je vhodný zvláště pro přípravu čistého ankordu, který se po tomto způsobu čištění získává v čistotě zřetelně přes 95

P.ř.í.k l.ady.......pro ve den i.........vyná lezu

9 • · « • · · • ···· • · ·♦·· · ·· ·· • · · » • · ··

9 9 9 9

4 4 9

44

44

4 4 4

4 44

494 9 4

4 9

44

Příklad 1

a. Předčištění v 50 (TRIS fosforečnanu) s pH 8,5, byly odstraněny centrifugou,

300 ml pufru (10 mM g sušeného iedu malajsijské zmije bylo rozpuštěno ml pufru fosforečnanu tr i s--( hydroxymethyl )--ami nomethanu nerozpuštěné buněčné části jedu jasný, žlutý roztok se nanese na chromatografický sloupec, který má průměr 1,6 cm a byl naplněn až do výšky 30 crn DE AE-SE P HAROSE ~F F , firma Pharmacia. Enzymy jedu, podobné trombinu, a rovněž proteiny s kyselým charakterem se vázaly na matrici. Chromatografie byla provedena s průtočnou rychlostí 150 až 200 ml/h. Praním sloupce při teplotě okolí TRIS fosforečnanu, pH 8,5) byla hodnota

Vsso mm eluátu snížena pod 0,5 a dalším praním ve 400 ml 35 mM

TRIS fosforečnanového eluátu pod 0,4, se vztaženo na optickou pufru, pH 6,0, až byla hodnota A280 min eluovalo 70 až 80 % cizích proteinů, hustotu výchozího

Hlavní frakce ankrodem byla eluována s až 200 ml 150 mM pufru TRIS fosforečnanu, pH 6,0.

roztoku při 280 nm. 85 % výtěžkem ve 150

b. Hlavní čištění

Eluat, který obsahuje ankrod, byl koncentrován pomocí u 1 trafi 1 trace na membráně s nominálním dělícím rozhraním 10000 Dalton na 20 ml a pufrován 100 mM pufru TRIS fosforečnanu, pH 8,0. Tento roztok byl nanesen na sloupec, který měl průměr 1,6 cm a byl naplněn až do výšky 15 cm BI0RAW-CP6 sklem (firma Sehott, porézní průměr 25 až 35 nm, zrnitost 30 až 60 pm) . Praním sloupce při teplotě okolí 300 ml IQOmM TRIS fosforečnanu, pH 8,0 a rychlostí protékání 250 ml za hodinu bylo ze sloupce eluováno cca 60 % cizích proteinů, vztaženo na optickou hustotu navážky.

• φ φ··· φφ φ φ φ φ φ φφφφ φφ φφ

Φ φ φ ι φ φφφ φ φ φ I φ φ φ 1 φφ φφ φφ φφ > φ φ «

I φ φφ

ΦΦΦΦ 1

Φ Φ 4

ΦΦ Φ· φφφ

Eluát byl automaticky podobný thrombinn byl oblastí. K udrženi která obsahuje nejvíce

Κ eluaci byl použit 0.5 Μ roztok chloridu sodného, který byl pufrován 100 mM TRIS fosforečnanu na hodnotu pH 8,0.

zachycen v cca 10 ml frakcích. Enzym eluován v zóně s připojenou upravovači hlavní komponenty, odpovídající ankroda, > % vedlejších komponent podobných thrombinn, byly při přechodu hlavni zóny k upravovači oblasti vyšetřeny jednotlivé frakce fibrogenozní aktivity, jakož pomocí inverzní fáze HPLC.

z hlediska jejich specifické také z hlediska jejich složení Hlavní zónou byly čištěny jen frakce (cca 80 ml), které mají specifickou aktivitu více ne;

1700 ot/ODzs O n m produktů. Hlavní a ma j i v komponenta

HPLC méně než 10 % vedlejších byla získána s čistotou 36 1¾ a výtěžkem 72 X z bioranového sloupce.

c. Jemné čištění

Eluát hlavní komponentou ankrod byl koncentrován pomocí u1trafi 1trace na membráně YM 10 (firma Amicon) na 2 ml a sloupec, který měl průměr cm SEPHARYLem S-100 HR.

obdržený koncentrát byl nanesen na

1,6 cm a byl naplněn až do výšky Sloupec byl předtím ekvilibrován pufrem 100 mM chloridu sodného a 100 mM fosforečnanu sodného, který má hodnotu pH 6,9. Touto gelovou chromatografii byly od ankrodu odděleny zbytkové proteázy a rovněž TRIS. Výtěžek činil při tomto kroku 90

Příklad 2 . Předčištění

2,1 g jedu malajsijské zmije bylo rozpuštěno v 50 ml 35 mM pufru TRIS fosforečnanu s pH 8,5, nerozpuštěné buněčné části jedu byly odstraněny centrifugou, jasný, žlutý roztok se nanese na chromatografický sloupec, který má průměr 1,6 cm • φφ ·· • φφφφ φ φ φ · φφ • ΦΦΦ φ φ φ φ « • Φ Φ Φ ι φ φφφφ «· φφ » · φ « » · φφ • ΦΦΦ <

φ φ <

φφ φφ a byl naplněn až do výšky 30 cm DEAE-SEPHAROSE-FF, firma Pharmacia. Praním sloupce při teplotě okolí 600 ml uvedeného pufru, až byla hodnota A?so eluátu menši než 0,2, bylo eluováno 70 % cizích proteinu, vztaženo na optickou hustotu výchozího roztoku při 280 nm. Hlavní frakce byla eluována s 90 až 100 fcním výtěžkem 200 až 250 ml 150 mM pufru TRIS fosforečnanu, pH 6,0.

b. H1avní čištění

Eluát byl jako a pufro ván 5 0 mM pufru v příkladu 1 koncentrován na 20 ml fosforečnanu sodného, pH 8,5. Tento roztok byl nanesen na sloupec BIORAN-CPG-G1 as, který měl průměr

1,6 cm a výšku 15 cm, porézní průměr 25 až 35 nm a zrnitost 30 až 60 pm. Praním sloupce při teplotě okolí 300 ml 50 mM pufru fosoforečnanu sodného, pH 8,5 a rychlostí protékání 250 ml za hodinu bylo ze sloupce eluováno cca 60 % cizích proteinů, vztaženo na optickou hustotu navážky při 280 nm.

K eluaci enzymů podobných

M roztok chlor i du fosforečnanu sodného sodného, který na hodnotu pH thrombinu byl 8,0.

eluováno na enzym cca 80 % vloženého množství.

by 1 použit 1 pufro ván 5 0 mM 150 ml pufru bylo

c. Jemné čištění

Eluát byl koncentrován, jak je shora uvedeno, na 20 ml a pufrován 50 mM pufru fosforečnanu sodného, pH 5,0. Tento roztok byl vnesen na sloupec, který má hodnotu který mě 1 průměr

1,6 mrn a byl naplněn až do výšky 15 cm BIORAN-CPG-G1 as, který měl porézní průměr 90 až 110 nm a zrnitost 30 až 60 pm. Při pH 5,0 byly na BIORAN-Glas vázány jen zásadité proteiny a rovněž vedlejší komponenty, zatímco hlavní komponenta ankrod byla eluována pufrem na čistotu 100 % a s výtěžkem cca 80 až 90 X, ·· ·· ·· ·· » · · · 9 9 9 9

9 99 9 9 99 ft · 9 9 9 999 9 9

9 9 9 9 9 9

99 99 99 • · • · · » ···· · vztaženo na vložené množství

Přiklad 3 a, b. Předčištění a hlavni čištění

2,1 g sušeného jedu malajsijské zmije bylo analogicky s příkladem 2 předem eluat byl analogicky a pufrován pufrem 40 rozděleno do frakcí na DEAE-SEPHAROSE, s příkladem 1 koncentrován na 20 ml mM TRIS fosforečnanu. Tento roztok byl nanesen na sloupec chromatografu, který má průměr 1,6 cm a je naplněn až do výšky 20 cm CM-SEPHAROSE-FF, firma Pharmacia, a působilo se na něj shora uvedeným pufrem. Praním sloupce při ml pufru a rychlostí proudění 250 ml/h bylo cca 60 Ž cizích proteinů, vztaženo na teplotě okolí 300 ze sloupce eluováno optickou hustotu vloženého množství.

K e1uac i enzymů M roztok chloridu sodného, který byl fosforečnanu sodného na hodnotu pH 8,0.

podobných thrombinu byl použit 1 pufrován 50 mM eluováno thrombinu, cca vloženého množství

150 ml pufru bylo enzymu podobného

c. Jemné čištění

Jemné čištění ankrodu bylo provedeno analogicky s příkladem 2 na BlORAW-CPG-Gi as, porézní průměr cca 100 nm a zrnitost 30 až 60 pm, 50 mM fosforečného pufru, pH 5,0. Ankrod byl ze sloupce eluován s 95 Žní čistotou a cca 85 Žním výtěžkem, vztaženo na vložené množství.

Claims (4)

1. PATENTOVÉ NÁR OKY

   1. Způsob čištění proteaz, podobných thrombinu. z hadího jedu, vyznačující se tím, že se

   a. proteazová surovina podrobí předčištění pomocí afinitní chromatografie nebo chromatografie s výměnou zásaditých i o nt ů,

   b. takto získaná frakce s enzymy podobnými thrombinu se podrobí chromatografi i s úzkou výměnou kationů nebo se oddělí adsorbcí na sklo v zásadité oblasti a

   c. hlavní komponenta z kroku 2 se podrobí gelové chromatografii nebo se čistí chromatografii na sklo v kyselé oblastí, přičemž alespoň jeden z kroků 2 a 3 zahrnuje oddělování pomoci adsorpce, případně chromatografie na sklo.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se ve stupni b provádí čistění adsorpcí na sklo a stupeň c se provádí pomoci gelové chromatografie.
3. 3.. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že se čištění ve stupních bac provádí na sklo pomocí chromatografie.
4. 4. Přirozeně získaný ankrod v čistotě přes 95