CZ254197A3 - Multifunkční enzym - Google Patents

Description

Polyfunkční enzym

Oblast techniky

Vynález se týká z drobného korýšovitého polyfukčního planktonu a enzymu enzymů pocházej ícího pocházej ících z čeledě korýšů a ryb, polyfunkčnímu enzymu korýšovitého planktonu enzymu týká způsobů jež jsou podstatně strukturálně podobné získanému z antarktického drobného

Vynález se kromě tohoto polyfunkčního purifikace tohoto polyfunkčního enzymu, purifikovaného polyfunkčního enzymu a farmaceutického, kosmetického a jiného použití polyfunkčního enzymu podle tohoto vynálezu.

Dosavadní stav techniky

Uvedené enzymy, které jsou podstatně strukturálně podobné polyfunkčnímu enzymu získanému z antarktického drobného korýšovitého planktonu, mají stejnou užitečnost jako je enzym pocházející z drobného korýšovitého planktonu. Zejména jsou tyto polyfunkční enzymy užitečné pro léčení virových infekcí jako je vypuknutí herpes, plísňová, bakteriální nebo parazitická infekce, včetně primární a sekundární infekce lepry, kolitida, vředy, hemoroidy, jizvy na rohovce, zubní povlaky, akné, cystická fibróza, trombusy, poranění tělesné tkáně, imunitní poruchy včetně autoimunitních poruch jako je lupus erytheraatodes a roztroušená skleróza a nádorová onemocnění.

U.S. patent č. 4,801,451 a 4,963,491 popisují směs exopeptidas a endopeptidas izolovanou z antarktického drobného korýšovitého planktonu (Euphasia superba) a použití této směsi jako čisticích roztoků. U.S. patent č. 4,801,451 popisuje použití takových enzymů k odstraňování cizí látky a odumřelé tělesné tkáně z poraněných částí tkáně. Patentová přihláška VO 85/04809 popisuje použití enzymů z drobného korýšovitého planktonu jako promotoru trávení. Evropská přihláška EP-A1-0170115 popisuje použití enzymů z drobného korýšovitého planktonu k rozpouštění krevních sraženin. Ve všech uvedených odkazech se používaly nevyčištěné látky nebo jen málo popsané. U produktu k farmaceutickému použití je však žádoucí, aby byl polyfunkční enzym purifikován.

Podstata vynálezu

Tento vynález se týká polyfukčního enzymu, který je použitelný v mnohých lékařských a kosmetických souvislostech. Zejména se tento vynález týká enzymu majícícho polyfunkční aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exopeptidasové aktivity, přičemž je relativní molekulová hmotnost mezi 20 kd a 40 kd, jak je určeno podle SDS PAGE a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolasou pocházející z drobného korýšovitého planktonu. Je výhodné, jestliže má enzym relativní molekulovou hmotnost od 26 kd do 32 kd podle určení pomocí SDS (sodium dodecyl sulfáte - natrium-dodecyl sulfát) polyakrylamidovou gelovou elektroforézou (PAGE), výhodněji pak 29 kd. Je výhodné, je-1i enzym selektivně reaktivní s povrchově buněčnými receptory jako proteiny nebo glykolipidy. Výhodné je, je-li enzym podstatně purifikován. S výhodou je čistota enzymu vzhledem k makromolekulám alespoň 90 %, výhodněji alespoň 95 %, ještě výhodněji 97 %, přičemž ještě více je výhodné 99,7 % vzhledem k makromolekulám. S výhodou má enzym N-terminační sekvenci: I-V-G-G-X-E/D-B-X-X-X-X-Z/B -P-Z/H-Q-B-X-B /Z, kde X je jakákoli aminokyselina, Z je jakákoli aromatická aminokyselina, B je jakákoli aminokyselina mající C2 až C6 alkylový postranní řetězec a B je leucin nebo isoleucin. Výhodněji jsou všechny hydrolasou výhodněj i alespoň ze pocházej ící alespoň z 80 aminokyseliny reprezentované symboly X, Z nebo B přírodní aminokyseliny. S výhodou má enzym N-terminační sekvenci:

I-V-G-G-X-E/D-B, kde X je jakákoli aminokyselina, B je jakákoli aminokyselina mající C2 až C6 alkylový postranní řetězec. S výhodou je enzym polyfunkční hydrolasa pocházející z drobného korýšovitého planktonu. Výhodné je, má-li enzym N-terminační sekvenci : I-V-G-G-N/M-E-V-T-P-H-A-Y-P-V-Q-V-G-L-F-I-D-D-M-Y-f (SEQ ID N0.1). Pro účely této přihlášky znamená v podstatě čistý 60%ní čistotu.

V j iném výhodném provedení by měl polyfunkční enzym být 70 % homologický s polyfunkční z drobného korýšovitého planktonu, % homologický, ještě výhodněji alespoň z 90 % homologický a ještě více výhodněji z 95 % homologický. Při homologických měřeních se budou počítat konzervativní substituce jako homologické. Polyfunkční hydrolasa pocházející z drobného korýšovitého planktonu může být polyfukční enzym. Polyfukční hydrolasa pocházející z drobného korýšovitého planktonu je ze 100 % sama o sobě homologická.

Vynález také poskytuje farmaceutický prostředek obsahující polyfunkční enzym podle nároku 1 a farmaceuticky přijatelné ředidlo nebo nosič.

Vynález dále poskytuje (a) způsoby týkající se jistých podmínek používání účinných množství výše uvedeného enzymu, (b) prostředků pro užívání u těchto způsobů, (c) farmaceutických prostředků obsahujících účinné množství enzymu pro použití při těchto způsobech a (d) použití prostředku pro výrobu léku k použití při těchto způsobech. Tyto způsoby jsou:

(1) léčení nebo profylaktická prevence mikrobiálních infekcí, např. virových jako jsou herpes (např. HSV-1, HSV-2, pásový opar nebo genitální oparová infekce), HIV, hepatitida, koronovirová chřipka, cytomega1ovirus, rinovirová nebo papi 11omavirová infekce, infekce způsobující gastrointestinální onemocnění jsou nádory nebo diarea, plísňová infekce jako je systemická, kožní, orální, vaginální nebo jícnová plísňová infekce, včetně např. kvasinkové infekce, včetně plísňové nehfové infekce a candida infekce, mikrobiální infekce očí, s výhodou aplikace do očí, bakteriální infekce včetně stafylokoků, streptokoků, klebsiella, pseudomonas, gonorea, hemofylus, chlamydia, syfilis a E.coli infekce a bakteriální infekce způsobující měkký vřed, oportunistické mikrobiální infekce u pacientů s poruchou imunity kde se výhodou podává určité množství dále uvedeného enzymu, se mikrobiologická infekce léčí nebo se jí předchází podáváním účinného množství nebo má inhibiční aktivitu vůči srůstové adhezí buňka-buňka nebo buňka-virus, (2) léčení nebo profylaktická prevence dermatologických stavů jako je např. akné, psoriáza nebo ekzém, včetně obličejového seboroického ekzému nebo ekzém na rukou, obličeji nebo krku, hemoroidy apod., kde se s výhodou podává určité množství polyfukčního enzymu pro léčení nebo prevenci dermatologických stavů, (3) léčení nebo profylaktická prevence cystické fibrózy, COPD, nádorů, např. se podává účinné množství pro léčení nádorů nebo prevenci nádorových metastáz se podává preventivní nebo inhibiční množství enzymu, dále při ateroskleróze, astma, septickém šoku, toxickém šokovém syndromu, tkáňových srůslech, abdominálních srůstech po chirurgickém zákroku nebo kloubových srůstech, reperfúzních poraněních, malárii, poruchách imunity jako je autoimunitní onemocnění, apoptosis, colitis a enteritis, jako je Crohnova nemoc, kde se s výhodou podává takové množství polyfunkčního enzymu, aby bylo účinné pro léčení nebo prevenci, (4) léčení nebo profy1 akt ická prevence infekcí při poranění tělesné tkáně (na poranění s mikrobiální infekcí se aplikuje účinné množství enzymu nebo se dosahuje zahojení rány podáváním účinného množství enzymu jež inhibuje účinek mikrobů), kdy může být z ošetřované rány v podstatě odstraněna nekrotická tkáň, (5) léčení nebo profy1aktická prevence akutních nebo chronických zánětů, kdy se k léčení nebo prevenci u akutních nebo chronických zánětů s výhodou podává účinné množství polyfunkčního enzymu, (6) léčení nebo profylaktická prevence při indikaci onemocnění, vybraného ze skupiny, v níž jsou zahrnuty bolesti, bronchitida, infekční chřipka hemofylus, mykoplasma v plících, infekce předkožky, dermatofýza nohou, kanálková infekce, infekční zevní vředy, žaludeční vředy, pupeční infekce u novorozenců, vrásky, polypy, jizvy a keloidy, 1 išej, vřídky, bradavice a alergické svědění, prostat itida, mastitida, zánět dásní, sinusítida, artritida a záněty kloubů, diarea, oční onemocnění jako je glaukom nebo katary, slábnutí vlasů, kdy je výhodné pro léčení nebo prevenci podávat účinné množství polyfunkčního enzymu, (7) odstraňování nebo peelíng pleti z povrchu zdravé pleXi, čímž se zlepšuje vzhled pleti, kdy je výhodné podávat účinné množství polyfunkčního enzymu pro odstranění odumřelých kožních buněk, (8) lyžování krevních sraženin, kde podává s výhodou určité množství polyfunkčního enzymu k lyžování sraženin, a (9) odstraňování zubních povlaků, kdy je výhodné podávat určité množství polyfunkčního enzymu k odstranění zubních povlaků.

Způsob zahrnuje podávání prostředku obsahujícího výše uvedený polyfunkční enzym. Prostředek podle tohoto vynálezu může být také použit k odstranění mrtvých nebo divergentních buněk.

Vynález poskytuje zevní kosmetický prostředek obsahující výše popsaný polyfunkční enzym, a krémový, gelový nebo čípkový prostředek.

Vynález také poskytuje způsob purifikace výše popsaného polyfunkčního enzymu k získání prostředku, který v podstatě neobsahuje jiné proteiny, jež vážou vybraný proteázový inhibitor než daný polyfunkční enzym. Způsob sestává z těchto kroků:

(a) aplikování prostředku obsahujícího polyfunkční enzym na iontomčniěovou kolonu, (b) eluování v prvním kroku adsorbované látky z kolony, a to prvním vodným roztokem první iontové síly 1^, a (c) eluování polyfunkčního enzymu z kolony a to druhým vodným roztokem druhé iontové síly l2^; (d) aplikování eluovaného polyfukčního enzymu z kroku (c) na afinitní matrici obsahující proteázový inhibitor, a (e) eluování afinitní matrice třetím vodným roztokem jež destabilizuje interakce mezi polyfunkčním enzymem a proteázovým inhibitorem kde je vybrán z tzv. prvního vodného roztoku (i) eluujícího první adsorbovanou látku obsahující proteiny, jež se vážou na proteázový inhibitor, ale jež proteiny adheruji na iontoměničovou kolonu slaběji než polyfunkční enzym, a (ii) neeluuji polyfunkční enzym, a kde I2 je větší než Ia je vybrán z tzv. druhého vodného roztoku eluujícího uvedený polyfukční enzym a v podstatě neeluujícího jiné proteiny, jež vážou vybraný proteázový inhibitor. S výhodou je vybraný proteázový inhibitor použitý v afinitní matrici rezistentní vůči štěpení polyfukčním enzymem, jako je savčí trypsinový inhibitor, např. bovinní trypsinový inhibitor.

Vynález dále poskytuje (a) způsoby týkající určitých podmínek používání účinných množství výše uvedeného enzymu, (b) prostředků nebo složek pro použití farmaceutické prostředky obsahuj ící použití při těchto způsobech, a (d) léku pro použití při takovýchto způsobech.

Tyto způsoby jsou pro:

(10) profylaktickou prevenci sexuálně přenosných mikrobiálních infekcí, jako candida jako je orální nebo vaginální candida infekce, gonorea, chladmya, syfilis, trichomonas, měkké vředy, HIV, herpes, papi lomové nebo hepatitidové infekce, kde se podává výše uvedený enzym před, současně nebo po sexuální aktivitě, s výhodu v účinném množství k ochraně před infekcí, (11) profylaktickou prevenci nachlazení nebo chřipkové virové infekce, kde se s výhodou podává v účinném množství pro prevenci enzym do plic, v oblasti nosu nebo dutin u zvířat při při těchto způsobech, (c) účinná množství enzymu pro použití enzymu pro výrobu

nebezpečí infekce u mikrobiální infekce, (12) léčení nebo profytaktickou prevenci primární nebo sekundární infekce u pacientů majících lepru, jimž se s výhodou podává podává v množství jež je účinné při léčení primární nebo sekundární infekce nebo pro prevenci, (13) léčení tkání, tělních tekutin nebo kompozice buněk k odstranění nebo inaktivaci buněk obsahujících adhezní složku, přičemž se enzym aplikuje do tkáně, tělní tekutiny nebo kompozice buněk, kdy se pro odstranění adhezní složky z buňky nebo pro inaktivaci s výhodou podává účinné množství enzymu, přičemž je výhodná mimotělní léčba tkáně, tělní tekutiny nebo kompozice buňky, ač lze také použít léčby in šitu u zvířat, (14) čištění kontaktních čoček, s výhodou aplikováním k čištění účinného množství enzymu na čočky, přičemž aplikace může být prováděna i na čočkách v oku, (15) léčení nebo profy1 akt ickou prevenci koronaviru, jako je koronavirus způsobující kočičí infekční peritinotidu, cytomegalovirus, rhinovirus nebo papilloma virus (jako je lidský papilloma virus) způsobující infekci, přičemž se podává účinné množství enzymu k léčení virové infekce nebo prevenci, (16) léčení nebo profylaktická prevence HIV infekce, přičemž se s výhodou podává účinné množství enzymu pro léčení HIV infekce nebo prevenci, (17) léčení nebo profy1aktickou prevenci orální nebo jícnové plísně, včetně kvasinkové infekce, kdy se s výhodou podává účinné množství enzymu k léčení mikrobiální infekce nebo prevenci, (18) léčení nebo profy1aktickou prevenci pseudomonas, lišeje, candida, jako je vaginální nebo orální candida infekce, gonorea, chlamydia, syfilis, trichomonas nebo infekční měkké vředy, kdy se s výhodou účinné množství enzymu k léčení nebo prevenci mikrobiální infekce, (19) profylaktickou prevenci, zmenšení nebo odstranění korneálních jizev, přičemž se s výhodou podává účinné množství enzymu pro prevenci korneálních jizev, zmenšení nebo jejich

odstranění, přičemž se s výhodou podává enzym spolu s očním chirurgickým zákrokem k prevenci utvoření korneální jizvy, (20) léčení nebo profylaktickou prevenci kataru spojivek, jako je virový, bakteriální nebo alergický katar spojivek, přičemž se s výhodou podává účinné množství enzymu k léčení kataru spojivek nebo prevenci, (21) léčení nebo profylaktickou prevenci onemocnění nebo buněčného procesu vybraného ze skupiny, sestávající z cystické fibrózy, COPD, atherosk1erózy, astma, toxického šokového syndromu, reperfúzního poranění, kolitidy, enteritidy a maláriové infekce spojené s bolestmi, přičemž se s výhodou podává účinné množství enzymu k léčení a prevenci, (22) profylaktické prevenci nebo omezenému reperfúznímu poranění, přičemž se s výhodou podává účinné množství enzymu k prevenci nebo omezení reperfúzního poranění, (23) léčení nebo profylaktícké prevenci procesu apoptosis v buňkách při nebezpečí apoptosis, jako T-buňky u HIV pacientů, přičemž se s výhodou podává účinné množství enzymu k léčení nebo prevenci apoptosis (24) léčení nebo prevenci autoimunitních onemocnění jako je roztroušená skleróza, reumatoidní artritida, lupus erythrematosus, vaskulitida, temporální arteritida, primární biliární cirbóza, aktivní chronická hepatitida, ulcerativní kolitida nebo sklerodermie, přičemž se s výhodou podává účinné množství enzymu k léčení nebo prevencí autoimunitního onemocněn i, a (25) léčení hemoroidů (např. poporodní hemoroidy), přičemž se s výhodou podává účinné množství enzymu k léčení hemoroidů.

Způsob v sobě zahrnuje podávání prostředku obsahujícího výše popsaný polyfunkční enzym.

Vynález dále poskytuje (a) způsoby k léčení nebo profylaktícké prevenci buňka-buňka nebo buňka-virus srůstového syndromu, přičemž zahrnuje podávání protisrůstově účinného množství hydrolasy působící odstranění nebo inaktivaci celulární nebo virové akceptorové nebo receptorové sůstové

složky jež je zahrnuta ve srůstu buňka-buňka nebo buňka-virus, (b) prostředky nebo složky pro použití u těchto způsobů, (c) farmaceutické prostředky obsahující účinná množství enzymů pro použití při těchto způsobech, a (d) použití uvedených enzymových prostředků pro výrobu Léku pro použití při těchto způsobech. Způsoby jsou výhodné u syndromu, kdy je zahrnut zánět, šok, nádorové metastázy, autoimunitní onemocnění, reakce při odhojování po transplantaci nebo mikrobiální infekce. Výhodné je, je-li (a) syndrom vybrán ze skupiny sestávající z mikrobiální infekce, imunitní poruchy, cystické fibrózy, COPD, atherosklerózy, nádoru, astma, septického šoku, toxického šokového syndromu, kataru spoj i vek, reperfúzního poškození a bolesti, a (b) buňkový povrchový receptor, spojený s buňka-buňka nebo buňka-virus srůstovým syndromem, je vybrán ze skupiny sestávající z ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, CD4, CD9, CDU, CD18, CD28, CD29D, CD31 , CD44, CD49, CD62L, CD102 a asialo GM1 ceramid je odstraněn nebo inaktivován podáváním hydrolázy. S výhodou se tyká léčení mikrobiální infekce nebo prevence, a mikrobiální infekce je herpes, HIV, hepatitida nebo papilloma infekce, infekce způsobující kolitidu, vředy nebo diarheu, candida infekce jako je orální, vaginální nebo jícnová candida infekce, nachlazení nebo chřipková infekce, pseudomonas, haemophiLus, staphyίococcus, klebsiella nebo E. coli infekce, primární nebo sekundární infekce lepry a infekce způsobující katar spoj i vek.

Vynález dále poskytuje (a) způsoby léčení nebo profylaktické prevence infekce vůči lékům rezistentními mikroby, podáváním léčivé nebo preventivně působícího účinného množství výše popsaného polyfunkčního enzymu, (b) prostředky nebo složky pro použití takových způsobů, (c) farmaceutické prostředky obsahující účinné množství enzymu pro použití těchto způsobů, a (d) použití enzymového prostředku pro výrobu léku pro použití pro uvedené způsoby. Je výhodné, je-li mikrob vůči methici1 1 inu nebo chinol inu rezistentní bakterie. Při jiném výhodném provedení je mikrob plíseň jako je plíseň (např.

candida plíseň), která je rezistentní vůči lékům azolového typu jako je fluconazol.

Vynález dále poskytuje farmaceutický prostředek pro odstraňování nebo inaktivaci srůstu molekul na povrchu buněk, přičemž se použije účinné množství polyfukčního enzymu, potřebné k odstraněni srůstů molekul na povrchu buněk nebo k inaktivaci, aktivita obsahuje alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, relativní molekulová hmotnost je mezi 20 a 40 kd, určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolasou pocházej ící z drobného korýšovitého planktonu, a farmaceuticky přijatelné ředidlo nebo nosič.

Vynález ještě dále poskytuje farmaceutický prostředek pro léčení nebo profy1aktickou prevenci buňka-buňka nebo buňka-virus srůstového syndromu, přičemž obsahuje dostatečné množství prostředku obsahujícího polyfunkční enzym, jež je účinné pro léčení buňka-buňka nebo buňka-virus srůstový syndrom nebo pro prevenci, aktivita obsahuje alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo paptidasové aktivity, relativní molekulová hmotnost je mezi 20 kd a 40 kd, určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolasou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, a farmaceuticky přijatelné ředidlo nebo nosič. Je výhodné, pokud má polyfukční enzym podle tohoto vynálezu alespoň dvě z identifikovaných proteolytických aktivit, výhodněji alespoň tři a ještě výhodněji alespoň čtyři. Ještě více je výhodné, má-li enzym všechny identifikované proteolytické aktivity. S výhodou má polyfukční enzym v podstatě anti buňka-buňka a buňka-virus srůstovou aktivitu. Výhodné je, je-li polyfunkční enzym v podstatě homologický s polyfunkční hydrolasou pocházející z drobného korýšovitého planktonu.

Při výhodném provedení jsou pacienti infikovaní HIV léčeni pomalým postupem spoj ení ni onemocnění způsobem (1) izolování

T-buněk z těla pacienta, (2) léčení T-buněk hydrolasou účinnou k odstraňování CD4, a (3) podáváním injekcí T-buněk do těla pacienta.

Způsob léčení nádorů se může provádět orálním nebo parenterálním podáváním, přičemž je zahrnuto, avšak tím nijak neomezeno, podávání intravenózní, intraarteriální, intraperitoneální, podkožní, nitrosvalové nebo intranádorové. Jako část tohoto provedení poskytuje vynález způsob prevence nebo omezení metastázového nádorového procesu.

Při jednom z provedení poskytuje vynález způsob inhibice nebo nebo profyLaktické prevence přenosu patogenních mikrobů podáváním polyfunkčního enzymu. Je výhodné, pokud se polyfunkční enzym aplikuje na části těla na nichž jsou primární vstupní místa pro mikroby. Při výhodném provedení se aplikuje sprej, mast nebo promývání a oplachování tělních otvorů, souvisejících se sexuální aktivitou, např. pro prevenci přenosu HIV nebo hepatitidy. při ji něm provedení se polyfunkční enzym místech, např. jako aerosol, pro přenosu některých virů jako rinoviru nebo koronaviru.

Podle jiného aspektu se mimotělním způsobem léčí tělesné tkáně, tělní tekutiny nebo kompozice buněk odstraňováním srůstovýeh složek buněk snižováním imunitní odezvy při odhojování tkáně, tělních tekutin nebo kompozice buněk je-li prováděna individuální transplantace. Podle jiného aspektu se tímto léčením odstraňuje nebo inaktivuje srůstová složka buňky nalezená v léčené tkáni, tělní tekutině ne kompozici buněk včetně mikrobiální infekce.

Při léčení nebo profy1aktické prevenci septického šoku nebo toxického šokového syndromu podáváním polyfunkčního enzymu lze použít vhodné způsoby podávání bez omezeni systemického podávání. Při vaginálních infekcích spojených s šokem, se také jako výhodné způsoby podávání volí vaginální krémy, gely nebo čípky.

Vynález dále zahrnuje způsob profy1 akt ieké prevence na otevřených nebo prevenci aplikuj e zpomalení sexuálně přenosných onemocnění tak, že se u

zařízeni pro

regulování porodnosti (antikoncepci) aplikuje takové množství polyfukčního enzymu, aby bylo účinné k prevenci mikrobiální infekce při regulování porodnosti. Dále poskytuje vynález zařízení pro regulování porodnosti, jež zahrnuje polyfukční enzym.

Při inhibicí nebo prevenci způsobu apoptosis, nebo programovaném odumírání buněk, může být uvedený enzym podáván in vivo nebo ex vivo.

Při výhodném provedení vynálezu se uvedený polyfunkční enzym izoluje ve formě, jež v podstatě neobsahuje trypsinový inhibitor. Po pojmem v podstatě neobsahuje se zde rozumí, že není přítomen trypsinový inhibitor v množství, jež by bylo detegovatelné podle Coomassie Blue barvení analyzuje-li se 15 mikrogramů izolovaného polyfunkčního enzymu pomocí SDS-PAGE. Výhodné je, pokud neí detegovate1ný žádný trypsinový inhibitor při barvení stříbrem analyzuje-li se 1 mikrogram polyfunkčního enzymu pomocí SDS-PAGE.

POPIS OBRÁZKŮ

Obr. IA a ÍB ukazuje tepelnou stabilitu polyenzymu připraveného v Příkladu IA, když dochází k inkubaci při různých teplotách v časové stupnici hodin anebo dnů.

Obr. 2 ukazuje teplotní optimum přípravy polyenzymu z Příkladu IA.

Obr. 3 ukazuje stabilitu pH při přípravě polyenzymu z Příkladu IA.

Obr. 4 ukazuje zvýšení hmotnosti myší majících měkký vaječníkový nádor, jež se bud’ ošetřují nebo neošetřují multifunkčním enzymem purifi kovaným tak, jak je uvedeno v Př i k1adu ÍC.

Obr. 5 ukazuje přežití myší ošetřovaných enzymem a neošetřovaných myší jež měly vaječníkový nádor.

Obr. 6 ukazuje časové narůstání mezi urinacemi u pacientů s infekcí močového měchýře ošetřovanými polyenzymovým preparátem z Příkladu 1A.

Obr. 7 ukazuje snižování zarudnutí kůže/otoky u pacientů s virovým infekčním onemocněním plic při ošetřování polyfunkčním enzymem purifi kovaným tak, jak je uvedeno v Příkladu 1B.

Obr. 8 ukazuje ochranný účinek polyfunkčního enzymu, purifikovaného tak, jak je uvedeno v Příkladu 1C, proti HIV.

Obr. 9 ukazuje závislost polyfunkčního enzymu, purifikovaného tak, jak je uvedeno v Příkladu 1C, při testování vůči různým substrátům.

Obr. 10 ukazuje titraci aktivity polyfunkčního enzymu, purifikovaného tak, jak je uvedeno v Příkladu 1C, s dvěma různými proteázovýni inhibitory.

Obr. 11 ukazuje úlevu od bolesti zjišťovanou u kulhajících závodních koní ošetřovaných polyenzymovým preparátem z Příkladu 1A.

Obr. Obr. 12 ukazuje různé indikátory hojení nekrotických zraněni ošetřovaných polyfunkčním enzymem purifikovaným tak, jak je uvedeno u Příkladu 1B.

Bylo prokázáno, že polyfunkční enzymy podle tohoto vynálezu účinně odstraňují nebo inaktivují určité molekuly se srůstovým povrchem buněk, jako jsou ICAM (tj . CD 54), ICAM-2, VCAM-1, CD4, CD8, CD28, CD31, CD44 a asialo GM1 ceramid, aniž by byla ovlivněna životaschopnost buněk. Považuje se za zjištěné, že odstraňování srůstových míst nebo inaktivačních jevů lze alespoň zčásti objasnit účinkem enzymů vůči mnohým, ačkoli ne vůči veškerým, indikujícím faktorům vůči nimž je účinný polyfukční enzym. U jiných buněk povrchových receptorů bylo zjištěno, že jsou v podstatě rezistentní vůči odstraňování nebo inaktivaci polyfunkčním proteiny, jako jsou T-receptory, histokompatibi 1 ηí komplex nebo komplex CDU maj or

Class i a CD1-8.

Ačkoli není snaha o omezování nějakou partikulární teorií, předpokládá se, že aktivita polyfunkčního enzymu při prevenci infekcí viry působícími nachlazení.

nebo léčení týká

Například rinovirus, který je infikuje takovým způsobem, že ICAM-1 molekulu se se srustovým 64:2582-2587 Polyfunkční enzymové protisrůstové aktivity, zodpovědný za většinu nachlazení používá interakce mez i v i rem a buněčným povrchem. Viz L i neberg a koL., J. Ví rol. (1990), Stauton a kol.. Cell 61:243-254 (1990). enzym odstraňuje nebo inaktivuje ICAM-1 z povrchu savčích buněk. Analogická je infekční cesta koronavirů, jež jsou zodpovědné za většinu nachlazení, jež nejsou způsobena rinoviry, kdy jsou využívány CD13 buněčné povrchy molekul. Viz Delman a kol·., Nátuře, 357-420 (1992), Yeager a kol., Nátuře, 357:420-422 (1992). Je zřejmé, že polyfunkční enzym odstraňuje nebo inaktivuje srůstový buněčný povrch molekuly, což je součástí infekční cesty pro koronaviry. Protože polyfukční enzym je stabilní a v širokém rozmezí pH zůstává účinný, může tedy být enzym účinný v mnohých prostředích, jako jsou plíce, dutiny, ústa, střeva a vagína, kam může být aplikován.

Aniž by byla snaha o omezování nějakou partikulární že aktivitu působení úlevy od bolesti u při malárii lze přičíst alespoň zčásti enzymové aktivitě vůči ICAM-1 srůstovému buněčnému povrchu molekuly. ICAM-1 je zúčastněn při srůstové infekci červených krvinek (RBC) do endotelu a do ne ifi kovaných RBC, působí potíže ve vlásečnicícb a drobných žilkách pacientů a bolesti spojené s krizemi u malariových infekcí. Ockenhouse, Cell Adhesion teorií, lze uvést, polyfukčního enzymu

Molecules in Host Parasite Interaetors v Adhesion Molecules, Craig Vegner, Ed. , Academie Press, San Diego, 1994, str. 277-291. Polyfukční enzym odstraňuje nebo inaktivuje ICAM-1 s povrchu buněk.

Při repefúzním poranění se uplatňuje velké množství molekul se srůstovým buněčným povrchem. Korthius a Granger,

Pathogenesis of 1schemial/Reperfusion v Adhesion Molecules, Vegner, Ed., Academie Press, 1994, str. 163-190. ICAM-1 specifické protilátky interferuji s náchylností neutrofilu k migraci do ischemické tkáně, odkaz tamtéž, čímž omezují funkci neutrofilu při reperfúzním poranění. Tyto protilátky mohou také omezovat rozsah infarktu myokardu. Odkaz tamtéž, na 177, obr. 8.17. Polyfunkční enzym interferuje s ICAM-1 tím, že jej odstraňuje s povrchu buněk nebo je inaktivuje.

Aniž by byla snaha o omezování partikulární teorií, je pravděpodobné, že aktivita anti-CD4 molekul s růstovým buněčným povrchem polyfukčního enzymu je alespoň částečně odpovědná za enzymovou inhibiční aktivitu HIV přenosu. Při cestě infekce HIV se používá CD4 molekul. Viz Lentz, Molecular Interaction of Viruses with Host-Cell Reeeptors v Adhesion Molecules, Vegner, Ed., Academie Press, 1994, str. 223-251 a str. 229.

Při infekcích candida se považuje hyfální stadium za více infekční. O 1igandech na pli seň candida, u nichž je možné zjistit GaINAcbeta(1 - 4)Ga1 sacharidovou strukturu na asialo-GMl ceramidech infekčního hostitele, se předpokládá, že mohou být zahrnuty do procesu infikování candida. Tyto ligandové molekuly mohou být také obsaženy v procesu, jímž se candida konvertuje na hyfální stadium. U infekcí pseudomonas v plících se předpokládá, že ligandový bakteriální buněčný povrch, u něhož byla zjištěna GaINAcbeta(1 -4)Gal sacharidová struktura, hraje důležitou roli při cestě plicní infekce. Abraham, Bacterial Adhesion” v Ahdesion Molecules, Vegner, Ed., Academie Press, 1994, str. 253-276. Stejná nebo podobná glyko1ipidová struktura se předpokládá u srůstů některých patogenů na plicích, včel ně Pseudnaonas aeru^inosa, Haemophilus influenzae, Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Klebsiella pneumoniaea některé izolované E. coli. Viz Krivan a kol., Proč. Nati. Aead. Se i Vrásky na kůži jsou kolagenu volnými radikály nalezly výborné teorii lze s bakteriální infekcí omezovat partikulární

U.S.A. 85:6157-6161, 1988. z větší části způsobeny síťováním O tvorbě volných radikálů se předpokládá, že je způsobena vzájemným působením odumřelých nebo barevnými buňkami a bakteriemi, jež na takových buňkách růstové prostředí. Bez ohledu na partikulární předpokládat, že anti-adhezní vlastnosti polyfunkčního enzymu zhoršují přilnutí bakterií ke kůži včetně tvorby volných radikálů.

O bakteriích bujících na mrtvých, zbarvených nebo divergentních buňkách se předpokládá, že produkují toxiny, které se uplatňují při slábnutí vlasů. Toxiny dávají podnět kožním buňkám k produkování faktorů jako je nádorový faktor nekrózy, který negativně ovlivňuje růst vlasů- Aniž bychom se vázali na partikulární teorii. lze předpokládat, že anti-adhezní vlastnosti polyfunkčního napomáhají stabilizaci nebo reverzi slábnutí vlasů.

Existují domněnky, že CD4 a ICAM-1 jsou obsažena v T-buňkách apoptosis. Viz Okazaki a kol., Cell. Immunol. 156:135-45 (1994). Aniž bychom byli omezováni partikulární teorií, lze předpokládat, že anti-adhezní vlastnosti polyfunkčního enzymu hrají určitou roli při inhibici apoptosis.

Žaludeční vředy je onemocnění, které je často spojeno helicohacter pylori. Aniž by byla snaha teorii, lze se domnívat, že polyfukční enzym podle tohoto vynálezu působí inhibičně na přichycování bakterií na gastrointestiná1ni slizniei.

Studie destrukce nebo inaktivace buněčného povrchu molekul u T-buněk vystavených působení 10 mikrogramů hydrolasy pocházející z drobného korýšovitého planktonu po dobu čtyř hodin při teplotě 37 °C ukázala, že: CD3 a CD90 jsou velmi málo ovlivněny, CD28, CD49, CD29D, CD18 a CDU jsou významně porušeny nebo inaktivovánv, od 25 % do 40 % redukce • · · ·· ···«·· • ···· »· · • · · · c · ·· · ·····« • · · · · ··· ······· ·· · detegovatelného antigenu, CD54, CD102, CD44, CD31, CD62L, CD4 a CD8 jsou v podstatě zničeny nebo dezaktivovány, obvykle od 70 % 100 % redukce detegovatelného antigenu. Kromě toho byly

u	protilátky	proti asialo	GM-1 i	nd i kovány	redukce
v	imunologicky	detegovate1ném	množství	tohoto	ceramidu
v	membránách	plicních epitelních	buněk po	vystavení	působení
polyfunkčního	enzymu podle tohoto	vynálezu.	Dále se	při této

léčbě redukuje připojování plicních epitelních buněk k bakteriím Pseudomonas v plicních epitelních buňkách.

Předpokládá se, že výše uvedené diskutované adhezní (srůstové) molekuly a jiné budou hrát roli při mnohých jiných onemocněních, pro je polyfunkční enzym účinným léčebným nebo preventivním činidlem.

Pro účely této přihlášky uvádíme seznam pojmů, jež mají následující význam:

- v nebezpeč í i nfekce živočich je v nebezpečí infekce, jestliže nějaký rys jeho životního prostředí nebo lékařské anamnézy má vztah ke zvýšenému nebezpečí jedné infekce nebo několika infekcí

- buňka-buňka nebo buňka-virus srůstový syndrom onemocnění, při kterém srůstová složka buňky receptoru nebo akceptoru hraje roli v etiologii onemocnění, např. tím, že hraje nějakou rol i při vzniku, vývoji , přenosu, rozvíjení nebo průběhu nemoc i

- srůstová složka buňky obsažená v mikrobiální infekci srůstová složka buňky použitá mikrobem k usnadnění ulpění na tkáni nebo buňce při nebezpečí infekce

- dermatologické podmínky podmínky týkající se poškození zevního povrchu živočicha, přičemž neni omezení pokud se týká kůže, vaginy a povrchu očí

- odvozený od ryb nebo korýšů týká se enzymu majícího stejnou sekvenci jako má enzym izolovaný z ryby nebo korýše

- rezistentní vůči léku mikrob takového typu, který je nebo byl obecně citlivý vůči

danému množství jednoho něho více antimikrobiálních činidel, ale není citlivý vůči určitým činidlům nebo je pouze citlivý při významně vysokých množstvích hydrolasa enzym, který degraduje vazby, tvořené dehydrogenačními reakcemi jako je amidová, esterová nebo jiné vazby. Pojem též zahrnuje, aniž by se okruh omezoval, proteasy jako je trypsin a chymotrypsin imunitní porucha jakákoli porucha způsobená imunitní reakcí vůči cizím látkám, tkáním nebo buňkám vůči autologní nebo transplantované tkáni. Pojem zahrnuje autoimunní onemocnění polyfunkční hydrolasa pocházející z drobného korýšovifého planktonu polyfunkční enzym mající stejnou sekvenci jako enzym izolovaný z drobného koryšovítého planktonu mající vlastnosti proteinu popsaného v příkladech IB, 1C a ID. Tento enzym se také uvádí jako polyfunkční hydrolasa z drobného koryšovítého planktonu nebo polyfunkční enzym z drobného korýšovitého planktonu nebo polyfunkční enzym pocházející z drobného korýšovitého planktonu makromolekula pro určení čistoty se tím rozumí biologický polymer jako je protein, kyselina nukleová nebo sacharid o relativní molekulové hmotnosti větší než 1000 mikroby bakterie, mykoplasma. kvasinka, plíseň, virus, protozoa, parazity (jako jsou parazity malárie) apod.

polyfunkční enzym enzym mající aktivitu obsahující alespoň jedné z ehymotrypsi nové, trypsinové, ko1agenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, relativní molekulovou hmotnost od 20 kd do 40 kd a v podstatě je homologický s polyfunkční hydrolasou pocházející z drobného koryšovítého planktonu nekrotická tkáň

• · « část zmrtvělé tkáně nebo nevratně poškozené buňky protei n pro účely zjišťování čistoty znamená polypeptid s relativní molekulovou hmotností větší než 1000 reaktivní s proteinem na povrchu buňky nebo glykolipidem znamená, že na buněčném povrchu molekul lze v detegovatelném rozsahu určit poškození, zničení, inaktivaci nebo nezpůsobilost jakýmkoli mechanismem reaktivní s buněčnou nebo virovou akceptorovou nebo receptorovou srůstovou složkou znamená odstranění, poškození, nezpůsobilost schopnosti buněk buňkou, ligandem, skupinou mechani smem

SDS-PAGE znamená po 1yakry1amidovou ge1ovou elektroforézu proteinů za př i tomnos t i natr i um-dodecy Lsu 1 fátu selektivně reaktivní s buněčným povrchem proteinu znamená odstranění, zničení, inaktivace nebo nezpůsobilost u určitého proteinového buněčného povrchu a to na povrchu buňky, nikoli jinak sexuálně přenosná mikrobiální infekce jakékoli mikrobiální onemocnění, které je sexuálním styku v podstatě homoLogický alespoň 60 % homologické sekvence v podstatě žádné jiné proteiny, proteázový inhibitor prostředek neobsahující v vážou vybraný proteázový neobsahu j i v í ce než 5 % proteinu v prostředku systemické podávání podávání biologického činidla jako je polyfunkční enzym, označené dávky činidla do krve nebo jiného oběhového systému zničení, inaktivaci nebo nebo viru interagovat s nebo molekulou jakýmkoli přenášeno pri které vážou vybraný podstatě žádné proteiny, které inhibitor, pokud takové proteiny (hmotnost/hmotnost) z celkového »t ··> ·

(jako je lymfatický systém) živočicha

Korýši, včetně antarktického drobného korýšovitého planktonu, jsou užitečným zdrojem polyfunkčního enzymu podle tohoto vynálezu. Například mrazený korýšovitý plankton může být homogenizován ve vodě nebo pufru, kde je s výhodou obsaženo antimikrobiální činidlo. Supernat,který pokud je třeba, může se pak frakcionuje pomocí iontoměničové výhodou aniontové iontoměničové gelové nebo pomocí být zředěný, chromatografie (s chromatografie), chromatograf ie, způsobu. Nicméně je výhodné způsobu obsažena afinitní připojené molekuly maj i c i filtrace, chromatofokusni jiného tradičního separačního je-li v některé části separačního chromatografie za použití matrice trypsínového inhibitoru, jako je sojový trypsinový inhibitor. Polyfunkční hydrolasa z drobného korýšovitého planktonu, použitá podle tohoto vynálezu, může být z takovéto matrice za aplikace podmínek, kdy destabi 1 izaei interakce mezi hydrolasou a inhibitorem. Mezi tyto podmínky patří nebo přítomnost denaturačnich činidel K přidání jiného selektivního způsobu desorbována dochází k silná sůl, nízké pH, jako je močovina.

je možno na matrici přírůstkově, ve vztahu ke gradientu, aplikovat destabilizační se afinitní chromatografie, bude výhodné matrice mající připojené molekuly použitého podle tohoto vynálezu. Tento k odstranění molekul podmínku. Použije-li pokud se použije polyfunkčního enzymu afinitní enzymová stupeň slouží trypsinového inhibitoru, který vyluhuje první afinitní matrici. Těmito způsoby lze izolovat polyfunkční enzym o čistotě vyšší než 95 % až 99,7 % nebo vyšší.

Polyfunkční enzym izolovaný z jiného zdroje než je drobný korýšovitý plankton, lze porovnávat s polyfunkční hydrolasou izolovanou z drobného korýšovitého planktonu, podle relativní hmotnosti, sekvence, teplotní stabilitou nebo pH, teplotním nebo pH optimem a proteolytickou specifičností, nebo s jinými vlastnostmi polyfunkčního enzymu pocházej ici ho z drobného korýšovitého planktonu uvedeného moleku1ové stah i 1 i tou určena inkubací enzymové % (hmotnost/hmotnost) při přičemž se měří vyvíjení se měří přírůstkem v příkladech.

Proteázová aktivita může být preparace s kaseinem (koncentrace 1 teplotě 30 °C po dobu 20 hodin, aminokyselin nebo peptidů (jež kolorometricky měřitelných aminoskupin). Izolovaný polyfunkční enzym o čistotě 95 % má typicky specifickou aktivitu alespoň 25 kaseinových jednotek, podle definice

173:291-298, 1978 (za použití azokaseinu jako substrátu).

Alternativně může být měřena tryptická proteázová aktivita proti ty rosín-arginin-methyl-esteru (TAME). Polyfunkční enzym o čistotě alespoň 95 %) má s výhodou specifickou aktivitu alespoň 60 TAME jednotek na mg. Nebo může být tryptická aktivita měřena za použití Benzoyl-Val-Gly-Arg-p-NC^-anilidu Při použití tohoto substrátu a způsobu podle 185:423-433, 1980, má polyfunkční enzym jako substrátu. Biochemieal J.

s výhodou specifickou aktivitu alespoň 210 jednotek na mg.

Chymotryptická aktivita může být

Succiny1 -Ala-A1 a-Pro-Phe-p-NC^-ani Lidu měřena za použití jako substrátu. Při použití tohoto substrátu a způsobu podle J. Biol. Chem.,

269:19565-19572, 1994, má polyfunkční specifickou aktivitu alespoň 260 jednotek aktivita může být měřena enzym s výhodou na mg. Elastasová za použití

Boc-A 1 a-Ala-Pro-A 1 a-p-N0₉-ani 1 idu jako substrátu. Při použití tohoto substrátu a způsobu podle J. Biol. chem., 269:19565-19572, 1994, má polyfunkční enzym s výhodou specifickou aktivitu alespoň 270 jednotek na mg.

Proteinová čistota se obecně stanovuje pomocí SDS-PAGE s barvením Coomassie b 1 ue . Procento zbarvení v příslušné vazbě odráží čistotu. Proteinová koncentrace se obecně stanovuje analýzou na aminokyse1iny nebo absurbancí při 280 nm.

Obecně je polyfunkční enzym dostatečně stabilní, jestliže si podrží alespoň 50 % proteo1ytieké aktivity po ikubaci při teplotě 50 °C po dobu 24 hodin při pH 7,0 a při koncentraci 5 mg/ml. Je výhodné, pokud si udrží alespoň 50 % proteolytické

• · · *» aktivity po inkubaci při teplotě 60 °C po dobu 5 hodin při pH 7,0 a při koneetraci 5 mg/ml.

Je výhodné, je-li optimum pH polyfunkčního enzymu závislé na substrátu. Pro substrát azokasein je s výhodou optimum pH od

3,5 do 6,5, výhodněji od 4,0 do BenzoyL-Va1-Cly-Arg-p-nitroani 1 id, je s vyšší než 8,0, výhodněji vyšší než

6,0. Pro substrát výhodou optimum pH 9,0. Pro substrát

Boc-Ala-Ala-Pro-A1a-p-nitroani I id, je optimum pH s výhodou mezi

6,0 a 7,0, výhodněji 7,0.

Při použití Benzoy1-Va1-Gly-Arg-p-nitroanilidu jako substrátu je výhodná hodnota K_]n při pH 9,5 za přítomnosti 2 mM Ca^⁺ mezi 200 a 240 mikroM. Pří použití

Suceiny1 -Ala-A 1 a-Pro-Phe-p-nitroani 1 idu jako substrátu je .

výhodná hodnota K_n) při pH 9,5 za přítomnosti 2 mM Ca mezi 250 a 290 m i kroM.

Je výhodné, má-1 i polyfunkční enzym teplotní optimum pro aktivitu kase in mezi 45 °C a 60 °C. Obecně si enzym podrží alespoň 50 % své aktivity, je-li inkubován při 5 mg/ml po dobu 18 hodin při rozmezí pH od 5,0 do 9,5 při teplotě 25 °C.

Když se buňky HL60 předzpracovávají s polyfunkční hydrolasou z drobného korýšovitého planktonu, je jejich vazba na TNFalfa stimulované endotelové buňky inhibována z více než 60 %. S výhodou je při zpracovávání HL60 nebo endotelových buněk po 1yfunkčním enzymem podle tohoto vynálezu inhibováno vázání buněk HL60 na TNFalfa stimulované endotelové buňky alespoň z 20 %, výhodněji alespoň z 40 %, ještě výhodněji alespoň ze 60 %, ještě více výhodněji alespoň z 80 %.

Alternativně bude mít polyfunkční enzym alespoň 30 % aktivity adheze- inhibice u polyfunkční hydrolasy pocházející z drobného korýšovitého planktonu. Výhodněji bude mít polyfunkční enzym alespoň 60 % adhezní aktivity u polyfunkční hydrolasy pocházející z drobného korýšovitého planktonu, ještě výhodněji alespoň 80 % a ještě více výhodněji 100 %.

Polyfunkční enzym podle tohoto vynálezu se podává orálně, místně, rektálně, vaginálně, pomoci instilace (např. do

9· ··· · • · · Ν

C ·· močových cest nebo do kanálků) do plicních cest za použití aerosolu, aplikováním kapek do oka, nebo systemicky, jako je způsob parenterální, včetně například nitrosvalový, podkožní, intraperitoneálηί , intraarteriální nebo intravenózní. Polyfunkční enzym se podává samotný nebo spolu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo excipientem podle běžné farmaceutické praxe. Pro orální způsob podávání se používá polyfunkční enzym ve formě tablet, kapslí, tobolek, žvýkací gumy. prášků, sirupů, elixírů, vodných roztoků a suspenzí apod. V případě tablet patří mezi nosiče např. laktosa, citrát sodný a soli kyseliny fosforečné. Obecně se do tablet používají různá rozvolňovadla jako je škrob a maziva jako je stearat horečnatý a talek. Pro orální podávání ve formě kaps1 i se ke zředění používá např. laktosa a polyethylenglykoLy s vysokou relativní molekulovou hmotností. Pokud je to žádoucí. přidávají se různá sladidla a/nebo vonné látky. Pro parenterální podávání se obvykle připravují steří lni roztoky polyfunkčního enzymu a pH roztoků se obvykle upravuje a používá se též pufrů (tlumivých roztoků). Pro intravenózní použití se celková koncentrace roztoků kontroluje na izotonicítu preparátu. Pro oční aplikaci se dodávají masti nebo kapaliny vhodné pro kapání do oběhového systému oka, jak je známo dané oblasti techniky. Takové prostředky mohou obsahovat mukomimetika jako je kyselina hyaluronová, chondroitinsu1fat, hydroxypropy1 celu l osa nebo pólyv inyI a 1 koho 1 , konzervační látky jako je kyselina sorbová, EDTA nebít benzoy 1 chroni umchlor i d , a obvyklá množství ředidel a/nebo nosičů. Pro podávání vdechováním se vybírají taková ředidla a/nebo nosiče, jež jsou schopná tvořit aerosol. Pro lokální (místní) aplikování je typické podávání polyfunkčního enzymu ve vodné formě nebo ve formě hydrogelu. Výhodný hydrogel obsahuje vodnou suspenzi 1%ηího (hmotnost/objem) až 10%ního (hmotnost/objem) hydroIyzovaného škrobu o nízké relativní molekulové hmotnosti .

Ve formě čípků se ap1ikuje polyfunkční enzym při používání vaginálním, urctálním a rektálním podávání. Takovéto čípky se obvykle sestavují ze směsi látek, které jsou za teplofy místnosti v pevném stavu látky, obvykle používané například theobromový ale tají při tělesné teplotě. Mezi k přípravě masťových základů, patří olej, glycerinovaná želatina, hydrogenované rostlinné oleje, srněsi po 1yethy1eng1ykolů o různé relativní molekulové hmotnosti a estery po1yethylenglykolu a mastných kyselin. Viz Remingtons Pharmaceutical Sciences, 16. vydání, Mack Publishing, Easton, PA, 1980, str. 1530-1533 pro další diskusi o dávkových formách čípků. Analogicky mohou být k vaginálnímu, uretálnírau a rektálnímu podávání použity gely nebo krémy.

V dané oblasti techniky je mnoho masťových základů, jež jsou zjevné odborníkům a .jež lze použít a mezi než patří například, aniž by se tím jejich výběr omezoval, fomulace s pomalým vyvíjením, liposomáJní formulace a polymerní matrice.

Při místním podávání se vhodná dávka polyfunkčního enzymu na aplikaci pohybuje 9 rozmezí od 0,1 mikrogramů/cm^ do 1 mg/cm“. s výhodou mikrogamů/m1) do výhodnčj i od 5 mik rogramů/m 1 ) <Jo od 1 mikrogramu/cm (např. se použije 10 mg/cm mikrogramů/cm (např.

(např. se použije 2 se mg/ml), použije 50

100 mikrogramů/cm výhodněj i od 10 ještě více výhodněji β 2 se použije 100 mikrogramů/ml) do 50 mikrogramů/cm se použ i je 500 in i k rogramů/ml) . Pro systemické léčení se obvykle vybírají tak. ahy množství séra polyfunkčního bylo mezi 0,1 mikrogramu/lOOcc a 5 mikrogramů/lOOcc, mg/m1), ještě mikrogramů/cm“, (např.

(např. dávky enzymu (např. se použije 1 2 m i k r og rámů/cm od 10 mikrogramů/cm do 250 2 s výhodou mezi 0,5 mikrogramů/1OOcc a 2,0 mikrogramů/lOOcc. Při al te rna t i vn i m me reni výhodných systém icky podávaných množstvích, je výhodné od 0,1 mg/kg do 10 mg/kg, výhodněji se podává 1 mg/kg (ačkoli podle toxikologie u živočišných modelů se navrhuje, aby byl přijatelný přebytek 25 mg/kg). Pro oční apl ikaci je vhodné dávkovat polyfunkční enzym v rozmezí od 0,1 mg na oko do 5 mg na oko, s výhodou od 0,1 mg na oko do 2,0 mg na oko. Pro léčení vaginálních a urinárních cest jsou vhodné se obecně dělaj i 0,1 mg/ml do 15 vyplachovací/instilační roztoky polyfunkčního enzymu mající koncentraci od 1 mikrogramu/ml do 15 mg/ml, s výhodou od 100 mikrogramů/ml do 3 mg/ml. Pro orální způsob léčby jsou vhodné roztoky k vyplachování úst jež mají obvykle koncentraci polyfunkčního enzymu od 1 mg/ml do 15 mg/ml, s výhodou od 2 mg/ml do 10 mg/ml. Pastilky typicky obsahují od 100 mikrogramů do 10 mg polyfunkčního enzymu. Aerosoly z roztoků majících koncentraci enzymu od mg/ml, s výhodou od 1 mg/ml do 10 mg/ml. Obecně se aplikuje od 0,1 ml do 2 ml aerosolu do dýchacích cest pacienta, s výhodou od 0,5 ml do 1,0 ml. Pro ošetření rány a keloidní jizvy se obvykle používá od 0,1 mg do 5 mg polyfunkčního enzymu ve formě

O injekce na každý cm léze, s výhodou od 0,5 mg do 3 mg. Pro ošetření srůstové pojivové tkáně nebo kloubů se obvykle používá od 0,5 mg do 10 mg polyfunkčního enzymu v injekcích intersticiálně do srůstu, s výhodu mezi 1 mg a 5 mg. Při všech způsobech léčby se enzymový prostředek aplikuje jednou až desetkrát denně, s výhodou dvakrát až pětkrát denně. Tyto hodnoty ovšem velmi kolísají podle počtu faktorů ovlivňujících nemoc a pod 1e jejich typu, dále podle závažnosti onemocnění a věku, hmotnosti a zdravotnímu stavu pacienta a také závisí na zkušenostech a okolnostech z lékařského hlediska. Lze pokládat za v podstatě dokázané, že lze použít vyšších dávek bez podstatného škodlivého vedlejšího účinku.

Pro léčení nebo prevenci infekce lze podávat polyfunkční enzym systemicky nebo způsobem, zaměřeným na působení na tkáň. Pro prevenci při přenosu nachlazení nebo chřipky se s výhodou prostředek ap1ikuje do plic nebo do dýchacích cest. Pro léčení poruch imunity se může prostředek aplikovat systemicky nebo způsobem zaměřeným na napadenou tkáň. Pro léčení primární a sekundární infekce lepry se jako primární podávání obecně aplikuje lokální způsob, pro léčení poraněné tkáně, jizvy nebo se prostředek podává injekčně do jizvy nebo vyjma korneálních jizev, kdy se prostředek jizvy, j i zvy, kelo i dn i keloidn i obecně ap1ikuje očně bez injekce. Pro léčení nádoru se

prostředek obecně podává systemicky způsobem nebo zaměřeným přímo na napadenou tkáň. Pro léčení ateroskLerózy se prostředek obecně podává systemicky, ačkoli v místě podávání může ošetřující zvolit nejvyšší dávkování tak, aby nedocházelo k nebezpečí pro oběhový systém. Pro léčení astma se obecně volí způsob podávání do dýchacích cest.

pseudomonas je typická infekce dýchacích způsob podávání dýchacími cestami. Při reperfúzním poranění se prostředek podává systemicky, ač může ošetřující volit nejvyšší dávkování do napadeného místa těla. Pro ošetřování bolestivých symptomů malárie je obecným způsobem podávání systemicky.

výhodou aplikuje aplikace v době

Pro léčení infekce cest a tedy se volí

Pro léčení ran se s častěji než je jednoduchá polyfunkční enzym ošetřování rány.

S výhodou se polyfunkční enzym aplikuje alespoň při každém obvazování rány, kdy se mění obvaz. Polyfunkční enzym lze pokud možno také jednom z v podstatě ap1 i kovat i j iný den, provedení se polyfunkční bez nekrotické výhodněji každý den. Při enzym dává do rány, pojmem v podstatě bez tkáně. Pod nekrotické tkáně se rozumí tak malé množství nekrotické tkáně, že podle zkušeného patologa ne Lze v ráně v podstatě najít žádnou zbylou nekrotickou tkáň, jež by byla irelevantní vzhledem k diagnóze určující způsob ošetřování rány.

Při transp1antaci orgánů se orgán před vlastní transplantaci s výhodou vkládá do roztoku polyfunkčního enzymu po dobu mezi 10 minutami a 5 hodinami. Roztok enzymu s výhodou obsahuje od 0,01 mg/ml do 25 mg/ml polyfunkčního enzymu, výhodněji od 0,5 mg/ml do 5 mg/ml. Po transplantaci se polyfunkční enzym s výhodou podává systemicky za použití výše uvedených podm i nek.

Pro čištění kontaktních čoček in šitu je výhodné použít k oční ap1ikaci výše uvedené roztoky, pro ex vivo ošetření se s výhodou používají vyšší koncentrace enzymu. Také jsou výhodné čisticí inkubace od 5 do 30 minut při teplotě od 20 °C do 50 °C. Pro aplikace e.v vivo je výhodné použít vyšší hodnotu teploty na konci uvedeného teplotního rozmezí.

- 27 Při lepře, často spojené s infekcemi, je vhodné ošetřování zevní aplikací polyfukčního enzymu. Pro CF nebo COPD lze použít polyfunkční enzym k ošetření (a) vytvořených viskózních kapalin v plících a (h) přídavným plienim infekcím. S výhodou se léčí pacienti s CF a COPD včetně ošetřování onemocnění dýchacích cest pomocí aerosolu polyfunkčního enzymu, ale mohou být použity i jiné způsoby podávání včetně systemického podávání.

Zvláště významné mezi nemocemi souvisejícími s přenosem při ínhibičním provedením podle tohoto vynálezu jsou sexuálně přenosné nemoci, jako je candida, gonorea, chladmya, syfilis, trichomonas, měkký vřed, HIV. pásový opar nebo hepatitické infekce. Mezi nimi jsou zvláště významná z hlediska prevence jejich přenosu virová onemocnění. z tohoto hlediska je zvláště významný účinek u HIV. Pro toto použití se obvykle části těla spojená se sexuální akivitou oplachují nebo natírají prostředkem obsahujícíem polyfunkční enzym, a to ve formě krému, gelu nebo čípků upravených tak, aby je bylo možno použít na uvedená místa na těle. Prostředek lze použít před, současně nebo brzy po sexuální aktivitě, přičemž je výhodné použití před nebo současně s touto aktivitou.

U infekcí oparů patří mezi virové cíle HSV-1, jež se primárně projevuje jako orální herpes, HSV-2, jež se primárně projevuje jako gemitální herpes, a pásový opar.

onemocněn í ch patří mezi cíle by se tím rozsah omezoval, revmatická artritida, roztroušená skleróza, primární biliární cirhóza, aktivní chronická hepatitida, ulcerativni kolitida, revmatická artritida, sklerodermie, systemický lupus erythematodes, Hashimotova tyreoiditida, primární myxedčm, tyroroxi kosa, zhoubná anémie, Addisonova nemoc, předčasný příchod menopauzy, autoimunitní mužskneplodnost, na insulinu závislá cukrovka, typ B vůči acanthosis nigricans, alopická alergie, Lambert-Eatonův syndrom, Goodpastureův

U au to imunitnich s autoimunitními látkami nebo onemocněních při ošetřování, aniž insulinu resistentní myas ten i e g ravi s.

synd rom pemfigus obecný pemfigoid, fakogenní uveitida, • · • · · · endotelové nádorové buňky, mikrobiální sympatet ická oftalmie, auto imunitní hemolytická anemie, idiopatická trombocytopenická purpura, Sjogrenův syndrom, disko i dní lupus erythematodes. dermatomyozitida a smíšená onemocnění tkání.

Při srůstových onemocněních lze mezi buňky nebo viry zahrnout, aniž by tím by i jejich rozsah omezován, buňky, lymfocyty, včetně T-buněk buňky, viry, včetně HIV a herpes. Mezi srůstové procesy lze zahrnout ty, jež mohou být v tkáňové invazi, například imunní buňky, mikroby a nádorové buňky.

Jak je dále uvedeno v mnoha klinických příkladech, polyfunkční enzym podle tohoto vynálezu je účinný pro léčení nebo prevenci zánětů. Typicky se záněty redukují na přijatelnou během 3 nebo 4 dnů od začátku léčení. Příklady dále úroveň ukazu j i bolesti je často udáváno během 20 minut až 2 hodin od začáxku že enzym je účinný ke zmírnění bolesti. Zmírnění léčení. Zmírnění bolesti není V ošetřované tkáni. Kompletnější spojeno se ztrátou citu úleva od bolesti, takže pacient pocituje .jen mírnou bolest nebo má poci t bolestivosti pozoruje během dvou dnů od (ci t1 i vos t i na začátku léčení.

t 1 ak se často

Měření tohoto parametru je často subjektivní, v příkladech je uvedeno léčení zanícených kloubů koně, kde lze zmírňování bolesti objektivněji měřit podle chůze ošetřovaného koně .

Pro mnoho nemocí je užitečný polyfunkční enzym podle tohoto vynálezu jako profy1aktická léčba, včetně těch případů, jež nejsou způsobeny mikroby, pacientovou lékařskou anamnézou, životním stylem nebo genetickou výbavou, predispozice k onemocnění. To je u ateroskIerózy.

Výhodnými hydro1ázami jsou proteázy polyfunkční enzym podle tohoto vynálezu.

Obecně se polyfunkční enzym podává

Účinným množstvím je účinné množství k buď (1) redukování symptomů nemoci jež má být léčena, (2) způsobení farmakologické je často indikována pravdivé například

Zvláště výhodný je v účinném množství.

změny relevantní k léčení nemoci jež má být léčena, (3) inhibici nebo prevenci infekce nebo opakované infekce infekční látkou, nebo (4) preventivnímu působení na výskyt neinfekční nemoci (například nemoci, které lze léčit blokováním srůstů buněk). V případě účinného množství pro léčení nádoru se do účinného množství metas tázy. vel i kos t i prevence nebo omezení ještě zahrnuje:

například ke snížení úrovně metastázy, zmenšení nádoru, pornaLý růst nádoru, a prodloužení pravděpodobné délky života postižených živočichů. Pro ošetření rány je podle jednoho aspektu účinným množstvím taková dávka, která při regulérní aplikaci působí preventivně při výskytu infekce. Podle jiného aspektu je pro hojení rány účinným množstvím takové účinné množství, které zkracuje průměrnou dobu nutnou pro vyhojení rány.

Výhodnými subjekty pro léčení jsou lidé. Nicméně však může být polyfunkční enzym použit v mnohých veterinárních případech při léčení zánětů, s výhodou savců, jak je zjevné odborníkům v dané oblasti techniky ve světle tohoto vynálezu.

dané oblasti techniky je známo mnoho způsobů, jak procento honu, 1 og i ckého podílu. Jedním z výhodných je použít verse 6.0 v GAP počítačovém programu pro je dostupný na Universitě ve

V určovat způsobů porovnávání sekvencí. Program Visconsin Genetics Computer Group a používá příspěvkové metody třídění podle Needlemena a Vunsche, J. Mol. Biol. 48, 443,

1970 a dále podle Smitha a Vatermana, Adv. Appl. Math., 2, 482, 1981. Jinou dostupnou metodu používá počítačový program

FASTA.

Polyfunkční enzym byl vzat na vědomí jako prostředek k léčení infekcí. Nicméně je jeho přímý vliv na růst mikrobů in vitro ma1ýpart i ku 1úrní

Aniž bychom přihlíželi k omezování jakoukoli teori i , je pravděpodobné. že enzym atakuje mechanismus, jímž mikroby a nádory ničí tkáně. Tyto mechanismy obsahují srůstový mechanismus buňka-buňka nebo buňka-virus, jímž může být v tkáni založen nádor nebo působení mikrobu. Důležitost srůstovych molekul buňka-povrch a srůstového způsobu

Metas tasis' při nádorových metastázáeh je i lustrován diskusí v Albelda, Role of Cell Adhesion Molecuies in Tumor Progression and Adhesion Molecuies, Craig Vegner, vydáno

Academie Press, San Diego, 1994, 1994, str. 71-88.

Přerušení jiných buňka-buňka nebo buňka-virus srůstových reakcí polyfunkčním enzymem se zdá být relevantní vůči jiným podmínkám za nichž probíhá léčení polyfunkčním enzymem, včetně dentálního povlaku a poruch imunity.

Adheze HL60 buněk (lidská lymfocytová buněčná linie) vůči endotelovým buňkám se obecněji zdá být modelovým mechanismem pro nádorovou buňkovou invazi a infekci. Tato adheze je stimulována nádorovým nekrotickým faktorem alfa (TNFalfa) a inhibována protilátkami vůči E-selekci antigenu na HL60 buňkách. E-selekce je buňková povrchová adheze proteinu, která se projevuje vázáním na sialatované uhlovodíky. Viz Bevilacqua a kol., Science (1989) 243:1160.

Preparáty z polyfunkčního enzymu jsou stejnoměrně aktivní homogenitě. Pro sledování vlivu jak je dále uvedeno, připraven póly-enzymový prostředek obsahující alespoň šest proteinů. Jak i lustrují mnohé případy, by! uvedený preparát potvrzen jako akti vn i .

Alespoň jeden z enzymů přítomných v poly-enzymovém preparátu je polyfunkční hydrolasa z drobného korýšovitého planktonu a má alespoň jednu z. chymotrypsinové, trypsinové, elastasové, kolagenasové nebo exo peptidasové aktivity. Tato v závislosti na purifikaci a purifikace byl v příkladu IA, hydrolasa může být v podstatě purifi kována tradičními způsoby k dosažení z drobného čistoty alespoň 60 %. Polyfunkční hydrolasa korvšotitého planktonu vykazuje zdánlivou molekulovou hmotnost 29 kd.

Užitečné preparáty z po 1\-enzymových preparátů obvykle obsahují s ohledem na prote-i nv alespoň 10 % polyfunkčního enzymu S výhodou preparáty obsahují alespoň 30 % polyfunkčního enzymu.

Na obr. IA a B jsou zobrazeny profily teplotní stability

poly-enzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu. Preparáty z enzymu (5 mg/ml, pufrováno při pH 7,0) se inkubují při 10, 20, 30, 40, 50, 60 nebo 70 °C po různou dobu a následně se zkoumají na schopnost vyvíjení aminokyselin a peptidů z bovinního kaseínu (dostupno z Bio.Rad Laboratories, lne., Hercules, California) po 20 hodinách inkubace při pH 7,0. Při teplotě 60 °C má preparát poločas v přebytku 6 hodin, při 50 °C má poločas v přebytku 24 hodin, a při 40 °C má poločas 6 dnů. Obrázek 2 znázorňuje profil aktivity poly-enzymového preparátu při různých teplotách. Teplotní optimum je 55 °C. Obrázek 3 znázorňuje profil aktivity poly-enzymového preparátu po inkubaci při teplotě místnosti při různých hodnotách pH. Po inkubaci následuje úprava pH na hodnotu 7,0 a určí se zbytková aktivita jak je výše uvedeno. Optimální stability se dosáhne při pH 7,0. Nicméně alespoň 50 % původní aktivity se udrží po následujících 18 hodinách inkubace v roztocích majících hodnoty pH mez i 5,0 a 9,5.

V purifikace proteinů s chromatografie. Mezi ně filtrační eh romatourafi e

Polyfunkční enzym může být purifikován z homogenizované tkáně ryb nebo korýšů nebo z homogenátů nebo supernantů získaných z buněčné kultury transformovaných nebo normálních prokaryotických nebo eukaryoi ických buněk jež produkují polyfunkční enzym. Výhodná puriíikace obsahuje použití afinitní kolony obsahující inhibitor jež je reaktivní vůči polyfunkčnímu enzymu. Po eluování polyfunkčního enzymu z afinitní kolony se odstraní zbylý enzymový inhibitor Jedním způsobem odtranění je procházení preparátu afinitní matricí obsahující molekulu, typicky proteasu, s níž se inhibitor si Lně váže (například s afinitní konstantou alespoň 10° M, s výhodou alespoň 10' M). Výhodnější pro způsob purifikace je, je-li afinitní ligand přednostně izolován z preparátu z polyfunkčního enzymu.

určitém měřítku se mohou dělat některé tradiční výhodou patří různé i onlově před stupněm afinitní způsoby srážení, gelová měničová chromatografie, chromatografie na slabě hydrofob ických matricích jako jsou barvicí matrice, chromatofokusní a reverzní fázová kapalinová chromálografie. 1e výhodné, kroků k odstranění všech kilvž se použije jeden nebo více proteinů, které jsou jiné než polyfunkční enzym, vážící se na afinitní ligand. Alternativně nebo dodatečně může být po kroku afinitní chromatografie aplikován jeden nebo několik tradičních kroků pro purifikaci prote i nů.

Výhodný purifikační způsob obsahuje tyto kroky:

(a) aplikování prostředku obsahujícícho polyfunkční enzym do iontově měničové kolony, (b) eluování prvního adsorbovaného materiálu z kolony prvním vodným roztokem vybrané iontové síly 1^, a (c) eluování polyfunkčního enzymu z kolony druhým vodným roztokem vybrané iontové síly I_?.

přičemž 1^ je vyhrán tak, že pivní vodný roztok (i) eluule první adsorbovaný materiál obsahuj icící proteiny, které se mohou vázat na hvdrolazový inhibitor, přičemž ale proteiny adheruji vůči iontově měničové koloně slaběji než polyfunkční enzym a (ii) neeluují polyfunkční enzym, a kde je větší než Ij a je vybrán tak, že druhý roztok eluuje polyfunkční enzym a v podstatě žádné proteiny, které vážou vybraný proteázový inh i b i tor.

Způsob dále sestává z dalších kroků, následujících po kroku (c):

(d) apI i kování e1uovaného po I v f imkěni ho enzymu z kroku (c) na afinitní matrici obsahujícící proteázový inhibitor:

(e) eluování afinitní matrice třetím vodným roztokem, který destabilizuje interakce mezi polyfunkčním enzymem a proteázovým inhi h í torem, a (f) shromáždění el uovaného po 1 v ! iinkčn i ho enzymu.

Těmito výhodnými způsoby se získají, po několika krocích, homogenní preparáty z polyfunkčního enzymu.

Způsob popřípadě obsahuje t\to kroky po kroku (f):

(g) aplikování druhého eluovancho roztoku na afinitní matrici před preparací polyfunkčního enzvmu, a • · · (h) shromáždění eluentu z afinitní matice obsahující enzym, a eluentu obsahujícího purifikovaný polyfunkční enzym.

Je výhodné, je-li Ij iontová síla 0,4M NaCl a I₂ iontová je-li iontově měničová 5,5 a 7,5, výhodněji mezi síla 0,6M NaCl. Je výhodné, chromátografie prováděna při pH mezi ž,0 a 7.0, ještě výhodněji při 6.2. S výhodou obsahuje iontově výměnná matrice raatriei založenou na polysacharidu v nabotnalém stavu s 0,05 mmol až 0,6 mmol aniontové výměnných míst na ml. S výhodou je matricí zes í ťovaný ilextran typu, který je prodáván pod ochrannou značkou Sepharosc. S výhodou obsahují aniontové výměnné skupiny diethano1aminoethy! (DEAE) nebo kvarterní aminoethyl (QAE) skupiny, výhodněji DEAE skupiny.

Kroky afinitní chromatografie (d) až (f) s výhodou dále obsahují mezi krokem (d) a (c) promývání kolony obsahující inhibitor, roztokem majícím iontovou sílu alespoň 0,5M NaCl, výhodněji 0,8M NaCl, ještě výhodněji ÍM NaCl před eluováním se s výhodou provádějí výhodněji mezi 6,0 a 7,0. El učni krok (e) s výhodou obsahuje aplikování pufru (tlumivého roztoku) majícího pH od 2 do 4, s tento krok a krok při pH mezi 5,5 a 7,5, výhodou maj ícího

Alternativně může být výhodou aplikování pufru výhodou vhodnou pH alespoň 8. Eluční pufr má s iontovou sílu takovou, aby bylo možno potlačit slabé iontové interakce s afinitní matricí.

Kroky (g) a (h) tohoto způsobu se s výhodou provádějí při PH mezi 5,5 a 7,5, výhodněji mezi 6,0 a 7,0. Pufr použitý v těchto krocích má s výhodou iontovou sílu takovou, aby bylo možno potlačit slabé iontové interakce s afinitní matricí.

Matrice použitá k vývoji afinitní matrice s výhodou obsahuje uhlovodíkovou matrici jako je zesíťovaný dextran (např. takový, jaký se prodává pod ochrannou značkou Sepharose) nebo agarosa (například .jako se prodává u firmy Pharmacia, Sveden, jako Sephacry1). Matrice by měla mít velikost pórů aby moh1 v pojmout jako afinitní ligand, který je matrici, trik po Iv funkční enzym podle tohoto dos ta icčnou připojen k vynálezu. Způsohv syntetizováni dostatečně afinitníeh kolon

V i z např. Axén a kol., Nátuře, 214:1302-1304, jsou dobře známy 1967 .

S výhodou rezistentní vůči vyluhování použitých v krocích (d) a patří bovinní trypsinový je afi ni tni 1 igand vybrán tak, aby byl polyfunkčním eznymem za podmínek (e) Mezi takové afinitní ligandy inhibitor. Použití takového inhibitoru, popřípadě kroků (g) a (h) je obecně méně důležité

Údaje o izolování a parciálních sekvencích u hydrolas různých ryb nebo korýšů byly již publikovány. V Tabulce 1 jsou uvedenv takové odkazy.

Tabulka 1: Odkazy týkající se sekvencí

Penaeus vanamelii 1
	Uváděná sekvence	Van Wormoudt » kol.. Comp Biochem. Physio!., 1038: 675-680. 1992 and Sellos and Wormhoudt, FEBS. 39: 219-224. 1992.
Uváděné aktivity	chymotryptická
Zdánlivá MW	25kd
Panaeus vanameii 2
! i	Uváděná sekvence	Van Wormsudt * kal.. Comp Biochem. Physio!.. 103B: 675-680. 1992.
Uváděné aktivity	cbýfiíutrypticka ttryptická7
Zdánlivá MW	25kd
| Panaeus monadon tryptic (garnát)
i I i i I	Uváděná sekvence	tu a kel.. Bioi. Chem. Hoppe-Seyier, 371: 851-859. 1990.
Uváděné aktivity	tryptická
Zdánlivá MW	27kd
pH optimum	7.4 - 8.0
Pi	í, 2.4
l Penaeus monodon chYmoiryptic - 1 (gamát)
	Uváděná sekvence	Tsaia kol.. Biochem et Biophys. Acta. 1080: 59-67, 1991
Uváděné aktivity	chymotryptická kolagenasová
Zdánlivá MW	27-28kd
Panaeus monodon chymotryplic - 2
	Uváděná sekvence	Tsai a kal., Biochem. et Biophys. Acta. 1080: 59-67. 1991
Uváděné aktivity	chymotryptická kolaaenasová
	Zdánlivá MW	25-26kd
Uca pubilator (krab) l
	Uváděná sekvence	Tsai a kol., Biochem. et Biophys. Acta. 1080: 59-67. 1991
Uváděné aktivity	chymotryptická
Zdánlivá MW pH optimum	25kd 8.0 - 8.5
Uca pugilator II
	Uváděná sekvence	Grant «JraL. Biochemistry. 19: 4653-4659, 1960.
Uváděné aktivity	chymotryptická kolagenasová tryptická elastasová
Zdánlivá MW	25kd
piu	8.0 - 8.5
Kamčatský krab (alespoň čtvři proteasy)
	Uváděná sekvence	GrBnt a k.t. Biochemistry. 22: 354-358, 1983
Uváděné aktivity	tryptická kolagenasová
Zdánlivá MW	23-26kd
Rak proteáza

Sekvence prvních 25 aminokyselin polyfunkčního enzymu pocházejícího z drobného korýšovitého planktonu je I-V-G-G-N/M-E-V-T-P-H-A-Y-P-(V)-O-V-G-L-F-I-D-D-M-Y-F (SEQ ID NO. 1). Závorky indikují slabou regeneraci 14. aminokyseliny a N/M znamená heterogeni tu v 5. pozici . Porovnání N-term i načnich 20 až 25 aminokyselinových sekvencí různých serinových hydro1 as je uvedeno v Tabulce 2.

·· · ·· ······ • · · ······ • · · · · •·· ······· ·· ·

Tabulka 2: N-terminační sekvence

Druh	Sekv. ID č.	Sekvence
Penaeus vanameii 1 (garnát)	3	IVGGVEATPHSWPHQAALFIDDMYF
Penaeus vanameii 2	4	IVGGVEATPHSXPHQAALFI
P. monodon, trypt. (garnát)	5	IVGGTA VTPGEFPYQLSFQDSIEGV
P. monodon, chym. 1	6	ivggveavpgvwpyqaai.fi IDMYF
P. monodoa, chym. 2	7	IVGGVEAVPHSWPYQAAI.fi. IDMYF
Uca pugilator I (krab)	. 8	IVGGVEAVPNSWPHQAALFIDDMYF
Uca pugilator II	9	IVGGQDATPGQFPYQLSFQD
Krab král.	10	IVGGQEASPGSWP7QVGLF
Krab kamčatský	11 12 13 14	IVGGQEASPGSWPXQVGLFF IVGGTEVTPGEIPYQLSLQD IVGGTEVTPGEI PYQLSFQD IVGGSEATSGQFPYQXSFQD
Rak	15	IVGGTDATLGĚFPYQLSFQN
Enzym z drob korýš, plank'	1 :. 2	IVGGNEVTPHAYPWQVGLFIDDMYF IVGGMEVTPHAYPWQVGLFIDDMYF
Bovinní chymotrypsin	16	IVNGEDAVPGSWPWQVSL Q D
Losos Atlant.třesk AtMská	18 1 19 20	IVGGYECKAYSQAYQVSLNSGYHYC IVGGYECTKHSQAHQVSLNSGYHYC IVGGYECTRHSQAHQVSLNSGYHYC

neznámo nebo nedefinováno

Proč. Nati. Acad. Sci. Bio Techniques, 3:208,

Odborníkům je zjevné, že enzym může být vyroben rekombinantními způsoby. Například sekvence uvedené zde, mohou být použity jako báze o 1 igonuk1eoitidových zkoušek na vyšetření exprese nebo genomových knihoven pro izolaci kompletní struktury genu. Viz např. Suggs a kol

USA, 78:6613, 1981 nebo Beret a kol.

1985. Alternativně mohou být známé proteinové sekvence použity pro designování primérů pro použití v amplifikaci založené na PCR nebo nukleové kyseliny kódující polyfunkční enzym. Viz obecně Molecular Colning: A Lahoratory Manual, druhé vydání,

Cold Spring Harhor, 1989 a PCR Protocols, A Guide Methods and Applications, vydáno Michaelem a kol., Academie Press, 1990. Jednou plně identifikované, mohou tyto strukturní geny být editovány a vhodně vloženy do exprese vektorů způsoby, jež jsou známy v dané oblasti techniky.

Tyto strukturní geny mohou být změněny mutagenními metodami jako je popsáno v Adelman a kol., DNA, 2:183, 1983 nebo přes použití řetězců syntetických nukleových kyselin. Tyto produkty genových mutentů mohou být testována na polyfunkční enzymovou aktivitu. Výhodné jsou konzervativní mutanty. Mezi tyto konzervativní mutanty patří ty, jež mohou působit na orientaci aminokyselin, (na jinou z následujících) což se týká těch, jež jsou uvedeny v této skupině:

1. Malá alifatická, nepolární nebo málo poLární rezidua: Ala, Ser, Th r, Pro a Gly,

2. Polární, negativně změněná rezidua a jejich amidy: Asp, Asn, Glu a G1 η,

3. Polární, pozitivně změněná rezidua: his, Arg a Lys,

4. Velká alifatická, nepolární rezidua: Met, Leu. Ile, Val a

Cys, a

5. Aromatická rezidua: Phe, Tyr a Trp.

Seznam výhodných konzervativních substitucí je následující:

• » · · · « * * · • · · · • · ·· ·

Původní reziduum	Substituce
Ala	Gly, Ser
Arg	Lys
Asn	Gin, His
Asp	Glu
Cys	Ser
Gin	Asn
Glu	Asp
Gly	Ala, Pro
His	Asn, Gin
Ile	Leu, Val
Leu	Ile, Val
Lys	Arg, Gin, Glu
Met	Leu, Tyr, He
Phe	Met, Leu, Tyr
Ser	Thr
Thr	Ser
Trp	Tyr
Tyr	Trp, Phe
Val	Ile, Leu

·· ·· ·· ···· • · r · • * · • ·

Typy vybraných substitucí mohou být založeny na analýze frekvencí aminokyselinových substitucí mezi homologickými proteiny různých druhů vyvíjených podle Schulze a kol., Principles of Protein Structure. Springer-Verlag, 1978, str. 14-16. na analýze strukturu formujících potenciálů vyvinuté Chou a Fasmanern, Biochemistry 13, 211. 1974 nebo na jiných způsobech, jež jsou uvedeny v práci Schulze a kol., Principles in Protein Structure, Springer-Ver1ag. 1978, str. 108-130. a na anylýze vzorků hydrofob ici ty v proteinech, kterou vyvinul Kyte aDoolittle, J. Mol. Biol. 157:10-132. 1982.

Klinické testy u pacientek trpících poporodními hemoroidy ukázaly, že 1 ml hydrogelů (z příkladu IF) obsahující 500 mikrogramu/m1 hydrolasy získané z drobného korýšovitého planktonu z příkladu 1C aplikovaného na hemoroidy třikrát denně je účinné k vyléčení hemoroidů během dvou dnů, a obvykle během jednoho dne.

Pří porovnání sledování léčení pacientů trpících genitálním herpes se ukázalo, že 1 ml hydrogelů (z příkladu IF) obsahující 500 mikrogramů/m1 hydrolasy z drobného korýšovitého planktonu z příkladu 1C aplikovaný třikrát denně je má hojivý účinek na boláky z vypuknutí herpes během 5 dnů. U pacientů léčených plaeebo trvá tato doba 12 dnů. U pacientů léčených hydrolasou bolest a svedeni pomine během 36 hodin, zatímco tyto symptomy vrcholí vrchol i ve 3 nebo 4 dnech u sledování plaeebo.

•Klinické testy s pacienty s HIV trpícími potížemi s orální cand i da ukázaIv. že pas tílky (z příkladu 1H) obsahuj í ci 3 mg hydrolasy z drobného korýšovitého planktonu z příkladu 1C aplikované třikrát denně způsobí vymizení infekce během 7 až 9 dnů.

Klinické testy s pacientkami trpícími reeidivující vaginální kartd i dózou, která je rezistentní vůči tradičním antifungálním lékům, ukázaly, že i ml hydrogelů (z příkladu IF) obsahující buď 100 m í k rogramťi .'m I nebo 250 m i k rogramů/ml hydrolazy pocházející z drobného korýšovitého planktonu z • ·

• · • · • · · · • · • A ς příkladu 1C aplikovaného třikrát denně způsobí vymizení candida v průměru během čtyř dnů a sníží se výskyt recidivy.

Lokální vůči methicinu rezistentní Staphylococcus aureus (MRSA) infekce charakterizovaná nekrotickou tkání, erythematóznímí a spodními tkáněmi, které jsou zduřelé a edematózní a působí na 100 cm povrchu se ošetřuje aplikováním 3 ml hydrogelu (z příkladu IF) obsahujícího 500 mikrogramů hydrolázy pocházej ící z drobného korýšovitého planktonu z příkladu 1C třikrát denně. Po aplikaci se infekce pokryje obvazem. Po třetím ošetření druhý den se odstraní veškerá nekrotická tkáň a z postižené tkáně vyteče zánětlivá tekutina. Pátý den edém ustoupí. Po sedmém dnu se rána ze 40 % zavře a kultura MRSA je negativní. PO devátém dnu je rána ze 75 % zahoj ená.

Výhodným zdrojem polyfunkčního enzymu je drobný korýšovitý plankton, aniž by platilo omezení drobného korýšovitého planktonu rodu Euphasia (jako je superba, crystallorphias, frigida, triacantha, vellantini, lougirostris, lucens, similis, spinifera, recurva apod.), Meganyctiphanes (jako je norvegica apod.) a Tysanoessa (jako je macurura, vicina, gregaria apod.)

Dále jsou uvedeny příklady, jež mají blíže ilustrovat tento vynález, avšak nijak neomezují jeho obsah ani rozsah vynálezu. Ačkoli se ve všech příkladech používá polyfunkční enzym pocházející z drobného korýšovitého planktonu (tj. polyfunkční hydroláza z drobného korýšovitého planktonu), lze použít i jiné polyfunkční enzymy.

• · · · · · • · • · · · ·

Příklady provedení vynálezu

Příklad IA

Polyenzymový preparát

Zmrazený drobný korýšovitý plankton se rozmrazí a homogenizuje. Přidá se stejný díl destilované vody obsahující 0,02 % (hmotnost/objem) azidu sodného a směs se míchá po dobu 6 hodin při teplotě 4 °C. Poté se Supernatant sesbírá pomocí odstřeďování. Supernatant se zbaví tuku přidáním ethylacetátu a mícháním po celou noc při teplotě 4 °C. Ethylaeetatová vrstva obsahující tuk se pak dekantuje a vodný extrakt se odpaří tak, aby se odstranil ethylacetát. K extraktu se přidá síran amonný do 60 % saturace při teplotě 4 °C a směs se míchá po celou noc. Odsolená sraženina se izoluje odstředěním. Sraženina se rozpustí ve fosforečnanenm pufrovaném fyziologickém roztoku (PBS, 0,05M fosforečnan sodný, pH 7,4, 0,05M chlorid sodný) a dialyzuje (použije se odřezek 10 kd molekulové hmotnosti) vzhledem k PBS.

Znovurozpuštěná sraženina se aplikuje na filtrační kolonu se zesífováným agarosovým gelem (Sephacryl 200, Pharmacia, Sveden) a frakce vykazující absorbanci při 280 nm se zkoumají na proteolytickou aktivitu. Spojené proteolyticky aktivní frakce se nashromáždí a lyofilizují se. Tímto způsobem se z antarktického drobného korýšovitého planktonu izoluje póly-enzymový preparát obsahující šest pásů molekulových hmotností (pomocí SDS PAGE) v rozmezí od 24 do 34 kd. Pro skladování se lyofilizovaný prášek z tohoto preparátu ukládá do ampulí o 25 kaseinových jednotkách na ampuli.

Příklad 1B

Příprava polyfunkčního enzymu pocházejícícho z drobného korýšovitého planktonu

Polyenzymový preparát připravený tak, jak je popsáno v příkladu 1A se znovu aplikuje na kolonu Sephacryl 200. Izoluje se frakce, která je v podstatě homogenní a prokazuje zdánlivou molekulovou hmotnost 29 kd. Tato frakce se použije k proteolytické zkoušce popsaně níže na polyfunkční aktivitu. Lyofilizát polyfunkčního enzymu pocházejícího z drobného koryšovítého planktonu se uloží do ampulí po 15 kaseinových jednotkách na ampuli ke sterilnímu skladování bez konzervačních látek nebo antimikrobiálních aditiv.

Příklad 1C

Purifikace polyfunkčního enzymu

100 kg zmrazeného antarktického drobného koryšovítého planktonu se rozmrazí, smíchá se se 100 kg destilované vody a míchá se po dobu 30 minut. Použitý drobný korýšovitý plankton pochází z doby výlovu mezi lednem a březnem. V tomto období je drobný korýšovitý plankton bez pigmentu, tzv. bílý drobný korýšovitý plankton. (Vzhledem ke změně potravy je v pozdějším období vylovený drobný korýšovitý plankton označován jako červený. Výtěžky polyfunkční hydrolázy získané z červeného drobného korýšovitého planktonu bílého drobného korýšovitého jsou o 30 až 40 planktonu. V odstřeďováním za dostupná od firmy % mzsi nez z období ještě pozdějším, během června až srpna je výlovek tzv.: černý drobný korýšovitý plankton. Z černého drobného korýšovitého planktonu se získává ještě méně enzymu.). Supernatant se shromáždí použití GL-síta, centrifuga Model 220, G. Larssons Mekaniska Verkstad, Fjalkinde,

Švédsko, za použití kužele o 125 mikronech při rychlosti 1000 otáček za minutu. Hodnota pH supernatantu se upraví na 6,2. Supernatant má zákal menší než 4 % a obsah tuku nižší než 2 %.

Supernatant, 100 ml, se dále pročišťuje a projasňuje za pomoci odstřeďování při 17000 xg a míchá se s 5 kg gelu

DEAE-sepharose (Pharmacia, Švédsko), jež se předem upraví na pH 6,2. Směs se mírně míchá po dobu 1 hodiny. Gel se pak shromáždí na filtrační přepážce a promývá se 5 objemy 0,5M NaCl. Gel se pka ukládá do vhodného kolonového zásobníku za použití 0,4M NaCl fyziologického roztoku. Kolona se pak po celo noc promývá 15 obj emy 0,4M NaCl vzhledem k přepážce.

Frakce obsahující protein (shromáždí se 1,5 1) se desorbuje z gelu roztokem 0,6M NaCl. Tato frakce obsahuje proteiny s relatiní molekulovou hmotností v rozmezí od 10 kd do 90 kd, jak je určeno podle SDS-PAGE. Obsah proteinů je 20 g/1, jak je zjištěno podle absorbance při 280 nm. Proteinová frakce se filtruje přes sterilizovaný 0,20 mikronový filtr a aplikuje se na afinitní kolonu obsahující sojový trypsinový inhibitor připojený na agarosu (200 ml gel:inhibitor 3:1). Afinitní gel filtrační přepážce) ÍM NaCl. Polyfunkční enzym se desorbuje z gelu pomocí 0,2M citrátu sodného, pH 3,0. (Při paralelních způsobech se připravují ekvivalentní praparáty polyfunkčního enzymu za použití buď 0,5M TRIS-HC1, pH 8,0 nebo 0,ÍM amonného roztoku, pH 11 k desorbování polyfunkční hydrolázy). Výtěžek polyfunkčního enzymu je 100 mg.

U preparátu polyfunkční hydrolázy se upraví pH na 7,4 a aplikuje se na 200 ml agarosový afinitní gel, který se přidává před preparací polyfunkčního enzymu (substituční poměr gel:enzym 6:1).

Purifikovaný preparát polyfunkční hydrolázy se homogenizuje pomocí SDS-PAGE. Purifikovaný preparát se pak na sterilizovaném filtru filtruje a rozděluje se do pro injekčn použití, poté se suší vymrazováním. Takto upravený preparát je stabilní při skladování při teplotě 4 °C.

gelu, substituční poměr se promývá 4 objemy (vůči

Příklad ID

Charakterizace proteinu

- 45 Polyfunkční hydroláza pocházející z drobného korýšovitého planktonu se purifikuje podle protokolu popsaném v příkladu ÍC. připraví se tři preparáty polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu. Tyto tři praparáty se liší pouze v tom, že se polyfunkční hydroláza pocházej ící z drobného korýšovitého planktonu eluuje z trypsinového inhibitorového gelu s pufrem (tlumivým roztokem) při pH 3, pH 8 a resp. pH 11. Tyto preparáty se označí jako Prep-3, Prep-8“ a Prep-11. preparáty se rozpustí ve vodě na koncentraci 6 mg/ml.

Vzorky každého z preparátů se anylyzují pomocí SDS-PAGE a každý preparát obsahuje jednoduchý protein, který se projevuje u pásů v pásmu zdánlivé molekulové hmotnosti 29 kd. SDS pásy jsou elektricky odsávány až k PVDF membráně a sekvenovány pro 25 cyklů Edmanovy degradace. Viz Matsudaira, J. Biol. Chem., 262:10035-10038, 1987. Každý ze získaných preparátů má identickou sekvenci:

I V G G M/N EVTPHAYPVQVGLFIDDMYF.

Je tedy zřejmé, že všechny tři preparáty jsou homogenní, ačkoli je každý mikro-heterogenní v poloze 5. Proteolytická aktivita každého z těchto tří preparátů se testuje proti substrátu benzoyl-val-gly-arg-p-nitroanilin. Hydrolýza těchto substrátů může být monitorována při 210 nm, reflektováním uvolňování p-nitroanilinu. Závislost PH těchto tří preparátů a iontové síly 0 , ÍM ukazuje obr. 9. Profily u Prep-3 (znázorněno vyplněnými čtverečky), Prep-8 (znázorněno prázdnými kosočtverečky) a Prep-11 (znázorněno plnými kosočtverečky) jsou identické. U všech tří je optimum pH pro uvedený substrát 9,5.

S elastasovým substrátem sukcinyl-p-ala-p-nitroanilid a boc-ala-ala-pro-p-nitroanilid je pro Prep-8 optimum pH 7,0. Viz profil na obr. 9, reprezentovaný X . Podobné studie modelů substrátu ukazují, že pro účinné štěpení u polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu platí, že chymotrypsin-trypsin-elastasa.

U substrátu azokaseinu je závislost PH široká a to v kyselé oblasti pH. Viz profil na obr. 9, označený prázdnými trojúhelníčky.

Hodnoty K_m se určují za použití benzoyl-pal-gly-arg-p-anilidu v O,1M v CASP pufru obsahujícím 2 mM Ca⁺⁺ při pH 9,5. Hodnoty pro Prep-3, Prep-8 a Prep-11 jsou 210 + 8,210 + 8 a popř. 230 + 13 mikroM. Proti substrátu sukcinyl-ala-pro-phe-p-nitroanilid, za stejných podmínek, jsou hodnoty K_m 260 + 50, 270 + 50 a popř. 270 + 40 mikroM.

Účinnost tří proteázových inhibitorů se testuje při pH 9,5 proti třem hydrolázovým preparátům. Výsledky jsou následující:

Proteázový inhibitor	Prep-3	Prep-8	Prep-11
(zbytková aktivita, % )>
Antipain (1 pM)	2	5	5
Chymostatin (1pM)	0	0	0
tJovinm pankreatický trypsinový inhibitor (1 pM)	2	1	1

Účinnost jiných proteázových inhibitorů proti Prep-8 se testuje v 0,lM tris-HCl pufru při pH 7,5. Jako substrát se použije benzoyl-val-gly-p-nitroanilid (ARG-p-NA) a sukcinyl-ala-pro-phe-p-nitroanilid (Phe-pNA). Výsledky jsou následuj ící:

Substrát : Inhibitor:	Phe-pNA	Arg-pNA
(zbytková aktivita, %)
Phosphoramidon (10 pM)	94	87
Elastatinal (10 pM)	100	100
Eglin C fragment (8.4 pM)	100	Not doně
Anti-Thrombin III (0.2 pM)	2	4
σ-anti-chymotrypsin (0.2 pM)	1	7
σ-proteázový inhibit{0.2 pM)	0	0

Alikvotní podíly roztoku Prep-8, s nominální koncentrací 6 mg/ml se titrují proti bovinnímu pankreatickému trypsinovému inhibitoru, alf a-^-antichymotrypsinu, alfa-proteázovému inhibitoru a sojovému trypsinovému inhibitoru. Výsledky jsou na obr. 10. Profil 1 je pro titraci bovinního pankreatického trypsinového inhibitoru testovaného při pH 9,5 za použití banzoyl-val-gly-arg-p-nitroanilidu jako substrátu, pro profilž, je pH 7,0 a použitý substrát je sukcinyl-ala-ala-pro-phe-p-nitroanilid. Podobné profily byly získány s alfa-antichymotrypsinem, alfa-proteázovým inhibitorem a sojovým trypsinovým inhibitorem. Tyto křivky lze použít pro zjištění pro inhibitor a účinnou koncentraci polyfunkční hydrolázy.

Příklad IE

Hydrogelový preparát

Polyfunkční s hydrolyzovaným obsahuj ící 90 % enzym se míchá s škrobem s nízkou vody a to způsoby, hydrogelem molekulovou známými v při praveným hmotností dané oblasti techniky pro získání hydrogelové formulace enzymu.

Příklad IF

Hydrogelový preparát

Polyfunkční hydroláza podle příkladu IB se míchá s hydrokoloidním gelem obsahujícím vodný gel, který obsahuje 0,8 % (hmotnost/objem) Carbopolu^rn (Dow Corning, Midland, Michigan) TM a 23,5 % (hmotnost/objem) glycerinu před použitím. (Carbopol¹ je vinylovy polymer s aktivními karboxylovými skupinami, jak je popsáno v Chem. Eng. News 36:64 (1958)).

Příklad IG

Hydrogelový preparát polyfunkční enzym podle příkladu IC se míchá s hydrokoloidním gelem obsahujcícm vodný gel, kteý obsdahuje 0,8 % (hmotnost/objem) Carbopolu™ (Dow Corning, Midland, Michigan), 23,5 % (hmotnost/objem) glacerinu a 10 % (hmotnost/objem) Pluronic P85 TM použitím. (Carbopol¹ je karboxylovými skupinami. Chem.

(BASF, Vyandotte, Michigan) před vinylový polymer s aktivními Eng. News 36:64 (1958).)

Příklad 1H

Pastilkový preparát

Pastilky obsahující 3 nebo 6 mg polyfunkčního enzymu podle příkladu IC se utvoří z 50 % laktosy, 20 % Avicelu (mikrokrystalická celulosa), 29 % sacharózy a 1 % stearatu hořečnatého.

Příklad 2

Proteázová aktivita

Polyfunkční enzym se porovnává s izolovanou polyfunkční proteázou z drobného korýšovitého planktonu podle molekulové hmotnosti, sekvence, teplotní nebo pH stability, optima pH nebo pH a proteolytické aktivity.

Příklad 2A

Specifičnost

Ke studiu proteolytické aktivity se použijí následující substráty:

Substrát Typ aktivity

Sukcinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-pNC^anilid Chymotrypsinová

Boc-Ala-Ala-Pro-Ala-pNC^anilid Elastasová

Benzoyl-Val-Gly-Arg-pNO₂anilid Trypsinová

Tyto substráty se použijí k měření proteolytických aktivit polyfunkčního enzymu podle příkladu ID. Viz Biochemical J., 185:423-33, 1980, J. Biol. Chem., 269:19565-19572, 1994. Tyto studie obsahují měření K_m a K_cajPříklad 2B

Exo peptidasová aktivita

Polyfunkční hydroláza z drobného korýšovitého planktonu purifikovaná jako je uvedeno v příkladu 1B (1 mg) se rozpustí v 5 ml pufru spolu s 1 % (hmotnost/objem) bovinního kaseinu a inkubuje se při teplotě 20 °C po dobu 24 hodin. Pufrem ÍM je fosfát sodný, pH 7,5. Po 24 hodinách se přidá 10 % kyseliny trichloroctové ke srážení proteinů přítomných v roztoku. Shromáždí se suprnatant a nechá se reagovat s ninhydrinem. Ninhydrin se použije z 2%ního roztoku v 3:1 DMSO.4M aceatat lithný, pH 5,2, jak uvádí dodavatel, Sigma Chemical, Co., St. Louis. Zreagovaný supernatant se aplikuje na kolonu se zesífováným akrylamidem (Biorad P-2, Bio-Rad, Hercules, CA) k oddělení reagujících aminokyselin od reagujících peptidů. Koncentrace aminokyselin v aminokyselinové frakci se určí z absorbance při 820 nm. 1 % roztoku nespotřebovaného kaseinu se zpracuje stejným způsobem jako srovnávací podíl. Srovnávací podíl má absorbanci nižší než 0,01, zatímco aminokyselinová frakce u spotřebovaného podílu se projevuje při absorbanci 0,28 (při ekvivalentních zředěních).

Příklad 2C Optimum pH • · • · · ·

• · ·

Polyfunkční enzym se testuje na proteolytickou aktivitu proti různým substrátům v roztocích majících rozmanité hodnoty pH mezi 4 a 10 pro stanovení optima pH proti danému substrátu, za použití podmínek s pufrem, jak je známo v dané oblasti techniky. tato optima lze srovnat s odpovídajími optimy pro polyfunkční hydrolázu z drobného korýšovitého planktonu.

Příklad 2D

Proteázové inhibitory

K porovnávání různých kandidátů polyfunkčních enzymů se používá účinnost různých proteázových inhibitorů. tyto inhibitory jsou alf a-^-proteázový inhibitor, alfa^-antichymotrypsin, anti-thrombin III, alfa2~makroglobin, bovinní pankreasový proteinový inhibitor, a sojový proteinový inhibitor. Podmínky pro provádění takových studií jsou popsány v příkladu ID. Tyto inhibitory jsou dostupné od firmy Sigma Chemical Co., St. Louis, MO. Hodnoty K- jsou určovány v roztocích o různém pH za použití proteázových substrátů, mezi něž patří TAME, Benzoyl-Val-Gly-Arg-p-Ní^-anilid,

Sukcinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-NC^-anilid,

Boc-Ala-Ala-Pro-Ala-p-N02-anilid a azokasein.

Příklad 3A

In vitro vazebnost HL60 buněk na endotelové buňky

Endotelové buňky se nejdříve dají na očkovací plotny o 96 jamkách při dané koncentraci. Endotelové buňky použité při exoerimentu jsou popsány v publikaci Edgell a kol., Proč. Nati. Acad. Sci. USA (1983) 80:3734. Buňky se inkubují při teplotě 37 °C v DMEM buněčné kultivační půdě obsahující 10 % fetálního telecího séra a pod atmosférou s 5 % CC^. Poté se médium odstraní a nahradí se 100 mikrolitry suspenze 200000 HL60 buněk (lidská lymfocytová buněčná linie, dostupné z European Cell Culture Bank pod ECACC Accession No. 85011431) v RPMI médiu obsahujícím 10 % fetálního telecího séra. Buňky se inkubují po dobu 30 minut. Potom se médium odstraní a adherentní buňky se dvakrát promyjí médiem DMEM. Relativní adherence HL60 buněk se stanovuje měřením diference u optické hustoty při 450 nm mezi plotničkami se spoluinkubovanými buňkami a plotničkami se samotnými endotelovými buňkami.

Vliv TNFalfa se měří přidáním TNFalfa při 1500 jednotek/ml k endotelovým buňkám 4 hodiny před inkubací s HL60 buňkami. Vliv protilátek vůči E-selekci se měří přidáním 25 mikrogramů /ml monoklonální protilátky BBAZ (RandD Systems Europe, Oxford, England) k HL60 buňkám. Výsledky experimentů j sou:

,Fxperimenl	HL6O buňky	Endotel. buňky	Absorbance*
1	žádné zpracování	žádné zpracování	0,324
2	žádné zpracování	předzpracováno s TNFff	0.444
3	přidáváno za přít. mAb s E-selekcí	předzpracováno s ΤΝΕσ	0.357

+ zvýšení nad absorbanci endotelových buněk

Vlivy polyfunkční hydrolázy drobného korýšovitého planktonu na tento systém se stanovuje:

(1) měřením vlivu přídavku k endotelovým buňkám 92,3 mikrogramů/ml polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu (připravené jako v příkladě IC) spolu s HL60 buňkami, (2) po předzpracování endotelových buněk s TNFalfa po dobu 2 hodiny, se přidá 92,3 mikrogramů/ml polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu a inkubování po dobu 2 hodiny před přidáním HL60 buněk, nebo • · · · (3) předzpracování HL60 buněk s 92,3 mikrogramů/ml polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu před zpracováním se přidávají HL60 buňky k endotelovým buňkám na kultivačních plotničkách.

Experiment č.	HL60 buňky	Endotel. buňky	Absorb- ance*
4	polyfunkční enzym přidav. současně s buňkami	předzpracováno s TNFa	0.425
5	žádné zpracování	4 hodiny předzpracování 0-4h TNFa 2-4h polyfunkční enzym	0.247
6	předzpracováno s polyfunkčním enzymem po 2 hodinách	předzpracováno s TNFa	0.160
7	předzpracováno s polyfunkčním enzymem po 2 hodinách	4 hodiny předzpracování 0-4h TNFa 2-4h polyfunkční enzym	0.059

+ zvýšení nad absorbanci endotelových buněk

K potvrzení těchto výsledků se stanovuje počet adherovaných HL60 buněk po jejich odstranění z kultivačních plotniček jejich počítáním. Počet HL60 buněk se určuje odečtením počtu buněk u kontrolních plotniček majících pouze endotelové buňky. Tyto výsledky počítání odrážejí výsledky optické hustoty:

EXPERIMENT	HL60 - počet buněk
1	32,590
2	43,990
3	35,730
4	42,190
5	25,280
6	17,010

·· · ·· ······ • ···· ·· · • · · · · * • · · ··«···

Tyto studie adherence ukazuj i, že hydroláza z drobného korýšovitého planktonu rozrušuje ligand buňka-povrch a akceptorové molekuly, které usnadňují adhezi buněk.

Příklad 3B

Aktivita vůči určitým buňka-povrch adhezním molekulám

Čerstvě izolované T-buňky z brzlíku C57BL/6 myši (pěstovány v Institut Armaud Frappier) se třikrát promyji prostředkem bez séra. Zpracuje se 1 ml podílu obsahujícího 5 až 10 χ 10⁶ buněk při teplotě 37 °C po dobu 4 hodiny s 0, 100 nebo 500 mikrogramů/ml polyfunkční hydrolázy pocházející z drobného korýšovitého planktonu, připravené podle příkladu IB, jež se rozpustí v prostředku bez séra. Získané buňky se značkují jednou z fluorescentních protilátek, jak je níže identifikováno:

Protilátka	Zdroj
CD4-PE	Boebringer Mannheim. LaVal, Quebec
CD8-Red613	GIBCO, Long Island, New York
ICAM-1	PharMingen, San Diego, CA
ICAM-2	PharMingen, San Diego. CA
CD44	PharMingen, San Diego, CA
H-2K	PharMingen, San Diego, CA

Množství vazebné protilátky se určuje za použití fluorescenčně aktivovaného druhu buňky. Z výsledků je patrné, že pořadí citlivosti vůči inaktivaci nebo odstraňování hydrolázou je CD4, CD8<ICAM-2< CD44<ICAM-1<Η-2K. Za použití stejných způsobů s vhodnými buňkami, přičemž jsou obsaženy endotelové buňky, obsaženy jsou s-konce-1 endotelové buněčné linie (Kinashi a kol., J. Beukocyte Biol. 57:168, 1995) a T-buňky izolované z brzlíků C57BL/6 myší, přičemž je zjištěno, že VCAM-1, CD28, CD31 a asialo GM ceramídy markéry jsou sensitivní vůči hydroláze. Protilátky použité pro uvedené určování jsou:

Specií', protilátky	Zdroj
VCAM-1	PharMingen. San Diego, CA
CD28	PharMingen, San Diego, CA
CD31	PharMingen, San Diego, CA
asialoGMI	Wako Bioproducts, Richmond, VA

V některých případech je vazebnost delegována se značenou druhou protilátkou, například vazebnost asialo GM1 protilátky je delegována FITC-značenými Fab fragmenty, které jsou specifické pro králičí IgG (těžké a lehké řetězce), jež se získávají z Caltag Laboratories, San Francisco, CA.

Příklad 3C

Časový průběh zpětného získání adhezivních molekul

DO-11.10 T buněčné hybridy (tato buněčná linie je popsána

Shimonkevitzem a kol., J. Experimental Med. 158:303, 1983) se zpracují s 500 mikrogramy/ml polyfunkční hydrolázy pocházející

z drobného korýšovitého planktonu, připravené podle příkladu 1B a testované na CD4 markér jak je popsáno v příkladu 38. Bezprostředně po tomto zpracování bylo zj ištěno méně než 1 % z CD4 v porovnávacích vzorcích u buněk zpracovávaných pomocí hydrolázy. O 48 hodin později byla úroveň u zpracovávaných buněk stejná jako u nezpracovávaných buněk.

Příklad 4

Porovnání vazebnosti buněk

Účinnost různých členů skupiny polyfunkčních enzymů, tj. enzymů nepocházejících z drobného korýšovitého planktonu, které j sou alespoň z 60 % homologické s hydrolázou odvozenou z drobného korýšovitého planktonu, se porovnávají se získanými z drobného korýšovitého planktonu za použití HL60 zkoušky vazebnosti z příkladu 3A.

Příklad 5

Zpracování nádorových buněk vaječníků myší

25000 nádorových buněk vaječníků myší bylo injekčně vpraveno do břišní dutiny 12 C3H/hsd myši. Ve dnech 1, 2a každý z dnů 5 až 9, se injekčně podával 1 ml buď fyziologického roztoku nebo 200 mikrogramů polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu (připraveného tak, jak je popsáno v příkladu 1C) rozpuštěného ve fyziologickém roztoku. Na obr. 4 se uvádí zvětšení hmotnosti (jako indikace růstu nádoru) při působení fyziologického roztoku (tmavé kroužky) a působení hydrolázy (prázdné světlé kroužky) na myši. Na obr. 5 se uvádí procento zvířat, která přežila po dobu podávání fyziologického roztoku (křivka A) a podávání hydrolázy (křivka B) myším. U kontrolních myší docházelo ke tvorbě solidních nádorů, ale nikoli u myší ošetřovaných enzymem.

Nádorové buňky jsou izolovatelné od tekutiny z ascites u zkoušených myší. 25000 takových izolovaných nádorových buněk se injekčně vpraví do každé z 6 C3H/hsd myši. U kontrolních experimentů se injekčně vpraví stejné množství nezpracovaných myších vaječníkových nádorových buňek do C3H/hsd myši. U myší v kontrolní skupině se tvoří nádory, ale nikoli u myší, jež dostaly injekce s izolovanými buňkami.

Příklad 6A Toxikologie

Na oddlené skupiny samečků a samiček krys (Crl:CD(SD)BR kmen, Charles River LTd, Margate, UK, 5 krys na skupinu), se působí I.V. způsobem tak, že se podává 0, 0,5, 5 a 50 mg/kg na den polyfunkční hydrolázou pocházející z drobvného korýšovitého planktonu, připraveného podle příkladu IC po 7 dnů. Po sedmi dnech je výsledkem těchto dávek malý pokles hemoglobinu (HB), počtu červených krvinek (”RBC”) a objemu shluknutých buněk (PCV), jak ukazuje tabulka níže:

Skupina	Dávka	Pohl.	HB	RBC	PCV	MCV*	MCH*	MCHC*
1	0	M	14.8	6.79	44.3	65.4	21.8	33.4
		F	14.7	6.76	43.7	64.6	21.7	33.6
2	0.5	M	14.0	6.35	41.8	65.9	22.2	33.6
		F	13.8	6.12	40.5	66.3	22.5	33.9
3	5	M	13.8	6.25	41.1	65.8	22.1	33.6
		F	13.4	5.94	39.9	67.2	22.6	33.6
4	50	M	13.1	6.19	39.1	63.3	21.3	33.6
		F	13.0	6.01	38.8	64.6	21.7	33.6

MCV = střední korpuskulární objem

MCH = střední korpuskulární hemoglobin

MCHC = střední korpuskulární hemoglobinová koncentrace • * ·

Žádné z ošetřovaných zvířat neprokazuje žádné viditelné symptomy nemoci nebo nežádoucích reakcí.

Příklad 7

Toxicita u myší

Toxicita polyenzymového preparátu se testuje na myších s.c. imlantovaných P388 leukémií vyskytující se u myší (chemicky indukovaný nádor) a porovnávána s doxorubicinem, známým lékem proxi nárorům (označený jako DOX). Výsledky jsou shrnuty v následující tabulce. Žádná myš ošetřovaná polyenzymovým preparátem z příkladu IA nebo v kontrolní skupině nezemřela nebo neubyla na váze, přičemž skupina myší s doxorubicinem, kromě těch myší, které dostaly nejnižší dávku, ubyly na váze nebo zemřely. Nejvyšší dávka polyenzymového preparátu (20 mg/kg) byla mnohem vyšší než jakákoli z dávek, použitých při klinických testech, popsaných níže.

Toxicita polyenzymového preparátu a DOX, podáváno i.p. denně během 9 po sobě jdoucích dnů myším s P388 leukémií vyskytující se u myší

Lék

Uávka (mg/kg)

Smrt otravou

Tělesná hmotnost změna (9)

Porovnávací	0	0/6	+ 2.3
Preparát z póly-
enzymu z drobného	zu	0/6	+ 3.3
korýš, planktonu	10	0/6	+ 3.3
	5	0/6	+ 3.3
DOX	5	6/6	- 2.3
	2.5	6/6	- 0.6
	1.25	0/6	+ 0.5

Příklad 8A

Infekce u pooperačních chirurgických ran

Do této studie je zahrnuto čtyřicet pacientů, rozdělených do dvou skupin po 20 pacientech, přičemž je celkem zahrnuto 41 pooperačních abdominálních (34) a thoracických (7) ran. V každé skupině se testuje preparát polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu připraveného podle příkladu IB (3 kaseinové jednotky/ml) a polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu IA (5 kaseinových jednotek/ml). Enzymové roztoky se připravují z lyofilizovaných preparátů uložených v ampulích, jak je popsáno v příkladech IA a IB, které se k použití event. zředí fyziologickým roztokem.

Průměrný věk pacientů je 52 + 16 let a je mezi nimi 28 mužů a 12 žen. Enzymové preparáty se aplikují na rány dvakrát denně v množství 25 mg/ošetření. Během 5 dnů se všechny infekce dostávají na nižší než klinickou úroveň a všechny projevují znaky ústupu klinické infekce. Nebyl zjištěn žádný znatelný rozdíl mezi dvěma preparáty. Neprojevovaly se žádné nežádoucí reakce.

Příklad 8B

Infikovaná rána

Tříměsíční chlapeček byl operován na vodní kýlu (hydrokélu) přičemž došlo po deseti dnech po operaci k závažné infekci v místě chirurgického řezu. Infikovaná incize (řez) vylučovala hnis. U částí tohoto řezu mohlo po odstranění stehů dojít k prasknutí. Chlapeček byl dvakrát denně ošetřován po dobu 3 dnů obvazem, který byl nasáknut polyenzymovým preparátem z příkladu IA (4 mg na ošetření). Po 3 dnech ošetřování infekce odezněla a rána se zahojila.

Příklad 8C

Nekrotické pooperační rány pacientů s nekrotickými ranami se ošetřuje roztokem (3 kaseínové jednotky/ml) polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu ÍB. Rány se čistí oplachováním před aplikací polyfunkčního enzymu popsaného v příkladu ÍB, který se ředí 5 ml fyziologického roztoku a nalije se na obvazovou gázu, která se přikládá na celou ránu. Gázový obklad se fixuje na ránu pomoci samolepicích částečně upevněných obvazů. Každá změna obvázané rány se vizuálně kontroluje na erytém, edém, krvácení, opuchnutí, zvýšenou teplotu, výpotky, hnis, nekrotickou odumírající tkáň, bolestivost, pach, možné vedlejší reakce a celkový stav pacienta. Ošetřování se ukončí, když se rozloží všechny odumřelé části, fibrin, hnis a krevní sraženiny, avšak ne déle než po 7 dnech.

Pacienti jsou rozdílní z hlediska etilogie ran, tj. operace, trauma, poranění, popálení, dávkování a diabetes u pacientů. Všichni pacienti jsou ošetřováni dvakrát denně. Nebyly zj ištěny žádné nežádoucí účinky způsobené testovanými preparáty. Výsledky jsou shrnuty na obr. 12. Body označené symboly Y jsou pro žlutou fibrinovou a purulentní (zhnisanou) tkáň. Body označené symboly B jsou pro černou nekrotickou tkáň. Body označené symboly R jsou pro granulační tkáň a epitel. Nekrotické části, fibrin, hnis, krevní sraženiny, se účinně rozpadaj i během týdne a některé rány se hoj i v průběhu týdne. Popáleniny, a pooperační rány u diabetických pacientů je účinnost malá, ale na konci studie, 7 dnů, nekrotické části zcela odpadaj i a na novém povrchu tkáně se postupně rány hoj i během týdne.

• · · · · · • · * «····· • · · · ·

9 9 ·*«·*·· »« «

Příklad 9

Abscesy na lýtkách

Na zúženém místě obou lýtek se tvoří abscesy o 25 až 40 ml objemu injekcemi roztoku chloridu vápenatého. Abscesy se ošetřují jednou denně instilací 10 ml polyenzymového preparátu z příkladu IA (5 mg/ml) za použití drenážní trubičky. Pro každém ošetření se trubička s roztokem enzymu utěsní na místě po dobu nejméně 4 hodiny. Poté se trubička otevře a umožní se obvázání abscesu. Po třetím ošetření je kapalina z drenážní trubičky čistá a po šestém ošetření se trubička odstraní. Vyhojení je úplné po 9, resp. 12 dnech.

Příklad 10

Sklerodermie

Pacient trpí chronickým tvrdnutím a zbytňováním kůže, tj. sklerodermií na konečcích prstů na pravé ruce. Je ošetřován dvakrát denně aplikováním 0,5 ml hydrogelu (popsáno v příkladu IF) obsahujícím 0,5 mg/ml polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu IB. Bolest, která je spojená s tímto stavem se zmírňuje po 48 hodinách, a po třech týdnech se všechny praskliny zahojí. Ošetřování se přeruší na tři týdny. V průběhu následujících šesti týdnů nedochází k žádnému opakování výskytu uvedených obtíží.

Příklad 11

Profylaktické ošetření pooperačních řezů

Testuje se polyfunkční hydroláza z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu IB (1) a polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu z příkladu IA (2) proti sterilnímu 0,9%nímu kontrolnímu roztoku NaCl (3) jako • · · · · 9 antimikrobiálnímu oplachovacímu roztoku na pooperační řezy. V každé z ošetřovaných skupin je 20 pacientů.

Nekrvácej ící pooperační řezy se ošetřuj í dvakrát denně fyziologickým roztokem, polyfunkční hydrolázou (3 kaseinové jednotky/ml) nebo polyenzymovým preparátem (5 kaseinových jednotek/ml). Tyto pooperační rány se případně oplachují fyziologickým roztokem a pokrývají se sterilní gázou a částečně obvazem. Při každém opětovném obvázání se rána kontroluje na infekci, zánět, erytém, zduření, teplotu, nekrotickou tkáň, fibrin, hnis, krvácení, bolestivost a možné nežádoucí reakce.

K žádným pooperačním klinickým infekcím nedošlo ve skupině, ošetřované polyfunkční hydrolázou nebo polyenzymovým preparátem, ani nebyl zjištěn žádný akutní zánět nebo erytém u žádného pacienta v těchto dvou skupinách. U obou skupin ošetřovaných enzymovými prostředky, se zahojilo 18 ran (více než 90 % epitelizace) během 10 dnů ošetřování. Nebyly pozorovány žádné nežádoucí reakce. V kontrolní skupině došlo u 4 pacientů k vyvinutí závažné invazivní infekce a u dalších 2 pacientů došlo k akutnímu zánětu. U této skupiny byl často pozorován erytém, zduření a bolestivost, 14 ran se zahojilo během 10 dnů ošetřování.

Příklad 12

Spáleniny malého rozsahu

Do této studie je zahrnuto jedenáct pacientů s malými, plně ztluštělými spáleninami, infikovanými S. aureus a P. aeruginosa, a kteří nereagují na antibiotika a stříbrný sulfadizianový krém. 5 pacientů se ošetřuje polyfunkční hydrolázou z drobného korýšovitého planktonu jako hydrokoloidního krému jak je popsáno v příkladu 1F (3 kaseinové jednotky/ml) a 6 pacientů polyenzymovým preparátem z drobného korýšovitého planktonu z příkladu 1A v izotonickém fyziologickém roztoku (5 kaseinových jednotek/ml).

• · · · * ·

Rány se ošetřují dvakrát • ·

denně 25 mg/ošetření polyfunkční hydrolázou. U všech ran vymizely veškeré známky infekce během 5 dnů ošetřování. Vymizení infekce bylo potvrzeno kultivací mikroorganismu (MO). Nekrotická tkáň, hnis a fíbrinová vlákna v granulované tkáni byly účinně rozloženy oběma praparáty a nebyl zjištěn znatelný rozdíl mezi účinností praparátů. nebyly zjištěny žádné nežádoucí účinky.Výsledky testů jsou shrnuty v následující tabulce:

					- 63 -		• ♦ · • · · · • · « · • ·	• ·· ·· ···· • · · · · · · • · · « · • · «····· • · · ·
den zahojení jpo léčbě 1	m	-	Ό	i		MT	vo	O		oo	oo
-P Ή Q. ω N to o c •P CD C p to CD 1 1	O c-	o m	O Vi	o *n	O r-	O OO	O co	O	O oo	8	o
o m	8	O mí·	O VI	O m	o CM	s	s	O CM	c MT	O oo
O xd B -H CL <m 'rj tjý		O	O				o				O
1-< CO •CD ·Ρ □ C N JZ											t
> P to c
> r\ CD CD •LJ fll»^ co 1 CD C X OL	v	v	v	v	v	V	v	v	V	v	v
1 C 'P c o c to to Ώ □ >U	V-J m	o	o m	o	o 'TT	V} CM	o vo	o m	*n CM	vo co	o vo
preparát	o •P n o P	r—j to CD)	i—l to CD	ι—1 to CD	2ť O •P N O P	o -P N O P	rp to CD	.X o -P N O P	.X o -XJ N O P	rP to CD	J«L O •P N CD P
-P *r-j a ω
i—1 N to c O CD -Ρ p C 05 01
vizuální proci nekr. hnis f/fib	o CM	O *r		O *n			O	o CM		O MJ-	O -rf
8	O	8	O	8	8	o oo	O Ό·	8	O co	o co
o CM	8	o	O ''ď			O	O	O	O co	O *-o
ro > CD CD r-1 -p to Ό 1 to § ’k	O	oo	CM CM	-ΤΓ	• r-	Ό	V»	CM	Ό	r-	O CM
c to E Jť	tM3 «J Χί}ι·	oo C *j r» cu	V0 O V v_ □ tó	c*o •j π cC	V) □ O Z3 ti v>	Vl 73 O 73 n co	V» 7D O 73 n V0	tfcO V Λ cí	ΡΊ 73 U 73 rt co	CkO ce c_	tJD V Γ5 c_
•H • ω >o O z~ -X CN <3 -rM Ρ C r-H c ω u >	V~x	o •xr	<5 cn	CM >	OO CM >	O >	vn mt >	CM n >	oo X	<o X	X

Příklad 13

Infikovaný proleženinový vřed

Do této skupiny bylo zařazeno čtrnáct starších pacientů s celkem 18 proleženinovými vředy na patách nebo v dolní části zad. Vředy se oplachují fyziologickým roztokem a poté se oplachuj i 5 ml polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu z příkladu 1A, rozpuštěného ve fyziologickém roztoku (5 kaseinových jednotek/ml). Na vředy se pak přiloží částečně obvaz. Postup se opakuje dvakrát denně po 7 dnů a vředy se kontrolují na zánět, erytém, horečku, zduření, nekrotickou tkáň, hnis, bolestivost a možné nežádoucí reakce. Infekce ustala během 4 dnů ošetřování. Šest ran se zcela zahojilo během 7 dnů a celkem jedenáct ran se zahojilo během 14 dnů. Sedm ran se nehojilo vzhledem k celkovému zdravotnímu stavu pacientů, ale rány prokazovaly zlepšující se stav. Nebyly zjištěny žádné nežádoucí reakce.

Příklad 14 Fistulové infekce

Pro ošetřování anální fistule se použije hydroláza z drobného korýšovitého enzymu podle příkladu 1B a polyenzymový preparát z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu 1A. Před použitím se jedna ampule polyfunkční hydrolázy ředí 5 ml hydrogelu na finální koncentraci 3 kaseinové jednotky/ml. Polyenzymový preparát se ředí hydrogelem na finální koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml. Fistule se oplachují sterilním roztokem a poté se oplachují hydrogelem obsahujícím polyfunkční hydrolázou nebo polyenzymovým preparátem. Postup se opakuje pacienti se kontrolují na erytém, horečku, bolestivost a škodlivé nežádoucí účinky, pokračuje, dokud nevymizí všechny známky zánětu ale ne déle než 10 dnů. Každý gelový preparát j ednou denně a zduření, hnis, Ošetřování a infekce,

9 9 9 používají dva pacienti s anální fistulí nevedoucí do rekta, případně se používá ošetření polyfunkční hydrolázou a polyenzymovým preparátem. U obou skupin pacientů se dostavuje úleva od bolesti během 48 hodin a všechyn známky infekce a zánětu mizí během 4 dnů. Všechny fistule se hojí po 6 až 9 dnech, a během 6 měsíců nebyl pozorován žádný návrat léčených potíží.

Příklad 15

Dermatofýza nohou (epidermofýza)

Účelem této studie je zjišťování účinnosti polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu při ošetřování epidermofýzy nohou. Do této studie je zahrnuto 41 pacientů s plísňovou infekcí. Pacienti koupou nohy jednou denně po dobu třiceti minut po tři za sebou ve vodném roztoku obsahujícím 5 kaseinových jednotek polyenzymového preparátu z příkladu IA. Také se aplikuje hydrogel (popsaný v příkladu 1F) obsahující 5 kaseinových jednotek/ml polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu na postižená místa každý večer bezprostředně před spánkem po 7 nocí. U mnohých pacientů došlo k úlevě ihned a u dalších pacientů potíže zcela ustoupily během 2 dnů. Povlaky na povrchu, u ranek a pod nehty se působením polyenzymového preparátu snadno odstranily a všechny příznaky na povrchu, pach a infekce ustoupily po třech dnech.

Příklad 16A

Infekce předkožky

Infekce předkožky u dvou kojenců, májích 4a 6 týdnů, se ošetřuje dvakrát denně roztokem polyenzymového preparátu z příkladu IA obsahujícím 1 kaseinovou jednotku/ml. Ráno a večer se vyplachuje pod předkožkou 10 ml roztoku za použití • · · standardní injekční stříkačky s jemným katétrem. Po třech dnech byli oba kojenci bez příznaků a infekce se neopakovala po další dva měsíce.

Přiklad 16B

Infekce předkožky u psů

U šesti psů s infekcí předkožky bylo jednou denně prováděno vyplachování roztokem polyenzymového preparátu z příkladu IA obsahujícím 1 kaseinovou jednotku/ml. Jemný silikonový katétr připojený k injekční stříkačce se zavede pod předkožku a oplachuje se postižená oblast 10 ml polyenzymového roztoku. 1 ml roztoku se nechá pod přdkožkou minimálně 2 minuty a psovi se zabrání, aby si 30 minut nelízal postižené místo. Hnisavý výtok ustane během 2 dnů u všech případů a všechny známky infekce a zánětu ustoupí během 4 dnů.

Příklad 17A

Oportunistické infekce

Dvě pacientky s rakovinou dělohy ve stadiu IV s oportunistickými infekcemi v něhojících se pooperačních ranách a jedna pacientka s oportunistickou infekcí v ozařované ráně se dvakrát denně ošetřuj í obvazy, které j sou nasáknuty roztokem 5 mg/ml polyenzymového preparátu z příkladu IA. O infekcích se předpokládalo, že jsou to bakteriální infekce. Po 12, 14 a případně 17 dnech se rány zahojily.

Příklad 17B

Mykoplasmová infekce

Padesátipětiletý muž byl před 3 lety nakžen akutní

mykoplasmovou infekcí a ostrovan různými druhy antibiotik. Nicméně však toto léčení se stalo neúčinným, neboť se vyvinula rezistentní forma. Několik týdnů po infekci dostal muž vysokou horečku s velmi těžkým kašlem, způsobeným podle rentgenového vyšetření vodou u pohrudnice. Potíže muže ukazovaly na určitou formu repiračních potíží, kdy nemohl ujít 100 metrů, aniž by neměl pocit veliké únavy a těžký záchvat kašle.

Tento pacient byl oštřován 2 ml roztoku o 2 mg/ml (celkem 4 mg) polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu IB. Tento promývací roztok nalil do úst na 4 minuty a pak jej pomalu polykal. Toto léčení se opakovalo po první dva týdny každý druhý den. Během této doby inhaloval denně 0,5 ml aerosolu promývacího roztoku hydrolázy. V průběhu dvou týdnů nebylo pozorováno žádné zlepšení, ale po dvou týdnech léčeni otekla lymfatická žláza na levé straně krku. Během této doby léčení pokračovalo třikrát týdně (každý druhý den). Po 1,5 týdnu všechny problémy týkající se mízních uzlin ustoupily a bronchitické potíže pacienta začaly ustupovat. Po 3 týdnech léčení, kdy se ústa vyplachovala každý čtvrtý den, bronchitida zcela ustoupila. Po ukončení léčení, trvajícího 6,5 týdnů, se pacient uzdravil a po krátké době mohl jít 5 kilometrů bez obxíží.

Příklad 18 Vřídky u psů

Tři boxeři s bolestivými. krvácejícími vřídky mezi prsty denně polyenzymovým roztokem. polyenzymového preparátu z jednotek/ml) a poté se přiloží infikovanými a podebírajícímia u nohou jsou ošetřováni dvakrát Gáza se navlhčí 2 ml roztoku příkladu 1A (5 kaseinových na vřídek. Packa se zaváže tak, aby byla gáza upevněna na místě a aby se uchránil obvaz, byly přes něj navléknuty gumové holínky. Úleva od bolesti nastala po jednom dnu ošetřování. Podebírání a krvácení ustalo po dvou

dnech. Po 5 až ý dnech ošetřování byl zánět podstatně zredukován a po 11 až 15 dnech všechny příznaky, související s vřídky, ustoupily.

Příklad 19

Urinární krvácení a infekce močové trubice

Do této studie je zahrnuto dvanáct žen s bolestivými močovými infekcemi. Před vlastním použitím se zředí 6 ampulí polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu z příkladu 1A 5é ml fyziologického roztoku na finální koncentraci 3 kaseinové jednotky/ml. Na začátku léčení je první výtok u všech pacientek velmi kalný a druhý výtok čirý až slabě kalný. Pacientky byly dvakrát denně ošetřovány instilací 50 ml fyziologického roztoku . Úleva od bolesti je okamžitá a zlepšení schopnosti zadržovat moč je obvykle po dvou dnech léčení. Vzorky zkoumající přítomnost bakterií na mikroorganismy (MO) potvrzují, že nejsou přítomny žádné bakterie po 4 dnech léčby a celá léčba končí po 4 dnech. Nebyly zjištěny žádné nežádoucí reakce. Výsledky jsou shrnuty na obr. 6. Průměrné hodnoty MO-stavu jsou ukázány níže v tabulce.

	před léčením	den 2	den 4
MO-stav (průměr)	1.4 X 104	4.3 X 103	< 1.0 X 102
Relativní M0-stav: (% počátečního stavu)	100%	31%	1%

• · tltt

Příklad 20

Oční infekce

Patnáct pacientů s hnisavými očními infekcemi se ošetřuje dvakrát denně očními kapkami polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu. před použitím se ampule s polyenzyraovým preparátem jak je popsáno v příkladu 1A ředí v 25 ml vody na finální koncentraci 1 kaseinová jednotka/ml. Infikované očí se ošetřují ráno a večer dvěma kapkami, 0,4 ml, roztoku. při každém ošetření se oči kontrolují na erytém, otoky, hnis, oční sekreci a možné nežádoucí reakce. Pacient se léčí, dokud neustoupí všechny příznaky infekce, ale ne déle než 10 dnů, u všech pacientů infekce ustoupila během 3 dnů léčení. Erytém a otoky kolem očí přešly během 2 dnů a oční sekrece přestala během 2 dnů. po první aplikaciměli všichni pacienti pocit příjemné úlevy v infikovaných očích a svědění kolem očí mizelo během několika minut. Nebyly uváděny žádné nežádoucí reakce.

Příklad 21

Infekce

Do této studie je zahrnuto dvacet dva pacientů s akutním nebo chronickým infekčním/zánětlivým otokem dásně. Třikrát denně (ráno, v poledne a večer) se jedna z ampulí polyenzymového preparátu popsaného v příkladu 1A ředí v 5 ml odsáté vody (5 kaseinových jednotek/ml) a použije se k opláchnutí ústní dutiny pacienta. Po dobu 2 hodiny od ošetření se nesmí jíst ani pít. Ošetřování končí po 7 dnech nezávisle na výsledcích. Úleva od bolesti se udává po 20 minutách až 12 hodinách léčení. Infekce a zánět ustoupí během 4 dnů a neopakuje se v době 3 týdnů. Nejsou uvedeny žádné škodlivé nežádoucí reakce.

Příklad 22A

Virová infekce horních dýchacích cest

Do této studie je zahrnuto jedenáct pacientů s virovou chřipkovou infekcí a druhotnou bakteriální infekcí horních dýchacích cest, jako je zánět paranazálních dutin. Virová infekce v plicích působí poškození plicních cilií a zánětlivé reakce vedoucí k erytému, otoky a zvýšené vylučování hlenu. Poškozené cílie nestačí na zneškodnění bakterií, což vede často k druhotným bakteriálním infekcím. Viry jsou závislé na hostitelské buňce, pokud se týká jejího přežití a rozmnožování a je velmi těžké zničit virus aniž by se poškodily hostitelské bUňky, Před léčením se jedna z ampulí s polyfunkční hydrolázou z drobného korýšovitého planktonu, jak je popsáno v příkladu 1B, ředí v 5 ml fyziologického roztoku na finální koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml. 0,25 ml tohoto zředěného roztoku se rozprašuje do každé nosní dírky a ústní dutina se vyplachuje po dobu 5 minut 4,5 ml tohoto roztoku. Postup se opakuje třikrát denně a jednou denně se zaznamenávají pozorování ohledně erytému, otoku, vylučování hlenu, bolesti a škodlivých reakcí.

Léčení pokračuje dokud nevymizí všechny příznaky infekce, ne však déle než lé dnů. 8 pacientů bylo bez příznaků po 6 dnech léčení a zbylí 3 pacienti po 9 dnech. Úleva od bolesti byla u všech pacientů po době od 2 hodin do 2 dnů. Sputum se stalo čisté během třech dnů u pacientů s hnisavými změnami. Erytém a otoky ustoupily po 4 dnech. Výsledky jsou ukázány na obr. 7. Žádné nežádoucí reakce nebyly zjištěny.

Příklad 22B

Běžné nachlazení

Pět pacientů ve věku od 30 do 63 let se léčí polyfunkční hydrolázou z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu 1B pouze několik hodin po vypuknutí úprvních příznaků nachlazení. Léčení se provádí nazálními spreji 0,5 mg/ml vodného roztoku hydrolázy (0,1 mg na inhalaci jedné nosní dírky) každé 4 hodiny a 0,5 mg/ml roztoku na vyplachování úst (0,5 mg na výplach) každých 6 hodin. Roztok na vyplachování úst se dá do úst na dobu 2 až 4 minuty a pak se spolkne, po lě hodinách symptomy běžného nachlazení mizí a pacienti jsou bez potíží.

Příklad 23

Hemofilitická chřipková infekce

U ženy ve věku 34 let mající opakovaný zánět paranazálních dutin došlo k infekci hemofilitickou chřipkou. Několik hodin po objevení symptomů tlaku a bolesti v nazálních dutinách jí byl ústa vymývána po dobu 3 minut 4,5 ml 5 mg/ml roztokem polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu ÍB a 0,5 ml roztoku hydrolázy se rozprašovalo do každé z nosních dírek. Toto kombinované léčení se opakovalo třikrát ve dvouhodinových intervalech. Potom se ošetřování sprejem opakovalo každé tři hodiny celkem po dobu 3 dnů. Tlak působící při nazální infekci ustoupil během několika hodin po prvním ošetření a výtok nazální sekrece silně stoupl, po 3 dnech ošetřování byla žena bez potíží.

Příklad 24

Bronchitida

V ošetřování byl muž ve věku 55 let mající těžké bronchitické potíže. Muž měl potíže s dýcháním, s obtížemi ušel sotva 100 metrů, velmi snadno se unavil a měl chronický těžký kašel. Jeho vážný fyzický stav byl způsoben vypadal na to, že bronchitida byla způsobena mykoplasmou, která jej nejprve infikovala před 3 lety a tak došlo k vyvinutí antibiotické rezistence. Infekce vedla k tvorbě vody na plících, jak bylo ověřeno rentgenovým vyšetřením. Pacient byl ošetřován tak, že mu ústa byla vyplachována polyfukční hydrolázou z drobného

IB. Roztok hydrolázy byl byl pomalu polykán. Toto den po první dva týdny korýšovitého planktonu podle příkladu dán do úst na dobu 4 minuty a pak ošetřování se opakovalo každý druhý léčení. Také pacient během této doby inhaloval malá množství (0,ř ml) aerosolu roztoku hydrolázy.

V průběhu prvních dvou týdnů nebylo pozorováno žádné zlepšení, po dvou týdnech léčení lyfatická žláza na levé straně krku pacienta otekla a bolela. Pak následovalo ošetřování opakovaně třikrát. Po 1,5 týdnu poté otok lymfatické žlázy ustoupil a bronchitické potíže začaly slábnout. Po dalších 3 týdnech ošetřování vyplachováním úst každý čtvrtý den bronchitické potíže ustoupily. Po léčení po době 6,5 týdne se pacient uzdravil celkově a mohl bez potíží chodit na delší vzdálenbosti.

příklad 25A

Žaludeční vřed

Čtyřicetiletý muž mající potíže charakteristické pro mírnou formu žaludečních vředů byl léčen vůči kyselinám rezistentními kapslemi obsahujícími 5 mg polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu z příkladu IA na kapsli. Do opouzdřeného preparátu nebylo přidáno žádné plnivo. Pacient polykal jednu kapsli denně s jednou sklenicí vody po dobu 2 týdnů. Po 4 dnech žaludeční potíže ustoupily a pacientovy vnitřnosti fungovaly normálně.

Pětapadesátiletý muž mající opakované potíže s žaludečním vředem po dobu 20 let byl léčen stejnou dávkou léku jako je uvedeno výše. Po několika dnech léčení potíže ustoupily a jeho vnitřnosti fungovaly normálně.

Příklad 25B Vředová kolitida

Pacientka s patnáctiletou anamnézou vředové kolitidy byla léčena antiflogististikem Salazopyrinem (Pharmacia, Sweden). Po dobu 6 týdnů polykala jednou denně vůči kyselinám rezistentníkapsle obsahující 1 mg lyofilizované polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu ÍB. Současně zachovávala léčbu Salazopyrinem. Dvě hodiny po prvním léčení polyfunkční hydrolázou pocítila bolest v žaludku, plynatost a měla průjem, přičemž se tyto symptomy trvaly asi šest hodin. Po druhém léčení pocítila slabou bolest po 30 minut. Potom již neměla žádné škodlivé reakce. 16. a 29. den pocítila žaludeční bolesti s neobvyklými jídly. Nicméně a měla však tyto pruj em ve spoj ent příhody byly krátké V průběhu léčení a méně těžké než předcházející příhody, pozorovala zlepšený stav. Ve 3 až 4 měsících následujících po léčení, se její symptomy pomalu vracely k síle, jež byla popsána před léčením.

Příklad 26

Herpes genitalis

Byl léčen muž ve věku 62 let maj ící dlohodobý případ Herpes genitalis. Vypuknutí nemoci se opakovalo každé 4 měsíce a při akutním vypuknutí muž abstinoval od pohlavního styku. Při akutním vypuknutí byla postižená oblast ovázána obvazem nasáknutým roztokem polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu ÍB, který obsahoval 3 mg hydrolázy. Ošetřující obvázání se opakovalo dvakrát denně po dobu 2 dnů. Obtíže ustoupily po po druhém ošetření. Po následujících lé měsíců po této léčbě u muže nedošlo k vypuknutí nemoci.

Příklad 27

Infekční herpes simplex v ústní dutině

Osm pacientů s recidivou puchýřkového herpes simplex v ústní dutině bylo léčeno dvakrát denně vyplachováním úst. Před použitím se každá ampule polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu (popsáno v příkladu 1A) zředila v 5 ml fyziologického roztoku na finální koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml. Pacientům byla vyplachována ústní dutina roztokem po dobu 5 minut. Po ošetření pacienti nesměli 2 hodiny jíst ani pít. Postup se opakoval dvakrát denně a klinické parametry, erytém, otoky, bolestivost a škodlivé reakce byly zaznamenány jen jednou za den. Ošetřování pokračovalo, dokud neustoupily příznaky infekce, ale ne déle než 10 dnů.

Úleva od bolesti byla pociťována po dvou hodinách po prvním ošetření. U některých pacientů se bolest opět objevila mezi ošetřeními během prvních dvou dnů, ale nikdy později, po 5 dnech byli všichni pacienti bez potíží a nemocná místa byla zahojena. Nebyly zjištěny žádné škodlivé reakce.

Příklad 28

Pásový opar

Sedmdesátiletý muž, který měl na obličeji velmi bolestivý infekční pásový opar, byl po 10 měsíců ošetřován zevně přikládáním gázového obvazu nasáknutého roztokem obsahujícím 1 až 2 mg polyenzymového preparátu z drobného korýšovitého planktonu z příkladu 1A každý třetí den. Po prvním ošetření se bolest a svědivost snížila. Bolest úplně ustoupila po 12 dnech. Vzhledem k bolesti spojené s infekcí měl muž potíže se žvýkáním, ale po 12 dnech byl schopen žvýkat jídlo bez problémů.

Příklad 29

Akné

Dvě ženy ve věku 29 a 30 let byly léčeny na akné na obličeji. Muž ve věku 29 let měl těžkou formu akné, zatímco žena ve věku 30 let měla střední formu akné. Pacienti byli ošetřováni 0,1 mg polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu IB několikrát denně po dobu 4 až 6 dnů aplikováním 0,5 g/cm do 2 g/em hydrogelu (popsáno v příkladu IF) obsahuj icícho 5 mg/ml polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu. Zlepšení se objeví po prvním ošetření, a po týdnu ošetřování jsou znatelnépouze pigmentové stopy po akné.

Příklad 30

Psoriáza a suchý ekzém

Strupy psoriázy a suchého ekzému se snadno rozkládají hydrogelovými (popsáno v příkladu IF) preparáty z polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu IB. 0,5 g/cm hydrogelu (popsáno v příkladu IF) obsahujícího 5 kaseinových jednotek/ml hydrolázy se aplikuje na místa podle potřeby léčby a místa se pokryjí polopropustným obvazem. Ošetření se opakuj e dvakrát denně. Po dvou dnech j sou strupy zcela zničeny a citlivá pokožka, zvláště u pacientů s psoríázou, prokazuje sníženou zánětlivost. Následuje ošetřování postižených míst steroidními krémy.

Příklad 31A Ekzémové infekce

Čtyřicet pacientů s ekzémovou seboroickou a psoriázovou infekcí bylo léčeno jednou až dvakrát denně polyenzymovým hydrogelem (popsáno v příkladu 1F) obsahujícím 2,5 kaseinových jednotek/ml polyenzymového preparátu z příkladu 1A.U pacientů se suchým ekzémem/strupy byly potlačeny příznaky zánětu nebo infekce po 2 až 4 ošetřeních. Mastné typy seboroických strupů mizely po 6 až 9 dnech, ačkoli spojené potíže se zánětem/infekcí zmizely po 2 až 4 dnech ošetřování. Pacienti s psoriázou pociťovali zlepšení při ošetřování steroidními krémy, čímž se napomáhalo lepšímu obnovování pokožky a postižené kůže.

Příklad 31B

Lišej - s přidanou infekcí

Pacient trpěl lišejem. Na napadené oblasti byly pupínky a léze, povrch byl mokvavý. Každý den se na napadenou oblast aplikoval 1 g hydrogelu (popsáno v příkladu 1F), který obsahoval 0,5 mg/ml polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu 1B. Po třech dnech se povrch uklidnil a pupínky zmizely. Sedmý den se mokvavý povrch uzdravil a léčení skončilo.

Příklad 32

Trombolytické/antíembolické vlastnosti

Aplikováním umělé stáze do hlavní krční tepny králíka byl vyvolán umělý trombus. Injekčně byla aplikována polyfunkční hydroláza z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu 1B (0,5 mg rozpuštěné v 0,2 ml izotonického roztoku) přímo do uvedeného místa v krční tepně, a to 2 cm od ischemického povrchu. Během 30 minut se trombus úplně rozpustil a krev mohla volně protékat. Na ošetřovaném povrchu se sice vyvinula drobná nekrotická místa, avšak byla resorbována během 7 dnů. U • · · · · · • · » • · · * • · • · » kontrolních zvířat byla tato doba pro nekrotická místa jen 4 až 5 dnů.

Příklad 33

Dentální povlaky u psů

Polyenzymový preparát z drobného korýšovitého planktonu byl použit pro odstranění dentálního povrchu u malých stavěčích psů. Před použitím se ampule s polyenzymovým preparátem (popsáno v příkladu 1A) zředí v 5 ml fyziologického roztoku na finální koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml. Obsah čerstvě připravené ampule se pečlivě nanese na zuby a dáseň. Jazyk se fixuje na 2 minuty a po ošetření se nedává žádná potrava po dobu 2 hodiny. Ošetření se opakuje dvakrát denně, dokud se zubní povlak zcela neodstraní. Psi jsou prohlíženi a kontrolováni na stav povlaku, vylučování slin a nežádoucí škodlové reakce jednou denně. Do studie bylo zhrnuto osm malých stavěčích psů a abnormální tvorbou zubního povlaku, kteří měli zvláštní stravu a umístění, po 4 dnech všechny příznaky spojené s uvedenými povlaky zmizely a studie byla ukončena. Nebyly zjištěny žádné škodlivé reakce.

Příklad 34

Dentální povlaky u lidí

Pro odstranění dentálních povlaků u lidí byl použit polyenzymový preparát z drobného korýšovitého planktonu. Jedna ampule polyenzymového preparátu z příkladu 1A byla zředěna v 5 ml fyziologického roztoku na finální koncentraci 5 kaseinových jednotek/ml před každým použitím a použita k oplachování ústní dutiny pacienta po dobu 5 minut. Po ošetření nesměl pacient 2 hodiny jíst ani pít. Ošetření se opakovalo dvakrát denně a pacienti byli prohlíženi

T8 a kontrolováni jednou denně na povlak. tvorbu slin, suchost a škodlivé reakce. Pacientům nebylo umožněno čistit si zuby během této studie. Ošetřování pokračovalo, dokud neustoupily všechny příznaky povlaků, ale ne déle než 7 dnů. Po dvou hodinách byli pacienti prohlíženi a kontrolováni na citlivost a hladkost zubů, přičemž vizuální kontrola byla uspokojivá. Dvě hodiny po třetím ošetření veškeré známky povlaků ustoupily a léčení bylo ukončeno. Žádné škodlivé reakce nebyly zjištěny.

Příklad 35

Rakovina

Polyenzymový preparát z drobného korýšovitého planktonu z příkladu 1A byl použit pro léčení Yoshida Sarcoma nádorů u dospívajících krys. Yoshida sarcoma buňky jsou popsány v Mitcotina a kol., Tumour Biology, 12:225, 1991, a Goseki a kol., Cancer, 68:1865, 1992. Uvedený polyenzymový preparát se podává třemi způsoby (intraperitoneálně - i.p.), intranádorově - i.t.) a podkožně (s.c.) bílým krysám Vistar, jimž byly implantovány Sarcoma buňky. Ošetřovaé skupiny jsou:

A. Jedno podávání i.p. 5 mg/kg.

B. Jedno podávání i.t. 5 mg/kg.

C. Jedno podávání s.c. 5 mg/kg.

D. Dvakrát denně podávání s.c. 1,25 mg/kg po dobu 7 dnů.

E. S.c. podávání 5 mg/kg po 4 dny - obden.

F. S.c. podávání 12,5 mg/kg po 4 dny - obden.

Před použitím se ampule polyenzyroového prášku ředí izotonickým roztokem na koncentraci 5 mg/ml roztoku. 1 x 10^ buněk Yoshida Sarcoma se implantují podkožně do zadečku bílých krys Vistar. Když se implantované buňky generují na nádor 10 mm x 10 mm, krysy se buď ošetřují polyenzymovým preparátem nebo se použijí neošetřené kontrolní krysy. Krysy se pak usmrtí, a to 7 dnů po posledním ošetření. Velikost nádoru se měří a porovnává se s nádory neošetřených kontrolních krys.

• · · · · ······ • ···· · « · • · · · · · ·· · ······ • · · · ·

Relativní redukce velikosti nádoru byla 46 % pro skupinu A, 56 % pro skupinu B a 49 % pro skupinu C. Ve skupině ošetřované opakovanými dávkami 1,25 mg/kg dvakrát denně po dobu 7 dnů (skupina D), byla redukce 72 %. Ve skupině s 5 mg/kg a 12,5 mg/kg s.c. každý druhý den (skupina E a F) se nádor redukoval na 53 %, resp. 69 %. U všech ošetřovaných krys byl podíl nádoru, který byl nekrotický, podstatně vyšší než nádory u neošetřených krys. Ošetřované krysy také rychleji přibývají na váze než neošetřované.

U jedné krysy dostávající 12,5 mg/kg každý druhý den se ukázala absolutní ztráta nádorové hmoty (spíše než relativní ztráta). Stupeň metastázy v ošetřované skupině byl velmi málo srovnatelný s kontrolními krysami. Ošetřované krysy prokazovaly normální chování pokud se týká pití a jídla, v porovnání s kontrolními krysami, u nichž nebyla pozorována chuť k jídlu. Během pokusu nebyly pozorovány žádné škodlivé reakce.

Příklad 36

Antivirový účinek na HIV-kontaminované buňky, in vitro

Polyfunkční hydroláza z drobného korýšovitého planktonu byla testována na anti-HIV použití pomocí standardní zkoušky national cancer institute, viz Veislow a kol., J. Nati. Cancer Inst. 81:577-586, 1989. Postup je tento:

(1) Polyfunkční hydroláza podle příkladu IC se rozpustí v dimethylsulfoxidu, zředění 1:100 v prostředí buněčné kultury a pak se podrobí sérii zředění. K různým zředěním se přidávají virem infikované T4 lymfocyty (CEM buněčná linie). Kontroly zahrnují neinfikované buňky zpracované s hydrolázou na HIV-infikované buňky paralelně zpracovávané bez přítomnosti polyfunkční hydro!ázy.

(2) Buněčná kultura se inkubuje při teplotě 37 °C pod atmosférou 5 % oxidu uhličitého po dobu 6 dnů.

(3) K buněčným kulturám se přidá tetrazoliová sůl, XTT, a kultury se inkubují, přičemž se kontrolují a pozoruje se barevný vývoj u životaschopných buněk. 4 kultury se analyzují spektrofotometricky a mikroskopicky na kvantitu počtu přítomných životaschopných buněk. Na obr. 8 je ukázán průběh zkoušky. Křivka A je pro buňky zpracované s polyfunkční hydrolázou, zatímco křivka B je pro neinfikované kontrolní buňky. Žádná aktivita není pozorována, pokud koncentrace nepřevýší 10 mikrogramů/ml, kdy še ukazuje bod ostrého přechodu v aktivitě a hydroláza začíná prokazovat téměř totální ochrannou aktivitu. Koncentrace, při nichž hydroláza prokazuje podstatnou ochranu, jsou desekrát nižší než koncentrace krevního séra známého pro tuto ochranu.

Příklad 37

Šedý zákal u psa

Pravé oko psa s šedým zákalem bylo ošetřováno 2 kapkami 5 kaseinových jednotek/ml roztoku polyenzymového preparátu z příkladu 1A. Levé oko bylo stejně ošetřováno, vyjma toho, že se použil roztok polyfunkční hydrolázy o 3 kaseinových jednotkách/ml z příkladu 1B. Postup se opakoval jednou denně pro každé oko a pes byl kontrolován ne změny zakalenosti a škodlivé reakce. Po 5 dnech vymizely zákalové skvrny a po 10 dnech byly obě oči jasné, vypadala velmi čistě a léčení bylo ukončeno. Nebyly zjištěny žádné škodlivé reakce.

Příklad 38

Zákal u lidí

Osmdesátiletá žena trpící poruchou vidění denního/nočního byla vzhledem k šedému očnímu zákalu ošetřována každý den po dobu třech dnů 0,4 ml roztoku 0,1 mg/ml polyenzymového preparátu z příkladu 1A. Po 5 ošetřeních byla studie ukončena vzhledem k dalším lékařským důvodům, ale bylo zjištěno, že zákal je méně intenzívní a podle pacientky se zlepšilo i vidění ošetřeného oka. Během léčení nebo 1 měsíc po ošetření nebyly zjištěny žádné potíže, dráždivost nebo bolest.

Příklad 39 Zelený zákal oční ze ma menši trpí zvýšeným permanentní a den byl do mg . Dva

U muže ve věku 74 let bylo zjištěno, potíže/bolest v pravém oku a bylo zjištěno, že očním tlakem, o němž bylo zjištěno, že je nezpůsobuje akutní problémy. Každý čtvrtý postiženého oka vkapáván roztok obsahující 0,1 polyenzymového preparátu z příkladu 1A a to celkem třikrát týdny po ošetření byl nitrooční tlak normální a udržel se na normální úrovni po dobu 4 měsíců. Muž měl pocit bolesti bezprostředně, během 20 minut po prvním ošetření. Nebyly zjištěny žádné škodlivé reakce.

Příklad 40

Obecný účel očních kapek

Dvacet pacientů nezaznamenalo žádnou oční nemoc, alergické reakce na znečištění vzduchu nebo oční infekci/zánět. Tito pacienti byli ostřeni na unavené a podrážděné oči. Do očí jim byly vkapány dvě kapky roztoku o 0,1 kaeinových jednotek/ml polyenzymového preparátu z příkladu 1A. všichni pacienti pociťovali úlevu od napětí a bolesti během 30 minut. Nebyla zjištěna žádná změna citlivosti na světlo, rozšiřování nebo jakoukoli dilataci zorniček. Občas byla zjišťována přechodná suchost. Nebylo zj ištěno žádné dráždění, zvýšené slzení nebo jiné škodlivé reakce.

Příklad 41

Srůsty pochvy šlachy

Levá Achillova šlacha každého ze dvou králíků byla přetržena a ihned sešita. Pět dní po operaci bylo evidentní, že došlo ke srůstu šlachy a pohvy šlachy. Intersticíálně byl do pochvy vpraven injekčně 1 mg polyenzymového preparátu (z přikladu ÍA), rozpuštěného v 0,25 ml, a to 5, 7 a 9 dnů po operaci. Jeden den (24 hodin) po první injekci nebylo znát žádný srůst mezi šlachou a pochvou. Šest týdnů po operaci nedošlo k recidivě. Osm týdnů po operaci byla zvířata zabita a šlachy mikroskopicky zkoumány na srůst, přebytek fibrinu a kolagenu, šlachy a pochvy byly odděleně zpracovány a nebyly zjištěny žádné známky srůstů. Pevnost v tahu u šlachy operované levé nohy byla porovnána s neoperovanou šlachou pravé nohy a nebyl zjištěn žádný rozdíl. Je pravděpodobné, že preparát specificky rozkládá přebytek fibrinu bez ovlivnění potřeby fibrinu z hlediska uzdravení šlachy, resp. pochvy.

Příklad 42

Uvolnění přirostlého zápěstí

Čtyřicetiletá žena trpěla neohebným zápěstím vzhledem k dlouhému znehybnění v sádře. Prokazovala se u ní jen 25%ní pohyblivost. Navzdory provádění pohybového programu se účinek na pohyblivost projevoval jen velmi málo a diagnóza zůstávala stejná vzhledem k fibrinovému povlaku uvnitř kloubu. Intraartikulárně byl pomocí injekce vpravován roztok polyenzymového preparátu z příkladu 1A (2 mg/0,5 ml) každý třetí den a to celkem čtyři injekce. Pohyblivost kloubu se zvýšila během 14 dnů na 50 až 60 %. Ženě se vracela pohyblivost na 70 až 80 % po 8 měsících rehabilitačního cvičení. Nebyly zjištěny žádné škodlivé reakce.

• * *·· ·

Příklad 43

Léčení j izev a keloidů

Jednou denně byla dávána injekce polyenzymového preparátu z příkladu IA do 5 jizev na obličeji a 3 keloidúm na rukou a předloktí. Na každý centimetr jizvy/keloidu byla dána injekce 0,2 ml roztoku (obsahujícího 5 kaseinových jednotek/ml) do maximálního objemu 1 ml na jizvu nebo keloid na den. Postup se opakoval denně a jizva/keloid byla prohlížena na erytém, otoky, teplotu, krvácení, nekrózu a škodlivé reakce. Ošetřování skončilo při 80%ním rozkladu jizvy/keloidu, ale ne déle než za 7 dnů. Fibrinové jizvy byly redukovány na 25 % Svého původního objemu a kolagenové keloidy na 70 % po 7 dnech ošetřování. Během pokusu nebyly zjištěny žádné škodlivé reakce.

Příklad 44

Zmenšování vrásek

331etá žena byla ošetřována každý večer po 60 dnů aplikováním gázy navlhčené roztokem polyfunkční hydrolázy podle příkladu IB na dobu 30 minut. Celkové množství polyfunkční hydrolázy použité na aplikaci bylo 0,15 mg. Ošetřována byla oblast pod jedním okem pacientky, zatímco oblast pod druhým okem sloužila jako porovnávací. Po 15 dnech ošetřování byl zjišťován rozdíl mezi elasticitou kůže a po 60 dnech byl vizuálně zjevný rozdíl u vrásek. Ošetřená oblast byla velmi jemná a elastická a počet hlubokých vrásek poklesl v porovnání a neošetřovanou oblastí kůže.

Příklad 45 A Polypy

9999 • * • · fl fl> · · · • · ·· ·

Byl ošetřován muž ve věku 62 let majícící polyp na anus. Muž trpěl polypy po dobu 3 let a byl ošetřován lékařem. Ošetřován byl několika lékařskými způsoby, ale nebylo zjištěno zlepšování. Byl tedy ošetřován gázovým obvazem obsahujícím 5 mg polyfunkční hydrolázy podle příkladu 1B, rozpuštěné v 5 ml fyziologického roztoku. Léčení bylo opakováno celkem pětkrát. Všechny potíže zmizely a při příští návštěvě u lékaře bylo zjištěno, že polyp zmizel. Osm měsíců po léčení byl muž bez potíží.

Příklad 45B

Bradavice

Pětatřicetiletá žena mající na krku bradavici byla jeden týden léčena pomocí plaster (sádry) (Hansaplast) obsahující roztok polyfunkční hydrolázy podle příkladu 1B (0,1 mg/plaster). Ošetření se opakovalo po dobu jednoho týdne. Po jednom týdnu ošetřování bradavice zcela zmizela.

Příklad 45C

Hemoroidy

Na hemoroidy byly léčeny dvě osoby, muž ve věku 55 let a žena ve věku 30 let. Žena měla potíže po dobu 3 let, měla bolesti a slabé krvácení. Byla ošetřována suchým práškem z polyfunkční hydrolázy podle příkladu 1B, který byl obalen gázovým obvazem , přiloženým na ošetřené postižené místo. Každá dávka byla 5 mg. K ustoupení potíží pacientky bylo třeba pět ošetření. Jeden rok po tomto léčení byla bez potíží.

Muž měl potíže s hemoroidy řadu let. Když byly jeho symptomy, včetně krvácení a silných bolestí, akutní, muž byl jednou ošetřen gázovým obvazem nasáknutým 4 mg polyfunkční hydrolázy podle příkladu 1B ve formě bezvodého prášku. Bolest vymizela během 20 minut a pak se ošetření opakolvalo, všechny potíže ustoupily a zatím nedošlo k recidivě.

Příklad 46

Léčení infekce pupíčku kojence

Čryřdenní chlapeček byl ošetřen polyfunkční hydrolázou pro odstranění nekrotické tkáně a následné infekce. Gáza nasáknutá roztokem polyfunkční hydrolázy podle příkladu 1B (2 mg/jeden kousek gázy) a položena kolem pupeční šňůry tak, aby pokryla jek zdravou, tak infikovanou a nekrotickou tkáň. Gázový obvaz byl měněn čtyřikrát každých 12 hodin. PO 12 hodinách ošetřování byla nekrotická tkáň odstraněna a infikovaná část tkáně, jakož i zdravá tkáň byla zcela zbavena infekce. Nebylo pozorováno žádné porušení zdravé tkáně u pupeční šňůry, jakož ani jakákoli j iná infekce nebo podráždění či svědění kůže nebo zanícení. Zdravý pupíček byl ošetřován čtyřikrát. Po 6 dnech po narození bylo děťátko prohlédnuto v nemocnici a pupíček neměl žádnou infekci oproti většině kojenců, kteří byli prohlíženi při stejné příležitosti.

Příklad 47

Alergické svědění

Žena ve věku 28 let měla alergické problémy ve formě intenzivního svědění s kopřivkou nad jedním kolenem a také pod bradou. Vzrážka se projevovala bílými poněkud se rozšiřujícími hrbolky u kolena, u brady to byla drobná vyrážka v barvě kůže. Gázový obvaz se navlhčil roztokem obsahujícím 2 mg polyfunkční hydrolázy podle příkladu 1B. Gáza se aplikovala na vyrážku v oblasti nad kolenem. Po 10 minutách se gáza odstranila. O 45 minut později začala vyrážka mizet a zcela zmizela po 1,5

hodině. Také ustoupila bílá vyrážka a kopřivka zmizela.

O den později byla ošetřena oblast pod bradou. Tato oblast svědila nyní velmi intenzívně a byla více podrážděná než předtím. Přímou aplikací bylo přiložení gázového obvazu s roztokem polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu, kdy byl obvaz přiložen na 7 minut, přičemž svědění bylo velmi intenzívní. Během následuj ící 1,5 hodiny pupínky zpostupně ustupovaly a zcela ustoupily po 2,95 hodině. Za dva dny po počátku léčení kolena nebyly pozorovány žádné škodlivé reakce na ošetřených oblastech.

Příklad 48 Prostata

Muž ve věku 52 let trpěl potížemi s prostatou od svých 20 let. Během posledních 4 let se problémy staly akutními a měl silné bolesti. Při každé akutní fázi byl ošetřován antibiotiky, a to různými druhy, avšak vždy po dobrání celé dávky antibiotik se během týdne potíže vrátily. Při jedné příhodě si muž vzal vůči kyselině rezistentní kapsle obsahující 5 mg/kapsli bezvodé formy plyfunkční hydrolázy podle příkladu IB. Bral 2 kapsle/den po dobu jednoho týdne. Všechny symptomy ustoupily a muži se nevrátily po dobu 12 měsíců.

Příklad 49

Mastitida (zánět prsu) u žen

Matka novorozeněnte ve věku 28 ler trpěla galaktostázou 3 drny po porodu, onemocnění mělo těžkou formu a měla velké bolesti. Tyto potíže nastávaly především půl hodiny až hodinu po kojení. Byla hospitalizována a léčena standardními způsoby, které jsou dostupné, ale nepomáhaly. Když opět začaly intenzívní bolesti, byl na její prsní bradavku nakapán roztok obsahující 0,1 mg polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu IB. Všechny bolesti zmizely během 5 minut a po 45 minutách byly mléčné žlázy již měkké. Toto ošetření se opakovalo po každém kojení po dobu ne delší než 3 měsíce. Podle potřeby probíhajícího léčení byla žena podrobována lékařským prohlídkám, zejména přímo po kojení, zejména zaměřených za zjišťování bolestí a tvrdnutí mléčných žláz.

Příklad 50

Záněty kloubů u koní

Do této studie bylo zahrnuto 16 chromých koní. Ampule polyenzymového preparátu z příkladu 1A byly zředěny v 10 ml vody pro injekce na finální koncentraci 2,5 kaseinových jednotek/ml roztoku a 2 ml byly injekčně vpraveny do bolavých kloubů koní v den 1, 2, 4 a 7. Po injekcích byli koně pozorováni na škodlivé reakce nebo změny v celkovém zdravotním stavu. U devíti případů odpovídala úleva od bolesti 30 minutám až 2 hodinám po prvním ošetření, u čtyř případů odpovídala 6 hodinám a u dvou případů 2 hodinám po ošetření. V jednom případě byla úleva od bolesti po třetí injekci a v tomto případě došlo k velkému svědění nad kolenem. Teplota a svědění rychle klesalo a po 2 dnech nebyly pozorovány příznaky zánětu u 15 případů. Nebyly zjištěny žádné škodlivé reakce. Výsledky jsou shrnuty v obr. 11. Jeden týden po ošetření se koně vrátili k lehkému výcviku.

Příklad 51

Turistická diarhea (průjem)

U muže ve věku 41 let došlo k akutnímu vývoji otravy potravou (pravděpodobně Staphylococcus) s průjmem a zvracením.

• · « · « ·

Hodinu poté začal být nemocný muž léčen roztokem obsahujícím 5 mg polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu IB, který si dal do úst na 3 minuty a pak jej pomalu polykal. Tento postup se opakoval třikrát. Po čtvrtém ošetření bolesti žaludku ustoupily a zvracení a průjem přestal.

Příklad 52

Pevnost vlasů

Byly ošetřeny dvě ženy ve věku 55 let a 62 let. Obě měly slabé vlasy posledních 10 let. Ošetření se provádělo tak, že se část hlavy porostlá vlasy namočila roztokem obsahujícím 5 mg polyfunkční hydrolázy z drobného korýšovitého planktonu podle příkladu IB. Aby bylo dosaženo potřebné vlhkosti, působení bylo určeno na dobu 30 minut. Ošetření se opakovalo jednou týdně po dobu 3 měsíců. Po této době byly vlasy regenerovány a začaly narůstat.

Příklad 53

Ošetření enzymy nikoli z drobného korýšovitého planktonu

Pro každý z příkladů 8 až 52 byla polyfunkční hydroláza z drobného korýšovitého planktonu nahrazena jinou látkou, která byla porovnána z hlediska účinků.

Průmyslová využitelnost

Polyfunkční enzym z drobného korýšovitého planktonu podle tohoto vynálezu je vzhledem ke svým léčivým účinkům významný pro farmaceutický průmysl.

Claims (113)

1. Enzym, v podstatě purifikovaný, mající čistotu vzhledem k makromolekulám alespoň 95%,vyznačující se t í m, že jeho polyfukční aktivita je alespoň jedna z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházej ící z drobného korýšovitého planktonu.

2. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že má molekulovou hmotnost od 26 kd do 32 kd jak je určeno podle SDS PAGE.

3. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že má molekulovou hmotnost od 29 kd jak je určeno podle SDS PAGE.

4. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že enzym je selektivně reaktivní vůči povrchově buněčným receptorům.

5. Enzym podle nároku 4, vyznačující se tím, že mezi povrchově buněčné receptory jsou zahrnuty povrchově buněčné proteiny nebo glykolipidy.

• · · · · ·, ······

6. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že má čistotu alespoň 97 % vzhledem k makromolekulám.

7. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že má čistotu alespoň 99 % vzhledem k makromolekulám.

8. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že má čistotu alespoň 99,7 % vzhledem k makromolekulám.

9. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že jeho N-terminační sekvence obsahuje:

I-V-G-G-X-E/D-B-X-X-X-X-Z/B -P-Z/H-Q-B-X-B /Z, kde X je jakákoli aminokyselina, Z je aromatická aminokyselina, B je aminokyselina mající C2 až C6 alkylový postranní řetězec a B je leucin nebo isoleucin.

10. Enzym podle nároku 9, vyznačující se tím, že všechny aminokyseliny reprezentované X, Z nebo B jsou přírodní aminokyseliny.

11. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že jeho N-terminační sekvence obsahuje:

I-V-G-G-X-E/D-B kde X je jakákoli aminokyselina, B je aminokyseliny mající C2 až C6 vedlejší alkylový řetězec.

12. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje polyfunkční hydro]ázu pocházející z drobného korýšovitého planktonu.

13. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že jeho N-terminační sekvence obsahuje:

I-V-G-G-N/M-E-V-T-P-H-A-Y-P-V-Q-V-G-L-F-I-D-D-M-Y-F (SEQ ID NO. 1).

14. Enzym podle nároku 13, vyznačující se tím, že jeho molekulární hmotnost je od 26 kd do 32 jak je určeno pomocí SDS PAGE.

15. Enzym podle nároku 1, vyznačující se tím, že je alespoň ze 70 % homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu.

korýšovitého planktonu.

16. Enzym podle nároku 15, vyznačující se tím, že je homologický alespoň z 80 %.

17. Enzym podle nároku 15, vyznačující se tím, že je homologický alespoň z 90 %.

18. Enzym podle nároku 1, vyznačuj ící že je homologický alespoň z 95 %.

se tím,

19. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje polyfunkční enzym podle nároku 1 až 18 a farmaceuticky přijatelné ředidlo nebo nosič.

20. Farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci mikrobiální infekce, vyznačující se tím, že tento prostředek obsahuje pro léčení mikrobiální infekce nebo prevenci účinné množství enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18.

21. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, vyznačuj ís e tím, že mikrobiální infekce je virová.

22. Farmaceutický prostředek podle nároku 21, vyznačuj ís e tím, že virová infekce je virová infekce oparu, HIV, hepatitida, koronavirus, cytomegalovirus, rinovirus nebo papi lom.

23. Farmaceutický prostředek podle nároku 21, vyznačuj ίο i se tím, že infekce oparu zahrnuje HSV-1, HSV-2 nebo infekci pásový opar.

24. Farmaceutický prostředek podle nároku 22, vyznačuj ίο í se tím, že infekce oparu zahrnuje infekční genitální opar.

25. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, vyznačuj ίο i se tím, že mikrobiální infekce způsobuje gastrointestinální onemocnění.

26. Farmaceutický prostředek podle nároku 25, vyznačuj ίο i se tím, že gastrointest inální onemocnění je vřed

- 93 nebo průjem.

27. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, vyznačuj ίο i se tím, že mikrobiální infekce je plísňová infekce.

28. Farmaceutický prostředek podle nároku 27, vyznačuj ίο i se tím, že mikrobiální infekce je systemická plísňová infekce.

29. Farmaceutický prostředek podle nároku 27, vyznačující se tím, že mikrobiální infekce je infekce kožní, orální, vaginální nebo jícnová plísňová infekce.

30. Farmaceutický prostředek podle nároku 21, vyznačuj ίο i se tím, že mikrobiální infekce je plísňová infekce nehtů.

31. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, vyznačuj ίο i se tím, že mmnožství uvedeného polyfunkčního enzymu má inhibiční aktivitu vůči srůstu buňka-buňka nebo buňka-virus.

32. Farmaceutický prostředek podle nároku 20, vyznačuj ίο i se tím, že mikrobiální infekce je oční infekce a prostředek je uzpůsoben k oční aplikaci.

33. Farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci dermatologického stavu, přičemž je tento prostředek vyznačující se tím, že k ošetřování nebo prevenci dermatologického stavu je použito účinné množství enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18.

34. Farmaceutický prostředek podle nároku 33, vyznačuj ίο i se t i m, že dermatologický stav je akné, psoriáza nebo ekzém a způsob zahrnuje podávání takového množství uvedeného prostředku, které je účinné vůči akné, psoriáze nebo ekzému.

35. Farmaceutický prostředek podle nároku 34, vyznačuj ίο i se t í m, že dermatologický stav zahrnuje ekzém.

36. Farmaceutický prostředek podle nároku 33, vyznačuj íc í se tím, že dermatologický stav zahrnuje hemoroidy a prostředek obsahuje takové množství polyfunkčního enzymu, které je účinné pro léčení a prevenci hemoroidů.

37. Farmaceutický prostředek podle nároku 36, vyznačuj íc í se tím, že hemoroidy jsou poporodní hemoroidy.

38. Kosmetický prostředek k odstraňování odumřelé kůže nebo peelingu kůže od jiných částí zdravé kůže pro zlepšení vzhledu kůže, přičemž je tento prostředek vyznačuj íc í se tím, že obsahuje takové množství enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18, které je účinné pro odstraňování odumřelé kůže.

39. Farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci onemocnění • · • · · · nebo buněčný proces vybraný ze skupiny, kterou tvoří rakovina, septický šok, srůsty tkání, malárie, poruchy imunity a apoptosis, přičemž je tento prostředek vyznačující se tím, že obsahuje takové množství enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18, které je účinné z hlediska léčení nebo prevence.

40. Farmaceutický prostředek podle nároku 39 pro léčení rakoviny, vyznačující se tím, že se pro léčení nádoru používá účinné množství prostředku.

41. Farmaceutický prostředek podle nároku 40 pro prevenci nebo omezení nádorových metastáz, vyznačující se t i m, že se pro prevenci nebo inhibici nádorových metastáz použije účinné množství tohoto prostředku.

42. Farmaceutický prostředek podle nároku 39 pro léčení nebo prevencí tkáňových srůstů, vyznačující se t i m, že se k léčbě nebo prevenci používá účinné množství tohoto prostředku.

43. Farmaceutický prostředek podle nároku 42, vyznačuj ίο i se t i m, že tkáňový srůst je srůst pochva-šlacha nebo abdominální pooperační srůst.

44. Farmaceutický prostředek podle nároku 39 pro léčení nebo prevenci poruch imunity, vyznačující se tím, • ·

- 96 • · • · · · • · • · · že se podává účinné množství tohoto prostředku pro léčení nebo prevenci poruch imunity.

45. Farmaceutický prostředek podle nároku 44, vyznačuj íc í se t i m, že porucha imunity je autoimunitní onemocnění .

46. Farmaceutický prostředek pro rozpouštění krevních sraženin, vyznačující se tím, že uvedený prostředek obsahuje účinné množství enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 k rozpouštění krevních sraženin.

47. Farmaceutický prostředek pro dosažení zahojení rány, vyznačující se tím, že prostředek obsahuje účinné množství enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 k dosažení zahojení rány.

48. Farmaceutický prostředek podle nároku 47, vyznačuj íc í se tím, že před aplikací polyfunkčního enzymu rána v podstatě neobsahuje nekrotickou tkáň.

49. Farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci mikrobiální infekce rány, vyznačující se tím, že tento prostředek obsahuje účinné množství enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 k prevenci mikrobiální infekce

50. Farmaceutický prostředek podle nároku 49, vyznačuj ίο i se tím, že mikrob je rezistentní vůči lékům.

51. Farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci akutního nebo chronického zánětu, vyznačující se tím že tento prostředek obsahuje účinné množství enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 k prevenci nebo léčení zánětu.

52. Farmaceutický prostředek pro léčení nebo prevenci indikace, vybrané ze skupiny, kterou tvoří bolest, bronchitida, hemofilitická chřipka, mykoplasma v plících, infekce předkožky, dermatofýza nohou, fistulové infekce, infikované zevní vředy, infekce pupíčku u novorozeňat, vrásky, polypy, rány a jizvy, lišej plochý, vřídky, bradavice a alergické vyrážky, prostata, mastitida, zánět dásní, sinusitida, artritida a zánětlivé klouby, průjem, oční onemocnění a slabost vlasů, vyznačující se tím, že tento prostředek obsahuje účinné množství enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 k prevenci nebo léčení.

53. Farmaceutický prostředek podle nároku 52, vyznačující se tím, že oční onemocnění je zelený zákal oční nebo katary.

54. Farmaceutický prostředek pro odstraňování zubního povlaku, vyznačující se tím, že tento prostředek obsahuje účinné množství enzymu podle nároků 1 až 18 k odstranění zubního povlaku.

55. Způsob purifikace polyfunkčního enzymu majícího aktivitu, vyznačující se tím, že obsahuje alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity a má molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, • · · pro získání prostředku neobsahujícího v podstatě žádné jiné proteiny než ty, které vážou vybraný proteázový inhibitor jiný než polyfukční enzym, přičemž způsob tvoří:

(a) aplikování prostředku obsahujícího polyfunkční enzym na iontoměničovou kolonu, (b) eluování první adsorbované látky z kolony prvním vodným roztokem první iontové síly Ij, (c) eluování polyfunkčního enzymu z kolony druhým vodným roztokem druhé iontové síly Ι2» (d) aplikování eluovaného polyfunkčního enzymu z kroku (c) na afinitní matrici obsahující proteázový inhibitor, a (e) eluování afinitní matrice třetím vodným roztokem, který destabilizuje interakce mezi polyfunkčním enzymem a proteázovým inhibitorem, kde Ij je vybráno tak, že první vodný roztok (i) eluuje první adsorbovanou látku obsahující proteiny, jež se mohou vázat na proteázový inhibitor, přičemž ale proteiny adheruji na iontoměničovou kolonu slaběji než polyfunkční enzym a (ii) neeluuji polyfunkční enzym, a kde I2 je větší než a je vybráno tak, aby druhý vodný roztok eluoval polyfunkční enzym a v podstatě žádné jiné proteiny než ty, které vážou vybraný proteázový inhibitor.

56. Způsob podle nároku 55, vyznačující se t i m, že Ij je iontová síla 0,4M NaCl a I2 j^e iontová síla 0,6M NaCl.

57. Způsob podle nároku 55,vyznačuj ící se t í m, že kroky (b) a (e) se provádějí při pH mezi 5,5 a 7,5.

58.

59.

60.

Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že kroky (b) a (c) se provádějí při pH 6,2.

Způsob podle nároku 55, vyznačuj ící se tím, že iontoměničová kolona obsahuje zesíťovaný dextran a iontoměničové skupiny obsahují diethylaminoethylové (DEAE) skupiny.

Způsob podle nároku 55, vyznačuj ící se ti m, že vybraný proteázový inhibitor použitý v afinitní

61 .

matrici enzymem je rezistentní vůči vyluhování polyfunkčním Způsob podle nároku 60, v y z n a č u j ící s e tím, že proteázový inhibitor je savčí trypsinový

62.

inhibitor.

Farmaceutický prostředek pro prevenci sexuálně přenosné mikrobiální infekce, vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje preventivně účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

• · · * · «

- 100

63.

64.

65.

66.

Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 62, vyznačující se tím, že mezi sexuálně přenosné mikrobiální infekce patří kandida, gonorea, chladmya, syfilitida, trichomonas, měkký vřed, HIV, opar, papilom nebo hepatitická infekce.

Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 62, vyznačující se tím, že mikrobiální infekce je vaginální kandida infekce.

Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 62, vyznačující se tím, že mikrobiální infekce je HIV infekce.

Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci nachlazení nebo virové chřipkové infekce, vyznačující se t i m, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nachlazení nebo virové chřipkové infekce účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnujícící alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci primární nebo sekundární mikrobiální infekce u pacientů majících lepru, vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo léčení

67.

- 101 mikrobiální infekce účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnujícící alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

68. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 67, vyznačující se tím, že mikrobiální infekce je jiná infekce než infekce způsobující lepru.

69. Farmaceutický prostředek nebo složka pro léčení tkáně, tělní tekutiny nebo složení buněk k odstranění nebo inaktivaci srůstové buněčné složky, vyznaču jící se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro odstranění nebo inaktivaci srůstové buněčné složky účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnujícící alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

70. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 69, vyznačující se tím, že tkáň, tělní tekutina nebo složení buněk se léčí uvedeným enzymem a to v množství inhibujícím imunitní rejekci.

• · · · · » lt •« * · ··· · · · * · · « » · · • · · · ··«·»·

- 102 - .:..:.. .:,.:.. ..· :

71. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 70, vyznačující se tím, že tkáň, tělní tekutina nebo složení buněk se léčí mimotělně.

72. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 70, vyznačující se tím, že tkáň, tělní tekutina nebo složení buněk se léčí in šitu v těle zvířete.

73. Farmaceutický prostředek nebo složka pro čištění kontaktních čoček vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje polyfunkční enzym mající: k čištění kontaktních čoček aktivní účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnujícící alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

74. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 73, vyznačující se tím, že polyfunkční enzymový prostředek je aplikován in šitu do oka.

75. Farmaceutický prostředek nebo složka pro léčení nebo prevenci srůstového syndromu buňka-buňka nebo buňka-virus vyzná ču jící set ím, že prostředeknebo složka obsahuje protisrůstově účinné množství hydrolázy působící na odstranění nebo inaktivaci buněčné nebo virální akceptorové nebo receptorové srůstové složky, zahrnuté do srůstu buňka-buňak nebo buňka-virus.

·· ·»·»

- 103

76.

77.

78.

Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 75, vyznačující se tím, že syndrom zahrnuje zánět, šok, nádorové metastázy, autoimunitní onemocnění, transplantační rejekční reakce nebo mikrobiální infekce.

Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 75, vyznačující se tím, že (a) onemocnění je vybráno ze skupiny, kterou tvoří mikrobiální infekce, poruchy imunity, cystícká fibróza, COPD, atheroskleróza, rakovina, astma, septický šok, toxický šokový syndrom, zánět oční spojivky, reperfúzní poranění a bolest, a (b) buněčný povrchový receptor, spojený se srůstovým syndromem bUňka-buňka nebo buňka-virus, jež je vybrán ze skupiny, kterou tvoří ICAM-1, ICAM-2, VCAM-1, CD4, CD8, CDU, CD18, CD28, CD29D, CD31, CD44, CD49, CD62L, CD102 a asialo GM1 ceramid je odstraněn nebo inaktivován podávanou hydrolázou.

Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 77, vyznačující se tím, že mikrobiální infekce je: opar, HIV, hepatitidová nebo papilomová infekce, infekce způsobující kolitidu, vřed nebo průjem, infekce kandida, nachlazení nebo chřipková infekce, pseudomonas, hemofilus, stafylokokus, streptokokus, klepsiella nebo E. coli infekce, primární nebo sekundární infekce lepry, nebo infekce způsobující zánět dásní.

Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci infekce koronavirus, cytomegalovirus, rinovirus nebo papiloma, vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo léčení infekce

79.

104 účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnujícíc alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

80. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 79, vyznačující se tím, že infekce je koronavirová infekce způsobující infekční peritonitidu.

81. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 79, vyznačující se tím, že infekce je lidská papilomavirová infekce.

82. Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci nebo léčení HIV infekce, vyznačuj ící se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo léčení HIV infekce účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exO peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

83. Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci nebo léčení orální nebo jícnové plísňové infekce, vyznačující se tím, že prostředek nebo

105 složka obsahuje pro prevenci nebo léčení plísňové infekce účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

84. Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci nebo léčení lišejové nebo pseudomonas, kandida, gonorea, chladmya, syfilis, trichomonas nebo chankroidové infekce, vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo léčení mikrobiální infekce účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

85. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 84, vyznačující se tím, že se zabraňuje nebo se léčí infekce, jíž je vaginální nebo orální kandida infekce.

86. Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci, zmenšení nebo odstranění korneální jizvy, vyznaču jící se t i m, že prostředek nebo složka obsahuje

106 pro prevenci, zmenšení nebo odstranění korneální jizvy účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

87. Farmaceutický prostřede nebo složka podle nároku 86, vyznačující se tím, že je určen k podávání polyfunkčního enzymu ve spojení s oční operací k prevenci utvoření korneální jizvy.

88. Farmaceutický prostředek nebo složka pro použití při způsobu léčeni nebo prevence zánětu očních spoj ivek, vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo léčení zánětu očních spojivek účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

89. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 88, vyznačující se tím, že zánět očních spoj i vek je virový, bakteriální nebo alesrgický zánět očních spojivek.

107

90. Farmaceutický prostředek nebo léčení nemocí nebo skupiny, kterou tvoří nebo složka pro prevenci buněčného procesu vybraného ze cystická fibróza, COPD, ateroskleróza, astma, toxický šokový syndrom, reperfúzní poranění, kolitida, enteritis a malárie infekce spojené s vyznačující se tím, že prostřesložka obsahuje pro prevenci nebo léčení účinné bolestmi, dek nebo množství enzymu majícího: aktivitu chymotrypsinové, trypsinové, (a) polyfunkčního zahrnující alespoň jednu z kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

91. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 90, pro léčení pacientů majících cystickou fibrózu nebo COPD, vyznačující se tím, že tento prostředek nebo složka obsahuje účinné množství pro léčení cystické fibrózy nebo COPD.

92. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 90, pro léčení nebo prevenci aterosklerózy, vyznačuj í cí se tím, že tento prostředek nebo složka obsahuje účinné množství pro léčení nebo prevenci aterosklerózy.

93. Farmaceutický prostředek nebo složka podie nároku 90, pro léčení nebo prevenci astma, vyznačující se t i m, že tento prostředek nebo složka obsahuje účinné množství pro léčení nebo prevenci astma.

108

94. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 90, pro léčení septického šokového nebo toxického šokového syndromu vyznačující se tím, že tento prostředek nebo složka obsahuje účinné množství pro léčení septického šokového nebo toxického šokového syndromu.

95. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 90, pro prevenci nebo omezeni reperfúzního poranění, vyznačující se tím, že tento prostředek nebo složka obsahuje účinné množství pro prevenci nebo omezení reperfúzního poranění.

96. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 90, pro zmenšení bolesti spojené s malárickou infewkcí, vyznačující se tím, že tento prostředek nebo složka obsahuje účinné množství pro zmenšení bolesti spojené s malárickou infekcí.

97. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 90, pro léčení nebo prevenci kolitidy nebo enteritidy, vyznačující se tím, že tento prostředek nebo složka obsahuje účinné množství pro léčení nebo prevenci kolitidy nebo enteritidy.

98. Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevencí nebo léčení poruch autoimunity, vyznačující se t i m, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo léčení poruch autoimunity účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsínové, trypsinové, kolagenasové,

109 elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

99. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 98, vyznačující se tím, že porucha autoimunity je vybrána ze skupiny, kterou tvoří roztroušená skleróza, revmatická artritida, lupus erythematodes, vaskulitida, temporální arteritida, primární biliární cirhóza, aktivní chronická hepatitida, ulcerativní kolitida a sklerodermie.

100. Farmaceutický prostředek nebo složka pro inhibici nebo prevenci procesu apoptosis, vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo inhibici apoptosis účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

101. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 100, vyznačující se tím, že buňky jsou T-buňky pacientů infikovaných HIV.

102. Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci nebo léčení poporodních hemoroidů, vyznačuj ící

110 se t i m, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo léčení hemoroidů účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

103. Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci nebo léčení infekcí způsobených mikroby, rezistentními vůči lékům, vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo léčení infekcí zůsobených mikroby, rezistentními vůči lékům, účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

104. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 103, vyznačující se tím, že mikxob je vůči chinolinu rezistentní bakterie.

105. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 103, vyznačující se tím, že mikrob je vůči methicilinu rezistentní bakterie.

106. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 103,

111 vyznačující se tím, že mikrob je houba.

107. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 106, vyznačující se tím, že houba je rezistentní vůči lékům azolového typu.

108. Farmaceutický prostředek nebo složka podle nároku 107, vyznačující se tím, že houba je rezistentní vůči fluconazolu.

109. Farmaceutický prostředek nebo složka pro odstranění nebo inaktivaci povrchově srůstových buněk, vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro odstranění nebo inaktivaci povrchově srůstových buněk účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

110. Farmaceutický prostředek nebo složka pro prevenci nebo léčení buňka-buňka nebo buňka-virus srůstového syndromu, vyznačující se tím, že prostředek nebo složka obsahuje pro prevenci nebo léčení buňka-buňka nebo buňka-virus srůstového syndromu účinné množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE,

112 a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

111. Použití prostředku obsahujícího enzym podle jednoho z nároků 1 až 18 při výrobě léků k léčení nebo prevenci mikrobiální infekce.

112. Použití podle nároku 111, kde lék je pro léčení nebo prevenci virové mikrobiální infekce.

113. Použití podle nároku 112, kde lék je pro léčení nebo prevenci virové infekce opar, HIV, hepatitida, koronavirus, cytomegalovirus, rinovirus nebo papiloma.

114. Použití prevenci podle nároku infekce HSV-1, 113, kde lék je pro HSV-2 nebo pásový opar. léčení nebo 115. Použití prevenci podle nároku infekčního geni 113, kde lék tálního oparu. je pro léčení nebo 116. Použit í podle nároku 112, kde lék je pro léčení nebo prevenci mikrobiální infekce, gastrointestinální onemocnění. která způsobuj* 117. Použit í podle nároku 116, kde lék je pro léčení nebo

prevenci gastrointestinálního onemocněni, jímž je vřed nebo průjem.

113

118. Použití podle nároku 111, plísňové infekce. kde lék je pro léčení nebo prevenci 119. Použití prevenci podle nároku 118, systemické plísňové kde lék infekce. je pro léčení nebo 120. Použití podle nároku 118, kde lék je pro léčení nebo prevenci infekce. kožní, orální, vaginální nebo jícnové plísňové 121. Použití podle nároku 118, kde lék je pro léčení nebo

prevenci plísnové infekce nehtů.

122. Použití podle nároku 111, kde množství polyfunkčního enzymu v každé vyrobené dávkové formě má inhibiční aktivitu vůči buňka-buňka nebo buňka-virus srůstu.

123. Použití podle nároku 111, kde lék je pro léčení nebo prevenci oční infekce a je vyráběn pro oční aplikace.

124. Použití prostředku obsahující enzym podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci dermatologického stavu.

125. Použití podle nároku 124, kde lék je pro léčení nebo prevenci akné, psoriázy nebo ekzému.

124, kde lék je pro léčení nebo lék je vyráběn pro aplikaci při

- 114

126. Použití podle nároku prevenci hemoroidů a hemoroidech.

127

Použití podle nároku prevenci hemoroidů a hemoroi dech.

124, kde lék je pro léčení nebo lék je vyráběn pro aplikaci při

128. Použití prostředku obsahujícího enzym podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu zevního kosmetického prostředku pro odstranění odumřelé kůže nebo její peeling z jinak zdravé kůže pro zlepšení vzhledu kůže.

129. Zevní kosmetický prostředek vyznačující se t tm, že obsahuje enzym podle nároků 1 až 18, a krémový, gelový nebo čípkový prostředek.

130. Použití prostředku obsahujícího enzym podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci nebo buněčný proces vybraný ze skupiny, kterou tvoří rakovina, septický šok, tkáňové srůsty, malárie, poruchy imunity a aptosis.

131. Použití podle nároku 130, kde lék je pro léčení rakoviny.

132. Použití podle nároku 131, kde lék je pro prevenci nebo omezení nádorových metastáz podáván v takovém množství • · · ·· ······ • ···· ·· · • · · · · · • · · ··»··· • · ♦ · · ··· ····<·· (I ·

- 115 polyfunkčního enzymu, které působí na jejich prevenci nebo inhibici.

133.

Použití podle nároku 130, prevenci tkáňových srůstů.

kde lék je pro léčení nebo

134.

Použití podle nároku 133, kde prevenci tkáňového srůstu, jímž nebo abdominální pooperační srůst.

lék je pro léčení nebo je srůst šlacha-pochvy

135 .

Použiti podle prevenci poruch nároku 130, imunity.

kde lék je pro léčení nebo

136.

Použití prevenci podle nároku 135, poruchy imunity, jíž kde lék je pro léčení nebo je autoimunitní onmeocnění.

137.

138.

Použití prostředku obsahujícího enzym podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku na rozpouštění krevních sraženin.

Použití prostředku obsahujícího enzym podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku k dosažení zahojení rány.

Použití podle nároku 138, kde lék je pro dosažení zahojení rány, která v podstatě neobsahuje nekrotickou tkáň.

139.

• · · ·· ··»#·♦

- 116 - • · • ♦ · 9 * • · · · · • · · » · · · • · · · 140. Použití prostředku obsahujícího enzym podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku mikrobiální infekce v ráně. k léčení nebo prevenci 141 . Použití podle nároku 140, kde mikrob j e vůči lékům

rezistentní mikrob.

142. Použití prostředku obsahuj ícího enzym podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku k léčeni nebo prevenci akutního nebo chronického zánětu. 143. Použití prostředku obsahuj ícího enzym podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku k léčení nebo prevenci indikací , vybraných ze skupiny, kterou tvoří bolest,

bronchitida, hemofilitická chřipka, mykoplasma v plících, infekce předkožky, dermatofýza nohou, fistulové infekce, infikované zevní vředy, žaludeční vředy, pupíčková infekce u novorozeňat, vrásky, polypy, jizvy a keloidy, lišej, vřídky, bradavice a alergické vyrážky, prostata, mastitida, zánět dásní, sinusitida, artritida a záněty kloubů, průjem, oční nemoci a slabost vlasů.

144. Použití prevenci podle šedého nároku 143, kde i nebo lék j e katarů. pro léčení nebo zákalu očního 145. Použ i t i prevenci podle bolesti nároku 143, kde lék je pro léčení nebo 146. Použ i t i podle nároku 143, kde lék je pro léčení nebo

• · prevenci bronchitidy.

147. Použití podle nároku 143, kde lék je pro léčení nebo prevenci infekční hemolitické chřipky, mykoplasmy v plících, infekci předkožky, dermatofýzy nohou, fistulové infekce, infikovaných zevních vředů a pupíčkových infekcí u novorozeňat.

148. Použití prevenci podle nároku 143, žaludečních vředů. kde lék je pro léčení nebo 149 . Použití prevenci podle nároku 143, kde polypů, jizev a keloidů. lék je pro léčení nebo 150. Použití prevenci podle nároku 143, vřídků, bradavic a kde lék je pro léčení nebo alergických vyrážek. 151 . Použití prevenci podle nároku 143, prostaty. kde lék je pro léčení nebo 152. Použití prevenci podle nároku 143, mastitidy. kde lék je pro léčení nebo 153. Použití prevenci podle nároku 143, zánětu dásní. kde lék je pro léčení nebo 154. Použi tí podle nároku 143, kde lék je pro léčení nebo

• · · · • * · ·

- 118 prevenci sinusitidy.

155. Použití prevenci podle nároku 143, artritidy a zánětů kde kloubů lék je pro léčení nebo 156. Použití podle nároku 143, kde lék je pro léčení nebo prevenci průj mu. 157. Použití podle nároku 143, kde lék je pro léčení nebo

prevenci lišeje.

158. Použití prostředku obsahujícího enzympodle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku k odstranění zubního povlaku.

159. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci sexuálně přenosných mikrobiálních infekcí.

160. Použití podle nároku 159, kde prevenci kandida, gonorei, trichomonas, chancroid, HIv, hepatitické infekce.

lék je pro léčení nebo chladmyi, syfilitidy, opar, papiloma nebo • · • · ·

- 119

161. Použití podle nároku 159, kde lék je pro léčení nebo prevenci vaginální kandida infekce.

162. Použití podle nároku 159, kde lék je pro léčení nebo prevenci HIv infekce.

163. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chyraotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro prevenci nebo léčení nachlazení nebo virové chřipkové infekce.

164. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezí 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu prostředku na čištění kontaktních čoček.

165. Použití podle nároku 164, kde lék je pro léčení nebo prevenci mikrobiální infekce nebo jiné infekce, než je infekce působící lepru.

166. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující • · · · 4

- 120 alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro mimotělní léčení tkáně, tělních tekutin nebo buněk k odstranění nebo inaktivaci buněčné srůstové složky.

167. Použití podle nároku 166, kde každá dávková léková forma léku je vyráběna s takovým množstvím enzymu, které působí inhibici imunitní rejekce.

168. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu prostředku pro čištění kontaktních čoček.

169. Použití podle nároku 168, kde prostředek s polyfunkčním enzymem je vyráběn pro in šitu použití v oku.

170. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu • · ·

- 121 podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci buňka-buňka nebo buňka-virus srůstového syndromu.

171. Použití podle nároku 170, kde lék je pro léčení nebo prevenci zánětu, šoku, nádorových metastáz, poruch autoimunity, transplantačních rejekčních reakcí nebo mikrobiálních infekcí.

172. Použití podle nároku 170, kde lék je pro léčení nebo prevenci onemocnění vybraných ze skupiny, kterou tvoří mikrobiální infekce, poruchy imunity, cystická fibróza, COPD, ateroskleróza, rakovina, astma, septický šok, toxický šokový syndrom, zánět dásní, reperfúzní poranění a bolest, a (b) každá dávková léková forma léku je účinná k odstranění nebo inaktivaci buněčného povrchového receptoru spojeného s buňka-buňka nebo virus-buňka srůstovým syndromem vybraným ze skupiny, kterou tvoří 1CAM-1, 1CAM-2, VCAM-1, CD4, CD8, CDU, CD18, CD28, CD29D, CD31 , CD44, CD49, CD62L, CD102 a asialo GM1 ceramid.

173. Použití podle nároku 172, kde lék je pro léčení nebo prevenci: opar, HIV, hepatitícká nebo papilomová infekce, infekce způsobující kolitidu, vřed nebo průjem, kandida infekce, nachlazení nebo infekční chřipka, infekce pseudomonas, haemophilus, staphylococcus, streptococcus, klebsiella nebo E. coli, primární nebo sekundární infekce lepry, infekce způsobující zánět dásní.

174. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové,

- 122 elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci koronavirus, cytomegalovirus nebo papilomavirus infekce.

175. Použití podle nároku 174, kde lék je pro léčení nebo prevenci infekce koronavirus způsobující infekční peri tonitidu.

176. Použití podle nároku 174, kde lék je pro léčení nebo prevenci papilomavirus infekce.

177. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro odstranění HIV infikovaných T-buněk z ex-νίνο ošetřených T-buněk.

178. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu

- 123 podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčeni nebo prevenci orální nebo jícnové plísňové infekce, syndromu.

179. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci lišeje nebo pseudomonas, kandida, gonorea, chladmya, syfilis, trichomonas nebo chancroid infekce.

180. Použití podle nároku 179, kde lék je pro léčení nebo prevenci vaginální nebo orální kandida infekce.

181. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci buňka-buňka nebo buňka-virus srůstového syndromu.

182. Použití podle nároku 181, kde lék je vyráběn pro použiti spolu s oční operací pro prevenci tvorby korneální jizvy.

- 124

183. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci zánětu oční spojivky.

184. Použití podle nároku 183, kde lék je pro léčení nebo prevenci virového, bakteriálního nebo alergického zánětu oční spojivky.

185. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci onemocnění nebo buněčného procesu vybraného ze skupiny, kterou tvoří cystická fibróza, COPD, ateroskleróza, astma, toxický šokový syndrom reperfúzní poranění, kolitida, enteritida a maláriová infekce spojená s bolestí.

186. Použití podle nároku 185, kde lék je pro léčení nebo prevenci cystické fibrózy nebo COPD.

187. Použití podle nároku 186, kde každá vyrobená dávková léková forma obsahuje k léčení cystické fibrózy nebo COPD

188.

189.

190.

191.

192.

193.

- 125 účinné množství polyfunkčního enzymu.

Použití podle nároku 185, kde lék je pro léčení nebo prevenci aterosklerózy.

Použití podle nároku 188, kde každá vyrobená dávková léková forma obsahuje k léčení aterosklerózy účinné množství polyfunkčního enzymu.

Použití podle nároku 185, kde lék je pro léčení nebo prevenci astma.

Použití podle nároku 190, kde každá vyrobená dávková léková forma obsahuje k léčení astma účinné množství polyfunkčního enzymu.

Použití podle nároku 185, kde lék je pro léčení septického šoku nebo toxického šokového syndromu.

Použití podle nároku 192, kde každá vyrobená dávková léková forma obsahuje k léčení septického šoku nebo toxického šokového syndromu účinné množství polyfunkčního enzymu.

Použití podle nároku 185, kde lék je pro prevenci nebo omezení reperfúzního poranění.

194.

126

195. Použití podle nároku 194, kde každá vyrobená dávková léková forma obsahuje k prevenci nebo omezení reperfúzního poranění účinné množství polyfunkčního enzymu.

196. Použití podle nároku 185, kde lék je pro zmenšení bolesti spojené s malárickou infekcí. 197. Použití podle nároku 196, kde každá vyrobená dávková léková f orma obsahuj e dávku účinného množství

polyfunkčního enzymu pro zmenšení bolesti spojené s malárickou infekcí.

198. Použití podle nároku 185, kde lék je pro léčení nebo prevenci kolitidy nebo enteritidy.

199. Použití podle nároku 199, kde každá vyrobená dávková léková forma obsahuje dávku účinného množství polyfunkčního enzymu pro léčení kolitidy nebo enteritidy.

200. Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci autoimunitních onemocnění.

201. Použití podle nároku 200, kde je autoimunitní onemocnění

202.

203.

204.

vybráno ze skupiny, kterou tvoří roztroušená skleróza, revmatická artritida, lupus erythematodes, vaskulitida, temporální arteritida, primární žlučová cirhóza, aktivní chronická hepatitida, ulcerativní kolitida a sklroderma.

Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro inhibici nebo prevenci procesu apoptosis v buňkách při ohrožení apoptosis.

Použití podle nároku 203, kde lék je pro inhibici nebo prevenci apoptosisi v T-buňkách od HIV pacientů.

Použití buď (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro léčení nebo prevenci poporodních hemoroidů.

Použití polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE,

205.

- 128 - a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18 pro výrobu léku pro inhibici nebo prevenci infekce způsobené mikroby, jež jsou rezistentní vůči lékům.

206 . Použití rezister podle ítní vůči nároku 205, chinolinu. kde mikrob je bakterie 207. Použ i t í podle nároku 205, kde mikrob je bakterie rezistentní vůči methicilinu. 208. Použití podle nároku 205, kde mikrob je plíseň.

209. Použití podle nároku 205, kde plíseň je rezistentní vůči lékům azolového typu.

210. Způsob odstraňování odumřelých kožních buněk nebo peeling kůže od jinak zdravé kůže pro zlepšení vzhledu aplikováním vůči odstraňování účinného množství prostředku, vyznačující se t í m, že prostředek obsahuje enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

211. Způsob odstraňování zubního povlaku vyznačuj ící se ΐ í m, že se aplikuje vůči odstraňování zubního povlaku účinné množství enzymu podle nároků 1 až 18.

212. Způsob prevence sexuálně přenosných mikrobiálních infekcí, « · » · · ·

- 129

213.

214.

215.

vyznačující se tím, že se aplikuje antikoncepce s vůči mikrobiální infekci preventivně působícím účinným množstvím (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasová, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzymu podle jednoho z nároků 1 až 18.

Způsob podle nároku 212, vyznačující se t í m, že mezi sexuálně přenosné mikrobiální infekce patří kandida, gonream chladmya, syfilitida, trichomonas, chancroid, papiloma nebo hepatitická infekce.

Způsob podle nároku 213, vyznačující se tím, že mikrobiální infekce je vaginální kandida infekce.

Způsob podle nároku 213, vyznačující se tím, že mikrobiální infekce je HIV infekce.

množství maj ící:

prostředku aktivitu

Způsob čištění kontaktních čoček, vyznačuj ící se tím, že se na kontaktní čočky aplikuje účinné obsahujícího (a) polyfunkční enzym zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou

216.

• ·

- 130 pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.

217. Způsob podle nároku 216, vyznačující se tím, že enzymový prostředek je aplikován in šitu do oka.

218. Antikoncepční prostředek vyznačující se tím, že obsahuje vůči mikrobiální infekci preventivně působící množství (a) polyfunkčního enzymu majícího: aktivitu zahrnující alespoň jednu z chymotrypsinové, trypsinové, kolagenasové, elastasové nebo exo peptidasové aktivity, molekulovou hmotnost mezi 20 kd a 40 kd jak je určeno podle SDS PAGE, a je v podstatě homologický s polyfunkční hydrolázou pocházející z drobného korýšovitého planktonu, nebo (b) enzym podle jednoho z nároků 1 až 18.