CZ266398A3 - Peptidové deriváty, způsob přípravy a použití - Google Patents

Description

Ohlásí techniky

Vynález se týká určitých nových peptidových derivátů, které mají farmakologicky výhodné vlastnosti pro použití k léčení autoimunitních nemocí nebo stavů, . jako je revamatoidní artritis nebo další nemoci zprostředkované T-buňkami závislými na MHC II. třídy. Vynález dále zahrnuje farmaceutické přípravky z nových chemických sloučenin, způsob přípravy těchto nových sloučenin a jejich použití pro léčení jedné nebo více výše zmíněných nemocí nebo stavů a také jejich použití pro výrobu nových léčiv pro takové léčení.

Dosavadní stav techniky í

i»

Stimulace lidské imunitní odpovědi je závislá na· rozpoznání proteinových antigenů T-buňkami. Avšak T-buňky samy nemohou odpovídat na antigen, jsou pouze antigenem aktivovány, pokud se antigen naváže na molekuly .hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) na povrchu buněk prezentujících antigen, jako jsou B-buňky, makrofágy nebo dendritické buňky.

Molekuly MKC I. třídy vyvolají odpověď zabíječských T-buněk, která vede k destrukci buněk nesoucích antigen. Molekuly MHC II. třídy vyvolají odpověď pomocných T-buněk, která řídí rozvoj a zrání vybraných B-buněk (tj. tvorbu antigenně-specifických protilátek) a aktivaci makrofágů.

Kritickým požadavkem imunitního systému je schopnost rozlišovat mezi vlastními („šelf)_a nevlastními __(„non-

self), tj. cizími antigeny.

í í: C ' <· <; rr

Takové odlišení je.nezbytně nutné, k ,tomu, aby umožnilo imunitnímu systému odpovídat na škodlivé cizorodé patogeny a přitom i udržovat., toleranci . k, vlastním proteinům, a -tak zabránilo poškození normální tkáně. Aútoimunitni nemoc vzniká tehdy,r když tolerance : vlastního' selhává', *'a- (to umožňuje imunitnímu systému'reagovat proti vlastní tkáni, např: proti, kloubům -v spřípadě revmátoidní · ár.tritis.” Má se /..za* to, '^že udržování tolerance -a. (-tedy zabráněni autoimuníťním. nemocem v kritické míře.závisí na molekulách MHC. . ...

Zjištění, j že mnoho autoimunitních,-nemocí -je -spojeno s dědičností určitých alel MHC, dává předpoklad pro klíčovou úloho molekul MHC v patogeheze autoimunitních nemocí. 'Tak.· např. roztroušená skleróza iňózkomíšní je spojena s dědičností alely HLA-DR2, diabetes mellitus závislý na inzulínu je spojen s HLA-DR3 a/nebo HLA-DR4 a Hashimotcva thyroiditis s HLA-DR5. Zvláště silné spojení existuje mezi predispozicí' k vývoji chronické zánětlivé kloubní revmátoidní .artritis a dědičností alel Hlá-ĎR4Dw4 -a/nebo HlA-D.R4w'l4 a/nebo, .HLA-.· DRl. Má se za to, že molekuly MHC - spojené' s autoimunitní nemocí se váží na' určité vlastní. antigeňy („self-antigens”} a prezentují je T-buňkám,.· a tím stimulují autoimunitní odpověď. ‘

Jiné peptidy, které ' 'se ' mohou vázat na MHC molekuly spojené s autoimunitou a/nebo které mohou zabránit vazbě vlastního^;'antigenu nebo nahradit již navázaný vlastní antigen a/nebo inhibují aktivaci- T-buněk (zejména aktivitu patogenních T-buněk, tj . Thl-buněk) a/nebo zvyšují aktivitu ochranných T-buněk (tj. Th2-buněk), nebo peptidy, které interagu.jí s molekulami MHC alternativními mechanismy J?jgárúgÁmi_nebo_m.Qdí.fl;k.ujíc.ími_s_t.imu.lac.i_au±olmun.ít.ní_odpově.di. zprostředkované molekulami MHC, mohou specificky potlačit autoimunitní odpověď.

• « • · · · · · · ·»·* ·* ·· ·♦ ··

Agens takového druhu by poskytlo možnost léčení autoimunitní nemoci a přitom by zabránilo celkovému potlačení imunitního systému, což je dosud omezující škodlivý vedlejší účinek. Takové vlastností by měly významné výhody ve srovnání se současnou léčbou nemocí jako -je např. revmatoidní artritis. 'Je běžnou praxí léčit revmatoidní artritis na počátku pomocí , přípravků tišících symptomy, jako je např. NSAID, které nemají na postup onemocnění žádný prospěšný- víiv a jsou přitom často spojeny s nežádoucími vedlejšími účinky. Léčení vážnějších nemocí spočívá v použití tzv. přípravků, druhé linie. To jsou často obecně cytotoxické sloučeniny, které mají omezenou účinnost a jejich toxicita'může·způsobit vážné problémy. Agens modifikující nemoc, založené na .racionálním podkladě, které by nebylo spojeno s nespecifickou cytotoxicitou, by přineslo významný prospěch v léčení revmatoidní artritis.

Peptidy, které se váží na molekuly MHC a inhibují aktivaci T-buněk, byly popsány v mezinárodních patentových přihláškách WO 92/02543, WO 93/05011 a WO 95/07707.

Ačkoliv již bylo objeveno mnoho peptidů, které inhibují na HLA-DR omezenou aktivaci T-buněk tím, že se váží na molekuly HLA-DR, existuje stálá potřeba dalších sloučenin, které se váží na tyto molekuly a/nebo brání vazbě nebo nahrazují již navázané vlastní antigeny a/nebo inhibují aktivaci T-buněk a/nebo zvyšují aktivitu ochranných T-buněk, nebo interagují· s molekulami MHC alternativními mechanismy, a tak zabraňují nebo modifikují stimulaci autoimunitní odpovědi, která'je příčinou nemocí a stavů zmíněných výše.

φ · • · • « • ·

-4Fodstata vynálezu

Zjistili jsme, že peptidy podle předkládaného vynálezu (popsané dále) překvapivě vykazují takové (tj. výše uvedené) farmakologicky výhodné vlasnosti, a proto jsou tedy základem předkládaného vynálezu.

Jeden aspekt vynálezu poskytuje peptidový derivát podle obecného vzorce I

P — R¹ — R²—R³ —-R⁴ (¹) kde.

P je hydrofobní zbytek, . R¹ je sekvence 5 L-aminokyselin a R³ je. jedna L-aminokyselina., nebo R.¹ je sekvence 3 L-aminokyselin a R^J je sekvence 3 L-aminokyselin,

R² je skupina podle obecného vzorce II nebo III,

(II)

(III) kde

Ra a Rb jsou nezávisle vybrány ze souboru obsahujícího vodík a alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a A je metylenová skupina (CH₂) nebo kyslík, ί

• · • v • · a R⁴ je OH, NH₂ nebo NRcRd, kde Rc je vybrána ze souboru obsahujícího alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku,· a dále skupinu 2-karbamoylcyklopentylovou, 2-pyridylmetyiovou, 4-karbamoyIcyklohexylovou, 4-karbamoyicykíohexyimetylovou,

3- karbamoylfenylovou, 4-karbamoy'lfenyiovou, 4-(karbamoyimetyl)fenylovou, 4-(karboxymetyl)fenylovou, 4-(metoxykarbonylmetyl)fenylovou, 2-morfolinoetylovou a skupinu podle obecného vzorce -A^G¹, kde

A¹ je alkylenové skupina se 3 až 7 atomy uhlíku nebo je A¹ vybrána ze (1) skupiny obecného vzorce -A²-B^z, kde A² je p-fenylenová nebo 1,4-cyklohexylenová skupina a 3 je alkylenové skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo A² je metylenová skupina a 3^ je p-fenylenová nebo 1,4-cyklohexylenová skupina, a (2) skupiny podle obecného vzorce -A³-B³-C³, kde A³ je metylenová skupina, B³ je p-fenylenová nebo

1,4-cyklohexylenová skupina a C³ je alkylenové skupina s 1 až 3 atomy uhlíku, a

Gí je skupina podle obecného vzorce -N=C[N(Rp₂) ] ₂, kde každá Rp je vybrána nezávisle ze souboru obsahujícího vodík, metylovou, etylovou a propylovou skupinu, nebo’ A¹ je skupina podle obecného vzorce -A⁴-B⁴, -kde A⁴ je p-fenylen a B⁴ je -CH₂-CO- a G¹ je 2-morfolinoetylová nebo

4- [2-(hydroxyetoxy)etyl]piperazin-l-ylové skupina, a Rd je vodík nebo alkylová skupina s i až 4 atomy uhlíku, nebo

R⁴ je 1-piperazinylová, 4-metyl-l-piperazinylová, 4-amidino1-piperazinylová, 4-[2-(hydroxyetoxy)etyl]-1-piperazinylová,

1-piperidylová skupina nebo 4-substituovaná-l-piperičylová skupina, kde substituent v poloze 4 je vybrán ze souboru obsahujícího karboxylovou, karbamoylovou, N-(2-amino• 4 * 4 4 ·4·4 4 · 4 *444 44 44 44 44 44

-6etyl)karbamoylovou a N-(4-aminobutyl)karbamoylovou skupinu, nebo

R⁴ je sekvence 1 až 6 aminokyselin nebo jejich amidů, nebo jeho farmaceuticky přijatelnou sůl.

Přitom aminokyselina v R⁴ může být buď D- nebo L-stereoizomer. Dále pokud je R⁴ definována jako hydroxylová skupina (OK), rozumí se tím hydroxylové skupina C-koncové aminokyseliny z R³. Podobně pokud je R⁴ definována jako NH₂, NRcRd, prperazinylová'nebo piperidylová skupina atd., znamená to, že hydroxylová skupina Okonce aminokyseliny z R³ je nahrazena touto skupinou. Pokud se zde užívá termín aminokyselina, je tím míněnana aifa-aminokyselina. Dále pokud se zde užívá termín L-aminokyseiina, zahrnuje také aminokyseliny jako Gly, 2,2-dietyiGly, aza-alanin a azaglycin, které nemají žádný chirální atom uhlíku. Generický termín jako „alkylová skupina zahrnuje varianty jak s přímým tak i rozvětveným řetězcem, pokud to počet uhlíků dovoluje. Ta samá konvence platí i pro ostatní radikálové skupiny.

V oboru je dobře známo, že sloučeniny mající chirální centrum mohou existovat ve formě racemické směsi (nebo směsi diastereomerů pokud existuje více než jedno chirální centrum) nebo jako opticky aktivní enantiomer nebe diastereoizomer. V oboru je také- dobře známo, že konkrétní biologická aktivita spojená ' s racemickou nebo diastereomerickou směsí je důsledkem, a to z větší části nebo i výlučně, aktivity jediného opticky aktivního izomeru. Je třeba rozumět tomu tak, že vynález se týká jakékoliv formy peptidového derivátu podle obecného vzorce I, které vykazují .výše uvedené farmaceuticky výhodné vlastnosti. Způsob, jak získat jednotlivý opticky aktivní izomer, je v oboru dobře znám, např. se jedná o seperaci z racemické nebo diastereomerické směsi obsahující izomer pomocí konvenčních technik jako je « «

-7chromatografie, nebo chirální syntézou užívající za výchozí materiál vhodný opticky aktivní materiál nebo meziprodukt, jako je tomu v dále uvedených příkladech. Taktéž je v oboru dobře známo, jak stanovit farmakologické vlasnosti takových racemických nebo diastereomerických směsí a jednotlivých opticky aktivních izomerů, např. pomocí testů popsaných v této přihlášce. Odborník je proto snadno schopen získat určité izomery peptidových derivátů· podle vzorce I, které mají výhodné farmakologické vlasnosti zde uváděné.

Je tudíž také zřejmé, že předkládaný vynález zahrnuje jakoukoliv polymorfní formu, jakýkoliv tautomer nebo jakýkoliv solvát nebo jejich směs, peptidového derivátu podle obecného vzorce I, který vykazuje výhodné farmakologické vlasnosti zde uvedené.

Vhodné hodnoty pro α-aminokyseliny v R¹ a R³ zahrnují např. 20 přirozeně se vyskytujících aminokyselin kódovaných genetickým kódem, zvláště alanin (Ala), kyselinu giutamovou (Glu), glycin (Gly), hístidin (His), izoieucin (Ile), lysin (Lys), asparagin (Asn), glutamin (Gin), arginin (Arg), threonin (Thr), valin (Val) a prolin (Pro). Aminokyseliny jako je např. sarkosin (Sar), 3,3,3-trifluoro-alanin, 2,2-díetylglycin, kyselina 2,3-diaminopropanová (Dap), kyselina

2,4-diaminobutanová (Dab), kyselina 2-amino-butanová (Abu), homoarginin, homofenylalanin, trans-4-hydroxiprolin (Hyp), aza-alanin (Azala, H₂N-N(CH3}-COOH), aza-glycin (Azgly, H₂NNH-COOH), kyselina 1,2,3,4-tetrahydro-izochinolin-3-karboxylová (Tic), kyselina oktahydroindol-2-karboxylová (Oíc) a kyselina dekahydroizochinolin-3-karboxylová (Die) jsou také vhodné (pokud se týče Die, jde o formu, ve které obě kruhová spojení mají R konfiguraci nebo obě- mají S konfiguraci) . Odpovídající N²-metylované aminokyseliny se mohou použít, stejně tak jako odpovídající aminokyseliny, kde volná • φφ » · · I φ· φφ

-8karboxylová skupina postranního řetězce je esterifikována (např. jako alkylester s alkylovou skupinou s 1 až 6 atomy uhlíku nebo benzylester) a volná aminoskupina postranního řetězce je alkylována (např. metylována), acetylována nebo přeměměna na karbamát (např. alkylkarbamát, jako např. -metylnebo etylkarbamát, a fenyl- nebo benzylkarbamát.

Další vhodné hodnoty pro R¹ a R² zahrnují např.

2-substituovaný glycin, kde substituent v poloze 2 je skupina podle obecného vzorce -(CH₂)₃NH₂, kde s je 1 až 3, nebo skupina podle obecného vzorce - (CH?)_PN(Re) ₃\X', kde p je 2 až a X~ je opačný ion (jako např. acetát, trifluoroacetát, hydroxid nebo chlorid), nebo skupina podle obecného vzorce - (CH₂) _qN(Re) ₂, kde q je 0 až 4, nebo skupina podle obecného vzorce - (CH₂)_rN=C [N(Re) ?}2, kde r je 1 až 4, a Re je ve třech předchozích skupinách vybráno nezávisle ze souboru obsahujícího vodík a alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku (např. metylovou nebo etylovou skupinu).

Hodnota pro R^L zvláště zajímavá v případě, kdy jde o sekvenci 5 aminokyselin, zahrnuje např. sekvence s pátou aminokyselinou (při čtení z leva do prava) Val nebo Thr a sekvence, kde čtvrtou a pátou aminokyselinou jsou Lys-Val, Arg-Val, Lys-Thr, Arg-Thr, Ala-Vai nebo Ala-Thr.

Zvláštní hodnoty pro R¹, kdy jde o sekvenci aminokyselin, zahrnují např. Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Ala-LysAla-Ala-Val, Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Val, A.laLys-Ala-Lys-Val, Ala-Arg-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Lys-Val, Ala-Lys-Ala-Arg-Val, Ile-Ala-Ala-Arg-Thr, Arg-Ala-Ala-AlaVal, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-AlaArg-Thr, Ala-Ile-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-His-Val, Ala-ArgAla-Ala-Thr, Ala-Ala-Asn-Arg-Val nebo X-Ala-Ala-Ala-Thr, kde X je -NH.CH[CH₂NH.C(=NH).NH₂] .CO- (dále se označuje tato skupina termínem „Gap) nebo -NH.CH (CH₂N=C['N(CH₃) 2]2)-CO• · · *>

• · *· *·· · * • · · ** *· • ··

-9(dále se označuje tato skupina termínem „GapMe4), přičemž výhodné skupiny jsou Aia-Ala-áda-Lys-Val, Arg-Ala-Ala-AlaVal, Arg-Ala-AIa-AIa-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Thr, Ala-Arg-AlaArg-Thr, Gap-Ala-Ala-Ala-Thr a GapMe4-Ala-Ala-Ala-Thr. Zvláště výhodné pak jsou skupiny Arg-Aia-Ala-Ala-Val a Arg'Ala-Ala-Aia-Thr.

Hodnota pro R¹ zvláště zajímavá v případě, kdy jde o- sekvenci 3 aminokyselin, zahrnuje např. sekvence, ve které aminokyselina sousedící s R² je Ala a sekvence, ve které druhá a třetí aminokyselina (při čtení z leva do prava) jsou Lys-Ala, Arg—Ala, Ile—Ala a Ala—Ala.

Hodnota pro R^L zvláště zajímavá v případě, kdy jde o sekvenci 3 aminokyselin, zahrnuje např. sekvence Ala-LysAla, Ala-Arg-Ala, Arg-Ala-Ala, Arg-Ile-Ala, Arg-Ile-Arg a Ile-Arg-Ala, a zvláště Ala-Arg-Ala.

Hodnota pro R³ zvláště zajímavá v případě, kdy jde o sekvenci 3 aminokyselin, zahrnuje např. sekvence, kde první aminokyselina (při čtení z leva do prava, tj. sousedící s R²) je Ala nebo Leu.

Výhodná hodnota R³ , kdy jde o sekvenci 3 aminokyselin, zahrnuje např. Ala-Ala-Ala, Leu-Arg-Ala a zvláště Ala-ArgAla.

Výhodná hodnota R³ , kdy jde o jednu aminokyselinu, zahrnuje např. Ala, Gly a Azgly, a zvláště Ala.

Konkrétní hodnoty pro Ra a Rb zahrnují v případě, še se jedná o alkylové skupiny, např. metylovou, stylovou a propylovou skupinu.

Výhodné hocnty Ra a Rb zahrnují např. vodík a metylovou skupinu.

Vhodná hodnota pro hydrofobní zbytek P (který je výhodně připojen k aminoskupině N-koncové aminokyseliny v R¹) zahrnuje např. organickou hydrofobní skupinu jako je např.

* « *· • · ··· ··· ·«·· · · · ··«· ·· ·· ·· ·· ··

- 10hydrofóbní alifatická, aromatická, heteroaromatická nebo smíšená alifatická/aromatická nebo alifatická/heteroaromatická organická skupina s 5 až 20 atomy uhlíku (a i, 2 nebo 3 heteroatomy vybrané ze souboru obsahujícího kyslík, síru a dusík pro skupiny obsahující heteroarylovou skupinu), např., skupin . podle obecného vzorce R-, R.CO-, R.SO₂-, R.O.CO-, R.NHCO-, R.O.CS-, R.S.CO-, R.NHCS-, R.S.CS- a R.CS-, kde R zahrnuje např. alkylovou skupinu s 5 až 10 atomy uhlíku, arylovou, heteroarylovou, arylalkylovou, kde alkylová skupina obsahuje 2 aš 10 atomu uhlíku, heterorylaikvlovou, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 10 atomů uhlíku, diarylalkylovou, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 3 atomů uhiíku, arylalkenylovou, kde alkenylové skupina obsahuje 2 až 10 atomů uhlíku, arylcyklopropylovou, cykloalkylovou s 3 až 10 atomy uhlíku, cykloalkylalkylovou, kde cykloalkylové skupina obsahuje 5 až 10 atomů uhlíku a alkylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku, 3-bifenylovou, 4-bifenylovou, 4-cyklohexylfenylovou, 2-naftyloxymetylcvou, 3-naftyloxymetylovou, fenoxyfenylovou a tetrahydronaftylovou skupinu, a arylovou nebo heteroarylovou skupinu, jejíž R hodnota nese. jako substituenty jednu nebo více skupin alkylových s 1 až 4 atomy uhlíku, halogenových, kyanových nebo alkoxyových s 1 a.ž 4 atomy uhlíku..

Jedno provedení vynálezu např. zahrnuje, peptidové deriváty podle, obecného vzorce I, kde P j.e. R.CQ- ve smyslu výše uvedené definice. Další zvláštní provedení vynálezu např, zahrnuje peptidové. deriváty podle obecného vzorce I, kde P je hydrofobní alifatická, aromatická nebo alifatická/aromatická organická skupina s 5 až 20 atomy uhlíku.

Zvláštní hodnot·v R Tsbrnuií . nnknd no to Allrvlová skupina s 5 až 10 atomy uhlíku, např.: pentylovou, i · ♦· • · · • » « «φ «« * * φ

* « · • φ · · • · · • ΦΦΦ ·»

- II isopentylovou, terč.pentylovou, 2-metylpentylovou, hex.ylovou, isohexylovou, 5-metylhexylovou a oktylovou skupinu, pokud je to arylová skupina, např.: fenyiovou, naftylovu a indenylovou skupinu, pokud je to heteroarylová skupina, např.: 2-, 3-, 5nebo 6-indolylovou, 2-, 3-, 5- nebo 6-indoiinylovou, 2-, 3-,

5- nebo 6-benzo[b]thiořenylovou, thienylovou, 2-, 4- nebo 5benzothiazolylovou, 2-, 4- nebo 5-benzoxazoiylovou, 2-, ' 4nebo 5-benzimidazolylovou, 1,4-benzodioxanylovou s vazbou v poloze 2-, 3-, 6- nebo 7-, a 2-, 3-, 5- nebo 6benzofuranylovou skupinu, pokud je to arylalkylová skupina, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 10 atomů uhlíku, pak: arylalkylovou skupinu, kde alkylové skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku (a kde arylová skupina zahrnuje např. kteroukoliv ze specifických hodnot pro arylovou skupinu uvedenou výše a alkylová skupina zahrnuje např. metylenovou, etylenovou, trimetylenovou, tetrametylenovou a pentametylenovou skupinu) jako např..: 2-fenyletyiovou, 3-fenylpropylovou, 4-fenylbutylovou a 5-fenylpentylovou skupinu, pokud je to heteroarylalkylová skupina, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 10 atomů uhlíku, ' pak: heteroarylalkylovou skupinu, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku (a kde heteroarylová skupina zahrnuje např. kteroukoliv hodnotu pro heteroarylovou skupinu uvedenou výše a alkylová skupina, zahrnuje např. metylenovou, etylenovou, trimetylenovou, tetrametylenovou a pentametylenovou skupinu) jako je 2-(2kyano-benzo[b]ťniofen-5-yl)etylová skupina), pokud je to diarylalkylová skupina, kde alkylová skupina obsahuje 2 až 8 atomů uhlíku, pak: diarylalkylovou skupinu, kde' alkylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku, jako je 2,2difenyletylová, 3,3-difenylpropylová a 4,4-dífenylbutylová skupina, pokud je to arylalkenylová skupina, kde alkenylové skupina obsahuje 2 až 10 atomů uhlíku, pak: arylaikenylovou » · ·· • ΒΒΒ · « · *

ΒΒ Β«

Β · »«·« ΒΒ « ··

Β Β Β Β ► · · ·

ΒΒ ·Β

12skupinu, kde alkenylová skupina obsahuje 2 až 6 atornů uhlíku, jako styrvlová, 3-£enylpropen-2-ylcvá a 4-fenyl-buten-l-ylová skupina, pokud je to arylcyklopropylová skupina, pak: fenylcykiopropylovou, l-naftylcyklopropylovou a 2-naftylcyklopropylovou skupinu, pokud je to cykloaikvlová skupina s 5 až 10 atomy uhlíku, pak: cyklpentylovou, cyklohexylovou a 1-aaamantylovou skupinu, pokud je to cykloalkylalkylová skupina, kde cykloalkylová skupina obsahuje 5 až 10 atomů uhlíku a alkylová skupina obsahuje 2 až 6 atomů uhlíku, pak:

2- (cyklohexyl)©tylovou, 3-(cyklohexyl)propylovou a -4-(cyklohexyl)butylovou skupinu. Zvláštní hodnota pro substituent na arylové skupině R zahrnuje např. metylovou a etylovou skupinu, chloridovou, bromidovou a jodidovou skupinu, metoxyskupinu, etoxyskupinu a kyanovou skupinu.

Hydrofobní zbytek' R také zahrnuje např. hydrofobní L-aminokyselinu jako je fenylalanin (Phe) a její hydrogenované analogy jako je cyklohexylalanin (Cha), parachloroPhe, 3-(2-thienyl)alanin, tyrosin (Tyr), Tyr(Ometyl), tryptofan (Trp), bifenylalanin, 3-(1-naftyl)alanin, 3—(2naftyl)alanin a jeho hydrogenované analogy, 3-(1adamantyl)alanin (Ada), Glu(Obenzyl), 3-(benzyloxy)Ala,

3- (benzylsulfanyl)Ala a 9-fluorenyiGly, z nichž každý může případně nést na N-konci hydrofobní alifatickou, aromatickou, heterparomatickou nebo smíšenou alifatickou/aromatickou nebo aiifatickou/heteroaromatickou organickou skupinu jak je definováno nebo uvedeno v příkladech výše. Alternativně hydrofobní aminokyselina může připadne nést např. další sekvenci 1 až 3 aminokyselin vybraných 2 kterékoliv z hodnot pro R^L a R³ definovaných výše. Tak např. P zahrnuje konkrétně sekvence Ala-Cha, Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-Ala-Cha, Tyr-Ala-AlaPhe, Ala-Phe-Phe-Phe a Ala-Ala-Ala-Phe. První aminokyselina takové další sekvence 1 až 3 aminokyselin (při čtení z leva

- 13 9 9 9 9 »·» · 999 « 99* * * *· ·** · ⁹

9 9999 999

99 99 99 99 99 go prava) může být L- nebo D-aminokyselina a může případně nést hydrofobní alifatickou, aromatickou, heteroaromatickou nebo smíšenou alifatickou/aromatickou nebo alifatickou/heteroaromatickou organickou skupinu jak je definováno nebo uvedeno v příkladech výše.

Další zvláštní hodnoty pro P zahrnují např. 3-(benzyloxykarbonyl )propionyi-Phe, 3-(benzyloxykarbonyl)pro-pionylCha, 4-(benzyloxykarbonyl)butyryl-Phe, 4-(benzyloxykarbonyl)butyryl-Chs, (5-oxopyrrolidin-2-yl)karbonyl-Phe-Tyr, (5-oxopyrrolidin-2-yl)karbonyl-Glu(Obenzyl)-Tyr, acetylGlu(Obenzyl)-Tyr, dif enylmetyl. CONH. CH₂.CH₂.CO-Cha, difenylmetyi . CONH. CK₂. CH₂ · CO-Tyr, difenylmetyl. CONH. CH₂CH₂CH₂-CO-Cha, difenylmetyl. CONHCH₂CH₂CH₂. CO-Tyr, difenylmetyl.NHCOCH₂CH₂CH₂.C0-Cha, di fenylme tyl .NHCOCH₂CH₂CH₂. CO-Tyr, benzyl. NHCOCH₂CK₂CO-Cha, benzyl .NHCOCH₂CH₂CO-Tyr, N-acetyl-4chloro-beta-hydroxyPhe, 4-fenoxyfenyl.NHCO-, benzyl .NHCO.CH₂CH₂CO. (N-metyiPhe), benzyl. NHCO. CK₂CH₂.CONH. CH (CHPh₂) . CO, benzyl. NHCO.CH₂CH₂CO-Tyr, a dále 3,3-difenyl-propionylovou, trans-cinamoylovou, 5-fenylvaleryiovou a 3-(2-kyano-benzo[b]thiofen-5yl)propionylovou skupinu.

Hodnota P zvláště zajímavá zahrnuje např. Ph(CH₂)₄.CO(5-fenylvaleryl(Phv)), Ph.(CH₂)4.CS a 3-(2-kyanobenzo[b]thiofen-5-yl)propionylovou skupinu.

Výhodná hodnota pro hydrofobní zbytek P zahrnuje např,

3-(2-kyano~be.nzo [b] thiofen-5-yl) propionylovou a zejména 5-fenylvalerylovou (Phv) skupinu.

Když Rc je skupina podle obecného vzorce -A^G¹, zvláštní hodnota pro A¹, pokud je to alkylenová skupina, zahrnuje např. metylenovou, etylenovou, propylenovou a butylenovou skupinu, zvláštní hodnota pro B², pokud je to alkylenová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, zahrnuje např.

• »· ** ·«· · » · · »·· · · ··· · · *1 · · · · ··«« ·♦ ♦« *· ·· ··

- 14metylenovou, etylenovou a propylenovou skupinu, a zvláštní hodnota pro C³, pokud je to alkylenová skupina s 1 aš 3 atomy uhlíku, zahrnuje např. metylenovou, etylenovou a propylenovou skupinu.

Zvláštní hodnota pro -A^G¹ 'zahrnuje např. 3-guanidinpropylovou, 4-(2-guanidinetyl)fenylovou, 4-(2-morfolino-etyiNH.CO.CH₂)fenylovou a 4-(4-[2-(2-hydroxy-etoxy)etyl]piperazin-l-yi.CO.CH2)fenylovou skupinu.

Zvláštní hodnota pro R⁴, pokud je to sekvence 1 až 6 aminokyselin nebo jejich amidů, zahrnuje např. sekvenci L-aminokyselin nezávisle vybranou z hodnot R¹ a R³ definovaných výše (jako je Ala-Thr-Gly-OH), nebo příslušných D-analogů, nebo sekvence obsahující jak D- tak L-aminokyseliny, nebo jejich amidy, jako je amid odvozený z amoniaku, alkylamin s alkylovou skupinou obsahující 1 aš 4 atomy uhlíku (jako· je metylamin) nebo dialkylamin s alkylovou skupinou obsahující 1 až 4 atomy uhlíku (jako je dimetylamin) . Zvláštní soubor hodnot pro R⁴ zahrnuje např.. hodnoty definované zde v případě že R⁴' není sekvence 1 až 6 aminokyselin.

Výhodná hodnota pro R⁴ zahrnuje např. 4-karbamoyl-lpiperidylovou skupinu (zbytek piperidin-4-karboxamidu, Pip-NH₂), 4-karboxy-l-piperidylovou (zbytek piperidin-4karboxylové kyseliny, Pip-OH), 4-(karbamoylmetyl)anilinovou (zbytek 4-aminofenylacetamidu, Papa-NH₂, 4-(karboxymetyl)anilinovou (zbytek 4-aminofenyloctové kyseliny, Papa-OH) a 4-(2-guanidinetyl)anilinovou skupinu (zbytek 2-(4aminofenyl)etylguanidinu, Pape-NHC(=NH)NH₂) .

Zvláštní soubor hodnot pro R⁴ zahrnuje např. Pic-NK₂,

Papa-NH₂, Pape-NHC(=NH)NH₂) a NHRc, kde Rc je 3-guanidinpropylová, 2-morfolinetylová nebo 4-(2-(2hydroxyetoxy)etyl-1píperazinylová skupina.

« « ·» · · ·· * « « · · » ··»· · * · » · ··„.* »· ·· ·· • · · * · • · · • ·* · ·* výhodná hodnota pro R² zahrnuje např., skupinu podle

;ila)

Λ

libí

Výhodný soubor peptídových derivátů podle vzorce P zahrnuje např... peptidové deriváty,, kd.e R¹ je sekvence 5 L-aminokyselin a R³ je jedna L-aminokyselina, přičemž sekvence R¹ a R³ máji kteroukoliv z hodnot definovaných výše, včetně zvláštních a výhodných hodnot pro R¹ a R³. V rámci tohoto souboru zvláště výhodný podsoubor peptídových derivátů obsahuje např. takové, kde R² je skupina podle vzorce II, zvláště pak podle Ha a zejména lib. Další podsoubor zvláště výhodných peptídových derivátů zahrnuje např. takové, kde R^q je -Pip-OH, -Pip-NH2, -Papa-OH nebo Papa~NH2. Zvláště výhodný podsoubor sloučenin zahrnuje např. takové, kde R³ společně s R⁴ je Ala-Pip.NH2 nebo Ala-Papa-NH₂.

Další výhodný soubor peptídových derivátů podle vynálezu zahrnuje např. takové, kde R¹ je sekvence 5 L-amínokyselin podle vzorce AA1-AA2-AA3-AA4-AA5, kde

AA1 je vybrána ze skupiny obsahující Ala, Iie, Tyr, Val, Glu,

Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe4 a 3,3,3-trifluoroalanin, zvláště

Ala, Ile, Arg, Gap a GapMe4, zejména Ala, Arg a GapMe4 a hlavně Ala a Arg, * · · φ φ φ · φ · >

«φφφ φφ • * φφ φ φ φ · φ · φ φ «φ «φ

ΦΦΦΦ • φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ

- 16ΑΑ2 je vybrána ze skupiny obsahující Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-trifluoroalanin a N⁶dietylLvs, zvláště Ala, Arg, Ile, Lys a Tic, zejména Ala, Arg, Lys a Ile a hlavně Ala a A.rg,

AA3 je vybrána ze skupiny obsahující Ala, His, Gin, Val, Thr, glu, Gly, Asp a N³-dietylDap, zvláště Ala, His, Asp a Asn, zejména Ala a Asn a hlavně Ala,

AA.4 je vybrána ze skupiny obsahující Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar, Gly, Pro, His a N6-dietylLys, zvláště Ala, Arg, Lys a His, zejména Ala, Arg a His a hlavně Ala, a AA5 je vybrána· ze skupiny obsahující Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn a N3-dietylDap, zvláště Thr, Val a Dap, zejména Thr a Val, a kde R³ je jedna aminokyselina vybraná ze souboru obsahujícího Ala, Gly, Dap, ázaalanin a azaglycin, zvláště Ala, Gly a azaglycin, zejména Ala a Gly a hlavně A.la, a kde P, R² a R⁴ mají kteroukoliv hodnotu definovanou výše, včetně zvláštních a výhodných, v rámci tohoto souboru zvláštní podsoubor sloučenin obsahuje např. takové, kde sekvence ΑΑ.1-ΑΛ2-ΑΑ3-ΑΑ4-ΑΑ5 je vybrána ze souboru obsahujícího Ala-Ala-Ala-Lys-Val, Ile-Ala-Ala-Arg-Thr, ArgAla-Ala-Ala-Val, Arg-Ala-Ala-Ala-Thr, Ala-Ala-Ala-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Arg-Val, Ala-Ile-Ala-Arg-Val, AlaArg-Ala-His-Val, Ala-Ala-Asn-Arg-Val, Ala-Arg-Ala-Ala-Thr, Ala-Arg-Ala-ArgThr, Gap-Ala-Ala-Ala-Thr, GapMe4-Ala-Ala-Ala-T'nr a Ala-AlaAla-Arg-Thr. Výhodné jsou sloučeniny, kde R⁴ je Pip-NH₂, .Papa-NH₂ a Pape-NHC (=NH) NH₂.

Další výhodný soubor peptidových derivátů podle vynálezu obsahuje např. takové, kde R^L je sekvence 3 L-aminokyselin podle vzorce AA1-AA2-AA3, kde

AA.l je vybrána ze souboru obsahujícího Ala, Ile, tyr, Val,

Glu, Gap, GapMe4 a 3,3,3-trifluoroalanin, zvláště Ala, Ile, • ··

Arg, Gap a GapMe4, zejména Ala, Arg. a GapMe4 a hlavně Ala a Arg,

AA2 je vybrána ze souboru obsahujícího Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tic, 3,3,3-trifluoroalanin a N°-díetylLys, zvláště Ala, Arg,' Ile, Lys a Tic, zejména Ala, Arg, Lys a Ile a hlavně Ala a Arg,

AA3 je vybrána ze souboru obsahujícího Ala, His, Gin, Val, Thr, glu, Gly, Asp a N³-dietylDap, zvláště Ala, His, Asp a Asn, zejména .Ala a Asn a hlavně Ala, a R3 je sekvence 3 L-aminokyselin podle vzorce AA6-AA7-AA3, kde AAG je vybrána ze souboru obsahujícího Gly, Leu, Lys, Ala, Pro, Glu, Ser, His a Dap , zvláště Ala, Leu a Pro, zejména Ala,

AA7 je vybrána ze souboru obsahujícího Pro, Ala, Lys, Arg, Glu, Sar, Gly, Oic a Die, zejména Ala a Arg, a AA8 je vybrána ze .souboru obsahujícího Ala, Gly, Dap, azaalanin a azaglycin, zvláště Ala, Gly a azaglycin a zejména Ala, a P, R² a R⁴ máji kteroukoliv hodnotu definovanou výše včetně zvláštních a výhodných hodnot. V rámci tohoto souboru zvláštní podsoubor sloučenin zahrnuje např. takové, kde sekvence AA1-AA2-AA3 je vybrána z Ala-Lys-Ala a Ala-A.rg-Alá a sekvence AAG-AA7-AA3 je vybrána z Ala-Ala-Ala a Ala-ArgAla. Výhodné jsou sloučeniny,kde R⁴ je je Pip-NH₂, Papa-NH₂ a Pape-NHC(=NH)NH₂.

Výhodný aspekt předkládaného vynálezu obsahuje peptidové deriváty podle obecného vzorce I, kde R² je skupina podle vzorce II (a zejména kde A je metylenová skupina), zejména podle vzorce lib, a P, R¹, R³ a R⁴ mají kteroukoliv z hodnot výše definovaných, včetně zvláštních a výhodných hodnot.

Další výhodný aspekt předkládaného vynálezu obsahuje peptidové deriváty podle obecného vzorce I, které obsahují • 0 ··· 0

0 «*

- 18% argininový zbytek, zvláště sloučeniny, ve kterých první aminokyselionový zbytek v R^l (při čteni z leva do prava), pokud je R¹ sekvence 5 L-aminokyselin, je argíninyl (jako např. Arg-Ala-Ala-Ala-Val a Arg-Ala-Ala-Ala-Thr) a sloučeniny, ve kterých druhý aminokyselinový zbytek v R¹, pokud je to sekvence 3 L-aminokyselin, je argininyl a/nebo druhý aminkyselinový zbytek v R³, pokud je to sekvence 3 L-aminokyselin, je argininyl (jako když R¹ je Arg-Ala-Ala a R² je Ala-Ala-Ala nebo když jak R¹ tak i R² je Ala-Arg-Ala).

Další aspekt předkládaného vynálezu obsahuje peptidové deriváty podle obecného vzorce I, kde R² je skupina podle vzorce lila nebo Illb,

(Illb) a kde P, R¹, R³ a R⁴ máji kteroukoliv hodnotu z výše uvedených včetně zvláštních a výhodných hodnot.

Mezi zvláště zajímavé sloučeniny podle vynálezu patří např. specifické provedení vynálezu v oddíle Příklady provedení vynálezu. Z nich sloučeniny uvedené v příkladech 5,

16, 19, 23 a 24 jsou zvláště důležité a jak tyto sloučeniny «··» · »· · ·;·..* ··· · · ·· · * ·· ·· «·· · · ·· ···· · • * * Λ Λ Λ ♦ · · · «·· · ♦· ·· · • · · · · ·· ·«

19tak jejich farmaceuticky přijatelné soli jsou dalšími aspekty vynálezu.

Vzorec sloučeniny z příkladu 5 (sekvence identifikačního čísla 5):

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Vai-N'

H

O

Ala-N CONH,

Vzorec sloučeniny z přikladu 16 (sekvence identifikačního čísla 17) :

Phv—N H

CO-Aia-Ala-Aía-Thr-N' H

N

Ala-N

H

x 7-CH₂CONH,

Vzorec sloučeniny identifikačního čísla 20) ;

z přikladu 19 (sekvence

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-N'·

H

N

O

Gly-N·

W //

NH >-nh₂

N

H

Vzorec sloučeniny z příkladu 23 (sekvence identifikačního čísla 24):

Phv-Ala-Arg-Ala-N‘'·

H

N

O

N-Aía-Arg-Ala-N- CH₂CONH₂ Η H •φ·· ·· φ · φ > φφ

-20Vzorec sloučeniny z příkladu 24 (sekvence identifikačního čísla 25):

Farmaceuticky přijatelné soli zahrnují pro peptidové deriváty, které jsou dostatečně zásadité, např. takové soli, které mají volnou aminoskupinu, soli s kyselinami, které tvoří fyziologicky přijatelné anionty, ' jako jsou soli s minerálními kyselinami, např. .halogenovodíky (jako je např. chlorovodík a bromovodík), kyselinou sulfonovou a fosfonovou, a s organickými kyselinami jako kyselinou octovou, oxalovou, vinnou, mandlovou, p-toluensulfonovou, metansulfonovou, trifluoroctovou a pod., a pro peptidové deriváty, které jsou dostatečně kyselé, např. takové soli, které mají volnou karboxylovou skupinu, soli se zásadami, které tvoří fyziologicky přijatelné kationty, jako jsou soli s alkalickými kovy (jako sodík a draslík), s kovy alkalických zemin (jako hořčík a vápník), amoniové soli a soli hliníku, a také soli s vhodnými organickými zásadami jako je etanolamin, metylamin, dietylamin, izopropylamin, trimetylamin a pod..

Peptidové deriváty podle vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli, jak bylo již uvedeno výše,

-21 • 44 • 4 · 4 4 4 « 4 4 4 »444 · 4 4 4 44 44 44 ί-?

budou prospěšně farmakologicky působit u teplokrevných živočichů (včetně člověka) na řadu autoímunitních nemocí nebo stavů, a to jak pro léčení symptomů nebo jako nemoc modifikující agens nebo jako profylaktický přípravek. Mezi takové nemoci patří např. revmatoidní artritís, roztroušená skleróza mozkomíšní, Goodpastureův syndrom, idiopatická trombocytopenická purpura, juvenilní revmatoidní artritís, celiakie, systémový lupus erytemátodes, ankylozující spondylartritis, Sjogrenův syndrom, myasthenia gravis, diabetes I. typu (závislý na inzulinu), Hashimotova nemoc, Graveho nemoc, Addissonova nemoc, sklerodermie, polymyositis, dermatomyositis, pemfigus, pemfigoid, utoimunitní hemolytická anémie, perniciózní anémie, glomerulonefritis, odvržení štěpu a pod., zejména však revmatoidní- artritís a roztroušená skleróza mozkomíšní (sclerosis multiplex).

Užitečnost peptidových derivátů podle vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelných solí je možné hodnotit pomocí různých standardních testů a klinických studií, včetně těch, které jsou popsány v mezinárodních patentových přihláškách WO 92/02543, WO 93/05011 a WO 95/07707 (a jejich modifikací) a také těch, které jsou dále popsány v přihlášce. Peptidové deriváty podle vzorce I vykazují významnou aktivitu v jednom nebo ve více takových testech a studiích.

Test A: In vitro vazbový test s purifikovaným peptidem HLA-DR (Tento test je vhodný k prokázání vazby peptidového derivátu podle vzorce I $ molekulami MHC II. třídy spojenými s nemocí.) .30 μΐ biotin-FHA307-32o (peptid FHA(307-320) derivát izovaný dlouhým řetězcem biotinu na N-konci, biotin-Ahx-Pro-Lys-TyrVal-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) v koncentraci

800nM ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) se • 0 • 0« • 0 0 00 00

:.1

-22inkubuje se 30 μΐ purifikovaného HLA-DR4Dw4 v koncentraci 0,5 až 5 pg v jamkách tvaru V na mikrodestičce (Nunc) po dobu 43 hodin buď s inhibitorovým peptidem nebo bez něho. Na konci inkubace se 100 μΐ přenese na ELISA mikrodestičku (Nunc) předem pokrytou protilátkou anti-MHC· (L243-ATCC (Americká kolekce mikroorganismů) HB55, jak publikovali Lampson a Levý, 1980, J. Immunol. 125, 293-299) v koncentraci 10 pg/ml po 1 hodinu při teplotě místnosti a poté se blokuje 1 % roztokem hovězího sérového albuminu (BSA) v PBS a 0.05% Tween20. Po další hodině se nenavázaný peptid opláchne a přidá se streptavidinperoxidáza (Sigma) neředěná 1/4000 v PBS s 0,01 % vhodného detergentu jako je NP-40 (Sigma) na 2 hodiny při teplotě místnosti. Po dalším opláchnutí se přidá na každou destičku tetrametylbenzičenový (TMB) substrátový roztok (1 tableta TMB (Sigma) v 10 ml 0,1 M citrát/acetátového pufru, pH 6,0, s 36 pl peroxidu močoviny (UHPO) (Eluka),. Reakce se zastaví přidáním 2M kyseliny sírové (10· pl do každé jamky) a množství navázaného peptidu se kvantifikuje měřením absorbance při vlnové délce 450 nm. Inhibiční aktivita peptidu se získá tak, že se vynese závislost absorbance na koncentraci.

Purifikované molekuly HLA-DR4Dw4 se dají získat následně popsanými způsoby.

(i) Exprese HLA-DR v bakulovirovém systému

Exprese rekombinantních proteinů z bakulovirových vektorů v hmyzích buňkách je v oboru známý způsob jak získat vysoké výtěžky rekombinantního proteinu (Luckow, V.A. a Summers,M.D., 1988, Biotechnology, 6, 47-551). Aby byla umožněna exprese heterodimerické molekuly HLA-DR, t j. HLADR4Dw4, z jediného rekombinantního bakulovirového vektoru (oproti možnosti použít dva samostatné rekombinantní viry pro a a β řetěze a pak provést koinfekci), zkonstruuje se · ·· • 00*0 *

0 0 • 0 ··

0 0 » ’ ’ ' • » · · · ·· β * · 0 · ♦ · • 0 b · · · • 0 0 0 00 · · *·

-23 dvojitý rekombinantní bakulovirus nesoucí jak a tak β řetězec.

cDNA kódující sekvenci a polypeptidu se klonuje do transferového vektoru pacYMl [Matsuura,Y., Posee, R.D., Overton, H.A. a Bishop, Q.K.L., -J. Gen. Virol. 68, 1233 — 1250)a tím se vloží exprese tohoto proteinu pod kontrolu polyhedrinového promotoru. Tato jednotka se vloží do genomu bakuloviru pomocí homologní rekombinace v hmyzích buňkách Sf21, čímž se vytvoří jednoduchý rekombinantní bakulovirus pro a řetězec; Způsoby kultivace a infekce hmyzích buněk, homologní rekombinace a detekce a izolace rekombinantního viru byly plně popsány v práci Summers, M.D.D. a Smith, G.E., 1937 (A Manual of Methods for Baculovirus vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas Agrícultural Experiment Station, Bulletin No. 1555). Molekulárně genetické techniky použité pro konstrukci rekombinantních vektorů jsou rovněž dostupné v odborné literatuře a jsou plně popsány v příručce Sambrook, J,., Fritsch, E.F. a Maniatis, T., 1989 (Molecular Cloning. A Laboratory Manual. 2nd Edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.)

Pro vytvoření dvojitého rekombiantního bakuloviru se cDNA kódující β řetězec klonuje do transferového vektoru pAcUWl (Weyer, U., Knight, S. a Possee, R.D., 1990, J. Gen. Virol. 1990, 71, 1525-1534), čímž se vloží exprese proteinu pod kontrolu promotoru P10. Tato jednotka se pak vloží do genomu jednoduchého rekombinantního bakuloviru již nesoucího a řetězec. Dvojitý rekombinantní virus se detekuje tak, že se hmyzí' buňky nanesou na membránu a ponechají se reagovat s monoklonálni protilátkou, tj. L243, která specificky rozpoznává heterodimer HLA-DR. Navázání protilátky na hmyzí buňky Sf21 se detekuje užitím standardní techniky průtokové cytometrie, která je lehce dostupná v literatuře. Stabilní

0

0

00

0 * ·· 0 t i 0 0 0 0 0

0000 00 00 00 00

- 24 dvojité rekombinantní bakuioviry exprimující HLA-DR se vyčistí z virových plaků.

(ii) Purifikace HLA-DR z hmyzích buněk

Způsob purifikace použitý zde je modifikaci způsobu který popsal Gorga et ai., 1937 (Gorga et al., 1987, J. Siol. Chem. 262, 16087-16094) . Hmyzí buňky Sf.21 s bakulovirem exprimující HLA-DR (10 1 se rovná přibližně 2,^10¹⁰ buněk) se solubilizijí ve 100 mlroztc-ku o složení: 5 mM EDTA (sodná sůl), 50 mM Tris-HCl, pH 3,5, 2 % NP40, 150 nM NaCl, i mM iodoacetamid a i mM PMSF, a to homogenizací 10 tahy skloteflonového homogenizátoru. Homogenát se centrifuguje při ÍOQQOO g po 1 hodinu a pak se sebere supernatant. Supernatant se pak přes noc inkubuje s monoklonální protilátkou anti-HLADR LB3.1 (Gorga et al., 1986, Cell ímmunol. 103, 160-172) kovalentě navázanou v poměru. 50 mg L243 k 10 ml sefarózy s A-proteinem („Protein A-Sepharose fast flow, Pharmacia) a preinkubovanou s 10 mM Tris-Hcl, pH 8,0, a 0,1 % NP-40. Pryskyřice se potom nanese do kolony a promyje roztokem 10 mM Tris-HCl, pfí 8,0, 0,1 % NP-40 (20x objem kolony) a potom roztokem 0,15 M NaCl, 50 nM Na₂HPO4, pH 7,0, 1% oktylglukosidu (20x. objem kolony). HLA-DR se poté eluuje roztokem 50 mM dietylaminu, pH 11,0, 0,15 M NaCl a 1% oktylglukosidu. Frakce se ihned neutralizují 1 M Tris-HCl, pH 8,0, a koncentrují ultracentrifugací přes membránu „Centricon-10. Obsah proteinu se určí pomocí proteinového testu BCA (Piercej a čistota pomocí SDS-PAGE elektroforéžy.

Všeobecně platí, že peptidové deriváty podle vynálezu podle vzorce I, které byly testovány v testu A, projevovaly významnou inhibici v koncentraci 10 μΜ nebo nižší.

Další výhodný aspekt předkládaného vynálezu obsahuje peptidové deriváty podle vzorce I, nebo jejich farmaceuticky přijatelné solí, které se neváží na HLA-DR3, ale váží se na ι ϊ Γ ’ •1 i ί

r. i' *' <· I? *· <:··<·*'· «ř<

♦ »l «·* i t «: i « i : «1 * << *.« i: * ť

<4 <'« * *

• I

-25HLA-DRi a/nebo HLA-DR4Dw4 a/nebo HLA-DR4Dwl4. HLA-DR3 je obecná' ale.la HLA-DR,'' která ' není spojena s revmatoidni artritid-. Tedy u pacientů s revmatoidni artritis, kteří, nesou HLA-DR3 tjako jednu’z ,alel·' (což jé; asi jedna třetina všech -pacientů s revmatoidni. artritis) / ... peptidové» deriváty-i podle -vynálezu nebudou'· narušovat. / normální funkci HLA-DR3 obrany ••hOst-ite-levŤsp.óužitív·'.takových .peptidových derivátů je proto zvláště' výhodné prodléčení pacientů s revmatoidni artritis, neboť povede k menší⁽imunosupresi, než ke které by došlo při použití nes.elektivních' vážaců DR. ' <*

Jako další varainta- k testu A pro ověření schopnosti peptidů podle vynálezu^:vázat jednu nebo více molekul HLA-DR se použije následující test.

(i) Purifikace typů HLA-DR z buněčných linií

Způsob purifikace použitý zde je modifikací způsobu který popsal Gorga et al., 1987 (Gorga et al., 1987, J. Biol. Chem. 262, 16087-16094). Lidské antigeny HLA-DR se purifikovaly z různých buněčných.· linií pomocí imunoafinitní chromatografie'. Stručně popsáno, IxlO⁹ až 5xl0⁹ peletovaných buněk, z vhodné buněčné linie vybrané ze skupiny obsahující Hcm2 (zdroj DR1), B3.F (zdroj DR2), AVL-B ) zdroj DRB), JAK (zdroj DR4Dw4), JHAF' (zdroj DR4Dwl3) a PE17 (zdroj DR4Dwl4) se solubilizovalo při 4 °C v 50 ml 5, mM EDTA (sodná sůl), 5CmM Tris-HCl, ' pH -7,4;· 2% NP40; 150 mM NaCl, 1 mM iodo.acetamidu a .1 . mM ..PMSF . homogenizací 10 tahy skloteflonového homogenizátoru. Homogenát se centrifuguje při 100000 g po 1 hodinu a pak se sebere supernatant. Supernatant se pak přes n'oc inkubuje s'monoklonální protilátkou anti-HLADR LB3.1 (Gorga ' et al., 1986, Cell immunol. 103, 160-172) kovalentě navázanou, na. CNBr-sefarózu 4B{Pharmacia) předem vyrovnanou s 150’ mM:NaCl, 50 mM Tris-Hcl, pH 7,4, a 0,1 %

NP-40. Pryskyřice se potom nanese do kolony a promyje .·»

-26roztokem 0,15 NaCl, 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1% oktylglukosid (20x objem kolony). HLA-DR se poté eluuje roztokem 50 mM dietylaminu, pH 11,0, 0,15 M NaCl a 1% oktylglukosidu. Frakce se ihned neutralizují 0,5 M HEPES-NaOH, pH 7,4. Obsah proteinu se určí pomocí proteinového testu Biorad a čistota pomocí SDS-PAGE elektroforézy.

iii) Peptidový selektivní vazbový test

200 nM biotin-FHA307_320 ve fyziologickém roztoku pufrovaném fosfátem (PBS) se inkubuje buď s purifikovanými HLA-DR1, DR2, DR4Dw4, DR4Dwl3 nebo DR4Dwl4 (2 až 20 5 .pg/ml) v jamkách tvaru V na mikrodestičce (Nunc) po dobu 48 hodin buď s inhibitorovým peptidem nebo bez něho. Pro inhibic DR3, biotin-Ahx-Pro-Lys-Tyr-Val-Lys-Gln-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-AiaThr-Gly-OH se inkuboval s purifikovanou DR3 (20 pg/ml) stejně jak je popsáno výše. Po 48 hodinách inkubace se inkubát ošetřil a změřila se absorbance stejně jak je popsáno v testu A. Inhibiční aktivita peptidu vyjádřená jako ICso hodnota byla vypočtena pomocí softwaru „Mícrocal Origin na osobním počítači.

Test B: In vitro inhibice aktivace T-buněk (Tento test je vhodný k prokázání schopnosti peptidovýh derivátů, podle vzorce I inhibovat imunitní odpověď T-buněk zprostředkovanou molekulami MHC II. třídy.)

Inhibitorové peptidy byly testovány na to, jak jsou schopny blokovat stimulaci myší T-bunéčné hybridomové linie B52.24, které odpovídá na peptid FHA307-320 (H-Pro-Lys-Tyr-ValLys-Gly-Asn-Thr-Leu-Lys-Leu-Ala-Thr-Gly-OH) presentovaný molekulami HLA-DR4Dw4. B52.24 byla vytvořena fúzí T-buněk lymfatických uzlin z transgení myši HLA-DR4Dw4 imunizované

FHA307-320 (Mezinárodní patentová přihláška WO 95/03331) s linií myších lymfomových T-buněk BW5147 (White et al., • 9**9 · · · » · · ·· φ 9 ΦΦ * 9 * Φ · Φ ·« · · φ φφ Φ * 9 9 99*

ΦΦΦΦ φφ 9* Φφ Φ· ··

- 27 1989, J. Immunol. 143, 1822) podle postupu, který popsali Woods et al, 1994 (J. Exp. Med. 180, 173-181) a podle všeobecně známého způsobu pro vytváení hybridomů T-buněk popsaného v Current Protocols in Immunology, Vol. 2, 7.21.

Inhibitorové peptidy v koncentraci mezi 100 a 0,1 uM (nebo nižší) se smíchaly s antigenním peptidem EHA307-320; a to buď také v různých koncentracích mezi 100 a 0,1 μΜ nebo ve stálé koncentraci 10 μΜ neředěním v kultivačním médiu RPMI1640 (Gibco) na 96-jamkové mikrotitrační destičce (Nunc) v-celkovém objemu 100 μΐ. B-buňky exprimující HLA-DR4Dw4 jako buněčná linie transformovaných lymfoblastoidních buněk JAH EBV (Evropská sbírka mikroorganismů ECACC 85102909) nebo B-buňky odebrané jedincům homozygotním v HLA-DR4Dw4 a transformované virem Epstein-Barrové způsobem popsaným, v Current Protocols in Immunology 7.22.1., byly fixovány pomocí glutaraldehydu resuspendováním v 1% glutaraldehydu (Sigma) po 30 sekund na výslednou koncentraci 4x10° buněk/mi, a pak byl přidán stejný objem 200 mM lysinu (Sigma) na 3 minuty. Buňky pak byly sebrány centrifugací při 300 g, opláchnuty v RPMI-1640 a naneseny v množství 2xl0⁵ do každé jamky na mikrotitrační destičku, která již obsahovala antigen a inhibitorové sloučeniny. Mikrotitrační destička byla inkubována po 2 hodiny při 37 °C v 5% CO₂.

Poté byla mikrodestička opláchnuta RPMI-1640 při 300 g a dvakrát odsáta, než se přidala T-buněčná hybridomová linie B52.24 v množství IQ⁵ buněk na jamku v kultivačním médiu (RPMI-1640, 10 % fetální telecí sérum (Gibco) a 2 mM glutamin (Gibco)). Mikrotitrační destička byla dále inkubována po 2 dny při 37 °C v 5% C0₂. Destičky pak byly centrifugován/ při 300 g po 10 minut a 150 μΐ supernatantu z -každé jamky bylo odebráno a uschováno v -20 °C před tím, než byl proveden biotest na obsah IL-2.

m r ř « i * « : · «; í ·' ·· i'

W · · <’ «.A ♦ fe « i

I fl·*;

< « « · 4· « fl * V 4'« ·* >·

-28 Kultivační destičky, se supernatantem „k testování byly ponechány ’při teplotě místnosti, aby roztály a 100 ·μ1 supernatantu bylo přeneseno na novou 95-jamkovou destičku s jamkami s kulatým dnem. Pro vytvořeni -standardní křivky· bylo provedeno sériové ředění 1: l,.„IL-2 „užitím, kultivačníhomédia. (RPMI-1640 (Gibco),^;10 % telecí fetálnL· sérum (Advanced Protein ^Products ) A.:,,»100 .... gg/ml .· střep.tomýcin’ a 100.. U/ml , penicilín· (Gibco)·; '2mM L-giutamin (Gibco) . a 50' μΜ 2-merkaptoetanol (Sigma)) v rozmezí výsledné koncentrace IL-2 250 jedhotěk/ml. ‘až. 0,04 jenotkv/ml·. ¹ Buňky ěuněčné linie 'závislé na IL-2 -jako jsou buňky CTLL-2 (Nátuře, 1977, 268, 154-156) nebo buňky HT-2 (J.. Immunol. Methods, 1937, 94-104), byly sklizeny a opláchnuty dvakrát v kultivačním médiu předtím než byly resuspendovány na koncentraci 5xl0⁴ buněk/ml. 100 μΐ suspenze buněk závislých na IL-2 bylo přidáno ke každé jamce pro standardní křivku a testovaným vzorkům. 'Kultivační misky byly inkubovýny po 72 hodin při 37 °C a v 5 % C0₂. Poté bylo přidáno ke .každé - jamce 20 μΐ. (1 mCij ' 3K-týmidinu (Amersham International) a destičky byly dále inkubovány za stejných podmínek po 16 hodin. Obsah každé jamky byl sklizen na filtr ze skelných vláken a radiaktivita byla měřena pomocí beta scintiiačního počítače pro destičky.

Obecně lze shrnout, že peptidové deriváty podle vzorce I definovaného výše,· které byly testovány v testu B, vykazovaly významnou inhibici. pří. koncentraci asi 10 μΜ nebo mnohem nižší.

Test C: Peptidy stimulovaná hypersensitivní odpověď opožděněného typu (DTH, „delayed type hypersensitivity) u myší BALB/C (Test je vhodný k prokázání, in vivo aktivity, peptidových derivátů podle vzorce I na zvířecím modelu.)

ΦΦΦΦ φ Φ Φ ΦΦ

Φ Φ · * Φ Φ φ ΦΦΦΦ

ΦΦ ·· ·· • » φ φ φ φ «

Φ Φ Φ

Φ ΦΦ

ΦΦΦ Φ Φ

Φ Φ Φ

ΦΦ Φ·

-29Samice myší BALB/C (18 až 20 g), vždy 5 v každé skupině, byly na boku subkutánně imunizovány 0,1 ml emulzí ovalbuminu (Sigma)(2 mg/ml ve fyziolog. roztoku) smíchanou 1:1 (objem/objem) s Freundovým adjuvans (Sigma). Sedm dní později byla měřena tloušťka chodidla použitím dvojitého mikrometrického kaliperu. Poté následovala provokační subpiantární injekce 30 μΐ 1% tepelně agregovaného ovalbuminového proteinu ve fyziologickém roztoku do polštářku chodidla jedné zadní končetiny. Za dvacet čtyři hodin po antigenní provokaci byla měřena tloušťka chodidel a odpověď DTH byla vypočtena jako procentuální zvětšení tloušťky chodidla po injekci ve srovnání s kontralaterální kontrolní končetinou. Inhibitory byly podávány po 3 dny osmotickou minipumpou (Alzet) implantovanou 24 hodin před antigenní provokací a dávkování bylo 10 mg/kg/den až 0,1 mg/kg/den. Stupeň inhibice byl vypočten odečtením hodnoty otoku pro inhibitorem ošetřené chodidlo od hodnoty pro kontrolu ostřenou pouze vehikulem, pak dělením hodnotou kontroly a vynásobením 100 %.

Obecně lze shrnout, že peptidové deriváty podle vzorce I definovného v předchozím textu, které byly testovány v testu C, projevily významnou inhibici při dávkování 1 mg/kg/den a nižším, a to bez zřetelného toxikologického nebo jiného nežádoucího účinku.

Test D:

(Tento test je vhodný k prokázání in vivo aktivity peptidových derivátů podle vzorce I na zvířecím modelu artritis.)

Samice myší Balb/c (19 až 21 g, 5 až 10 v každé skupině) se v 0. den imunizují a 7. den ještě jednou podpoří subkutánni injekcí 0,1 ml emulze obsahující shodné objemy φ · · · φ φ φ • φφφφ φ· φφ φφφφ φφ φφφ φ φ φ φ φ φφ φφ

-30tloušťka x 100 %.

metylovanéno hovězího sérového albuminu (met-BSA, Sigma), mg/ml ve fyziologickém roztoku, a Freundova kompletního adjuvans (Sigma) doplněným o Mycobacterium tubercuioais (MTB, kmeny C, DT a PN, MAFF, Weybridge, Surrey) v koncentraci 2,5 mg/ml, čili výsledná koncentrace MTB byla

3,5 mg/ml. Současně se aplikuje navíc i.p. injekce 0,1 ml Bordetslla pertussis (Pertussis vakcina Welcome), 10⁹ organismů ve fyziologickém roztoku. 0 čtrnáct dní pczděj'1 jsou zvířata provokována do kolenního kloubu dávkou 10 μΐ obsahující 100 μσ met-BSA ve fyziologickém roztoku, které je injikována intraartikulárně pomocí injekční stříkačky Hamilton s jehlou 30G. Kontralaterální koleno je injikováno shodným, objemem fyziologického roztoku a slouží jako. kontrola. Stupeň zánětu/otoku obou kolen se stanov! 13 dní později měřením pomocí dvojitého mikrometrickěho kaliperu. Toho se dosáhne tak, že se vytvoř! incize nůžkami s tupým koncem a- pinzetou v kůži přibližně 5 mm nad a pod kolenem a podél celého kolena, takže vznikne volná chlopeň, která se· pak odřízne, aby se odkryl celý pod ní ležící kloub. Měření se provádí v nejširší části kolena, v horizontální rovině, na ohnuté končetině držené ve fixované poloze. Procentuální zvýšení zánětu v kolenu s injikovaným antigénem se vypočte podle vzorce: (tloušťka kolena s injikovaným antigenem tloušťka, kolena s injikovaným fyziologickým roztokem / kolena s injikovaným fyziologickým roztokem) Inhibitory se podávají použitím 14 denních osmotických minipump (Alzet) implantovaných 24 hodin před antigenni provokací s dávkováním v rozmezí 10 mg/kg/den·.až 0,1 mg/kg/den. Procento inhibice zánětu/otoku se vypočte z hodnot naměřené tloušťky odečtením hodnoty otoku . pro Inhibitorem ošetřenou skupinu od hodnoty pro skupinu ošetřenou pouze vehikulem, pak dělením hodnotou kontroly <··'<.·

4: i

<

<··> 4;

ť f: * »> 4; t .

I

I' '' j

íl- <

.

I

I' '' t <

I¹ * ij I

I;

I íl i

i!¹ i

H i

d ' ;í ΐ

'1 í

') * ΐ 1 I

I¹ * ij I

1;

I íl i

i!¹ i

i d ' ;í ΐ

ί í

') * ΐ 1 I a vynásobením 100, Další hodnocení nemoci zahrnuje 1) histologické -hodnocení zánětu, synovitis a eroze kosti/chrupavky, prováděné- na fixovaném řezu kolena obarveném hematoxylinem a eosinem, a” 2) stanovení· hladiny reaktantů.

akutní fáze v séru,sérového amyloidu · P 'a/nébo haptoglobrnú’.· : 'Peptidové’ deriváty podle vzorce·'· I» definované v předchozím. textu! ukazují „v· · testu· D významnou^ inhibici- -při dávkách 10 mg/kg/den nebo. nižších. , ,1

Pro lepší ilustraci 'farmakologické aktivity zvláštních pepťidbvých'derivátů podle^: vzorce I, všechny sloučeniny podle příkladů 5, 16 a 23 projevily významnou vazbu s HLA-DR4-Dw4 v testu A při koncentraci < 0,1 pmoi/l a byly 'aktivní při dávce < 0,1 mg/kg/den v testu C. Tyto sloučeniny mají také dobrou stabilitu ve vodném prostředí při pH 3 a pH 7,6, a ve formě extrudovaných polymerních depotních léčivých přípravků vykazují minimální ztráty degradací při extruzi a minimální degradaci,, při uvolňování z takového depotního léčivého přípravku;. Ve variantě testu A bylo prokázáno, že sloučenina podle příkladu 23 se významně vázala s HLA-DRÍ, HLA-DR2, HLA- \

DR4Dw4' a^[ HLA-DR4Dwl4, ale nevázala se s HLA-DR3 (IC50 > 100 μίϊΐοΐ/.ΐ) . ¹

Peptidové deriváty podle vzorce '1 se dají připravit jakýmkoliv způsobem, který je známý v oboru peptidové·chemie a který je vhodný pro syntézu analogických peptidů.

. · Peptidové deriváty podle vzorce I se mohou získat např. postupy analogickým těm, které jsou popsány např. v „Solid Phase· Peptide Synthesis: A Practical Approach autorů Athertona a Shepparda (vydáno v IRL Press, Oxford University press, 1989), „Solid Phase Peptide Synthesis od Stewarta a Younga (vydáno v Pierce Chemical Company, Illinois, 1934), „Principles of Peptide Synthesis (vydáno v Springer-Verlag, Berlin, 1984) a v sérii „Amino Acids, Peptides and Proteiňs a « Φ · ·'«« ο · ·· • · · · · · * · ··· · * ·· ·«· « · · *

		···« *· -32-	·· 99	99
1 ri	(díly 1-25, díl 25 byl vydán v r. 1994 v Royal Chemistry, Cambridge, UK) .	Society	of
	výhodně se peptidový postupnou syntézou v pevné	derivát podle vzorce fázi. Použitím tohoto	I připraví způsobu se

u aminokyseliny, která je C-koncovou aminokyselinou peptidu, ochrání její α-aminoskupina („protekce aminoskupiny), a jeli to potřeba také aminoskupina v postranním řetězci, a aminokyselina se naváže na pevný nosič, např. pryskyřici, jako je 2-chiorotr.itylchloridová pryskyřice nebo pryskyřice Merrifield (tj. chlormetylpolystyren-divinylbenzen) v případě, že je třeba po štěpení volná karboxylová kyselina, nebo prykyřice Rink amid (4-(2', 4'-dimetoxyřenyl-Fmocaminometyi) -fe.noxylová pryskyřice) nebo pryskyřice Rink amid MBHA . (N-(4-(2',4'-dimetoxyfenyl-Fmoc-amínometyl)-fenoxyacetamido-norleucyl)-4-metylbenzhydrylaminová . pryskyřice) (zde uvedené pryskyřice jsou dostupné od fy. Calbiochem-’ Novabiochem) v případě, že po· štěpení je vyžadován karboxamid, a poté se ochranná skupina na a-aminoskupině odstraní. Aminokyselina, která má být připojena k C-koncové aminokyselině, je chráněna na své α-aminoskupině, a je-li to potřeba také v postranním řetězci, a'navázána na' C.-koncovou' aminokyselinu, která zůstává navázána na pevný nosič. Postupný proces „deprotekce (odstranění ochranné skupiny navázané na aminoskupinu) α-aminoskupiny a navázání další aminokyseliny se opakuje a vzniká tak postupně chráněný a nechráněný polypeptid navázaný na pevný nosič. Skupina R² ve vzorci II nebo III je vložena do sekvence použitím vhodně chráněné (3-amino-2-oxo-pyrolidin-l-yl)alkanové kyseliny (propeptidové deriváty obsahující II kde A je metylenová skupina) nebo odpovídajícího oxa-analogu, získaného jak je popsáno v J. Med. Chem., 1993, 36, 256-263, nebo analogickým postupem (.pro peptidové deriváty obsahující II kde A je kyslík), nebo • · · ·· φ * φ · φ ♦ • Φ Φ Φ Φ:

Φ* ΦΦ • φ φ φ «

ΦΦ φφ ··*' • ··

Φ Φ Φ » Φ Φ

ΦΦ ΦΦ

-33(6-οχο-Ι,7-diazaspiro[4,4]non-7-yl)alkanové kyseliny (pro peptidové deriváty obsahující III) na místě chráněné aminokyseliny. Chráněný nebo nechráněný polypeptid je uvolněn z pevného nosiče standardním postupem, např. použitím směsi trifluorooctové kyseliny, trietylsilanu a vody. Je výhodné, když se ochranná skupina postranního řetězce odštěpí za podmínek použitých pro uvolnění peptidu z pevného nosiče, ale může se odštěpit také v samostatném kroku před uvolněním peptidu z pevného nosiče nebo po něm. Také je výhodné, když se způsob přípravy polypetidu modifikuje použitím sekvence dvou nebo více vhodně chráněných aminokyselin ve zvláštním vazebném kroku. Celá syntéza se může provádět ručním způsobem a nebo se může provést automaticky, např. použitím syntetizátoru peptidů jako je 431A nebo 430A firmy Applied Biosystem, nebo ACT357 firmy Advance Chemtech, nebo použitím podobných automatických syntetizátoru, nebo kombinací obou způsobů.

V průběhu syntézy peptidů jsou· aminokyselinové funkční skupiny, které se neúčastní reakce, chráněny různými, funkčními skupinami. Tak např. Ν'-koncové aminoskupiny a aminoskupiny postranního řetězce mohou být chráněny použitím 9-fluorenylmetoxykarbonylové (Fmoc), t-butoxykarbonylové(Boc), bifenylizoprpooxykarnonylové(Bpoc), 2-(3,5dimetoxyfenyl]propyl-2-oxykarbonylové (Ddz), adamantyloxykarbonylové (Adoc), allyloxykarbonylové (Aloe), 2,2,2trichloretoxykarbonylové (Troc) nebo benzylkarbonylové skupiny a různých substituovaných benzyloxykarbonylových skupin. Tyto ochranné skupiny mohou být odštěpeny podle potřeby použitím standardních způsobů (tj. např. působením kyseliny nebo zásady, katalytickou hydrolýzou a působením Pd(0) nebo působením zinku/kyseliny octové).

• · · * · • · * · ► ♦ ·· ··· * • · ·* »»

-34Vhodné ochranné skupiny použité pro ochranu guanidinové skupiny postranního řetězce v peptidech obsahujících argininový zbytek zahrnují následující skupiny: nitroskupinu, adamatyloxykarbonylovou, sulfonylovou (Mtr), sulfonylovou (Pmc) a

4-metoxy-2,3,6-trimetylbenzen2,2., 5,7,8-pentametylchroman-6( zejména) 2,2,4, 6, 7-pe.ntametyldihydrobenzofuran-5-sulfonylovou (Pbf) skupinu.

Vhodné ochranné skupiny použité pro ochranu hydroxylové skupiny postranního řetězce zahrnují t-butylovou, benzylovou a tritylovou (Trt) skupinu. Vhodné ochranné skupiny použité pro ochranu imidazolové skupiny v peptidu obsahujícím histidinový zbytek zahrnují tritylovou, benzylovou, tosvlovou a dinitrofenylovou skupinu, a dále Adoc, Boc a Fmoc.

Vhodné ochranné skupiny použité pro ochranu karboxylové skupiny postranního řetězce zahrnuji různé estery (např. obsahující metylovou, etylovou, t-butylovou, benzylovou, nitrobenzylovou, allylovou a 9-fluorenylmetylovou skupinu).

Reakce odštěpení ochranné 'skupiny se může provést v teplotním rozmezí od 4 °C do 40 °C (výhodně při teplotě místnosti) a v Časovém období 10 minut až 24 hodin.

Vhodné metody pro spojování (párování) jednotlivých aminokyselin všeobecně užívají azid, symetrický anhyórid, smíšený anhydrid a různé aktivní estery a karbodiimidy. V případě různých karbodiimidů (např. dicyklohexyl- nebo diizopropylkarbodiimidů) se může přidat množství různých aditiv (např. 1-hydroxybenzotriazol, HOBT, a N-hydroxysukcinimid). Navíc spojování aminokyselin lze dosáhnou i použitím řady dalších reagencií, např. lH-benzotriazol-lyl-oxy-tris-pyrrolidinfosofoniumhexafluorofosfétu (PyBOP), (2-(IH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetrametyluroniumtetrafluoroborátu (TBTU) a (2-(IH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetrametyluroniumtetrafluorofosfátu (HBTU). Spojovací reakce se φ 4 ·

4

4444 • · 4 4 4 • * 4 4 4 4 4

4 4 4 4 ·· ·* β 4 44

44«4 4

4 4

4« 44

-35mohou provádět při teplotě v rozmezí -20 °C až '40 °C a po dobu od 10 minut do 24 hodin. Vhodné médium pro provedeni spojovací reakce zahrnuje např. M, N-dimetylformamid (DMF). Zvláště vhodný způsob zahrnuje použití H3TU, HOBT a díizopropyletylenaminu v DMF.

Tyto a další způsoby syntézy peptidů jsou uvedeny v mezinárodních patentových přihláškách zde citovaných. Hydrofobní zbytek P, což je skupina podle vzorce R-, R.CO-, R.SO2-, R.O.CO-, R.NHCO-, R.O.CS-, R.S.C0-, R.NHCS-, R.S.CSa R.CS- (nebo taková skupina přítomná jako substituent na koncové aminoskupině P, když P je hydrofobní aminokyselina nebo hydrofobní aminokyselina nesoucí další aminokyseliny), se může vložit, např. v závěrečném kroku aikylací, acylací nebo . jinou standardní funkční modifikací terminální aminoskupiny (např. před uvolněním peptidu z nosiče nebo po něm) . Pokud jsou třeba modifikace C-konce (aby se získala zvláštní hodnota pro R⁴}, mohou se provést poté, co je syntetizován peptid, a to konvenční modifikací funkčních skupin nebo vhodným výběrem počáteční pryskyřice nebo ochranné skupiny navázané na pryskyřici (např. použitím vhodně chráněné skupiny podle vzorce R⁴-H). Typické příklady přípravy peptidových derivátů podle vzorce I jsou dále uvedeny v oddíle Příklady.

Typické způsoby měření stability peptidových derivátů podle předkládaného vynálezu jsou uvedeny dále. Aby se v těchto měřeních minimalizovala mikrobiální kontaminace a degradace, všechna zařízení pro přípravu peptidových roztoků jsou sterilizována autokiávováním a všechny přenosy materiálu jsou prováděny v boxu II. bezpečnostní třídy s laminárnim prouděním.

ml citrátového/fosfátového pufru (Mcllvain) s hodnotou pH 3 nebo pH 7,6, obsahující 0,02% azid sodný, je • 0 0» • · 0

0 0

00

0 0 • 0 · · · • * 00

00·0 0

0 0

00 přefiltrováno pomocí 0,22 μπι filtrační jednotky a injekční stříkačky. Přibližně 1,2 mg peptidu se přesně odváží v uzavřené zkumavce. Pipetou se sterilní špičkou se přidá do zkumavky k peptidu dostatečné množství pufru tak aby koncentrace peptidu byla 0,1 mg/ml. Zkumavka se uzavře a protřepe, aby se peptid rozpustil. Použitím pipety se sterilní špičkou se přenese alikvot asi 1 ml peptidového roztoku do nádobek pro HPLC, které se· potom uzavřou. 5 nádobek se uchová při -18 °C a 37 °C. Plocha peptidového vrcholu („peak) takového roztoku se určí užitím HPLC pomocí vhodných standardů, a to na počátku a po uchování při -18 °C a 37 °C po dobu 1, 2, 3 a 4 týdnů, přičmež pro každý časový bod se opoužijí čisté zkumavky a dvojitá injektáž vzorku. Procento peptidu zachované po uschování v 37 °C v každém časovém bodě se vyjádří jako poměr plochy peptidového vrcholu v každém časovém bodě k ploše na počátku. Výhodné peptidové deriváty podle vynálezu mají zachované procento po uskladnění v 37 °C vyšší než 90 %, výhodně vyšší než 95%, jak v pH 3 tak i v pH 7,6.

Peptidové deriváty podle vzorce I se budou obecně podávat pro účel léčení nebo profylaxe teplokrevným živočichům (včetně člověka), kteří vyžadují takové ošetření, ve formě farmaceutického přípravku, jak je v oboru farmacie dobře známo.

Další aspekt vynálezu poskytuje léčivý přípravek, který obsahuje peptidové deriváty podle vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli ve spojení s dalšími farmaceuticky přijatelnými ředidly a pomocnými látkami.

Přípravek může být ve formě vhodné pro perorální podávání, jako je např, tableta, tobolka, vodný nebo olejový roztok, suspenze nebo emulze, pro nazální použití jako nosní prášek pro šňupání, nosní spray nebo nosní kapky, pro r*

6; t

c. < C ¢/ c. (

CM? c-e < a/tC'·' í pc-4o\ t c] f t, ⁵ C ^c;

-. ^r /- ry re.

CC fC

-37vaginální nebo rektální použití jako čípek, pro podávání inhalací;, jako jemný prášek nebo kapalný aerosol, pro sublingvální nebo bukální použití jako tableta nebo tobolka, nebo - pro parenterální. podávání , (včetně y ., , podávání intrayenózního, subkutánního, · intramuskulárního,.- ·· intravaskulárního·-nebo podávání.-.infúzí)-Jako např.· sterilní vodný .nebo,., olejový roztok _;nebo^ suspenze. Připrayek-může být * také. ve formě· vhodné pro topické.. podávání jako je např. krém, mast a gel.· Kožní .náplasti také přicházejí v- úvahu. Formulace takových přípravků je..obecně popsána, v .kapitole 2.5.2 knihy „Comprehensive Medicinal. Chemistry?' Vol. 5, ed.:· Hansch et al., Pergamon.Press, 1990.

Obecně lze uvést,· že přípravky uvedené výše se dají připravit obvyklým způsobem použitím obvyklých excipientů. Avšak v případě přípravku pro perorální podávání je výhodné, aby přípravek obsahoval ochranný obal, který ochrání polypetidovou aktivní složku před působením enzymů v, žaludku.

Výhodný léčivý přípravek podle vynálezu je takový, který je vhodný pro perorální podávání v jednotkové Lékové formě jako je .tableta nebo tobolka, která obsahuje 2,5 mg až 500 mg, a výhodně 10 mg až 100 mg polypeptidu v každé jednotkové dávce, nebo přípravek vhodný pro parenterální podávání, který obsahuje .0,5 mg až 100 mg po.lypetidu· v,1 ml, výhodně 1 mg až 1.0 mg v 1 ml roztoku.

Parenterální přípravek je výhodně ve formě roztoku v izotonickém solném roztoku, (fyziologickém roztoku) nebo izotonickém. roztoku dextrózy, které mohou být v případě potřeby pufrovány na pH mezi 5 a 9. Případně může být parenterální přípravek v takové formě, která je určena pro prodloužené uvolňování léčiva, a v tomto případě je množství polypetidu na jednotkovou dávku obecně vyšší než se požaduje v případě konvenční.injekční. formy. Výhodná forma přípravku • 0 • 0 • 0 ϊ

-38 9 W

0 < 99 99 s prodlouženým postupným (kontinuálním) uvolňováním léčiva je např. taková forma, která je popsána v Evropské patentové přihlášce č. 58481 nebo, v případě peptidů obsahujících alespoň jednu bazickou skupinu, forma popsaná v Mezinárodní patentové přihlášce č. WO 93/24150; na něž se tímto odkazuje. Určité peptidy podle předkládaného vynálezu mají takové charakteristiky rozpustností, že jsou zvláště - vhodné pro přípravu lékových forem s. prodlouženým uvolňováním léčiva, zvláště pak přípravky obsahující biologicky rozložitelné polyestery jako polylaktidy, a také· pro přípravky ve formě .s prodlouženým uvolňováním léčiva a' velmi vhodným a prospěšným profilem uvolňování léčiva. Navíc peptidy podle předkládaného vynálezu, obsahující jednu nebo více bazických skupin, mohou vytvářet peptid-polymerové soli s kyselinou zakončenými polyestery jako jsou polylaktidy, a takové peptidy a peptid-polymerové soli představují další aspekt předkládaného vynálezu. Některé z těchto solí mají takové charakteristiky rozpustnosti, že jsou zvláště vhodné pro přípravu parenterálních lékových forem s prodlouženým uvolňováním léčiva, např. takové, které popisuje Mezinárodní patentová přihláška WO 93/24150, a také pro formy s prodlouženým uvolňováním léčiva a velmi vhodným a prospěšným profilem uvolňování léčiva. Výhodný parenterální přípravek ve formě s'prodlouženým uvolňováním léčiva obsahuje od 1 mg do 100 mg (např. 5 mg až 50 mg) polypetidu v jednotkové lékové formě. . Výhodná ' léková forma s prodlouženým uvolňováním léčiva ^e i takové forma, která je určena pro prodloužené uvolňování léčiva až po dobu· nejméně 5 dnů.

Výhodné peptidy podle předkládaného vynálezu zahrnují takové peptidy, které jsou-li ve formě extrudovaného polymerního depotního přípravku., vykazují minimální degradaci * 44 • ·· při uvolňování z takového depotního přípravku. Typický způsob měření úrovně degradace peptidu podle předkládaného vynálezu je uveden v následujícím odstavci.

Příprava extrudovaného polymerního depotního léčivého přípravku z peptidu

Asi 20 mg peptidu se přesně zváží a přidá se dostatek polymeru. (50/50% molovy kopolymer póly (D, L-kyselirva mléčná/kyselina glykolová) s přibližnou molekulovou hmotností 20 kD a polvdisperzitou 1,7, jak se stanoví velikostně vylučovací chromatografii vzhledem k polystyrénovému standardu), takže vznikne přibližně 20% (hmotnost/hmotnost) směs. Ta se rozpustí v anhydridu prosté ledové kyselině octové za vzniku asi 10% (hmotnost/objem.) roztoku. Roztok se pak suší ze zmrazeného stavu (lyofilizuje) a lyofilizovaný produkt se před použitím uchovává ve vakuu.

Asi 100 mg lyofilizovaného matreriálu se vloží do válce malého laboratorního extrudéru (vytlačovacího stroje) a vzorek se stlačí pístem. Extrudér se pak zahřeje na teplotu mezi 90 až 95 °C a na této teplotě se ponechá po 10 minut než se materiál pod tlakem vytlačuje za vzniku extrudátu s přibližným průměrem 1 mm.

Analýza obsahu peptidu v extrudovaném polymerním depotním léčivém přípravku

Dva kousky přibližné délky 5 mm- z extrudovaného polymerního přípravku obsahujícího peptidy se přesně zváží a každý z nich se rozpustí v 1 ml anhydridu prosté ledové kyseliny octové v samostatné 25ml volumetrické nádobě. Asi po

1,5 hodině se objem v každé nádobě doplní destilovanou vodou do 25 ml, což způsobí precipitaci polymeru. Usazenina se ϊ · · ·»·* ····

.. . . · ·· ·· ··· · k · · · · · · ·

-40, přefiltruje přes 0,5pm PTFE filtr Millex a roztoky, A, se seberou.

t* Připraví se série standardních roztoků ze zásobního roztoku peptidů v destilované vodě o koncentraci 0,5 mg/ml a zásobního roztoku polymeru v anhydridu prosté ledové kyselině octové o koncentraci 2,5 mg/ml podle následující tabulky, přičemž každý roztok se doplní destilovanou vodou do 10 ml.

koncentrace	objem zásobního roz-	objem zásobního roz-
peptidů (gg/ml)	toku polymeru {μΐ }	toku peptidů ΐμΐ)
50	1000	1000
40	1000	800
30	1000	600
20	1000	400
10	1000	200
5	1000	100
0	1000	0

Každý standardní roztok se přefiltruje pře 5μτη PTFE filtr Millex, a pak se alikvot filtrátu společně s alikvoty roztoků A analyzuje pomocí HPLC s dvojitým vstřikem vzorků. Obsah peptidů v extrudovaném polymerním depotním léčivém přípravku se vypočte z koncentrace peptidů v roztoku A, která se stanoví srovnáním plochy peptidového vrcholu v roztocích A s plochou peptidového vrcholu standardních roztoků.. Výhodné peptidy vykazují minimální ztrátu degradací při extruzi a obsah peptidů' v extrudovaném polymerním depotním léčivém přípravku je blízký přibližné teoretické hodnotě 20 % (hmotnost/hmotnost).

·♦· φ

β · .41 Degradace peptidu při in vitro uvolňování z extrudovaného polymerního přípravku

Mcllvaineův citrátový/fosfátový pufr . s pH 7,6, obsahující 0,02% azid sodný, je přefiltrován přes 0,22μπι filtr a uschován ve 4 °C. Přibližně 10 mg extrudovaného polymerního depotního přípravku obsahujícího -peptid se vloží do dvou malých nádobek a přidají se 2 mi pufrověho roztoku. Nádobky se pak uzavřou a uchovají ve vodní lázni s 37 °C na 1 měsíc. Po jednom měsíci se ve vhodných časových okamžicích odeberou 0,6ml alikvoty uvolňovacího média z každé nádobky a analyzují se přímo pomocí HPLC nebo se v lahvičkách pro HPLC uchovají při -18 ^aC před analýzou. 1,8 ml pufrověho roztoku se přidá do každé nádobky obsahující přípravek, aby se tak nahradilo odebrané uvolňovací médium.

Průměrné množství intaktního peptidu v uvolňovacím médiu v každém čase odběru se stanoví pomocí HPLC s dvojitým vstřikem vzorků srovnáním plochy peptidového vrcholu v uvolňovacím médiu s plochou peptidového vrcholu standardních peptidových roztoků o 2námé koncentraci. Průměrné množství peptidových degradačních produktů v uvolňovacím médiu v každém čase odběru se stanoví pomocí HPLC s dvojitým vstřikem vzorků srovnáním plochy dalších nových vrcholů v uvolňovacím médiu s plochou peptidového vrcholu standardních peptidových roztoků o známé koncentraci při současném předpokladu, že extinkční koeficient se nezměnil. Průměrný kumulativní profil in vitro uvolňování intaktního peptidu a celkového peptidu (tj. intaktní peptid a peptidové degračační produkty) je stanoven z množství intaktního peptidu a peptidových degradačních produktů v každém čase odběru. Výhodné peptidy podle vynálezu vykazují minimální degradaci při in vitro uvolňování a tak degradační produkty tvoří méně než 10 %, a výhodně méně než

-42 5 %, celkového peptidů po jednom měsíci in vitro uvolňování do Mcllvaneova pufru při ptí 7,6 a teplotě 37 °C.

Přípravek podle vynálezu se obecně bude podávat člověku např. v denní dávce, od 10 pg do 5000 mg, výhodně od 0,1 mg do 100 mg, pro 7 0kg pacienta, a to v případě potřeby v rozdělených dávkách. Přesné podávané množství a způsob podávání závisí na hmotnosti, věku a pohlaví léčené osoby a na konkrétní nemoci nebo stavu, které jsou léčeny a na jejich závažnosti, v souladu se'zásadami známými v medicíně.

Peptidové deriváty podle vzorce I nebo jejich farmaceuticky přijatelné soli se mohou výhodně podávat pro léčebné nebo profylaktické účely společně s jedním nebo více jinými farmakologickými agens, terá jsou v oboru všeobecně známa tím, že léčí nebo zmírňují symptomy anebo působí jako nemoc modifikující agens jedné nebo více nemocí nebo stavů popsaných v. předchozím textu, jako jsou NSAID (jako ibuprofen nebo piroxicam) nebo analgetika (paracetamol), kortikosteroidy, myorelaxancia, inhibitory lipoxygenázy, methotrexat, azathioprin, D-penicilamin, Cyklosporin-A, nebo léčebné . monoklonální protilátky (jako anti-CD4 nebo antiTNP) . V případě.diabetů se mohou peptidové deriváty podávat společně s inzulínem nebo jinými léky pro diabetes nebo doprovázející komplikace (jako je inhibitor aidózoreduktázy). Takové kombinované léčení je dalším aspektem předkládaného vynálezu.

Další aspekt předkládaného vynálezu poskytuje způsob léčení autoimunitních a zánětlivých nemocí zprostředkovaných T-buňkami závislými na molekulách MHC II. třídy, jako jsou nemoci a stavy již v předchozím textu uvedené, přičemž způsob obsahuje podávání teplokrevnému živočichu (včetně člověka), který takové léčení potřebuje, účinného množství peptidového

-43 derivátu podle vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli. Vynález také poskytuje použití peptídového derivátu podle vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu nových léků pro léčení autoimunitních a zánětlivých nemocí zprostředkovaných T-buňkami závislými na molekulách MHC II. třídy.

Navíc k . výše uvedenému použití pro léčeni lidí, peptidové deriváty podle vzorce I jsou také užitečné ve veterinárním léčení podobných stavů u komerčně cenných teplokrevnýcn žiovčichů, jako jsou psi, kočky, koně a hovězí dobytek. Obecně pro takové léčení se peptidový derivát podle vzorce I bude podávat v analogickém množství a analogickým způsobem k těm, popsaným výše pro podávání člověku. Peptidové deriváty podle vzorce I jsou také cenným farmakologickým nástrojem pro vývoj a standardizaci testovacích systémů pro vyhodnocování vlivu molekul MHC II. třídy u laboratorních zvířat jako jsou kočky, psi, králičí, opice, potkani a myši, což je součástí probíhajícího výzkumu nových a zlepšených léčivých přípravků, a také jsou vhodné jako diagnostické reagencie.

Vynález bude v následujícím oddíle ilustrován příklady, které ale vynález nijak neomezují, pro které platí (pokud není výslovně uvedeno jinak):

(i) zakoncentrování a odpařování se prováděly rotační evaporací ve vakuu (ii) postupy se prováděly při teplotě místnosti, t j. v rozmezí 18 až 26 °C (iii) výtěžky, pokud jsou uvedeny, slouží jen jako pomocná hodnota pro čtenáře a rozhodně nejsou shodné s maximálním výtěžkem, který je získatelný pečlivým vývojem postupu (iv) v příkladech se užívají následující zkratky

C fc c * t e fc fc *· ϋ fc ^e (i ff (i «5 '» C

C fc:

ř fcr»<

τ t., t Γ fc fr’ Of t c c r fc‘ fc'fc fc

Oťr r«c v » (7 t o n fc r

OC ι>

,·.ι ' ti'

-44Phv '= 5-fenylvaleryl, Boc = terč.butoxykarbonyl, tBu terč.butyl,. ĎMF =. N,N-dimetlyformamid, HOBT = 1-hydroxy, benzotriázol, Met methionin,, Fmoc = 9-fluorenylmetyloxy karbony 1,..- Fmoc-Pip-OH = N-(,9-fluorěnylmetoxykarbony!)piperidin-4-karboxylová. kyselina, Fmoc-Papa-OH - 4- [N- (9-fluorenylmetoxykarbonyl) amino].fenyloctová kyselina, CbZ = benzyloxykarbonyl, „Pníc = 2,.2, 5.,.7.,8^pentametylchroman-6sulfonyl,.. Pbf = 2,2,4,6, 7-pentametyldihydrobenzofuran-5sulfonyl, THF = tetrahydrifuran, DMSO = dimetyisilfoxid, HBTU = 2- (lH-benzotriazol-l-yl)-1,1,3,3-tetrametyluroniumhexaf- fluorofosfát, DIPEA = čiísopropyletylamin, TFA = trifluorooctová kyselina, Su = sukcinimid připojený prostřednictvím ’ atomu dusíku, který je součástí kruhu, HPLC '= vysokotlaké kapalinová chromatografie a RP-HPLC = vysokotlaká kapalinová chromatografie s reverzní fází (která byla, pokud není uvedeno jinak, provedena na koloně Vydac C18 218TP54, 4,6x250 mm) (v) velmi rychlá chromatografie a chromatografie na oxidu.

křemičitém, se prováděly s použitím silikagelu Kiselgel 60 fc· * (katalog, č. 9335) firmy Merck (E. Merck, Darmstadt, Německo) (vipH NMR spektra byla měřena při 200 MHz v CDCL₃ nebo d₆-bimetylsulfoxidu (dg-DMSO) s použitím tetrametvlsilanu (TMS) jako vnitřního standardu a jsou vyjádřeny jako hodnoty chemického posunu (delta hodnoty) v ppm vzhledem k TMS, přičemž pro označení hlavních vrcholů se používají obvyklé zkratky: s = singlet, m = multiplet, t = triplet, br = široký (broad), d = dublet / (vii) následující aminokyseliny chráněné Fmoc byly použity * k zavedení zbytku Lys, Thr, Arg nebo His:

** Lys: Fmoc_lys(Boc)-OH, Thr: Fmoc-Thr(Obu)-OH, Arg: Fmpc⁰ Arg(Pmc)-OH nebo Fmoc-Arg(Pbf)-OH, His: Fmoc-His(Trt)-OH * 0 .-45(viii) v příkladu 2, pokud se odkazuje na vzorec III, znamená to vzorec III kde Rb je metylová skupina (ix) v příkladech 17 a 31, kde je ve jménu produktu použito termínu „morfolin, znamená- -to, že morfolinová skupina je připojena k přilehlé metylenové. skupině prostřednictvím dusíku, který je součástí kruhu (x) v příkladech 18 a 34, kde je použito ve jménu produktu termínu ,,N(CH₂CH₂}₂N, tento termín· představuje piperazinový kruh (xi) v příkladu 30,- kde ve jménu produktu je užit termín. ,,-Lys (=C(NMe₂)₂ ^-'\ tento termín představuje L-aminokyseiinový zbytek -NH-CH [CH₂CH₂CH₂CH₂N=C (NMé₂) ₂] -CO- .

Příklady provedení vynálezu

Příklad·1

Příprava Phv-Ala-Ala-Ala-Ly3-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 1)

1.1 Syntéza Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe

5,6 g N-metylmorfolinu, 3,9 g metylesteru Lalaninylhydrochloridu, 4,6 g HOBT a 5,3 g l-(3dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodimidu se přidaly do roztoku g (0,028 mol) Boc-(D)-methioninu v 50 ml suchého DMF. Směs se míchala přes noc. Rozpouštědlo se odstranilo odpařením « φ φ Φ · » · φ φ φφ · ♦ ·· • « · « « φφ* Φ *

Φφφφ φφφ φφ φφ φφ ·· • · · * φ Φ · φφφ • ·· Φ ·· v

M'

-46a zbytek se rozdělil mezi 100 ml dichlormetanu a 50 ml 5% vodné kyseliny octové. Ustátím HOBT krystalizoval a odstranil se filtrací, a organická vrstva se oddělila a promyla vodným hydrogenuhličítanem sodným, usušila (MgSO₄) a odpařila. 8,5 g zbytku se purifikovalo velmi rychlou chromatografii v síntrové nálevce elucí se směsí dichlormetanu a éteru (0% az 100% éter). Frakce obsahující produkt se . spojily a odpařily za vzniku 7,2 g Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe jako gumy, která ustátím krystalizovala: NMR (CDCI3) : 1,4 (d, 3H), 1,45 (s, 9H), i,55 (m, 1H), 2,1 (s, 3H), 2,1 (m, 1H), 2,6 (m, 2H) 3,75 (s, 3H), 4,3 (bs, 1H), 4,6 (tn, 1H), 5,3 (m, 1H), 6,5 (bs, 1H).

1.2 Syntéza metyl (2S) -2-[(3R) -3- (N-fterc .butyloxycarbonyll amino) -2-Oxo-pyrolidin-l-yl]propionátu

Poznámka: Tento postup se musí provádět za suchých podmínek se suchými rozpouštědly, jinak nastane epimerizace.

K 8 g Boc-(D)-Met-(L)-Ala-OMe se přidalo 10 ml metyl jodidu ve směsi 20 ml DMF a 20 ml dichlormetanu a směs se ponechala stát 16 hodin, a poté odpařila do sucha. Dále se přidalo 2x50 ml dichlormetanu a odpařilo, aby se odstranil zbylý metyljodíd a 'zbytek se rozpustil ve směsi 300 ml DMF a 300 ml dichlormetanu. Směs se ochladila na ~5 °C a přidalo se 0,76 g hydridu sodíku (80% disperze v minerálním oleji) v jedné porci a směs se 2 hodiny míchala při této teplotě. Přidalo se 50 ml saturovaného vodného chloridu amonného a směs se odpařila do sucha, a poté rozdělila mezi vodu a éter. Éterový extrakt se promyl solným roztokem a usušil «00«

0 0 00 • 0 · 0 0 0 • 0 0 0 h

00 • * • 0 *

>

000· « · · ·»

000 0 • 0 • 0 ·· ••ί

-47.

\ a odpařil za vzniku gumy, která se purifikovala velmi rychlou chromatografii v sintrové nálevce (25% etylacetát:hexan až 100% etylacetát) za vzniku 4,2 g metyl (2S) -2~[(3R) -3“ (N[terc^butyloxycarbonyllamino) - 2-oxo-py rol idin-l“yl]propionétu jako gumy, která ustátim krystalizovala: NMR (CDCI3) : 1/4 (5, 9H), 1,4 (cí, 3H), 1,8 (m, 1H), 2,6 (m, 1H), 3,4 (m,-2H), 3,7 (m,-3H), 4,2 (m, 1H), 4,9 (q, 1H),5,2 (bs, 1H).

• 1.3 Syntéza kyseliny (2S) -2-[ (3R) -3- (N-[9-fluorenylmetyloxycarbonyl] amino) ’2-oxo-pyrolidin-l-yl]propionové (Fmoc-IIb^OH) ,'-ή i

g metyl (2S)-2-[( 3R)-3-(N-[terc. butyloxycarbonyllamino) 2-oxo-pyroličin-lyl]propionátu se udržovaly ve varu ve směsi 60 ml acetonu, 40 ml vody a 24 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové po 3 hodiny, a poté se směs odpařila do sucha. Přidala se voda a odpaření se opakovalo. Zbytek se rozpustil v 15 ml vody a přidal se pevný hydrogenuhličitan sodný v nadbytku. Přidalo se -5,2 g 9-fluorenylmetylsukcinimidylkarbonátu ve 30 ml acetonu, .Směs se míchala 16 hodin, a poté se odpařením odstranilo rozpouštědlo a zbytek se rozdělil mezi vodu a éter. Vodná vrstva se oddělila, její pH se upravilo na ~3 kyselinou chlorovodíkovou, a extrahovala se dichlormetanem. Organická vrstva se promyla vodou, usušila (MgSOq) a odpařila za vzniku bílé pěny, která krystalizovala při tření s éterem za vzniku

4,2 g kyseliny (2S) -2-[(3R)-3-(N-[9-fluorenylmetyloxycarbonyljamino) -2-oxo-pyrolidin-l-yl]propionové jako bílé ►ί* « Ο C Λ . λ c -e c C C' t e c »itc íc b b

4>i M ť bO b©

Φ V Γ G G G « tr «t fc fe'¹' , *fc bc t t ··& fr

¢. G· »Q «Ο |ί +

L*

pevné látky, mp.	191-3 °C	(dec), NMR	(CDCl	3) ’ 1,4	(d, 3H),
2,0 (m, ÍH), 2,6	(m, 1Ή),	3,4 (m, 2H),	4,2	(t, 1H),	4,4 (m,
3H), 4,9 (m., ÍH),	5,8 (bs,	1H ),.7,4 (m,	4H) ,	7,6 (d,.	2H), 7,7
(d, ,2H) .	* '

' ' / t ....*. % í»„4 4

1.4 Syntéza Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ •s identifikačním.číslem 1·}. _rw , sekvence ΰτ-'φ

-.'4 * V A _f - 'í ' Peptid se připravil syntézou pevné fáze. Fmoc, která začíná š 0,50 g (0,2'5 mmol) pryskyřice Ěmoc Pink Amide' MÉHA (Novabiochem) ve zkumavce- Bond Elut (Varian., 15 ml, vyplněné na dně filtrem).

a) Pryskyřice byla zbavena ochrany (deprotekce) použitím 20% roztoku piperidinu v DMF (dvě ošetření, každé s 5 ml po 10· minutách). Po deprotekci byla pryskyřice důkladně promyta 5x 10 ml DMF.

b) Acylace se prováděla přidáním 353 mg (i mmol) roztoku Fmoc-Pip-OH, 1,5 ml DMF, 165 mg (1 mmol) HOBT a 155. μΐ (1 mmol) diisopropylcarbodiimidu. Spojený produkt se ponechal přibližně 30 minut, promyl se 5x 10 mi DMF . a v'malé·. části, pryskyřice se kontrolovalo dokončení acylace za použití testu dle Kaisera (E. Kaiser etal., Anal. Biochem., .34,. 595, 1970). ..

Výše uvedená deprotekce a) a,;.spojovací cyklus .b) se opakovaly za použití: .

	311	mg	(Γ	mmol)	Fmoc-Ala-OH,
	394	mg	(1’	mmol)'	Fmoc-IIb-OH,·
	339	mg	(1	mmol)	Fmoc-Val-OH,'
	468	mg	(1	mmol) -	Fmoc-Lys(Boc)-OH,
h	311	mg	(1	mmol) ·	.Fmoc-Ala-OH,
Z	311	mg	(1	mmol)	Fmoc-Ala-OH, '
0	311	mg	(1	mmol)	.Fmoc-Ala-OH, a
	' 178	mg	(1	mmol)	kyseliny · 5-fenylvalerové

» · * · „ή • * ·' · • » ·· * · » · · » • · · · ·* ·· • · · • · · »·· · · * · ·· ·«

-49V každém případě byl čas spojovací reakce kolem 30 minut a v malé části pryskyřice se kontrolovalo dokončení acylace Kaiserovým testem. Kyselina fenylvaierová vyžadovala dvojitou spojovací reakcí, aby se získal pozitivní výsledek Kaiserovým testem.

Peptid se odštěpil od pryskyřice za použití směsi 7,9 ml kyseliny trifluorooctové a 0,395 ml trietyisílanu. Po hodinách se pryskyřice promyla přibližně 150 ml dichlormetanu a výsledný roztok se odpařil do sucha. Výsledná ř pevná látka se rozdělila mezi 25 ml éteru a 25 ml vody, a poté se éter extrahoval dalšími porcemi vody - 2x 25 ml.

Vodné fáze se spojily a lyofilizovaly.

Hrubý produkt se purifikoval za použití preparativní , RP-HPLC (kolona Vydac 218TP1022, 250 mm x 22 mm), hrubý materiál se nanesl v 5 ml 20% acetonitrilu/vody s 200 μΐ DMF. Eluce se ' prováděla na gradientu acetonitril-voda obsahujícím 0,1% TFA (15-35% acetonitril) přes 80 minut při mI průtoku 10 ml/minuta, Frakce obsahující produkt se’ spojily -i a lyofílizovaly za vzniku Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-IIb-AlaPip-NHV (sekvence s identifikačním číslem 1) jako bílé pevné látky v množství 84 mg (35%).

Produkt se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin.

RP-HPLC s kolonou Vydac C18, 218TP54, 4, 6 x 250 mm, eluce s acetonitrilem a vodou obsahujícími 0,1% TFA, za použití 10 až 50% acetonitrilového gradientu přes 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/min, indikovala 100% čistotu, • retenční čas 18,56 min, hmotnostní spektrometrie, m/e (pozitivní elektrospray (ES+)) 954, 6 (MH⁺), analýza ' aminokyselin (kyselá hydrolýza přes 24 hodin za použití

4 4 « «« · •44 · · ♦·

4 4 4 »»· · ·

4 4 · 4 · ·· ·· • 4 4 t

* ·

4

4444

-50roztoku 6N HCI obsahujícího 1% fenol při 130 °C) poskytla (Ala+IIb) 4,80, Val 1,11, Lys 1,07.

Fmoc-Pip-OH se získal analogickým způsobem ke způsobu popsanému v práci E. Athertona a R.C. Shepparda („Solid phase peptide synthesis: a practical approach, IRL press, 1989, s. 51) pro N-Fmoc-L-methionin: Fmoc-Pip-OH: NMR (DMSO-d₆) : 1,3

9,	(m, 2H), 1,7 (m, 2H), 2,5 (m, 2H), 2,9 4,2 (t, 1H) , 4,4 (d, 2H) , 7,4 (m, 4H), 2H), hmotnostní spektrometrie m/e (ES+)	(t,' 2H), 3,7 7,7 (d, 2H), 352,2 (MH+) .	(m, 1H), 7,9 (d,
·ίί>	Příklad 2
«	Phv-Ala-Ala-Ala-Ly3-Val-III-Ala-Pip-NH2 (sekvence s identifikačním číslem 2)	a separace	izomerů

2.1 Syntéza (RS)-2-allyl-N-(benzyloxycarbonyl)prolinu

g metylesteru N-benzyloxycarbonylprolinu ve 20 ml THF se po kapkách přidalo k 27,5 ml (2M v hexanu/THF) diisopropylamidu litnému ve 100 ml THF v -78 °C pod dusíkem. Směs se míchala 30 minut, a poté se po kapkách přidalo 5,5 ml allyljodidu a směs se míchala dalších 30 minut, poté se ponechala zahřát na teplotu okolí. Poté se směs přidala k 200 ml vodného chloridu amonného a extrahovala s 2x 200 ml éteru. Éterová vrstva se odpařila a zbytek se purifikoval chromatografii na oxidu křemičitém za použití hexanového '·. i* e

ι>

Γ» n O <

-51’ r ’ l oi *· ty> í?

• ř c gl· <?<: f c ¢- *A ¢1 £» c fit ní rj ¢1 r bffj íir

C <*i V.

ij. «>> O tx ,

O i) ly ♦; W

0) i: i!)

C < t> Č

A.

ft* **· gradientu stoupajícímu k 20% etylacetát-.hexanu. Příslušné frakce, odpařené ,. do sucha, poskytly 9 g (RS) -2-allyl-N(benzyloxycarbonyl)prolinátu jako oleje.

8,5 g.této látky se rozpustilo ve 40 ml metanolu .a 4,5 g hydroxidu sodného přidaného vé 20 ml vody a směs se udržovala ¹ J . <

ve. varu ' 60, minut.' pH .směsi; se ' poté. upravilo .na 7' koncentrovanou·· kyselinou n chlorovodíkovou a metanol . .se odstranil, odpařením. pH směsi se upravilo na 3 a směs· se extrahovala 2x 50 ml éteru. Spojené éterové ' extrakty se odpařily za .vzniku (RS)-2-allyl-N-(benzyloxycarbonyl)pro-linu. jako gumy, NMR (dg-DMSO (373K) ) r 1,9 hm, 2H), 2,1 (m,. 2H)·’,

2,6 (q, 1H), 2,9 (q, 1H), 3,-4 (m, 1H) , 3,6 (m, l.H) , 5,0 (m, 4H), 5,75 (m, 1H), 7,3 (m, 5H).

2.2 Syntéza metylesteru carbonyl)prolyl]- (S) -alaninu [(RS)-2-allyl-N-(benzyloxy-

O

7,7 g HOBT, 6,6 g N-metylmorfolinu, 4,5 g metylesteru Lalaninylhydrochloridu a 5,7 g 1-(3-dimetylaminopropyl)-3etyl-karbodimidu se přidaly k 6,5 g (RS)-2-allyl-N(benzyloxycarbonyl)prolinu v 30 ml DMF a směs se míchala 18 hodin, a poté se odpařila. Zbytek se rozdělil mezi éter a vodu, filtroval, aby se odstranil HOBT a separovala organická vrstva. Organická vrstva se odpařila a. zbytek se purifikoval chromatografií · na oxidu křemičitém za použití gradientu 20% etylacetátu v hexanu . stoupajícímu .na 50.%.

• · · • ·· * · * * · • · · • · ·** ·· • · · * · » *· ·· • · · * • · ·· ··· · · ·'.» * ·· ··

- 52 etylacetát v hexanu. Příslušně frakce se spojily a odpařily do sucha za vzniku 7 g metylesteru [(RS)-2-allyl-N(benzyloxycarbonyl)prolyl]-(S)-alaninu, NMR (di-DMSO (373K)): několik zdvojení vrcholů způsobené směsí diastereoizomerů, 1,25 a 1,3 (2d, 3H), 1,75 (ra, 2H)‘, 2,2 (m, 2H), 2,65 (m, 1H),

2,9 (m, 1H), 3,4 (m, 1H), 3,65 (2s, 3H)·, 3,7 (m, ΪΗ), 4,3 (2q, 1H), 5,0 (m,'4H), 5,7 (m, 1H), 7,3. (m, 5H), 7,4 a 7,5 (bs,.lH) :

2.3 Syntéza metyl(S)-2-(l-benzyloxycarbonyl-6-oxo-l,7diaza3piro[4.4]non-7-yl)propionátu (CbZ-III-OMe)

1,5 ml 4% vodného roztoku oxidu osmičelého se přidalo k 1,45 g metylesteru f(RS)-2-allyl-N-(benzyloxycarbonyl)prolyl]-(S)-alaninu ve. směsi 30 ml metanolu á 20 ml vody. Směs se míchala 10 minut v argonové atmosféře, a poté se přidalo po částech 2,45 g jodistanu sodného. Směs se hodiny míchala, a poté se přidalo 100 mi vody a směs se extrahovala 2x 70 ml etylacetátu. Spojené extrakty se usušily a odpařily za vzniku 1,4 g gumy. Guma se rozpustila ve 30 ml dichlormetanu a 0,65 g trietylsilanu, a poté se po kapkách přidaly 4 g kyseliny trifluoroctové. Směs se míchala hodiny, odpařila a zbytek se rozdělil mezi vodný hydrogenuhličitan sodný a éter. Éterový extrakt se oddělil a odpařil do sucha. Zbytek se purifikoval chromatografii na oxidu křemičitém za použití gradientu 25% etylacetátu v hexanu stoupajícím na 100% etylacetát. Příslušné frakce se líi l-t 1> « ni d «4:

íil M fcj O d d * ’ .. i:

«:j:í r* η ς i f

C*. i' t < t · Ϊ, <? ,^f i> * i i: .

Cl 4» * « ct«’l i. ib.

ÍK. K

539 spojily a-odpařily, do; sucha zá’ vzniku-0/9·' g metyl(S)-2-(1benzyloxycarbonyl-6^JóxÓ7-l·, 7-Hiazaspíro[4.4]non-7-yl) propionáí tu, NMR (dg-DMSO (373K)) : několik zdvojení vrcholů způsobené ' /' ' -A směs.í diastereoizomerů, 1,25 a 1,35 (2d, 3H), 1,95 (m, 6H), ,_v-‘· *

-3,1-3,5 (m, 4K), 3,6 á 3,,65 C2s,\3H), 4,5 a 4,65 (2q, 1H),

1*

5,05 (m, 2H), 7,25 (mý-5H) ?

I f v

_ . -Λ

- · · v ^t f

2.4 Syntéza kyseliny (S)—2-(6-oxo-l, 7-diazaspiró[4.4]non-7yl)propionové (Ή-ΙΪΙ-0Η)'

2,5 g uhličitanu draselného se přidalo ke 3,3 g metyl(S)-2-(l-ben-zyloxycarbonyl-6-oxo-l,7-diazaspiro[4 . 4]non-7-yl) propíonátu ve směsi 40 ml metanolu a 40 ml vody, a směs se míchala při teplotě okolí 10 hodin. pH se upravilo na ~5 - koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a směs se odpařila do.sucha.'Zbytek,se rozpustil ve 40 ml vody a ptí se upravilo na 3 koncentrovanou' kyselinou chlorovodíkovou. Směs se poté extrahovala. 2x 50 ml dichlormetanu. Spojené extrakty se ..usušily UMgSQJ- a - odpařily za poskytnutí 2,8 g pěny. Pěna se rozpustila, ve:. 20 ml metanolu á'přidalo se 0,7 g cyklohexanu následovaného. 0,5 g 10% Pd/C. Směs se udržovala ve varu '2 hodiny,, ochladila, filtrovala a filtrát se odpařil za vzniku 1,9 g kyseliny (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7yljpropionové jako pěny, NMR (dg-DMSO}: několik zdvojení vrcholů způsobené směsí- diastereoizomerů, 1,25 á 1,3 (2s, 3H), 1,8 (m, 4H)'.,· 2,0 (m, 2H), 3,0 (m, 2H) , 3,3 (m, 2H) , 4,5 (m, 1H-) .

*« ·· φ φφ φ φ · φ φ φ φφ · ·

Φ Φ Φ Φ ΦΦ· Φ

ΦΦΦΦ · · *Φ ΦΦ Φ* • φ φ * φ · -φ φφφ φ φ · φφφφ φφ

-54Φ.

2.5 Syntéza kyseliny (S) ~2-[1-(9-fluorenylmetyloxycarbonyl)6-oxo-l, 7-diazaspiro-[4.4]non-7-yl]propionové (Ftnoc-III-OH)

K 0,42 g kyseliny (S)-2-{6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7yl)propionové se přidal pevný hydrogenuhličitan sodný v nadbytku ve 2 ml vody, a poté se přidalo 0,7 g 9-fluorenylmetylsukcinlmičylkarbonátu ve 3 ml acetonu. Směs se míchala 18 hodin. Směs se pak přidala k 10 ml vody, extrahovala' se 10 ml éteru, a vodná vrstva se oddělila. (Éterové extrakty se vyhodily). pH vodné vrstvy se upravilo na -3 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou, a poté se vrstva extrahovala 2x 10 ml dichlormetanu. Spojené extrakty se oddělily, usušily (MgSO₄) a odpařily za vzniku 0,62 g kyseliny (S)-2-[l-(9fluorenylmetyloxycarbonyl)-6-oxo-l, 7-diazaspiro-[4.4]non-7-yl] -propionové jako bílé pěny, NMR (d_s-DMSO (373K) ) : několik zdvojení vrcholů způsobené směsí diastereoizomerů, 1,3 (2d, 3H), 1,6-2,0 (m, 6H), 3,05 (m, 1H), 3,2-3,45 (m, 3H),4,2-4,4 (m, IH), 4,5 (m, 1H), 6,2 (s, 2H), 7,35 (m, 4H), 7,8 (m, 4H).

2.6 Syntéza Phv-Ala-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip-NH₂ a separace izomerů (sekvence s identifikačním číslem 2)

První část syntézy se prováděla za použití podobné metody jako je ta popsaná pro Příklad 1.4, ale za použití

Fmoc-III-OH místo Fmoc-IIb-OH. V tomto případě se acylace *

»♦·· ·· • · · · • · 99 »·« 9 * • · · • 9 ··

-55prováděly aktivací kyselin následujícím způsobem: 1 mmol kyseliny, 1 mmol HBTU, 2 mmol diisopropyletylaminu, 4 ml DMF.

U všech spojovacích reakcí se při Kaiserově testu pozorovalo, že byly kompletní po méně než 45 minutách. Tato metoda byla použita za vzniku Fmoc-Val-III-Ala-Pip-NH-pryskyřice. Peptidová pryskyřice byla poté přenesena na automatizovaný syntetizátor peptidů ABI 431, kde byla spojována zbylá rezidua v sekvenci podle doporučení výrobce pro jednotlivé acylace začleňující chemický postup s použitím HBTU/HOBT, jak následuje. Po deprotekci se pryskyřice promyla 10x 10-20 ml .

í DMF. 1 mmol kyseliny karboxylové byl aktivován

I ekvivalentem HBTU.

ekvivalent HOBT a 2 ekvivalenty DIPEA v DMF přibližně

II minut před přenosem na pryskyřici. Acylace se prováděla přibližně 60 minut, a poté byla pryskyřice promyta s lOx 10 až 20 ml DMF. Deprotekce Fmoc se v každém stadiu prováděla za použití 20% roztoku 'piperidinu v DMF (dvě ošetření 5 ml,

- každé 10 minut). Po každé deprotekci se pryskyřice důkladně., promyla 5x 10 ml DMF.

Peptid se od pryskyřice odštěpil působením 10 ml směsi kyseliny trifluorooctové (TFA), trietylsilanu (TES) a vody (90:5:5) po dobu 1,5 hodiny. Pryskyřice se odfiltrovala,, důkladně promyla s TFA, sebraný filtrát se koncentroval do sucha rotačním odpařením, a poté se výsledný zbytek roztíral éterem za vzniku Phv-Alá-Ala-Ala-Lys-Val-III-Ala-Pip^NH2 (sekvence s identifikačním číslem 2) obsahujícím dvě hlavní složky (RP-HPLC (kolona Vydac 218TP54 CIS) indikovala směs z 52:48). Více polární diastereomer se eluoval s retenčním . časem 12,5 minut a méně polární diastereomer s retenčním časem 16,5 minut za použití 20-50% gradientu acetonitril:voda • (obsahujícím 0,1% TFA) 20,' minut při rychlosti průtoku ml/minutu. Peptid se dále purifikoval preparativní HPLC,

			c' € i tt· c- Γ	<?□ h <- « € íi. <·,<: r ?. L.
			• t? s C C‘	c fl. Qj r <: *; ef.-.fl-í, fl I) C·-®
			r. f* O C, C
		56-
v podstatě .jak	popsáno- pro	příkiad	i. 4, za	vzniku dvou
izolovaných slož	ek, obé čisté	>95 % při	RP-HPLC.	. více polární
diastereoměr by	1- účinnější	než méně	polární	diastereomer

v testech A a B a byi charakterizován, jak následuje:.,

RP-HPLC (20-50% acetonitrilový gradient 20 minut, rychlost » ru/ průtoku· 1 ml/minutu);, retenční čas = 12,3 minuty, hmotnostní · ·*· spektrometrie, m/e ·..·.(ES r) 994,5 (MH) ,'· analýza aminokyselin \poskytla· Ala 3,99, Lys. 1,20, Val 0,73/

... Příklad -3- 4 ’

Phv-Ala-Lys-Ala-IIb-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (sekvence s identi* fikačním čísiem. 3)

Syntéza se prováděla ručně a purifikace se prováděla za , použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce a deprotekce. aminokyselin chráněných Emoc a Emoc-IIb-OH v příslušném pořadí. Produkt se charakterizoval ^μ HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin *

podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC '(eluce * acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TEA,.za použití 25-40% acetonitrilového gradientu 20 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 5,56 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 926,5 (MH^1-), analýza aminokyselin poskytla (Ala+IIb) 5,87, Lys 1,12.

Příklad 4 / Phv-Ile-Ala-Ala-Arg-Thr-IIb-Ala-Papa-NHa (sekvence s identit, fikačním čísiem 4) ** Syntéza se prováděla ručně a purifikace se prováděla za ’ použití metody, podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných EmocΒ

Β ·«

-57.

· · ♦ · • · • · ·»·· « · Β ·

Β · ΒΒ • * Β • · Β Β

Β· Β· » Β ♦ · • ·· Β ·

Β Β · • Β · ·

Papa-OH (použito místo Fmoc-Pip-OH),' Fmoc a Fmoc-IIb-OH v příslušném pořadí. Produkt se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující' 0,1% TFA, za použití 20-50¾ acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 17,08 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 1048,7 (MH⁺), analýza aminokyselin poskytla Arg 0,98, Ala 3,00, lib 1,27, Thr 0,86, Ile 0,88.

Fmoc-Papa-OH se získal způsobem analogickým tomu, který popsal Ξ. Atherton a R.C. Sheppard („Solid phase peptíče synthesis: a practical approach, IRL press, 1989, s. 51) pro iV-Fmoc-L-metnionin.

Fmoc-Papa-OH: NMR (DMSO-d_s) 3,5 (s, 2H.), 4,25 (t, ÍH) , 4,5 (d,.2H), 7,1 (d, 2H), 7,4 (m, 6H), 7,75 (d, 2H), 7,9 (d, 2H),

9,6 (s, 1H), hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 372,1 (MH⁺) .

Příklad 5

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 5)

Syntéza se prováděla ručně za''použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných Fmoc a Fmoc-IIb-OH v příslušném, pořadí. Produkt se purifikoval za použití preparativní RPHPLC podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, eluce gradientem acetonitril-voda obsahujícím 0,1% TFA (15-40% acetonitrilu) 60' minut, při rychlosti průtoku 10 ml/minutu. Produkt se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií aminokyselin podobným způsobem jak popsáno

1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou a analýzou v příkladě obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% acetonitrilového ,-, \ c c fř w < C *;· <. Q- ϋ

C. α] <; <.' ο ς,α« C

C C.TQfc -C:

ί C' ζ Cci · Ο C < ..

C ί Γ»

C. 0«

C C G c

-58gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu),· retenční čas =18,28 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 982,5* (MH⁺), analýza aminokyselin poskytla Arg 1,12,· . (Ala+IIb)· 3,8,., Val 1,12. . ..... . y. . ' . .

.· · ·.-··-. ··- Příklad 6''ž i . per r.··· n ; ;.

• ' *·«- i .4 /'t . ._.£,· y. sj* * ¹Ά’*. v

Phv-Arg~Ala-Ala--Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 > (sekvence ' s , identi-.. fikačním číslem 6} :·? ' - ·,, ‘ , , ₄ ·, * a* První· část syntézy -se· prováděla ručně za použití metody· podobné té, · co _rje. popsána >.v„.příkladě ,1.4,- spojovací reakce, a'deprotekce..aminokyselin...chráněných ,’Fmoc-Papa-OH: (použito místo Fmoc-Pip-OHj, Fmoc a'. Fmoc-IIb-OK--y příslušném pořadí* za, vzniku Fmoc-Thr(OBu)-Ilb-Ala-Papa-NH-pryskyřice. Peptídová pryskyřice bylá potépřenesena na automatizovaný syntetizátor (ACŤ 357) 'a zbylá rezidua se spojovala podle doporučení výrobce ' pro jednotlivé acylace začleňující chemický postup s použitím HBTU/HOBT. ' peptid,, se odštěpil od pryskyřice a purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě 1.4. Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní 'spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným ,. způsobem^ak···.popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC-’(eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50%-'acetonitrilového .-gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 .ml/minutu)·,. retenční. - čas = 18,21 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 1006,4 (MH⁺), analýza aminokyselin poskytla Arg. 1,10, Ala 3,88, lib 1,04, Thr 0,95.

Přiklad 7

Phv-AIa-Ala-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Papa-NHj (sekvence s identifikačním číslem 7) _r . .·. . - n - • · · • ♦ · « · · ·· ·♦ • « »·« · 4 • · 4 ·* ··

-59použiti

První část syntézy se prováděla ručně za použití metody podobné té, . co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných Fmoc-Papa-OH (použito místo Fmoc-Pip-OH) , Fmoc a Fmoc-IIb-OH v příslušném pořadí za vzniku Fmoc-Val-IIb-Ala-Papa-N-H-pryskyřice. Peptidová pryskyřice byla poté přenesena na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zbylá rezidua se spojovala podle doporučení výrobce pro jednotlivé acylace začleňující chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid se odštěpil od pryskyřice a purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě 2.6. Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za 10-50% acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 20,87 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (SS+) 1004,6 (MH⁺) , analýza aminokyselin poskytla Arg 0,96, (Ala+IIb) 5,05, Val 0,97.

Příklad 8

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Val-IIb-Gly-Papa-NH2 (sekvence s identifikačním číslem 8)

První část syntézy se prováděla ručně za použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných Fmoc-Papa-OH (použito místo Fmoc-?ip-OH), Fmoc a .Fmoc-IIb-OK za vzniku Fmoc-ValIlb-Gly-Papa-NH-pryskyřice. Peptidová pryskyřice byla poté přenesena na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zbylá rezidua se spojovala podle doporučení výrobce pro jednotlivé acylace začleňující chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid se odštěpil od pryskyřice a purifikoval preparativní je popsán hmotnostní • · · • · · · • * · ·*·· ♦·

-60 RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co v příkladě 2.6.. Peptid se charakterizoval HPLC, spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující' 0,1% TFA, za použití 10-50% acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 18,12 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 538,4 (MK⁺), analýza aminokyselin poskytla Arg 0,92, Ala 2,16, (Gly+IIb) 2,12, Val 0,88.

Příklad 9

Phv-Ala-Ile-Ala-Arg-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 9)

Syntéza se prováděla ručně a purifikace se prováděla za použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných Fmoc .a Fmoc-IIb-OH v příslušném pořadí. Produkt se charakterizoval· HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno· v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 23,4 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e. (ES+) 1024, 6· (MH⁺), analýza aminokyselin poskytla Arg 1,15, (Ala+IIb) 3,88, Val 0,96, Ile 1,02.

Příklad 10

Phv-Ala-Arg-Ala-Hi3-Val-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 10)

První část syntézy se prováděla ručně za použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce

-61 a deprotekce aminokyselin chráněných Fmoc-Papa-OH (použito místo Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH za vzniku Fmoc-ValIlb-Ala-Papa-NH-pryskyřice. Peptidová pryskyřice byla poté přenesena na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zbylá rezidua se spojovala podle doporučení výrobce pro jednotlivé acylace začleňující chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid se odštěpil od pryskyřice a purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě 2.6. Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 20-50% acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 18,8 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 1070,6 (MH⁺), analýza aminokyselin poskytla Arg 1,02, (Ala+IIb) 4,12, Val 0,90, His 0,95.

Příklad 11

Phv-Ala-Ala-Asn-Arg-Val-IIb-Ala-Pip-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 11)

První část syntézy se prováděla ručně za použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných Fmoc a Fmoc-IIb-OH v příslušném pořadí za vzniku Fmoc-IIb-Ala-Pip-NH-pryskyřice. Peptidová pryskyřice byla poté přenesena na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) a zbylá rezidua se spojovala podle doporučení výrobce pro jednotlivé acylace začleňující chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid se odštěpil od pryskyřice a purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě 2.6. Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou * * β * · · » · · · * ·

I« · · · ·· · * ·· • · • · « ·*· ·» ·· · ··

-62aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TRA, za použití 10-50% acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku '1,0 ml/minutu), retenční čas = 17,66 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES + ) 1025,5 (MH⁺) , analýza aminokyselin poskytla Arg 1,04, Ala 2,94, Val 0,95, Asp 1,05.

Příklad 12 použití metody 2.6, spojující

Phv-Ala-Arg-Ala-XIb-Ala-Ala-Ala-Pip-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 12) ·

První část syntézy se prováděla automaticky na automatizovaném syntetizétoru ABI 431 za podobné té, co je popsána v příkladě aminokyseliny chráněné Fmoc v příslušném pořadí za vzniku Fmoc-Ala-Ala-Pip-NH-pryskyřice. Zbytek syntézy se prováděl ručně a produkt se purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě i·. 4. Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným v.příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 16,68 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 954,6 (ΜΗ*), analýza aminokyselin poskytla Arg 1,09, (Ala+IIb) 5,88.

způsobem jak popsáno acetonitrilem a, vodou

Příklad 13

Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH (CH₂) ₃NH. C (=NH) .NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 14) t ί * «: ί *

4. «

Ί ρ

ΐ * «ί •i ' -í !| j

•i ; ·' H (sekvence s • 0,4 g dostupného pryskyřici » « < β:

»! k ««

4. I <j λ * 4 · 4ι <

t *^j ii: c

4Í li <<. tlil I: lij ll jí «: 4; «I 41? 4i:;.

1. 4| < íf

4ι «ί 4..Ό

Příprava- Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH₂) ₃NH₂ 'identifikačním číslem .13) m... .

2-chlórotritylčhloridové . pryskyřice (0,25 .mmol chloru) ’ se^?s konvertovalo na (G-aminoptopyl)·aminoreakcí - s·'· 0/42 .ml í.l/3-diaminópropanu ,ve i. 4 ml -DMF hodinu při teplotě'· okolí. -Po důkladném·, promytí';? DMF· se

-íi (M pryskyřice··přenesla do syntétizátoru peptidů ;od í-firmy-Applied Biosystems 43QA a prováděly se postupné spojovací reakce a deprotekce příslušných aminokyselin podle doporučení výrobce. 0,722 g pryskyřice se. poté promylo metanolem a usušilo.' Peptid' se Odštěpil··; od-^pryskyřice a· purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě· 2; 6. Produkt se charakterizoval HPLC, #

hmotnostní spektroskopii a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4,. RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% acetonitrilového gradientu 40 minut·, rychlost průtoku

1,2 ml/minůtu) ,* retenční čas - 17,76 minuty.' Tak bylo po. lyofilizaci získáno 329 mg Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-GlyNH(CH₂)₃NH₂ (sekvence s’^ť identifikačním číslem 13) hmotnostní spektrometrie, m/e (ES-t) 916,5 (MH⁺) .

b) ^f 'Příprava . Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-GlyNH(CH₂)₃NH.C(=NH) ,NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 14)

.. 329 .mg- ··.. Phv-Alá-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-NH(CH₂)₃NH₂ (sekvence s, identifikačním číslem 13) se rozpustilo ve směsi 5 ml vody a 5 ml'acetonitrilu a 132 mg (3 ekvivalenty) 1-Hpyrazol-í-karboxámiďinhydrochloridu a přidalo se 52 μΐ (1 ekvivalent) diizopropyletylaminu.' Směs se míchala 4 dny při teplotě okolí. Směs se puřifikovala preparativní RP-HPLC á charakterizovala. HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin’ podobným 'způsobem' jak popsáno v .příkladě 1.4.

• ·

«.5 · a 0 00 • · Φ ’

0 * «

0« · a 00 00

- 64 Tak bylo získáno 178 mg Phv-Ala-Arg-Ala-Ala-Thr-IIb-GiyNH (CH₂) ₃NH. C (=NH) . NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 14) RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% acetonitrilového gradientu 40 minut, rychlost průtoku 1,2 ml./minutu), retenční čas = 18,42 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES⁺) 958,5 (MH⁺) , analýza aminokyselin poskytla Thr 0,86, Gly 0,90, Ala 3,20 Arg 1,00.

Příklad 14 ί Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Gly-NHEt (sekvence s identifikačním číslem 15)

První část syntézy se prováděla na syntetizátoru peptidů

-il od firmy Applied Biosystems 430A a postupné spojovací reakce , a deprotekce příslušných aminokyselin se prováděly podle doporučení výrobce, začínajíc od 0,54 g (0,25 mmol) Boc-GlyO-benzylesterové pryskyřice (pryskyřice Merrifield). 871 mg pryskyřice se promylo metanolem a usušilo, a poté se jemně míchalo s 10 ml DMF a 10 ml 2M etylaminu v metanolu 7 dnů při ·* teplotě okolí. RP-HPLC indikovala rychlé uvolňování metylesteru do roztoku následované pomalou konverzí na slaběji hydrofilnější N-etylamid. Směs se filtrovala a pryskyřice se promyla s DMF. Odpaření rozpouštědel poskytlo hrubý chráněný peptid jako N-etylamid. Deprotekce peptidu se provedla za použití směsi TFA, TES a vody (90:5:5) a peptid se purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě 2,6 za vzniku 168 mg / Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-Ub-Gly-NHEt (sekvence s ídenti• fikačním číslem 15). Peptid se charakterizoval HPLC, ** ' hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným *' způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% • 4

4 acetonitrilového gradientu 40 minut, rychlost průtoku 1,2 ml/minutu), retenční čas = 17,35 minuty, hmotnostní spektroskopie, m/e (ES⁺) 972,5 (MH⁺) , analýza aminokyselin poskytla Thr 0,83, Gly 1,03, Ala 2,17, lib 0,9, Arg 2,00.

Příklady 15 a 16

Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH2 (Příklad 15) (sekvence s identifikačním číslem 16)

Phv-Gap (Me) ₄-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (Příklad 16) (sekvence s identifikačním číslem 17)

a) Příprava Phv-Dap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 36)

Syntéza se prováděla automaticky na syntetizátoru peptidů od firmy Applied Biosystems 430A za použití 0,25 mmol pryskyřice Fmoc Rink Amide a postupné spojovací reakce a deprotekce příslušných aminokyselin se prováděly podle, doporučení výrobce. Zbytek Dapse začleňoval za použití FmocDap(Boc)-OH v příslušném stadiu syntézy. Dokončená pryskyřice se usušila. Výtěžek byl 1,292 g (hmotnostní přírůstek, 792 mg) . Peptid se odštěpil od pryskyřice a purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě 1.4, ale za použití kolony Dynamax 60A (vnitřní průměr 2,54 cm (1 palec}) eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA (gradient 10-40% acetonitril) 60 minut při rychlosti průtoku 12 ml/minutu za vzniku 304 mg Phv-Dap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s' identifikačním číslem 36). Peptid se' charakterizoval HPLC a hmotnostní spektroskopií podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-40% acetonitrilového • «9 ·

9 «9

9 9 · ·

9 9 ·

9 9 *

9 · ♦ 9 · • 9 ·

99 9 ·* • 9 9 9 • 9 99 • 99 9 · • 9 9

99

-66gradientu 60 minut, rychlost průtoku 1,2 ml/minutu), retenční Čas = 24,5 minuty, hmotnostní spektroskopie, m/e (£S⁺) 937,1 (MH) .

Peptid Dap za) se rozpustil v 7 ml vody a 8 ml mg 1-H-pyrazol-ldiizopropyletylaminu acetonitrilu a. ošetřil se 130 karboxyamidinhydrochloridu a 53 μΐ 1 týden při teplotě okolí. RP-HPLC indikovala, pouze 40% konverzi na odpovídající peptid Gap. Pokusná preparativní RPHPLC selhala úplně v oddělení těchto dvou sloučenin. V souladu s tím se směs ošetřila 87 mg HBTU a 50 pl diizopropyletyíaminu v 50 ml DMF 16 hodin, aby se nezměněnný peptid Dap konvertoval na tetrametyiguaničinový (GapMe₄) peptid. Zvýšená hydrofobnost této sloučeniny umožnila snadnější preparativní HPLC (podmínky jak popsáno v a)), která se prováděla za použití stejných podmínek jako ta popsaná v a) výše za vzniku obou

i) 80 mg Phv-Gap-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb~Ala-Papa-NH₂ (.sekvence s identifikačním číslem 16), které se charakterizovaly HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC acetonitrilový gradient 40 minut, rychlost

1,2 ml/minutu), retenční čas = 26,2 minuty, hmotnostní spektroskopie, m/e (ES⁺) 978,5 (MH⁺), analýza aminokyselin poskytla Thr 0,90, Ala 4,05, lib přítomný, vrchol v pozici Trp pro Gap.

(10-40% průtoku ii) 122 mg Phv-Gap (Me) ₄-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 17) které se charakterizovaly jako za i) výše, RP-HPLC (eluce a gradient jako v i) výše) retenční čas = 28,4 minuty, hmotnostní spektroskopie, m/e (ES*) 1034,6 (MH⁺), analýza aminokyselin

Λ ··«· · ·· <

» t «v · . · · · · 9 99 999 9 I * · · · · · 1 ·· ·· ·· ·· * · · * • · • · · · · ··« 9 99

-67 poskytla Thr 0,90, .Ala 4,11, lib přítomný, vrcho)

Trp pro Gap(Me)₄.

Příklad 17

Phv-Arg-Ala-Ala~Ala-Thr-IIb-Gly-NHCH₂CH₂-niorfolin s identifikačním číslem 18) ·,

Pro tuto syntézu byla použita strategie chráněného fragmentu. 1 g (1 mmol) Fmoc-Gly-O-Chlorotritylové pryskyřice se připravil automaticky na syntetizátoru peptidů od firmy Applied Biosystems 430A spojením 2 mmol Fmoc-Gly-OH s 1 g (1 mmol) 2-chlorotritylchloridové pryskyřice v 10 ml DMF za přítomnosti 4 mmol N-diizopropyletylaminu a prodlužoval se strategií dvojího spojování (podobným způsobem jak- popsáno v příkladě 2.6) za vzniku. 2,15 g chráněné, peptidové pryskyřice. Po odštěpení od pryskyřice 30 ml dichlormetanu, 5 ml kyseliny octové a 5 mi trifluoretanolu při teplotě okolí 1 hodinu, se pryskyřice odfiltrovala a promyla dichlormetanem a kyselinou octovou. Odpaření rozpouštědel a následná lyofilizace z vodného acetonitrilu poskytlo 1,23 g vyžadovaného chráněného peptidů. Peptid se charakterizoval podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (20-80% acetonitrilový gradient 40 minut, rychlost průtoku

1,2 ml/minutu), retenční čas = 26,2 minuty.

235 mg (0,2 mmol) chráněné kyseliny se spojilo s 27 μΐ (1 ekvivalent) 4-(2-aminoetyl)morfolinu v 10 ml DMF se 76 mg (1 ekvivalent) HBTU a 70 μΐ diizopropyletylaminu. Odpaření rozpouštědel, deprotekce 90% TFA/H₂O a purifikace za použití podobného způsobu jak popsáno v příkladě 1.4 poskytlo 150 mg čistého amidu. Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (10-40% acetonitrilový

L V POZICI (sekvence

-68gradient 40 minut, rychlost průtoku 1,2 ml/minutu), retenční čas = 13,6 minuty, hmotnostní spektroskopie, m/e (ES⁺) 972,8 (MH⁺) , analýza aminokyselin poskytla Thr 0,6, Gly 1,02, Ala 2,94, lib 0,9, Arg 1,00.

Příklad 18

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-GIy-N (CH₂CH₂) ₂NCH₂CH₂O-CH₂CH₂OH (sekvence s identifikačním číslem 19)

Za použití postupu analogického tomu, který je popsán v příkladě 17,. ale při použití 4-[2-(2-hydroxyetoxy) etyljpiperazínu místo 4-(2-aminoetyl)morfolinu byl získán Phv-A.rg-Ala-Aia-Ala-Thr-IIb-C-ly-N (CH₂CH₂) ₂NCH₂CH₂OCH₂CH₂OH (sekvence s identifikačním číslem 19) . Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (za použití eluce a gradientu jako v příkladě 17) retenční čas = 20,5 minuty, hmotnostní spektroskopie, m/e. (ES⁺) 1016,8 (MK⁺), analýza aminokyselin poskytla Thr 0,89, Gly 1,02, Ala 2,98, lib 1,05, Arg 1,00.

Příklad 19

Phv-Axg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Gly-Pape-NHC (-NH)NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 20)

Za použití postupu analogického tomu, který' je popsán v příkladě 17, ale při použití 4-(2-guanidinetyl)anilinu místo 4-(2-aminoetyl)morfolinu byl získán Phv-Arg-Ala-AlaAla-Thr-IIb-Gly-Pape-NHC(=NH)NH_Z (sekvence s identifikačním číslem 20). Peptid se purifikoval preparativní RP-HPLC podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, ale za použití kolony Vydac 201HS1022 (vnitřní průměr 2,54 cm (1 palec))

-69a eluce s', gradientem acetonitril-voda obsahující 0,1% TFA (10-35% acetonitri 1) < 60,. .minut* <při < rychlosti průtoku , 12 ml/minutu. Peptid se charakterizoval.·. HPLC, hmotnostní spektroskopií - a.· analýzou (aminokyselin,· RP-HPLC (za použití eluce a- gradientu jakový;'příkladě. 17) retenční'-čas ^r=.‘24,2 minuty,, hmotnostní ^: spektroskopie, m/e. (ES⁺) t 1021-, T '' (MH⁺) , analýza·,aminokyselin;,,poskytla ¹ Thr 0,8,- Gly ' 0/95, -Ala '2,86, Arg·; 1,.00,,/Ilbvpřítomný; .·/'·.··'· ; , ' ¹ * Λ * λτ ·,^ & * v ' -+-4¹ 4 ·

-» 4-..(27guanidinetyl·)áňilindihydrochlorid -tse - připravil, následujícím .postupem.!

.*'1,0ί3ς._; (5 .mmol)d 4rnitrofenety.laminhydrochloridu, 0/⁷33g ·* (5. mmol) ΰ.Β-pyrazol^l-kárboxamidinhydrochlořidu a 0,88 mi

4· (5-mmol) N-diizopropyletylaminu v 10 ml acetonitrilu a 10 ml vody .se. míchaio.-ilé hodin při teplotě okolí, Preparativní RPHPLC se prováděla ve dvou částech za použití kolony Dynamax ' , 60A, C18· (vnitřní průměr 2,54 cm (1 palec)), eluce s acetonitrilem-„a;'¹ vodou* obsahující 0,1% TFA za poskytnutí •«i čistého 4-nitrofenetylguanidinu. Produkt se rozpustil ve \ 100 , ml .-vody a přidala se jedna kapka koncentrované kyseliny chlorovodíkové, následovaná 5% paladiem na 100 mg uhlíku ’ a·, roztokem -v probublával l'4, hodiny vodík. Katalyzátor se odstranil filtrací a'.'promyl vodou. Těkavé látky se odstranily odpařením, za,,r vzniku _; 0,984 gv',4-(2-guanidinetyl)anilindihydrochloridu, jako ...hnědé .,pěny,ř *(po vysušení přes pelety hydroxidu draselného)·.' · 4 Pří klad. 20 .. ·. .

Phv-Ala-Ala-Ala-Axg-Thr-IIb-Ala-rPapa-NHa (sekvence s identi• fikačním číslem 21).

»”· · • φ φ

φ φ φφφφ * φ • » φ φ · φ φ • ·Φ φφφ» φ φ φ φ φφφ φ · φφφ φ φ · φφ φφ φφ Φ·

-70První část syntézy se prováděla ručně za použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 2.6, za použití aktivace HBTU/DIPEA a spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných Fmoc a Fmoc-IIb-OH v příslušném pořadí za vzniku Fmoc-IIb-Ala-Papa-NH-pryskyřice. Peptidová pryskyřice byla poté přenesena na automatizovaný syntetizátor (ABI 431) -a zbylá rezidua se spojovala podle doporučení výrobce pro jednotlivé acylace začleňující chemický postup s použitím HBTU/HOST. Peptid se odštěpil od pryskyřice a purifikoval za použití postupu podobného tomu, co je popsán v přiklade 2.6. Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě i.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použiti 20-40% acetonitrilového gradientu 20 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 11,57 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 1006, 4 (MH⁺), 503,8 (M+2H⁺') , 514,3 (M+H⁺+Na⁺) , analýza aminokyselin poskytla Ala 4,19, Arg 0,91, Thr 0,74.

Příklad 21

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 22)

První část syntézy se prováděla ručně za použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 2.6, za použití aktivace HBTU/DIPEA a spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných Fmoc a Fmoc-IIb-OH v příslušném pořadí, kromě začlenění zbytku Azgly. Zbytek Azgly byl začleněn spojovací reakcí 4 ekvivalentů Fmoc-Azgly-OSu (získán jak popsáno v EP 518655) s 0,25 ekvivalenty HOBT v DME v 50 °C 4 hodiny. Získala se tak Fmoc-IIb-Azgly-Papa-NH-pryskyřice. Peptidová pryskyřice byla poté přenesena na automatizovaný syntetizátor • · · ;

• · · ···· ·· » *' · ·· • » · · « · ·· ·« · v · • · · w ·· (ABI 431) a zbylá rezidua se spojovala podle doporučení výrobce pro jednotlivé acylace začleňující chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid se odštěpil od pryskyřice a purifikoval za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě 2.6. Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 15-35% acetonitrilového gradientu 20 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 8,10 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (negativní elektrospray (ES-)) 1076,4 (ΜΗ') , poskytla Ala 2,10, Arg 2,.00, Thr 0,99.

analýza aminokyselin

Příklad 22

Phv-Ala-Arg-Ala-Arg-Thr-IIb-Azgly-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 23)

Byl použit postup . analogický s postupem popsaným v příkladě 21. První část syntézy se prováděla ručně za použití aktivace HBTU/DIPEA za vzniku Fmoc-IIb-Azgly-NHpryskyřice. Peptidová pryskyřice byla poté přenesena na automatizovaný syntetizátor (ABI 430A) a zbylá rezidua se spojovala podle doporučení výrobce pro jednotlivé acylace začleňující chemický postup s použitím HBTU/HOBT. Peptid se odštěpil od pryskyřice a purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě 2.6. Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC' (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použiti 20-35% acetonitrilového gradientu 20 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 7,26 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 945,6

-72(ΜΗ^Τ) , 473,4 (M+2H⁺⁺), analýza aminokyselin poskytla Ala 2,08, Arg 2,00, Thr 0,78.

Příklad 23

Phv-Ala-Arg-Ala-IIb-Ala-Arg-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 24)

Byl použit postup analogický s postupem popsaným v příkladě 2.6, kromě toho, že veškeré spojování peptidů se provádělo, ručně za použití aktivace HBTU/DTPEA, spojování Fmoc-Pap-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Arg(Pbfj -OH, Fmoc-IIb-OH a- kyseliny 5-fenylvalerové v příslušném pořadí. Peptid se odštěpil oč pryskyřice za použití postupu, podobného tomu, co je popsán v příkladě 2.6. Produkt se purifikoval za použití preparativní RP-HPLC podobným, způsobem jak popsáno v příkladě

1.4, eluce s gradientem acetonitril-voda obsahující 0,1% TFA (15-30% acetonitril) 90 minut při rychlosti průtoku 10 ml/minutu.. Produkt se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 15-30% acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 20,02 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+)

1061,6 (MH⁺) , 531,4 (M+2H⁺⁺), analýza aminokyselin poskytla

Ala 4,16, Arg 2,00, lib přítomný.

Příklad'24

3- (2-kyanobenzo[b]thiofen-5-yl) propionyl-Ala-Arg-Ala-IIb-AlaArg-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 25)

Syntéza a purifikace se prováděly ručně za použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací •

«

-73reakce a deprotekce aminokyselin chráněných Fmcc-?ap=-OH (použito místo Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH v příslušném pořadí a za použití kyseliny 3-(2-cyanobenzo[bÍthiofen-5yl)propionové místo kyseliny 5-fenylvalerové. Produkt se purifikoval za použití preparativní RP-HPLC podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, eluce s gradientem acetonitrilvoda .obsahující 0,1% TFA (15-40% acetonitril) 60 minut při rychlosti průtoku 10 ml/minutu. Produkt se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 17,58 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 1114,7 (MR⁺) , analýza aminokyselin poskytla Arg 2,86, Ala 4,12, lib 1,00.

Kyselina 3-(2-kyanobenzo[b]thiofen-5-yl)propionové se získala, jak následuje:

a) 1 g Raneyova katalytického niklu a 3 ml hydrazinhydrátu se přidaly k 25 g etyl 5-nitrobenzo[b]thiofen-2-karboxylátu (získán jak popsáno v Syn. Comm.,.21, 959-964, 1991) v 500 ml etanolu v 60 °C. Následovala prudká reakce a směs se přivedla k varu. Další díly Raneyova niklu (1 g) a hydrazinhydrátu (3 ml) se přidávaly v lOminutových intervalech, dokud se nepřidalo celkové množství 15 ml, a směs se poté udržovala ve varu 90 minut. Horká směs se filtrovala a filtrát se odpařil. Zbytek se rozpustil ve 300 ml horkého etanolu a přidalo se aktivní uhlí. Směs se filtrovala a filtrát se odpařil do sucha za vzniku 18 g etyl 5-aminobenzo[b]thiofen-2karboxylátu jako světle žluté pevné látky. Pevná látka se přidala k míchané směsi 50 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové a 130 ml vody v ~0 °C. Pomalu se přidal roztok φ φ · · u. · · · · · φ · · ·· φ « · · φ « φ · * φ φ · · · » φ φφ ΦΦΦ · · * ♦ · · φ • ΦΦΦ φφφφ φ φ φ *« «*

-74 5,6 g dusitanu sodného ve vodě, a poté se směs míchala v 0 °C dalších 30 .minut. Poté se přidal roztok 130 g jodidu draselného v 200 ml vody. Směs se ponechala zahřát na teplotu okolí, a poté se zahřívala 30 minut v 50 °C. Směs se ponechala vychladnout, extrahovala 150 ml chloroformu a organická vrstva se promyla roztokem vodného siřičitanu sodného. Organická fáze se usušila (MgSO₄) a odpařila za vzniku hnědého oleje. Olej se purifikoval chromatografii na oxidu křemičitém za použití hexanového gradientu stoupajícího k 10% etylacetát/hexan. Příslušné frakce se spojily a odpařily za vzniku 14 g 5-jodobenzo[b]thiofen-2-karboxylátu jako oleje, NMR (d₆-DMSO): 1,35 (t, 3H), 4,4 (q, 2H) , 7,8 (dd, 1H), 7,9 (d, 1H) , 8,15 (s, 1K), 8,45 (d, 1H).

b) 5 g hydroxidu sodného ve 150 ml vody se přidalo k 14 g 5jodobenzo[b]thiofen-2-karboxylátu ve 200 ml etanolu a směs se míchala 16 hodin. Směs se koncentrovala na asi 150 ml odpařením a ve směsi se upravilo pH na ~3· přidáním naředěné kyseliny chlorovodíkové. Směs se poté extrahovala 2x 100 ml. dietvléteru. Spojené organické extrakty se usušily (MgSO₄)· a odpařily za vzniku 11,7 g kyseliny 5-jodobenzo[b]thiofen-2karboxylové jako pevné látky, NMR (dg-DMSO): 7,8 (dd, 1H),

7,9 (d, 1H), 8,05 (s, 1H), 8,45 (d, 1H) .

c) 2,7 ml oxalylchloridu a 1 kapka DMF se přidaly k 3,05 g kyseliny 5-jodobenzo[b]thíofeň-2-karboxylové ve 30 ml dichlormetanu, načež začal vývoj plynu. Poté, co se vývoj plynu ukončil, směs se odpařila do sucha a zbytek se rozpustil v 10 ml THF. Roztok se přidal po částech ke 25 ml koncentrovaného vodného čpavku. Po ukončení přidávání se směs míchala 1 hodinu. Pevná látka, . která precipitovala, áe sesbírala filtrací, promyla vodou a usušila ve vakuu. 3 g pevné látky se rozpustily v 15 ml DMF a směs se přidala v 0 '°C’ ke směsi 20 ml DMF a 3 g fosforylchloridu. Směs se *-_w· · · * • · · »·

4 4 4 4 * *

4 4 4· »4 44

4 4 »4 44

-752 hodiny míchaia. Směs se poté přidala do 60 ml vody a pevná látka, která precipitovala, se sesbírala filtrací, promyla vodou a usušila ve vakuu za vzniku 2, 65 g 2-kyano-5jodobenzo[b]thiofenu jako světle žlutého prášku, NMR (d_s-

d) 2 g metylakrylátu, 2,35 g trietylaminu a 0,05 g paladiumacetétu se přidaly k 4,8 g 2-kyano-5jodobenzo[b]thiofenu v 25 ml DMF a směs se míchala v argonové atmosféře v 90 °C 30 minut. Směs se ponechala vychladnout, a poté se přidala do 50 ml vody. Pevná látka, která precipitovala, se sesbírala filtrací a rozpustila v chloroformu. Přidalo se aktivní uhlí a směs se filtrovala a filtrát se usušil (MgSO₄) . Rozpouštědlo se odstranilo' odpařením za vzniku 2,5 g metyl-3-(2-kyanobenzo[b]thíofen-5yl)akrylátu, NMR (d_e-DMS0): 3,75 (s, 3H), 6,7 (d, 1H), 7,8

e) 2,5 g metyl-3-(2-cyanobenzo[b]thiofen-5-yl)akrylátu se hydrogenovalo ve 20 ml THF za použití 10% paladia na 0,5 g uhlíku jako katalyzátoru, dokud nevymizela většina počáteční látky při chromatografii na tenké vrstvě (destičky z oxidu křemičitého eluované etylacetát/hexanem 1:4). Směs se filtrovala a odpařila za vzniku 1,45 g metyl-2cyanobenzo[b]thíofen-5-propionátu kontaminovaného s ~20 % počáteční látky. 0,23 g hydroxidu sodného se přidalo ke směsi 1,4 g tohoto produktu v 10 ml THF a 3 ml vody a směs se míchala 2 hodiny. pH směsi se upravilo na -5 koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou a koncentrovalo odpařením, aby se odstranil přítomný THF.

r r. e f, c t c o c c <, c c <; c · c · ¢- 5 ' · c c ζ e* β t c· c O C ‘ · * * r; , c , f c c <· o c í c« t · c •»·c '·* c ·£ ·^Γ 0 c

-764(

Příklad 25Phv-Arg-Ala~Ala-IIb-Ala-Axg-Ála-Papa-NH2 (sekvence s identifikačním číslem 26)

Syntéza Se provádělaručně a .purifikace se prováděla zapoužití.. metody . podobné ,té, i.cp*je· popsána , v příkladě 1.4, spojovací reakce·:a deprotekce aminokyselin chráněných FmocPapa-ΌΗ ' (použito··· místo. Fmoo-Pip-O.H), Fmoc a Fmoc.-í Ib-OH -v příslušném pořadí; Produkt se- charakterizoval' HPLC,

Ml·,’· hmotnostní., spektroskopií a..analýzou .aminokyselin· podobným _ř .způsobem jak popsáno .v příkladě- 1.4, RP-HPLC. (eluce .acetonitrilem a vodou obsahující 0,1'%- TFA, za' použití 10.-50% * -acetonitrilového· .-gradientu 30 minut, rychlost průtoku l/O ml/minutu), retenční čas = 17,45 minuty,, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES⁺) 1061,9 (MH⁺) , analýza aminokyselin poskytla Arg 1,94, Ala 4,04, lib 1,02.

Příklad 26 ... .

Ί ’ .j Phv-Arg-Ile-Ala-Iib-Ala-Arg-Ala-Papa-NH2 (sekvence s identifikačním číslem 27) * Syntéza se prováděla automaticky na automatizovaném syntetizátoru (ASI 431) za použití metody podobné té, co je popsána,^ v příkladě,-.2,6, -spojující aminokyseliny chráněné Fmoc-Papa-OH,a Fmoc v příslušném pořadí, s výjimkou, že FmocIlb-OH byl začleněn .ručně. ,Produkt se charakterizoval HPLC, hmotnostní .spektroskopií .a analýzou aminokyselin podobným způsobem - jak , popsáno- v, příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% .+ ' acetonitrilového . gradientu 30 miinut, rychlost průtoku _t 1,0-ml/minutu), . retenčním čas = 20,7 minuty, hmotnostní * ·· ·««« ·· * ·

-77spektrometrie, m/e (ES*) 1061,9 (ΜΗ*) , analýza aminokyselin poskytla Arg 1,92, Ala 3,03, lib 0,96, Ile 1,08.

Příklad 27

Phv-Ile-Arg-Ala-IIb-Leu-Arg-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 28)

Syntéza se prováděla ručně a purifikace se prováděla za použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných FmocPapa-OH (použito místo Fmoc-Pip-OH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH v příslušném pořadí. Produkt se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonítrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% acetonitrilového gradientu 30 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 23,8 minuty, hmotnostní .spektrometrie, m/e (ES*) 1145,7 (ΜΗ*), analýza aminokyselin poskytla Arg 1,98, Ala 1,92, Leu 0,99, Ile 1,09, lib přítomný.

Příklad 28

Phv-Ala-Arg-Ala-IIc-Ala-Ala-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 29)

Syntéza se prováděla ručně za použití metody podobné té, co je popsána v příkladě 1.4, spojovací reakce a deprotekce aminokyselin chráněných Fmoc-Papa-OH (použito místo Fmoc-PipOH), Fmoc a Fmoc-IIb-OH v příslušném pořadí. Produkt nevyžadoval purifikaci preparativní HPLC. Produkt se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4,

C c * · —t ' C < ^r c < c é f»í % •C r. t «5| fc t c Γ «1 _c t t h f C t?

<· (»ó c <« < <· C C <?

- 51 c; <?

: 61 n.ij ' <»c«íc t 4i £ ír r»C G<I í^!i ί

' t

- 7SRP-HPLC'(sluce acetonitrilem'a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití'20-40% acetonitrilového gradientu .20 minut, rychlost průtoku 1,0. '.ml/minutu), retenční čas = 10,45 minuty, hmotnostní spektrometrie,·, m/e (ES ⁺ ) 962,-5 (MH⁺), 492,8 (M+H+Na)*’’ analýza aminokyselin poskytla ,Ala 4,90, Arg_; l/00, líc přítomný.. ^T ; _{; ;} '· · t ···.., ; · ·.

/ Fmoc-Ilc-OH-še-‘zúskal .použitím postupuu podobného .tomu, 'co'-je'popsán¹'v pří kládě .lt.pro přípravu Fmoc-IIb-OH, ale při použití metylesteru. glycinu místo . metylesteru Lalaninylhyčrochloridu v, kroku .1.1. Získaly se náseldující ' * meziprodukty:;. Boc- (D) -Met-Gly-OMe, v 80% výtěžku,·. NMR , (CDC1₃) : l,4d (s, 9Ή) , -2, Od (m, 1H) , 2,Id (m, ÍH),.2,ld (s,

3H), 2,6d (t, 2H), 3,8d (s, 3H) , 4,u5d (m, 2H), 4,4d (m, 1H),

5,3d (bs, 1H) , 6,8d (bs, 1H), metyl2-[(3R) -3-N-[terc.butyloxykarbonyIjamino) -2-oxopyrolidinl-yl]acetát, v 50% výtěžku, NMR (CDC1₃) : l,45d (s, 9H), 2,Od (m, 1H), 2,6d (m, 1H), 3,4d (m, 2H), 3,8d (s, 3H) , 4,05d (q, 2H), 4,Id (m, 1H), 5,55 (bs, 1H), , . , kyselina 2-[ (3R) -3- (N-[9-fluorenylmetyloxykářbonyl}amino) -2oxo-py.rolidin-l-yl]octová, v 75% výtěžku, NMR (dg-DMSO) 1,9'd (m, 1H) , 2,3d(m, 1H), 3,3d (m, 2H), 4,Od (q, 2H) , 4,3d (m, 4H), 7,4d (m,'4H), 7,6d (m, 2H), 7,9d (d, 2H).

Příklad 29

Phv-Arg-Aia-Ala-Ilb-Ala-Ala-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 30) ....

Syntéza. se prováděla automaticky na automatizovaném syntetizátoru peptidů· ACT 357 ⁱ(za použití pryskyřice Rink

Amide MBHA) spojující aminokyseliny chráněné Fmoc-Papa-OH a Fmoc v příslušném’pořadí; s výjimkou,· že Fmoc-IIb-OH byl začleněn ručně. Automatické' spojovací'-reakce se prováděly • · fc • · « ·

-79podle doporučení výrobce pro jednotlivé acylace aktivací 1 mmol karboxylové kyseliny s 1 ekvivalentem diisopropylkarbodiimidu a 1 ekvivalentem HOBT v DMF přibližně 11 minut před přenesením na pryskyřici. Acylace se prováděla přibližně 60 minut a promývací a deprotekční postupy se prováděly podobným způsobem jak popsáno v příkladě 2.6. Ruční spojovací reakce Fmoc-IIb-OH se prováděly ve zkumavce Bona Elut za použití chemického postupu s použitím HBTU/HOBT. Kyselina

5-fenylvalerová vyžadovala dvojitou spojovací reakci, aby se získal pozitivní výsledek Kaiserovým testem. Peptid se poté odštěpil od pryskyřice a purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu podobného tomu, co je popsán v příkladě 1.4. Produkt se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou- aminokyselin podobným v příkladě 1,4, RP-HPLC (eluce obsahující 0,1% TFA, za· použití 20-35% acetonitrilového gradientu 15 minut, rychlost průtoku 1,0 ml/minutu), retenční čas = 10,33 minuty, hmotnostní spektroskopie, m/e (ES⁺) 976,5 (MH⁺), 499, 9 (M+H+Na)Y, analýza aminokyselin poskytla Ala

5,02, Arg 1,00, lib 1,22.

způsobem jak popsáno acetonitrilem a vodou

Příklad 30

Phv-Lys (=C (NMe₂) 2) -Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂ (sekvence s identifikačním číslem 31)

Použitím postupu analogické tomu, který je popsán v příkladě 15a), ale při použití Fmoc-Lys(Boc)-OH místo EmocDap(Boc)-OH, se tak získalo, poté co se peptid odštěpil od pryskyřice a po purifikaci preparativní RP-HPLC, 270 mg PhvLys-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NH₂. 270- mg peptidu se poté míchalo , ve . směsi 94 mg HBTU, 88 μΐ diizopropyletylaminu a 50 ml DMF 16 hodin. Směs se odpařila a zbytek se • * • · · φ φ φ φ

-80purifikoval preparativní RP-HPLC za použití postupu analogického tomu, který je popsán v příkladě 15a). Peptid se charakterizoval HPLC, hmotnostní spektroskopií a analýzou aminokyselin podobným způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (10-40% acetonitrilový gradient 40 minut, rychlost průtoku 1,2 ml/minutu), retenční čas = 29,83 minuty, hmotnostní spektroskopie, m/e (ES⁺) 1077,27 (MHý, .analýza aminokyselin poskytla Thr 1,0, Ala 4,3, Arg 1,00, lib přítomný, tetrametylhomoarginin přítomný.

Příklady 31 až 33

Phv-Axg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NHCH₂CS2-niorfolin (příklad -31) (Sekvence s identifikačním číslem 32)

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OCH₃ (příklad 32) (sekvence s identifikačním číslem 33)

Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (příklad . 33) (sekvence s identifikačním číslem 34)

1,67 ς (1 mmol) hydroxymetylpolystyrenové pryskyřice se míchalo při teplotě okolí s 1,5 g (4 mmol) Fmoc-Papa-OH, 0,628 ml diizopropylkarbodiimidu a 61 mg (0,5 mmol) dimetylaminopyridínu v 5 ml DMF a 20 ml dichlormetanu 2 hodiny. Pryskyřice se filtrovala a promyla 5x 20 ml DMF a 5x 20 ml metanolu a sušila ve vakuu ve 40 °C (výtěžek 2,105 g) . Peptidové pryskyřice se poté přenesla na automatizovaný syntetizátor (ABI 430A) a zbylé aminokyseliny chráněné Fmoc se spojovaly podobným způsobem jak popsáno v příkladě 2.6 za vzniku 2,992 g chráněné peptidové pryskyřice. Peptidové pryskyřice se poté suspendovala ve směsi 10 ml DMF a 10 ml metanolu a přidalo se 0,88 ml 4—(2— aminoetyljmorfolinu, následováno katalytickým množstvím kyanidu draselného (50 mg) . Po 7 dnech v teplotě okolí se • 9 9 * 9

-81 směs filtrovala a pryskyřice se promyla 5x 20 ml DMF. Pryskyřice se okamžité resuspendovala ve směsi 10 ml DMF, 10 ml metanolu a 50 mg kyanidu draselného. Po 4 dnech se směs filtrovala a pryskyřice se promyla 5x 20 ml DMF. Všechny filtráty a roztoky po promytí se spojily a odpařily do sucha. Po deprotekci 90% TFA/H₂O a odstranění těkavých látek odpařením se zbytek purifikoval preparativní RP-HPLC za použití podobného postupu jak popsáno v příkladě 1.4 za vzniku 3 produktů. Produkty se charakterizovaly následovně:

mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-NHCH₂CH2morfolinu (sekvence s identifikačním číslem 32), RP-HPLC (10 až 50% acetonitrilový gradient 40 minut, rychlost průtoku

1,2 ml/minutu), retenční čas = 19,5 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES + ) 1119,8 (ΜΗ) , analýza aminokyselin poskytla Thr 0,58, Ala 3,84, Arg 1,16, lib 1,00.

mg Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OCH₃ (sekvence s identifikačním číslem 33), RP-HPLC (10 až 50% acetonitrilový gradient 40 minut,

1,2 ml/minutu), retenční Čas = 27,7 spektrometrie, m/e (ΕΞ+) 1021,6 (MH⁺), analýza aminokyselin poskytla Thr 0,61, Ala 3,80, Arg 1,22, lib 0,97.

155 mg Pitv-Arg-Ala-Ala-Ala-Thr-IIb-Ala-Papa-OH (sekvence s identifikačním číslem 34), RP-HPLC (10-50% acetonitrilový gradient 40 minut, rychlost průtoku 1,2 ml/minutu), retenční čas = 24,2 minuty, hmotnostní spektrometrie, m/e (ES+) 1007,5 (MH⁺), analýza aminokyselin poskytla Thr 0,62, Ala 3,78, Arg 1,20, lib 0,98.

rychlost průtoku minuty, hmotnostní i, * l·· r fcfc *' ♦» « ¢- ι l «:> ί: · I C ·' *’ fcfc' fc' ' i 'fc <t, * i: *· *>

o a ř ř í: *' c <' » < ** »^l

- 82Příkiad 34 ,· ' , ' i

Phv-Arg-Ála-Ala-Ala-Ťhx-IIb-Ála-Pápá-N (ČH₂CH₂) 2N(CH₂) ₂O (ČH₂) ₂OH (sekvence έ identifikačním číslem 35) !&' ·** ->

235 ^;i mg’ M-(2-(2-hydróxýě.ťóxy) etyl]piperazinu ' se’’^J přidalo ke⁴-' směsi ¹ 135 - mg · •Phv-Ařg-Ala-Ala-Ala-Thr-lib-Ala-Papá-OH, •51 mg HETL, 4 7 μΐ DIPEA a 10 ml DMF ·’a směs se- míchala 60 -minut'.· Těkavé ^láťký *se Odstranily odpařením a zbytek se purif'ikoval'^; preparativní'RP-HPLG- za použití podobného postupu

4, ^]jak popsáno v^Ť'příkladě'1;4 za vzniku 115 mg Phv-Arg-Ala-Ala,·.' 'Ala~Thr-IIb-Ala-Papa-Ň(CH₂CH2)2NCH2CH2-OC'H₂c:H2OH (sekvence' e ' s identifikačním číslem 34) . Peptid se^- -charakterizoval HPLC·,

-> . hmotnostní spektrometrií a analýzou aminokyselin podobným' způsobem jak popsáno v příkladě 1.4, RP-HPLC (eluce acetonitrilem a vodou obsahující 0,1% TFA, za použití 10-50% acětonitrilového gradientu 40 minut, rychlost průtoku

1,2 ml/minutu), retenční čas - 18,83 minuty, hmotnostní , spektrometrie,· m/e (ES+) 1163,8 (MH⁺), analýza aminokyselin.

’ , poskytla Thr 0,62, Ala 3,80, Arg 1,22, lib 0,97.

Příklad 35

Sloučeniny vynálezu mohou být podávány pro léčebné nebo profylaktické použití teplokrevným živočichům, jako je člověk, ve formě obvyklých farmaceutických přípravků, jejichž typický příklad obsahuje následující:

Roztok pro injekce

0,01 až 100 mg aktivní složky se rozpustí až ve 2 ml vodného injekčního nosiče, přičemž vznikne koncentrace aktivní složky mezí 0,01 až 100 mg/ml. Vodný injekční nosič yě^pufrován na hodnotu pH mezi 5 a 8 za použiti farmaceuticky • φφ φ φφ

ί.'·

-83přijatelného pufru (například fosfátový nebo acetátový pufr) a obsahuje farmaceuticky přijatelný přípravek upravující osmotický tlak (například chlorid sodný nebo dextróza), který je přidán, aby se dosáhlo izotoničnosti. Nosič může připadne také obsahovat další farmaceuticky přijatelné excipienty, jako jsou rozpouštědla (například DMSO, etanol, propylenglykol nebo,polyetylenglykol), konzervační přípravky a antioxidanty. Aktivní . složka může být typicky některý z příkladů popsaných v tomto textu a může být přítomná jako farmaceuticky přijatelná sůl.

• ·· «Φφφ

ο φφ

(III) φ φ φ _ · • φ · φ · · · φ φ * φφφφ φφ φ φ β φ • φφφ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ φ · » φ φ φφφ φ » • φ φ φφ φφ

(lila)

' t' b c t · «i fr € < t. c oc o©

-S r/ <· C <^L t * í £ t 'r £ í* <.

c c oc t; £ t t f»C

Gt e· c ftn ír ot

C) «Otat* b t ^; tu fr <;> <· ©

-86Seznam'sekvencí

--- ! i (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM, 1:

^:' ” (i i CHARAKTERI ŠTIKA SEKVENCE:

_λ (A) DÉLKA: 6 aminokyselin ·, · j '+¹'⁴ τ (B) · TYP :' aminokyselina ' ’ .

(C) ' TYP VLÁKNA: jednoduché (DM TOPOLOGIE: lineární ,(ii) TYP MOLEKULY: peptid' ' (ix) ZNAK:· ^; (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid .....

(S)'POZICE: Ϊ* (Dj 'DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentahoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE:

(D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopy ro I idin-1-y 1) propanoyl]-Ala-piperidin-4-karboxamid .(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 1:

Xaa Ala Ala Lys Val Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 2:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid '* (ix) ZNAK:

ř	(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ
u			/poznámka = _ „^TLenylpentan,o.yl.-Ala?i.

φ φ · · · · * · ♦ · • · φφφ · φ φ · »·· · · • « φ φ φφφ φφφ φ*·· φφ φφ ·Φ ·· ··

-87(ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-(6-oxo-l,7-diazaspiro[4.4]non-7-yl) propanoyl]-Ala-piperidin-4-karboxamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM .2:

Xaa Ala Ala Lys Val Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ¹¹ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) ' POZICE: 4 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = ,,[(S)-2-( (R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „Ala-piperičin-4-karboxamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 3:

Xaa Lys Ala Xaa Ala Xaa · 5 • » · · • · ·· • » 9

9 9

99 • * · · • · « » · · » · · •»·* 99 « ♦ · « • · • 9 · · • 9 9 9

99

-88[2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární

ii) TYP MOLEKULY: peptid
ix)	ZNAK:
	(A)	JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid
	(B)	POZICE: 1
	(D)	DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ile
ix)	ZNAK:
	(A)	JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid
	(B)	POZICE:-6
	(D)	DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ

/poznámka ' = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopy rol idin-l-yl) propanoyl]-Ala-4-amino feny láce tamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 4:

Xaa Ala Ala Arg Thr Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 5:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A)

--------- .. _γ5λ

JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid POZICE:· -6-.....................

ř·

,. *’ _ť,_ř . t;: $ ¢,. et . rr tt tři i-' e ο.'μφ’”Ti tc '«:♦$» »·.*', Μ π c '· e·.' I; «:' ' ;<!$. ě« * Cl-tt O

V..«'<:* < c : t<·· te · t‘ti et

-89- '

..... i.:..., ’(D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ

T⁵·^; ^'Vpo známka* · = -*,J(S)-2-( (R)-3~amino-2-oxo pyrolidin-T-yllpropanoyll-Ala-piperidin-A-karboxamid / ·^Γ<ί< ¹ ' ř *! . “ ' . k . -ι. -γ > í ' r ’> ί ’ i * 4. I »· £ I W4 i. J.IÍ ftv ,t‘^· M^i· 1 ¹ .

(xi) POPIS SEKVENCESEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM' ČÍSLEM 5:

Xáá Ala‘• Ala Ala Val Xaa .
1	' ,/U pái Aid
iJ-v'· ί'Τ'.J'U,C·.	t .. T . . * . ™,„ i.
(2)	INFORMACE PROtSEKVENCI S	IDENTIFIKAČNÍM' ČÍSLEM? 6: *
'· t ·'·'	(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

;·/: ^:(A) .DÉLKA.: 6/aminokyselin (Β) T.YP: aminokyselina ‘ \

ZLx/TI .; '(Cj v TYP i» VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE:.1 (D) DALŠÍ INFORMACE.: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

? (A)· JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid ' (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = - „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 6:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa ' 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

_T (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA': . 6 aminokyselin * (B) TYP: aminokyselina ,4 (C) TYP „/VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ii _ . _: TTT)' TYP” MOLEKULY:. pept id ^_ »» φ φ φ · φ φ φ φ φ · » · φφφ φφφφ φφφ* φφ φφφ φφ ·· φφφ · φ φφφ φφφφ φφφ φφφφ ·φ Φφφφ φφ φφ

-90(ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Aia (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoy l]-Ala-4-amino feny láce tamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 7:

Xaa Ala Ala Arg Val Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) . DÉLKA: 6. aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S}-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolídin-l-yl) propanoyl]-Gly-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 8:

Xaa Arg Ala Arg Val Xaa

5

-91 « 4 · · »44·

4 4 » · ·· • 4 · · · 4 ·

4·»4 4« 44 44

4 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK;

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid ' (3) POZICE:' 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid ' (B) -POZICE; 6 ' (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka =. „[ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-Ala-piperičin-4-karboxamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 9: '

Xaa Ile Ala Arg Val Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A)· DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) ' (B) * , (D) (ix) ZNAK: (A) '' (B).

JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid

POZICE: 1

DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala

JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid

POZICE: 6

Β Β * 1 14 * · » Β · β Β » · · »· * · * · • Β · · · · · · · · ·· ♦ # ··« ·. · · « · Β ·>

»··· «· «« ·· ·· ··

-92(D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)~3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE; SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 10:

Xaa Arg Ala His Val Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché ^: (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala , (ix) ZNAK:

* (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 ; (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-Ala-piperidin-4-karboxamid «I (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 11:

Xaa Ala Asn Arg Val Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) -TYP' MOLEKULY: peptid ............... .........

• · * • · * i · · «

-93 *« · · « • * ·· • · 9 t • · · · ·· ·» • · ·· * ♦· · * • · ♦ ·· · · fc' (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ : peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 4 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „Ala-piperidin-4-karboxamíd (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 12:

Xaa Arg Ala Xaa Ala Xaa

1-5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = .„5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-((R)-3-amino-2oxopyrolidin-l-yl) propanoylJ-Gly-3-aminopropylamin.................

• φ * · · · * *

I · · · Φ Φ« • · ΦΦΦ φ φ φ φ φ φ «ΦΦΦ φφφφ ·· «φ ·· • « · φ φ ΦΦΦ φ ΦΦΦ φ φ φ φ » φ* φφ

-94(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 13:

Xaa Arg Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM. 14:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid ř , (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: I (D) DALŠÍ INFORMACE: /'produkt = „DALŠÍ ' /poznámka = „5-fenyipentanoyÍ-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt - „DALŠÍ _Ť /poznámka = „[ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxoj pyrolidin-l-yl) propanoyl]-Gly-3-aminopropylguanidin' » (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 14:

Xaa Arg Ala Ala Thr Xaa , 1 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid . _......(B) POZICE·: 1- .............- ---------- ' “........

(D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala

	(ix) . ZNAK:
	(A)	JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid
	(S)	POZICE: 6
	(D)	DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ

/poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopvrolidin-1-yl) propanoyl]-Gly-NHetyl (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 15:

Xaa Arg Ala Arg Thr Xaa

5.

(2.) INFORMACE PRO SEKVENCI Ξ IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-3-guanidinoAla (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 16:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

'(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin

.......'iBj 'TY?; aminokyselina“· ...... ' .....

(C) TYP VLÁKNA: jednoduché • 0 0

00 000·

0 «0 000· · • 0 0 0 0 · •0 00 0· ·0

-96*1 (D) TOPOLOGIE: lineární (ií) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-3-(tetrametylguanidino) Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE.: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxo- .

pyrolidin-l-yl) propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamíd (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 17:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2.) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (íi) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka ~ „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2oxopyrolidin-l-y 1) propanoyl]-Gly-4- (2-aminoetyl) morfolin ·«· · · ·♦ · ·· • * * · · · · ··· · • · · ·*«· ·♦ ···· ·· ·· ·· ·· **

-97(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 18:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

1.5 (2) INFORMACE PRO.SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) · TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE; lineární (ii) TYP MOLEKULY:, peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-Gly-piperazin-4-yl.CH2CH2OCH2CH2OH (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 19:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa i 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) . DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

ÍC) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid

...................(B.)...PO.Z.ICE.:..l-........- - -........-......- ------------------(D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg «··· · ·

M« « • · ·· «

-98(ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-Gly-4-aminofenetylguanidin (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 20:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa . 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: í (A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

Ls (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid ťl (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyi-Ala i (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 i, (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 21:

Xaa Ala Ala Arg Thr Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina

......... ÍC! TYP VLÁKNA: jednoduché -- .......

(D) TOPOLOGIE: lineární

99\ (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

„ (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-[NH-NH-C0]-4-aminofenylacetamid ř (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 22:

Xaa Arg Ala Arg Thr Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE:, /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-NH-NH-CONH2 (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 23:

Xaa Arg Ala-Arg Thr Xaa

5 í; fc i? : pe re *'?.» g «r 6· l> '· ‘ r

- 1.00 ’< (2) INFORMACE ERO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24: .· ' (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

* '(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYPaminokyselina- (C) TYP -VLÁKNA: jednoduché .

(D) TOPOLOGIE:· lineární ' - ' (ii) TYP,MOLEKULY: peptid · (ix) ZNAK:

' '' (A) ' JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 ’ (D)· DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ala (ix) ZNAK: . - .

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid * (B) POZICE: 4 * (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S) -2-((R)-3-amino-2-oxo« pyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6.

’ (D) DALŠÍ INFORMACE:-/produkt = „DALŠÍ /poznámka = >,Ala-4-aminofenylacetamid í ¹ .

(xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 24:

q Xaa Arg Ala Xaa Arg Xaa l‘ ' 5 . (2) INFORMACE PRO' SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

ί' ,

5' (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

» (A) DÉLKA: 6 aminokyselin f (B) TYP: aminokyselina

Γ (C) TYP VLÁKNA: jednoduché ; ' (D) TOPOLOGIE:' lineární [ \ (ii) TYP MOLEKULY: peptid

Á * >'! i (ix) ZNAK:

........------ .----------I A) · .Jt4ÉN0/OZNAČENÍ-:- peptid · (B) POZICE: 1

- 101 • a · a ··· · * ta» aaa a· a-· ·· (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „3-(2-cyanobenzo[bJthiofen-5yl)propanoyl-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 4 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2oxopyroličin-l-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 25:

Xaa Arg Ala Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid' (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 4 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-{(R)-3-amino-2-oxopyrolidin-1-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid' (B) POZICE: 6 • · » » --- t 4 *·« » · » » ·· · ί t t · * · * · · · ««'· ·· ·· ·» ·· ··

- 102(D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 26:

Xaa Ala Ala Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché ' (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D), DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyi-Arg (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 4 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid
(B)	POZICE: 6
(D)	DALŠÍ INFORMACE:	: /produkt = „DALŠÍ

/poznámka = „Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 27:

Xaa Ile Ala Xaa Arg Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin ........

(B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché t

ΙΊ ί

ί f

I

f. f ί

ί • ί f

Ο f f· ť <?C . i? i: I fc rc l ι Vr i.t * i «:

fc ( «I ť-, r. fc

- 103 (D) TOPOLOGIE: lineární (ii)· TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) ' JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE:1 .

(D) DALŠÍ INFORMACE,: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Ii'e· (ix) ZNAK: ™ . '< · Ix, ^{7 1} (A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid /ti Λ. - XjB), POZICE: 4 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Leu (ix) ZNAK:

WJMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE:'.' 6 (D) DALŠÍ·INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „Ala-4-aminofenyiacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 28:

(

Xaa Arg Ala Xaa Arg Xaa ' 5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

V' (i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE: < ·' 7η \ η£τ wa · £ Ώτηί ;

t	' (A) (bT (C) (D)	DÉLKA: 6 aminokyselin TYP: aminokyselina TYP VLÁKNA: jednoduché TOPOLOGIE: lineární
(ii)‘	TYP-MOLEKULY: peptid
(ix)	ZNAK: (A) (B) (D)	JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid POZICE: 1 DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ
(ix)	ZNAK:	./poznámka = .„5-fenylpentanoyl-Ala
. . . , „ . -J f. —Λ. -	(A) — JP r(. B-) c	JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid • POZ-I.CE :-^4

• · a a a

- 104 t «« · • · ·

9 » • * · • · · · · · a a a a • · aa t * · » i» a a a

99 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ ((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-lyl) acetyi]-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ-INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 29:

Xaa Arg Ala Xaa Ala Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 4 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt - „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-((R)-3-amino-2oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „Ala-4-aminofenylacetamid (xi).POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 30:

Xaá Ala Ala Xaa Ala Xaa

5 * · * · » ♦ ·♦ fc · · * • · ft * ♦ · «* • · · · • · · • * · e t » v··· *· » · • ·*

- 105(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

(i) CHARAKTERISTIKA. SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ' (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid .

(B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyltetrametylhomoArg- (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl)propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS. SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 31:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: l' (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 · * *

4 44

444 4 4 • 4 ♦

44 *

I • 4 4 · • 4 ·

4 · ·

4 4 • * 4

4· • 4 4 »4 ·

4· ·4

- 106(D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „((S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoylJ-Ala- (4-aminofenylCH2.CO.NH.CH2.CH2-morfolin (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 32:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (3) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[metylester kyseliny (S)-2-((R)3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl·)propanoyl]-Ala-4aminofenyloctové (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S· IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 33:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5 (2) INFORMACEPRO- SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ···* ·*»» * · · · · ·· • · »· » ·> » • · « * * Φ ··.

• · ·' ·· ··

107 (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) .JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INEORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D)'DALŠÍ INEORMACE: /produkt = „DALŠÍ ' /poznámka = „[(S)-2-((R)-3-amino-2oxopyrolidin-l-yl) propanoyl].-Ala-4-kyselina aminofenyloctová (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 34:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5(2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6- aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární (ii) TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 . (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Arg (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 .

(D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = -· ,,[{S) -2-( (R)-3-amino-2oxopyrolidin^l-ylJpropanoyrj-Ala^-aminofenylacetylpiperazin-4-yl-CH2CH2OCH2CH2OH (xi) POPIS.SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 35:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

5

9

999 9

9 • · 9

9 8 9 • 9 9 ···· ··

- 108 9 · 99

9 9 9 * 9 9 · • 9 99

9' ι

I «9 (2) INFORMACE PRO SEKVENCI S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

(i) CHARAKTERISTIKA SEKVENCE:

(A) DÉLKA: 6 aminokyselin (B) TYP: aminokyselina (C) TYP VLÁKNA: jednoduché (D) TOPOLOGIE: lineární ' (ii} TYP MOLEKULY: peptid (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 1 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „5-fenylpentanoyl-Dpr (ix) ZNAK:

(A) JMÉNO/OZNAČENÍ: peptid (B) POZICE: 6 (D) DALŠÍ INFORMACE: /produkt = „DALŠÍ /poznámka = „[ (S)-2-((R)-3-amino-2-oxopyrolidin-l-yl) propanoyl]-Ala-4-aminofenylacetamid (xi) POPIS SEKVENCE: SEKVENCE S IDENTIFIKAČNÍM ČÍSLEM 36:

Xaa Ala Ala Ala Thr Xaa

Claims (15)

1. PATENTOVÉ NÁROKY φ φ ·· φφφφ φ φ φ φ φφ φφ

   1. Peptidový derivát obecného vzorce I, P-R¹-R²-R³-R⁴, kde P je hydrofóbní zbytek,

   R¹ je sekvence 5 L-amino kyselin a R³ je jedna L-aminokyselina, nebo R¹ je sekvence 3 L-aminokyselin a R³ je sekvence 3 L-aminokyselin,

   R² je skupina podle obecného vzorce II nebo III, kde Ra a Rb jsou nezávisle vybrány ze souboru obsahujícího vodík a alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku a A je metyienová skupina nebo kyslík, a

   R⁴ ’ ’je OH, NH2 nebo' NRcRd,'' kde Řc je vybrána ze souboru obsahujícího alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku,
2. 2-karbamoylcyklopentylovou, 2-pyridylmetylovou, 4-karbamoylcyklohexylovou, 4-karbamoylcyklohexylmetylovou,
3. 3-karbamoylfenylovou, 4-karbamoyl-fenylovou, 4-(karbamoylmetyl)fenylovou, 4-(karboxymetyl)fenylovou, 4-(metoxykarbonylmetyl)fenylovou a 2-morfolinoetylovou skupinu a skupinu podle obecného vzorce -A¹-G¹, kde A¹ je alkylenová skupina se 3 až 7 atomy uhlíku nebo je A¹ vybrána ze (1) skupiny obecného vzorce -A²-B², kde A² je p-fenylenová nebo 1,4-cyklohexylenová skupina a B² je alkylenová skupina

   -110s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo A² je metylenová skupina a B² je g-fenylenová -nebo 1,4-cyklohexylenová skupina, a (2) skupiny obecného vzorce -A³-B³-C³, kde A³ je metylenová skupina, B³ je £-fenylenová nebo 1,4-cyklohexylenová skupina a C³ je alkylenová skupina s 1 až 3 atomy uhlíku, a

   G¹ je skupina obecného vzorce -N=C [N (Rp₂) ] ₂, kde každá skupina

   Rp je vybrána nezávisle ze souboru obsahujícího vodík, metylovou, etylovou a propylovou skupinu, nebo

   A^{1 *} je skupina podle obecného vzorce -A⁴-B⁴, kde A⁴ je £-fenylenová skupina a B⁴ je -CH₂-CO- a G¹ je 2-morfolinoetylová nebo 4-[2-(2-hydroxyetoxy)etyl]piperazin-l-ylová skupina, a Rd je vodík nebo alkylová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo R⁴ je 1-piperazinylová, 4-metyl-l-piperazinylová,
4. 4-amidino-l-piperazinylová, 4-(2-(2-hydroxyetoxy)etyl·)-1piperazinylová nebo 1-piperidylová skupina nebo

   4-substituovaná-l-piperidylová skupina, kde substituent v poloze 4 je vybrán ze souboru obsahujícího karboxylovou, karbamoylovou, N-(2-aminoetyl)karbamoylovou a N-(4-aminobutyl)karbamoylovou skupinu, nebo

   R⁴ je sekvence 1 až 6 aminokyselin nebo jejich amidů, nebo jeho .farmaceuticky přijatelná, .sůl. . . .

   2. Peptidový derivát podle nároku 1, kde P je .alifatická, aromatická nebo smíšená alifatická/aromatická organická skupina s 5 až 20 atomy uhlíku, nebo heteroaromatická nebo smíšená alifatická/neteroaromatická organická skupina s 5 až 20 atomy uhlíku a 1, 2 nebo 3 heteroatomy vybranými ze souboru obsahujícího kyslík, síru a dusík, nebo jeho· farmaceuticky přijatelná sůl.

   • · 0 • 00

   0 0· 000» 00

   0 0 00 0 0 «· • « 0 0»0 »00 » 0

   0 0 0 0 0 0 0 »» »» 0» 0*

   Uil3. Peptidový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 nebo 2, kde R⁴ je OH, NH₂ nebo NRcRd, kde Rc je vybrána ze souboru obsahujícího alkylovou skupinu s.l až 4 atomy uhlíku,

   2-karbamoylcyklopentylovou, 2-pyridylmetylovou, 4-karbamoylcyklohexylovou, 4-karbamoylcyklohexylmetylovou, 3-karbamoylfenylovou, 4-karbamoylfenylovou, 4-(karbamoylmetyl)fenylovou,

   4-(karboxymetyl)fenylovou a 2-morfolinoetylovou skupinu a skupinu podle obecného vzorce -A^G¹, kde A¹ je alkylenová skupina se 3 až 7 atomy uhlíku nebo je A¹ vybrána ze (1) skupiny obecného vzorce -A²-B², kde A² je p-fenyienová nebo 1,4-cyklohexylenová skupina a B² je alkylenová skupina s 1 až 4 atomy uhlíku, nebo A² je metylenová skupina a B² je p-fenylenová nebo 1,4-cyklohexylenová skupina, a (2) skupiny· obecného vzorce -A³-B³-C³, kde A³ je metylenová skupina, B³ je p-fenylenová nebo 1,4-cyklohexylenová skupina a C³ je alkylenová skupina s 1 až 3 atomy uhlíku, a

   G¹ je skupina obecného vzorce -N=C[N(Rp)₂]₂, kde každá skupina Rp je vybrána nezávisle ze souboru obsahujícího vodík, metylovou, etylovou a propylovou skupinu a Rd je vodík nebo: alkylová skupina s, 1 až 4 atomy uhlíku,

   R⁴ je 1-piperazinylová, 4-metyl-l-piperazinylová, 4-amidino1-p.iperaz.inylová, 4-.(2- (2-h.ydroxy.et.ox.y.)-e-t-yl..)--1-piperazinylová nebo 1-piperidylová skupina, nebo 4-substituovaná-lpiperidylová skupina, kde substituent v poloze 4 je vybrán ze souboru obsahujícího karboxylovou, karbamoylovou, N-(2-aminoetyl)karbamoylovou a N-(4-aminobutyl)karbamoylovou skupinu, nebo

   R⁴ je sekvence 1 až 6 aminokyselin nebo jejich amidů, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.

   4.

   kde

   Peptidový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1 P je alifatické, aromatická nebo

   2 nebo 3, smíšená * · · · · ·· i* • · > 0»·· ··

   0 0 0U ·

   00 00' • ♦ *0 000 0 · • 0 0

   00 00

   -112alifatická/aromatická organická skupina s 5 až 20 atomy uhlíku,

   L-aminokyseliny v R¹ a R³ jsou nezávisle vybrány ze- souboru

   obsahujícího a Val, a Ala, Glu, Gly, His, Ile, Lys, Asn, Gin, Arg, Thr R⁴ je OH, i NH₂ nebo NHRc, kde Rc je vybrána ze souboru obsahujícího alkylovou skupinu s 1 až 4 atomy uhlíku,

   2-karbamoylcyklopentylovou, 2-pyridylmetylovou, 4-karbamoylcyklohexylovou, 4-karbamoylcyklohexylmetylovou, 3-karbamoylfenylovou, 4-karbamoylfenylovou, 4-(karbamoylmetyl}fenylovou skupinu, nebo R⁴ je 1-piperazinylové,

   4-metyl-l-pi.perazinylová, 4-amidino-l-piperazinylová nebo

   1-piperidylová skupina, nebo 4-substituovaná-l-piperidylová . skupina, kde substituent v poloze 4 je vybrán ze souboru obsahujícího karboxylovou, karbamoylovou, N-(2-aminoetyl)karbamoylovou a N-(4-aminobutyl)karbamoylovou skupinu, nebo R⁴ je sekvence 1 až 6 aminokyselin nebo jejich amidů, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
5. 5. Peptidový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1, 2 nebo 3, kde R¹ je sekvence 5 L-aminokyselin podle vzorce AA1-AA2-AA3AA4-AA5, kde....................... ............

   AA1 je vybrána ze souboru obsahujícího Ala, Ile, Tyr, Val, Glu, Lys, Arg, Gly, Gap, GapMe^ a 3,3,3-trifluoroalanin,

   AA2 ,je vybrána ze souboru obsahujícího Ala, Lys, Glu, Sar, Val, Arg, Gly, Pro, Ile, Tíc, 3,3,3-trif luoroalanin a N^{5 6}-dietylLys,

   AA3 je vybrána ze souboru obsahujícího Ala, His, Gin, Val, Thr, Glu, Gly, Asp, Asn a N³-dietylDap,

   AA4 je vybrána ze souboru obsahujícího Ala, Lys, Asn, Arg, Thr, Glu, Sar,· Gly, Pro, His a N⁶-čietylLys, a

   ,. ·, _Ψ ΐ «Γ ee.' fc ΐί'νΐϊΛ

   Λ ώ. Κ' t « fe Ií ÓOnítti ίψ ft> <ί «. C0 *· ’ fej.fi> «

   - 113 . c «y - .

   Í»C· o^c' ^f’^cJ o0, ' bí..‘

   AA5 je ,vybrána ze souboru obsahujícího Thr, Val, Ala, Gly, Dap, Dab, Pro, Hyp, Asn a. N³-dietylDap, a kde R³ je · jedna aminokyselina vybraná ze souboru obsahujícího Ala, Gly, Dap, azaalanin a azaglycin, nebo jeho farmaceuticky přijatelná.sůl.

   Ύ .

   ¹ /
6. 6. Peptidový derivát podle kteréhokoliv z nároků 1, 2 nebo 3, kde RÁje sekvence.3 L-aminokyselin podle vzorce AA1-AA2-AA3, kde

   AAl je' vybrána ze.souboru obsahujícího Ala, Ile, Tyr, Val, Glu,. Lys,· Arg), Gly, Gap, GapMe₄ a 3,3,3-třifluoroaianin, .

   AA2 je vybrána ze souboru obsahujícího Ala, Lys, Glu, Sar,, Val, Arg, Gly, Pro, ..Ile, Tic, 3,3,3-trifluoroaianiná N⁶-dietylLys,

   AA3 je vybrána ze souboru obsahujícího Ala, His, Gin, Val,

   X

   Thr, Glu, Gly, Asp, .Asn a N³-dietylDap, , ť

   a- R³, je vybrána ze. sekvencí 3 L-aminokysel.in podle vzorce AA6-AA7-AA8, kde ň» '1 - I*· . . rfBT-fll·-,*· μ ť* *' I*--*.,* f

   AA6' je vybrána ze souboru obsahujícího- Gly, Leu, Lys, Ala.,;., Pro, Glu, Sar, His a Dap, · .

   - L J ' jŽ- , ' , /

   AA7 je vybrána ze souboru obsahujícího Pro, Ala, Lys·, Arg, _Glu,_ Sar,. Gly.,_.Oic,_a. Die., a_____________________________________________________

   AA8 je· vybrána ^ze< souboru obsahujícího Ala, Gly, Dap, azaalanin a azaglycin, - \ '^r nebo jeho' farmaceuticky přijatelná sůl.

   - 114 φ φ'φ φφφ φφφ* φ φ φφ φφ φφφ φφ φφ'φφφφ φ φ φ φ φ φφφ φφφ • ΦΦΦ φφ *·' ** ** ’·
7. 7. Peptidový derivát podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 6, kde R^z je skupina podle obecného vzorce lib

   Ν'

   H (lib)

   0 ch₃ nebo jeho farmaceuticky přijatelné sůl.
8. 8. Peptidový derivát podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 7, kde hydrofobní skupina P je 5-fenylvalerylová skupina, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
9. 9. Peptidový derivát podle kteréhokoliv z předchozích nároků. 1 až 8, kde R⁴ je 4-karbamoyl-l-piperidylová, 4-(karbamoylmetyl)anilinová nebo 4-(2-guanidinetyl)anilinová skupina, nebo jeho farmaceuticky přijatelné sůl·.
10. 10. Peptidový derivát podle nároku 1, který·'je vybrán ze sloučenin znázorněných vzorci

    O i—I ^u

    Phv-Arg-Ala-Ala-Ala-Val-N>-‘-k^^N^X _Λ, / \ η ϊ T ^Ala~^N\_χ-^c°nh₂

    NMe₂

    I |-1 ⁰

    Rhv-N^CQ-Ala-Ala-Ala-Thr-N.....^N^A_ta-N-Qo = ^H

    -ch₂conh₂ r~—( o

    Phv-Arg-Ala-Aía-Ala-Thr-N k A NH

    H V Knh,

    H

    - 115 ϊ ».· •φφ* ·· i « · I Φ ’ φ Φφφφ φφ «φ

    9 9 ΦΦ «ΦΦΦ Φ

    Φ Φ Φ • Φ ΦΦ

    Phv-Ala-Arg-Ala- Ν Η

    CN kče Phv je 5-fenylvalerylová skupina, nebo jeho farmaceuticky přijatelná sůl.
11. 11. Farmaceutický přípravek vyznačující se tím, že obsahuje peptidový derivát podle vzorce I nebo jeho - - farmaceuticky' ' přijatelnou 'sůl, ' 've' spojení s farmaceuticky přijatelným ředidlem nebo pomocnou látkou (nosičem).
12. 12. Způsob přípravy peptídového derivátu podle nároku 1 nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli, vyznačuj ící se tím, že se postupně spojují v příslušném pořadí vhodně chráněné aminokyseliny nebo sekvence dvou nebo více vhodně chráněných aminokyselin, kde vhodná ochranná skupina je vyjádřena vzorcem H-II-OH nebo Η-ΙΠ-ΟΗ a případně je vhodná ochranná skupina vyjádřena vzorcem R⁴-H, a poté se « 4 t « * · · « «· • «· « ·< ·* » * »· ··· · « > · · «· 99

    116f' případně modifikuje funkční skupina N-koncove aminoskupiny, aby se zavedla hydrofobní skupina P a odstranily jakékoliv zbývající ochranné skupiny a veškerý pevný nosič.
13. 13. Způsob léčení autoimunitních nebo zánětlivých onemocnění zprostředkovaných T-buňkami závislými na MHC II. třídy, vyznačující se tím, že obsahuje podání účinného množství peptidového derivátu podle vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli teplokrevnému savci, který takové léčení potřebuje.
14. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že se použije pro léčení revmatoidní artritis nebo roztroušené sklerózy mozkomíšní (scierosis multiplex).
15. 15. Použití peptidového derivátu podle vzorce I nebo jeho farmaceuticky přijatelné soli pro výrobu nového léčiva pro použití pro léčení autoimunitní nebo zánětlivé nemoci zprostředkované T-buňkami závislými na MHC II. třídy.