CZ22766U1 - Sada pro přípravu protínádorové vakcíny a protinádorová vakcína - Google Patents
Sada pro přípravu protínádorové vakcíny a protinádorová vakcína Download PDFInfo
- Publication number
- CZ22766U1 CZ22766U1 CZ201124705U CZ201124705U CZ22766U1 CZ 22766 U1 CZ22766 U1 CZ 22766U1 CZ 201124705 U CZ201124705 U CZ 201124705U CZ 201124705 U CZ201124705 U CZ 201124705U CZ 22766 U1 CZ22766 U1 CZ 22766U1
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- tumor
- vaccine
- lysate
- cells
- patient
- Prior art date
Links
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims description 26
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 8
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 76
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 29
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 claims description 16
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 claims description 12
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 claims description 11
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 claims description 10
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 claims description 10
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 claims description 9
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 claims description 9
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 claims description 8
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 claims description 7
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 claims description 7
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 claims description 5
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 claims description 5
- 229940029030 dendritic cell vaccine Drugs 0.000 claims description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 24
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 17
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 11
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 11
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 9
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 9
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 7
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 5
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 4
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 4
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 239000012591 Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline Substances 0.000 description 3
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 3
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 208000035049 Blood-Borne Infections Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 2
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 2
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 2
- 241000237988 Patellidae Species 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 108010076089 accutase Proteins 0.000 description 2
- 238000011398 antitumor immunotherapy Methods 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 231100000050 cytotoxic potential Toxicity 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 108060003552 hemocyanin Proteins 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 2
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 2
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 2
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 2
- 229960000714 sipuleucel-t Drugs 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 2
- 208000006379 syphilis Diseases 0.000 description 2
- 102100035793 CD83 antigen Human genes 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101000946856 Homo sapiens CD83 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000946889 Homo sapiens Monocyte differentiation antigen CD14 Proteins 0.000 description 1
- 101000914484 Homo sapiens T-lymphocyte activation antigen CD80 Proteins 0.000 description 1
- 206010062904 Hormone-refractory prostate cancer Diseases 0.000 description 1
- 241000542855 Megathura crenulata Species 0.000 description 1
- 206010027480 Metastatic malignant melanoma Diseases 0.000 description 1
- 102100035877 Monocyte differentiation antigen CD14 Human genes 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010057249 Phagocytosis Diseases 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 208000007660 Residual Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102100027222 T-lymphocyte activation antigen CD80 Human genes 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011360 adjunctive therapy Methods 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005809 anti-tumor immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006023 anti-tumor response Effects 0.000 description 1
- 210000000612 antigen-presenting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 238000013475 authorization Methods 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000002659 cell therapy Methods 0.000 description 1
- 208000011654 childhood malignant neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 1
- 239000013256 coordination polymer Substances 0.000 description 1
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 1
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000012595 freezing medium Substances 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 230000003394 haemopoietic effect Effects 0.000 description 1
- 210000002443 helper t lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 102000046157 human CSF2 Human genes 0.000 description 1
- 230000008076 immune mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007885 magnetic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000021039 metastatic melanoma Diseases 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015286 negative regulation of phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 201000003733 ovarian melanoma Diseases 0.000 description 1
- 230000008782 phagocytosis Effects 0.000 description 1
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 229940121896 radiopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 239000012217 radiopharmaceutical Substances 0.000 description 1
- 230000002799 radiopharmaceutical effect Effects 0.000 description 1
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Oblast techniky
Technické řešení se týká protinádorové vakcíny s obsahem dendritických buněk (DB) a sady pro přípravu této protinádorové vakcíny.
Dosavadní stav techniky
Dendritické buňky (DB) představují buňky imunitního systému, které tvoří spojení mezi nativními a adaptivními mechanismy imunity. Nacházejí se především v kůži, ve sliznicích a v malé míre také v dalších tkáních a krvi. Jejich hlavní funkcí je zpracování a prezentace antigenů (cizorodého materiálu) tak, aby byla cíleně a účinně nastartována imunitní odpověď v případě, že daný antigen je DB rozpoznán jako nebezpečný. DB se vyvíjí z hematopoetických prekurzorů v kostní dřeni do myeloidní nebo lymfoidní DB. Za fyziologických okolností se v těle vyskytují především tzv. „nezralé“ DB, udržují stav tolerance imunitního systému, zejména k vlastním proteinům, molekulám a buňkám. Nezralé DB mají velmi dobrou schopnost fagocytózy, která slouží k pohlcování pevných částic, včetně cizorodých antigenů. Pokud je takový antigen rozpoznán jako nebezpečný, dojde k postupnému vyzrávání DB a jejímu vycestování z tkáně do lymfatické uzliny. Vyzrávání DB spočívá v utlumení fagocytózy nových částic a dochází k expresi molekul HLA (human leukocyte antigen) I. i II. třídy, kteréjsou nezbytné pro cílenou a specifickou aktivaci T lymfocytů v lymfatické uzlině. T lymfocyty představují výkonnou složku imunitního systému, která na základě informace předané od „zralých“ DB je schopna produkovat potřebné cytokiny (pomocné Th lymfocyty) a cytotoxický potenciál vůči cílovým antigenům (cytotoxické Tc lymfocyty). Pomocné Th lymfocyty můžeme rozdělit na Thl a Th2. Thl lymfocyty mají schopnost produkovat spektrum cytokinů (zejména interferon gama), které aktivují Tc lymfocyty a dále tak zvyšují jejich cytotoxický potenciál, který pak lze s výhodou využít v protinádorové imunoterapii. Th2 lymfocyty zodpovídají za stimulaci B lymfocytů a tvorbu protilátek, v protinádorové imunitě se výrazněji neuplatňují. Pro aktivaci Thl lymfocytů jsou důležité cytokiny ze skupiny interleukinu IL-12, které produkují některé zralé DB, DB1, které produkují IL12 a polarizují tak imunitní odpověď aktivací Thl lymfocytů, jsou v současné době považovány za důležité pro protinádorovou imunoterapii.
DB mají tedy centrální úlohu při iniciaci imunitní odpovědi, která je zprostředkována T lymfocyty. DB tak fungují jako profesionální antigen-prezentující buňky, které jsou schopny cíleně prezentovat antigeny (včetně nádorových) a efektivně tak stimulovat imunitní odpověď cílenou proti danému antigenů. Je možné využít tyto buňky k léčbě nádorových onemocnění. Po vakcinaci pacienta DB připravených in vitro je možné využít aktivaci vlastního imunitního systému, zejména pomocných a cytotoxických T lymfocytů pacienta in vivo. S rostoucími poznatky z oblasti imunobiologie DB se vyvíjejí postupy jejich přípravy pro dosažení optimálních vlastností, za které se v současné době považuje zejména imunofenotyp, produkce cytokinů IL-12 a schopnost stimulovat vlastní i alogenní T lymfocyty.
Prekurzory DB jsou standardně získány z periferní krve leukaferézou. Leukaferéza znamená odsátí frakce bílých krvinek z plné krve, přičemž červené krvinky a krevní plazma se vracejí zpět do krevního oběhu pacienta. Z těchto bílých krvinek jsou pak následně izolovány monocyty, které mají schopnost přilnavosti k povrchům. Monocyty představují výchozí surovinu - prekurzor DB.
V současné době probíhají klinické studie, které ukazují přínos různě připravených DB u některých vybraných nádorových onemocnění (karcinom prostaty, melanom, glioblastom a další). V případě léčby karcinomu prostaty byla prokázána účinnost vakcíny na bázi DB naložená jediným nádorovým antigenem v klinické studii fáze ΠΙ a tato vakcína pod názvem Sipuleucel-T byla registrována v USA pro léčbu hormonálně refraktemího karcinomu prostaty (Kantoff, et al. N Engl J Med 2010, 363: 479-81). Studie se účastnilo 512 pacientů, z toho 341 pacientů dostávalo
-1 CZ 22766 Ul vakcínu a 171 pacientů dostávalo placebo. Výsledkem studie byl průkaz prodloužení mediánu přežití o 4,1 měsíce (z přibližně 22 na 26 měsíců) s využitím Sipuleucel-T oproti placebu. Jedná se zatím o jedinou klinickou studii, která přípravek na bázi DB dovedla k jeho registraci americkou FDA. Nevýhodou takového postupu však může být použití pouze jediného nádorového antigenu oproti lyzátu nádorové tkáně, který obsahuje kompletní spektrum nádorových antigenů a protinádorová odpověď tak může být podstatně širší a účinnější. Příkladem takového přistupuje klinická studie využívající vakcinace DB u pacientů s glioblastomem, kdy standardní léčbou lze dosáhnout mediánu přežití 12 až 14 měsíců, při použití vakcíny na bázi autologních DB naložených autologním lyzátem glioblastomových nádorových buněk v kombinaci se standardní léčbou lze dosáhnout až 24 měsíční medián přežití (Ardon H, et al. J Neurooncol 2010, 99: 261-72). Nevýhodou této studie je fakt, že nádorový lyzát byl získán pouze od samotného pacienta, a tedy pouze pacienti schopní podstoupit neurochirurgický operační zákrok se mohli účastnit této léčby. Pacienti, u kterých nebylo možné provést operační zákrok pro získání nádorového antigenů tak byli vyloučeni z této léčby. Další nevýhodou bylo použití DB bez prokazatelné produkce IL-12, což mohlo ovlivnit efektivitu vakcinace. Konečně při léčbě metastázujícího melanomu bylo velmi dobrých výsledků dosaženo v klinické studii fáze II pomocí vakcíny na bázi DB, která byla naložena nádorovými antigeny z lyzátu autologní nádorové linie (Dillman RO, et al. Cancer Biother Radiopharmaceut 2009, 24: 311-9). Pokud byla vakcinace prováděna pouze nádorovou linií, medián přežití byl 31 měsíců, zatímco při využití vakcíny na bázi DB naložených lyzátem z autologní nádorové linie byl medián přežití signifikantně prodloužen na 64 měsíců s pětiletým přežitím 54 % takto léčených pacientů. Nevýhodou této studie je opět autologní přístup, neboť ne u všech pacientů lze získat a vypěstovat vlastní nádorovou linii pro využití vlastních antigenů, a také podání DB bez prokazatelné produkce IL-12. Vakcína na bázi DB, které produkují dostatečné množství IL-I2, byla rovněž popsána (Dohnal A, et al. Cytotherapy. 2007, 9: 755-70), Tato vakcína využívá standardní kultivace nezralých DB pomocí GM-CSF a IL-4 v médiu AIM-V a maturace pomocí LPS a ΙΡΝγ. Vakcína však byla užita v kombinaci s autologním nádorovým lyzátem, což značně omezuje její rozšíření a nelze jí využít u pacientů, u kterých není dostupná vlastní nádorová tkáň. Výsledky této studie fáze I u dětských onkologických pacientů ukázaly dobrou snášenlivost a navození imunitní odpovědi u těžce předléčených pacientů.
Předkládané technické řešení si klade za cíl poskytnout sadu pro přípravu protinádorové vakcíny a výslednou protinádorovou vakcínu umožňující přednostní aktivaci cytotoxických T lymfocytů a širší využití, tj. vakcínu nezávislou na autologním nádorovém lyzátu.
Podstata technického řešení
Předmětem předkládaného technického řešení je sada pro přípravu protinádorové vakcíny na bázi dendritíckých buněk z monocytů krve, která obsahuje cytokiny rekombinantní lidský interleukin IL-4 a rekombinantní lidský granulocyty a monocyty kolonie stimulující faktor GM-CSF, lipopolysacharid (LPS) a interferon gama (IFN-γ), médium, a alespoň dva rozdílné nádorové lyzáty ze stejného typu nádoru.
S výhodou je médiem DB médium CellGro, které je vhodné rovněž pro klinické použití. Toto médium je komerčně dostupné a má standardizované složení.
Ve výhodném provedení technického řešení jsou nádorové lyzáty kombinací alespoň jednoho nádorového lyzátu získaného od pacienta a alespoň jednoho nádorového lyzátu z nádorové linie.
V jiném výhodném provedení technického řešení jsou nádorové lyzáty kombinací iyzátů alespoň dvou nádorových linií stejného typu nádoru.
Příprava vakcíny na bázi dendritíckých buněk s pomocí sady podle předkládaného technického řešení probíhá tak, že se monocyty z krve kultivují za standardních podmínek (v inkubátoru v atmosféře 5% CO2 pri 37 °C) po dobu 6 dnů v přítomnosti cytokinů rekombinantního lidského interleukinu ILM a rekombinantního lidského granulocyty a monocyty kolonie stimulujícího faktoru (GM-CSF) na nezralé dendritické buňky, které se dále kultivují v přítomnosti cytokinů
-2CZ 22766 Ul rekombinantního lidského IL-4 a rekombinantního lidského GM-CSF a v přítomnosti alespoň dvou rozdílných nádorových lyzátů ze stejného typu nádoru a s následným přídavkem lipopolysacharidu (LPS) a interferonu gama (IFN-γ) na zralé dendritické buňky. GM-CSF a IL-4 jsou standardně používány pro in vitro přípravu DB z monocytů periferní krve. Molekuly LPS a IFN-γ umožní plné vyzrání DB a produkci IL-12, Získání dostatečného množství DB je zabezpečeno leukaferézou, což je standardně používaný postup k izolaci bílých krvinek z periferní krve. Použitím kombinace nádorových antigenů, což nebylo známo ve stavu techniky, je protinádorový efekt takto připravené vakcíny prohlouben. Navíc v situaci, kdy není dostupný autologní nádor, lze využít nádorové linie nebo kombinace více nádorových linií se stejným typem nádoru, jako je io nádor pacienta.
Nádorový lyzát se s výhodou připraví z nádorové tkáně rozmělněním a protlačením přes vhodné sítko (např. 100 pm). Výhodně je dárce nádorové tkáně podroben testům na přítomnost krví přenosných chorob, jako je HIV, hepatitida a syfilis, v případně pozitivního výsledku testu tkáň není použita.
Dalším předmětem předkládaného technického řešení je protinádorová vakcína na bází dendritických buněk, jejíž podstata spočívá v tom, že obsahuje dendritické buňky produkující interleukin 12 (IL-12) a prezentující antigeny alespoň dvou nádorových linií stejného typu nádoru nebo antigeny nádorových buněk získaných od pacienta a alespoň jedné nádorové linie ze stejného typu nádoru.
Vakcína na bázi dendritických buněk může být využita jako doplňková léčba pro pacienty s glioblastomem, renálním karcinomem, ovariálním karcinomem a melanomem, pokud je naložena příslušným lyzátem nádorové tkáně z jednotlivých typů nádorů a nádorových linií. Je určena jednak k individuálnímu podávání v případech indikovaných příslušným ošetřujícím lékařem nebo k testování v rámci klinických studií v souladu s ES č. 1394/2007, směrnicí 2001/83/ES a se zákonem o léčivech č. 378/2007.
Léčebného efektu se dosáhne zejména u přísně indikovaných pacientů nejlépe v situaci, kdy je standardní léčbou navozena parciální nebo kompletní remise, případně, když se jedná o tzv. minimální zbytkovou chorobu, kdy pacientův imunitní systém není oslaben natolik, aby to znemožňovalo jeho aktivaci pomocí vakcíny. V těchto situacích lze očekávat maximální efekt vakcíny.
Příklad provedení technického řešení
Příprava nádorového lyzátu.:
Reagencie
- DPBS (Dulbecco's Phosphate Buffered Salině, 10* PBS), (Lonza, No.: BE17-515F)
- HBSS (Hanks' Balanced Salt Solution), (Lonza, No.: BE10-547F nebo BE10-527F)
- Injekční voda Aqua pro iniectione ardeapharma (Ardeapharma, No.: 76/926/95-C), Sterile water for injection Fresenius (Fresenius Kabi, No.: 87/405/97-C) nebo Aqua pro injectione (B. Braun, No.: 87/02/98-C)
- KLH: Hemocyanin, Keyhole Limpet, Megat hurá crenulata, glycerol (Calbiochem, No.: 374817)
- Reagencie NaCl 0,9 % Sodium chloride in water for injectione (Fresenius Kabi, No.:
76/365/96-C).
Nádorová tkáň odebraná od dárce nebo získaná z kultivační misky (pokud se jedná o nádorovou linii) je uložena do zkumavky obsahující NaCl. Zkumavku je třeba uchovávat při 4 °C a zpracovat do 3 dnů od operace nádoru. Před zpracováním vzorku nádoru je potřeba ozářit zkumavku
120 Gy. Dále je vhodné před zpracováním nádoru podrobit dárce (pokud se jedná o nádorovou tkáň pacienta) testům krví přenosných chorob (HIV, hepatitis B, hepatitis C, syfilis), při pozitivitě testů není vzorek použit.
-3CZ 22766 Ul
Nádorová tkáň (pokud se jedná o nádorovou tkáň pacienta) se přenese do sterilní Petriho misky s 5 až 10 ml HBSS, S pomocí skalpelu a pinzety se odstraní nekrotická a konektivní tkáň. Skalpelem se nádor nakrájí na částečky o rozměru asi 0,5 mm a následně se rozmělní zadním koncem stříkačky. Získaná suspenze nádorových buněk se opakovaně protlačí injekční stříkačkou s jehlou. Suspenze buněk se pak protlačí přes nylonové sítko (100 pm) do čisté 50ml zkumavky. Tím se získá suspenze jednotlivých buněk. Petriho miska se zbytky suspenze se opláchne HBSS a opět protlačí přes nylonové sítko. Sítko se poté ještě propláchne zbylým HBSS. Získaná suspenze se centrifuguje pri 1600 rpm, 7 min pri 4 °C. Supematant se odsaje pipetou, pelet buněk se resuspenduje v 2 ml injekční vody. Suspenze se rozdělí do mikrozkumavek po cca 1 ml. Mikrozkumavky se suspenzí nádorových buněk se zamrazí v tekutém dusíku (-196 °C) dokud nebude na pohled zmrzlá - cca 3 min - a rozmrazí ve vodní lázni (37 °C) dokud nebude na pohled tekutá. Tento proces se opakuje 5* pro docílení lyže nádorových buněk. Suspenze se pak centrifuguje při 1600 rpm, 7 min pri 4 °C.
Supematant ze všech mikrozkumavek se nasaje pomocí jehly do jedné injekční stříkačky tak, aby nebyl nasát pelet buněk a aby supematant nezůstal v jehle, Supematant se pomocí stříkačky filtruje přes membránový filtr (0,2 pm) do sterilní 50ml zkumavky.
K nádorovému lyzátu se přidá DPBS (10*PBS) v objemu odpovídajícím 1/10 objemu lyzátu. Koncentrace proteinů se stanovuje spektrofotometricky.
Kultivace monocytů do vakcíny:
Reagencie
- CellGro DC Medium (CellGenix, No.: 2007)
- IL-4: Recombinant Human Interleukin 4 (CellGenix, GMP-grade, No.: 1003-050)
- GM-CSF: Recombinant Human Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor (CellGenix, GMP-grade, No.: 1012-050)
- KLH: Hemocyanin, Keyhole Limpet, Megathura crenulata, glycerol (Calbiochem, No.: 374817)
- LPS: lipopolysacharid Endotoxin (US Pharmacopeia, No,: 1235503)
- IFN-γ: interferon-γ, Imukin (Boehringer Ingelheim, No: 1-19480)
- Accutase, 100 ml (PAA, No.: Ll 1-007)
- Kryoprezervační roztok CryoStor CS2/DLite (BioLife Solutions, No.: 650211 - 50 ml; 650212 -100 ml) nebo CryoStor CS5 (BioLife Solutions, No.: 610202 -100 ml)
- HBSS, 500 ml (Lonza, No.: BE10-547F nebo BE10-527F).
Monocyty se separují z leukoferézy dárce elutriací (Elutra Cell Separation Systém, Gambro BCT) nebo magnetickou separací (CliniMACS).
IL-4 se rozpustí v médiu CellGro na výslednou koncentraci 32 000 U/ml. Rozplní se po 750 μΐ a 170 pl do mikrozkumavek. GM-CSF se rozpustí v médiu CellGro na výslednou koncentraci 100 000 U/ml. Rozplní se po 750 μΐ a 170 μΐ do mikrozkumavek. KLH (dodávaný rozpuštěný v glycerolu, koncentrace 22,7 mg/ml) - ke 200 μΐ roztoku KLH v glycerolu se přidá 45,2 ml HBSS. Výsledná koncentrace je 100 pg/ml. Rozplní se po 500 μΐ do mikrozkumavek. CryoStor CS2/DLite nebo CryoStor CS5 - sterilní stříkačkou s jehlou se odebere 30 ml a rozplní po cca 1,5 ml do 20 mikrozkumavek.
Do každé kultivační láhve se nasadí cca 167><106 monocytů do 70 ml média. Na cca 167x106 monocytů (1 kultivační láhev) budeme potřebovat 150 pg nádorového lyzátu. Dále je uveden postup pro kultivaci 500x106 monocytů. Suspenze monocytů v kultivačních lahvích se centrifuguje při 1500/10 min/22 °C. Odstraní se supematant. Pelet se resuspenduje v malém množství média CellGro a doplní médiem CellGro do 35 ml. Přelije se do kultivačních lahví.
Do kultivačních lahví se přidá zbylé médium (35 ml na láhev) s cytokiny:
-4CZ 22766 Ul
Pro 167x106 monocytů v 70 ml média (1 kultivační láhev):
IL-4 (32 000 U/ml) 320 U/ml 700 μΐ
GM-CSF (100 000 U/ml) 1000 U/ml 700 μΐ.
Promíchá se opatrným obracením láhve ze strany na stranu. Buňky se kultivují v termostatu při
37 °C, 5% CO2 po dobu 3 dnů. K buňkám pak bylo přidáno stejné množství média (70 ml) a cytokinů (700 μΐ IL-4 a 700 μΐ GM-CSF) jako na začátku kultivace. Buňky se kultivují v termostatu pří 37 °C, 5% CO2 po dobu dalších 3 dnů.
Výsledná buněčná suspenze nezralých DB s médiem se přelije z každé kultivační láhve do tří 50ml zkumavek. Do každé kultivační láhve se doplní 5 ml čerstvého média CellGro bez cytoki10 nů, aby přežily i buňky, které zůstaly adherované na povrchu láhve. Buněčná suspenze ve zkumavkách se centrifuguje pri 1500/10 min/22 °C. Odstraní se supematant. Pelet se resuspenduje v cca 2 ml média CellGro. Přenesou se všechny buňky pocházející z jedné kultivační láhve vždy do jedné 50ml zkumavky. Každá ze tří zkumavek se doplní médiem CellGro do 10 ml. Jemně se promíchá obracením zkumavky.
Do každé ze tří 50ml zkumavek s buňkami se přidá potřebné množství maturačních cytokinů, KLH a nádorového lyzátu získaného z nádoru pacienta a z nádorové linie nebo ze dvou nádorových linií dle následujícího rozpisu:
Pro nezralé DB v 15 ml média (1 kultivační láhev):
| IL-4 (32 000 U/ml) | 320 U/ml | 150 μΐ |
| GM-CSF (100 000 U/ml) | 1000 U/ml | 150 μΐ |
| KLH (100 μ^ιηΐ) | 1 pgnil | 150 μΐ |
| lyzát nádoru (nebo linie) | 10 pg/ml | 150 μg |
| lyzát nádorové linie | 10 μg/ml | 150 Mg. |
Buněčná suspenze s médiem a reagenciemi se přenese zpět do příslušných kultivačních láhví, které se promíchají opatrným obracením láhve ze strany na stranu. Buňky se inkubují v termostatu pri 37 °C, 5% CO2 1,5 až 2 hodiny.
LPS (aktivita 10* 104 U/vial) se rozpustí v 0,5 ml HBSS (přednostně stejný HBSS jako byl použit již drive pro přípravu nádorového lyzátu daného dárce). Výsledná koncentrace bude 20 000 U/ml.
K nezralým DB se přidají maturační cytokiny pro DB dle následujícího rozpisu:
Pro nezralé DB v 15 ml média (1 kultivační láhev):
LPS (20 000 U/ml) 200 U/ml 150 μΐ
IFN-γ (200 000 ng/ml) 50 ng/ml 37,5 μΐ.
Promíchá se opatrným obracením láhve ze strany na stranu. Buňky se inkubují v termostatu při
37 °C, 5% CO2 6 hodin.
Rozpínění a zamrazení vakcíny:
MiniCooíer se dá nachladit do lednice. Kultivační láhev s buňkami se promíchá protřepáním tak, aby se adherentní buňky uvolnily od stěn láhve. Objem každé kultivační láhve se přelije do označené 50ml zkumavky. Každá kultivační láhev se dvakrát vypláchne po cca 10 ml HBSS (přednostně stejný HBSS jako byl použit již dříve pro přípravu nádorového lyzátu daného dárce). Promíchá se protřepáním a přelije se celý objem HBSS do příslušné zkumavky s buňkami. Do každé kultivační láhve se nalije cca 5 ml HBSS a láhev se položí do boxu.
Buněčná suspenze v každé zkumavce se doplní HBSS do 50 ml a promíchá obracením zkumavky. Zkumavky se centrifugují pri 1500/10 min/4 °C. Supematant se slije a k peletu buněk se přidá cca 5 ml HBSS. Buňky se resuspendují v HBSS a slijí ze všech zkumavek do jedné 50ml
-5CZ 22766 Ul zkumavky. Doplní se HBSS do 50 ml. Promíchá se obracením zkumavky. Odebere se 10 μΐ suspenze na stanovení buněčnosti v Burkerově počítací komůrce. Pokud je buněčnost vyšší než l,4xl06/ml, následující odstavec přeskočíme. Pokud je buněčnost nižší než l,4xl06/ml, použijeme pro uvolnění buněk z kultivačních lahví akutázu.
Zamrazíme alikvoty o 5* 106 DB. Minimálně je třeba zamrazit 6 alikvotů pro podání pacientovi, po jedné kryozkumavce pro kontrolu kvality, pro imunomonitoring, itest, testy na přítomnost mykoplazmat a tři kryozkumavky pro arbitráž.
Buňky centrifugujeme při 1500/10 min/4 °C. Kryozkumavky se přemístí do vychlazeného MiniCooleru. Z centrifugovaných buněk se slije supematant a k sedimentu centrifugovaných buněk se ío přidá CryoStore (médium pro zamražení). Do kryozkumavek se napipetuje přípravek.
Ihned po rozplnění se přemístí všechny kryozkumavky s léčivým přípravkem do ethanolové krabičky a zamrazí se do -80 °C. Co nejdříve po uplynutí minimálně 24 hodin se přemístí všechny kryozkumavky z -80 °C do Dewarovy nádoby s tekutým dusíkem (-196 °C) určené pouze pro potřeby ČP.
V tabulce 1 je uveden příklad tří vyrobených vakcín na bázi DB s příslušnými testovanými parametry. Jednalo se o tři různé dárce. Všechny tri vakcíny splnily kritéria přijatelnosti.
Tabulka 1:
| Typ vyšetření | Vzorek 1 | Vzorek 2 | Vzorek 3 | Kritéria přijatelnosti | |
| Sterilita konečného přípravku | sterilní | sterilní | sterilní | sterilní | |
| Test na přítomnost mykoplazmat | negativní | negativní | negativní | negativní | |
| Počet buněk (x106) | 3.6 | 4.8 | 3,9 | 1-5x10® | |
| Viabilita (%) | 93,8 | 91,4 | 87,8 | 70-100% | |
| Čistota (%) | 98,0 | 98,1 | 98,2 | 70-100% | |
| Nečistoty | CD3 (%) | 0.7 | 0.2 | 1,1 | celkem 0-30% |
| CD 19 (%) | 1.3 | 1.7 | 0,7 | ||
| Fenotyp* | CD80(%) | 98,4 | 98,1 | 95,2 | 60-100% |
| CD86 (%) | 99,3 | 99.2 | 99,0 | 60-100% | |
| MHC II (%) | 86,2 | 99,3 | 74,6 | 60-100% | |
| CD83(%) | 97,6 | 86,5 | 86,8 | 60-100% | |
| CD14(%) | 1,8 | 26,2 | 0.3 | 0-40% | |
| Produkce IL-12 (pg/mt) | 9639,3 | 11874,6 | 836,63 | £ 100 pg/ml | |
| altoMLR aktivované T-tymfocyty (%Γ | DC:PBMC v poměru 1:5 | 87,1 | 81,1 | 90.6 | ž 30% |
| DC:PBMC v poměru 1:10 | 77,2 | 75,1 | 80,6 | a 30% | |
| DC:PBMC v poměru 1:20 | 62,7 | 68,4 | 46,2 | z 15% | |
| Závěr | vyhovuje | vyhovuje | vyhovuje | - |
* Z 5 uvedených fenotypových znaku musí alespoň 3 splňovat kritéria přijatelnosti ** Ze 3 uvedených poměrů altoMLR musí alespoň 2 splňovat kritéria přijatelnosti
Claims (4)
- NÁROKY NA OCHRANU1. Sada pro přípravu protinádorové vakcíny na bázi dendritických buněk z monocytů krve, vyznačená tím, že obsahuje rekombinantní lidský interleukinIL-4, rekombinantní lidský granulocyty a monocyty kolonie stimulující faktor GM-CSF, lipopolysacharid a interferon gama,5 médium, a alespoň dva rozdílné nádorové lyzáty ze stejného typu nádoru.
- 2. Sada podle nároku 1, vyznačená tím, že nádorové lyzáty jsou kombinací alespoň jednoho nádorového lyzátu získaného od pacienta a alespoň jednoho nádorového lyzátu z nádorové linie.
- 3. Sada podle nároku 1, vyznačená tím, že nádorové lyzáty jsou kombinací lyzátu io alespoň dvou nádorových linií stejného typu nádoru.
- 4. Protinádorová vakcína na bázi dendritických buněk, vyznačená tím, že obsahuje dendritické buňky produkující interleukin IL-12 a prezentující antigeny alespoň dvou nádorových linií stejného typu nádoru nebo antigeny nádorových buněk získaných od pacienta a alespoň jedné nádorové linie ze stejného typu nádoru.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ201124705U CZ22766U1 (cs) | 2011-08-11 | 2011-08-11 | Sada pro přípravu protínádorové vakcíny a protinádorová vakcína |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ201124705U CZ22766U1 (cs) | 2011-08-11 | 2011-08-11 | Sada pro přípravu protínádorové vakcíny a protinádorová vakcína |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ22766U1 true CZ22766U1 (cs) | 2011-10-06 |
Family
ID=44786220
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ201124705U CZ22766U1 (cs) | 2011-08-11 | 2011-08-11 | Sada pro přípravu protínádorové vakcíny a protinádorová vakcína |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ22766U1 (cs) |
-
2011
- 2011-08-11 CZ CZ201124705U patent/CZ22766U1/cs not_active IP Right Cessation
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2011200352B2 (en) | Administration of dendritic cells partially matured in vitro for the treatment of tumors | |
| JP2006510667A5 (cs) | ||
| US20220145246A1 (en) | Optimally activated dendritic cells that induce an improved or increased anti-tumor immune response | |
| JP2024019229A (ja) | 進行したがんを有する被験体のための活性化樹状細胞組成物および免疫療法処置に関する方法 | |
| JP2021516052A (ja) | 胸腺組織に由来する制御性ｔ細胞を入手する方法および免疫系障害における細胞免疫療法としての前記細胞の使用 | |
| CZ22766U1 (cs) | Sada pro přípravu protínádorové vakcíny a protinádorová vakcína | |
| CZ29538U1 (cs) | Sada pro přípravu protinádorové vakcíny, protinádorová vakcína včetně posílení účinku | |
| AU2018260971B2 (en) | Administration of dendritic cells partially matured in vitro for the treatment of tumors | |
| KR100562274B1 (ko) | 수지상 세포를 제조하는 방법 및 상기 수지상 세포를 유효 성분으로 함유하는 약학 조성물 | |
| AU2013234394B2 (en) | Administration of dendritic cells partially matured in vitro for the treatment of tumors | |
| HK40077476A (en) | Optimally activated dendritic cells that induce an improved or increased anti-tumor immune response | |
| HK1151249A (en) | Administration of dendritic cells partially matured in vitro for the treatment of tumors | |
| HK1082180B (en) | Administration of dendritic cells partially matured in vitro for the treatment of tumors | |
| HK1255084B (en) | Optimally activated dendritic cells that induce an improved or increased anti-tumor immune response |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG1K | Utility model registered |
Effective date: 20111006 |
|
| MK1K | Utility model expired |
Effective date: 20150811 |