CZ2014320A3 - Polyepitopový antigen, vakcinační konstrukt a vakcína pro prevenci lymeské boreliózy - Google Patents
Polyepitopový antigen, vakcinační konstrukt a vakcína pro prevenci lymeské boreliózy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2014320A3 CZ2014320A3 CZ2014-320A CZ2014320A CZ2014320A3 CZ 2014320 A3 CZ2014320 A3 CZ 2014320A3 CZ 2014320 A CZ2014320 A CZ 2014320A CZ 2014320 A3 CZ2014320 A3 CZ 2014320A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- seq
- ospc
- ospa
- antigen
- borrelia
- Prior art date
Links
- 239000000427 antigen Substances 0.000 title claims abstract description 160
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 title claims abstract description 160
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 title claims abstract description 160
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 51
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 title claims description 26
- 230000002265 prevention Effects 0.000 title claims description 5
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 title description 22
- 108700023315 OspC Proteins 0.000 claims abstract description 85
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims abstract description 79
- 108700006640 OspA Proteins 0.000 claims abstract description 63
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 claims abstract description 58
- 102000008857 Ferritin Human genes 0.000 claims abstract description 31
- 108050000784 Ferritin Proteins 0.000 claims abstract description 31
- 238000008416 Ferritin Methods 0.000 claims abstract description 31
- 241000833568 Borrelia afzelii PKo Species 0.000 claims abstract description 12
- 241001110868 Borreliella bavariensis PBi Species 0.000 claims abstract description 10
- 241001148605 Borreliella garinii Species 0.000 claims description 35
- 241001148604 Borreliella afzelii Species 0.000 claims description 23
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 22
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 22
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 claims description 5
- 102000002068 Glycopeptides Human genes 0.000 claims description 5
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 5
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K aluminium phosphate Chemical compound O1[Al]2OP1(=O)O2 ILRRQNADMUWWFW-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 4
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 claims description 3
- GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J potassium aluminium sulfate Chemical compound [Al+3].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O GRLPQNLYRHEGIJ-UHFFFAOYSA-J 0.000 claims description 3
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 claims 1
- 229940042470 lyme disease vaccine Drugs 0.000 abstract 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 50
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 44
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 36
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 34
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 31
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 29
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 29
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 28
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 27
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 26
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 26
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 25
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 25
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 22
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 19
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 19
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 16
- 238000012770 revaccination Methods 0.000 description 16
- HBTBNXFVJYRYGI-UHFFFAOYSA-M hexadecane-1-sulfinate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCS([O-])=O HBTBNXFVJYRYGI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 14
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 13
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 13
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 13
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 13
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 12
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 10
- -1 OspB Proteins 0.000 description 10
- 238000002296 dynamic light scattering Methods 0.000 description 10
- 239000000902 placebo Substances 0.000 description 10
- 229940068196 placebo Drugs 0.000 description 10
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 9
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 9
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 9
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 description 9
- 241000908522 Borreliella Species 0.000 description 8
- 241001198387 Escherichia coli BL21(DE3) Species 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 8
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical class OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 7
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 6
- 229940099789 ospa protein Drugs 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 229940024546 aluminum hydroxide gel Drugs 0.000 description 5
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Chemical group 0.000 description 5
- 108010030416 proteoliposomes Proteins 0.000 description 5
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 5
- XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidaz Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 4
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 4
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 4
- 230000036760 body temperature Effects 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 4
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 4
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 206010061591 Borrelia infection Diseases 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N [1-[2,3-dihydroxypropoxy(hydroxy)phosphoryl]oxy-3-hexadecanoyloxypropan-2-yl] (9e,12e)-octadeca-9,12-dienoate Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\C\C=C\CCCCC ATBOMIWRCZXYSZ-XZBBILGWSA-N 0.000 description 3
- AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N alpha-glycerophosphate Natural products OCC(O)COP(O)(O)=O AWUCVROLDVIAJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940024545 aluminum hydroxide Drugs 0.000 description 3
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000010241 blood sampling Methods 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 3
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 238000000113 differential scanning calorimetry Methods 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000001125 extrusion Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 3
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 3
- 230000036571 hydration Effects 0.000 description 3
- 238000006703 hydration reaction Methods 0.000 description 3
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 3
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 description 3
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 3
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 2
- 241000276440 Borrelia burgdorferi B31 Species 0.000 description 2
- 241000644815 Borrelia garinii PBr Species 0.000 description 2
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 2
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 2
- AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N Glycolic acid Chemical compound OCC(O)=O AEMRFAOFKBGASW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 2
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 2
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 2
- 102100022339 Integrin alpha-L Human genes 0.000 description 2
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 2
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 2
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 2
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 2
- SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K aluminum;trihydroxide;hydrate Chemical compound O.[OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] SMYKVLBUSSNXMV-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 230000008350 antigen-specific antibody response Effects 0.000 description 2
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 description 2
- 150000002411 histidines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 2
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 2
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003571 opsonizing effect Effects 0.000 description 2
- 238000000424 optical density measurement Methods 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 125000003696 stearoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- 229940031626 subunit vaccine Drugs 0.000 description 2
- 230000010512 thermal transition Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PAZGBAOHGQRCBP-ZCXUNETKSA-N 1-Palmitoyl-2-oleoylglycero-3-phosphoglycerol Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCC(O)CO)OC(=O)CCCCCCC\C=C/CCCCCCCC PAZGBAOHGQRCBP-ZCXUNETKSA-N 0.000 description 1
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 1
- SYFQYGMJENQVQT-UHFFFAOYSA-N 6-amino-2-[bis(carboxymethyl)amino]hexanoic acid Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N(CC(O)=O)CC(O)=O SYFQYGMJENQVQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 206010003399 Arthropod bite Diseases 0.000 description 1
- 125000001433 C-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 241000222122 Candida albicans Species 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 108090000738 Decorin Proteins 0.000 description 1
- 206010062488 Erythema migrans Diseases 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101150062179 II gene Proteins 0.000 description 1
- 241000238681 Ixodes Species 0.000 description 1
- 101100538215 Ixodes scapularis TROSPA gene Proteins 0.000 description 1
- 239000000232 Lipid Bilayer Substances 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N Methacrylic acid Chemical compound CC(=C)C(O)=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- 101100431670 Rattus norvegicus Ybx3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 208000031709 Skin Manifestations Diseases 0.000 description 1
- 241000589970 Spirochaetales Species 0.000 description 1
- 101000815632 Streptococcus suis (strain 05ZYH33) Rqc2 homolog RqcH Proteins 0.000 description 1
- 230000029662 T-helper 1 type immune response Effects 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000003917 TEM image Methods 0.000 description 1
- 208000004374 Tick Bites Diseases 0.000 description 1
- 208000035056 Tick-Borne disease Diseases 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 1
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001301 anti-borrelial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001363 autoimmune Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229940095731 candida albicans Drugs 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical group 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 229940030156 cell vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 102000036072 fibronectin binding proteins Human genes 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 1
- 239000007863 gel particle Substances 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 1
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- UACSZOWTRIJIFU-UHFFFAOYSA-N hydroxymethyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCO UACSZOWTRIJIFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000003949 imides Chemical class 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011147 inorganic material Substances 0.000 description 1
- 238000009434 installation Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 1
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 150000002734 metacrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 229940031346 monovalent vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000001446 muramyl group Chemical group N[C@@H](C=O)[C@@H](O[C@@H](C(=O)*)C)[C@H](O)[C@H](O)CO 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 231100001160 nonlethal Toxicity 0.000 description 1
- 230000014207 opsonization Effects 0.000 description 1
- 230000036542 oxidative stress Effects 0.000 description 1
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N phosphatidylcholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCCCCCCC=CCCCCCCCC WTJKGGKOPKCXLL-RRHRGVEJSA-N 0.000 description 1
- 229920000058 polyacrylate Polymers 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000016523 tick-borne infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/12—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria
- C07K16/1203—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria
- C07K16/1207—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from bacteria from Gram-negative bacteria from Spirochaetales (O), e.g. Treponema, Leptospira
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/70—Multivalent vaccine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/02—Bacterial antigens
- A61K39/0225—Spirochetes, e.g. Treponema, Leptospira, Borrelia
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Abstract
Řešení poskytuje chimérický polyepitopový rekombinantní antigen, obsahující dva až deset imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, Pak, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko, a orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borellia garinii Pbi. Dále řešení poskytuje vakcinační konstrukt a vakcínu proti Lymeské borelióze obsahující tento rekombinantní antigen a alespoň jedno adjuvans a/nebo Ferritin II.
Description
Polyepitopový antigen, vakcinační konstrukt a vakcína pro prevenci lymeské boreliózy
Oblast techniky
Vynález se týká složení a kombinace rekombinantních antigenů a formulace vakcíny k prevenci Lymeské borreliózy a klíšťaty přenášených onemocnění. Vakcína je určena pro humánní a veterinární použití.
Dosavadní stav techniky
Lymeská borrelióza je chronické multisystémové infekční onemocnění, které je nej častějším infekčním onemocněním přenášeným členovci, a to v Evropě i ve Spojených státech. Jde zpravidla o nesmrtící, ale v nezanedbatelném procentu invaliduzující onemocnění se závažnými zdravotními důsledky. Z tohoto pohledu jde o závažný socioekonomický problém. O významu tohoto onemocnění svědčí četnost publikací v časopisech zabývajících se infekční problematikou. V poslední dekádě je borrelióza svým významem zařazována za syndrom získané imunodeficience, jak je popsáno např. v článku Barbour AG, Fish D, Science. 1993 Jun ll;260(5114): 1610-6.
Klinické příznaky lymeské boreliózy jsou popisovány různými autory již z přelomu devatenáctého a dvacátého století (Bartůněk P. historie. In: Bartůněk P, a kol. Lymeská borelióza. Praha: Gradapublishing, 2006: 11), ale až v roce 1982 došlo k popisu původce popisovaných příznaků - spirochéty, později nazvané Borrelia burgdorferi. (Burgdorfer W, Barbour AG, Hayes SF, BenachJL, Grunwaldl E, Davis JP., Science. 1982; 216:1317-1319). Postupně došlo k popisu dalších blízce příbuzných druhů, takže druhová skupina označovaná jako Borrelia burgdorferi sensu lato (s. 1.) v současnosti čítá dvanáct druhů a je možné, že toto číslo stále není konečné.
Z popsaných druhů se jako patogeny na Euroasijském kontinentu uplatňují hlavně tři Borrelia burgdorferi sensu stricto (s. s.), Borrelia garinii a Borrelia afzelii. Na Severoamerickém kontinentu se jako patogen uplatňuje pouze B. burgdorferi sensu stricto. Borelie z druhové skupiny B. burgdorferi jsou bakterie přenášené nej častěji klíšťaty rodu Ixodes, ale přenos je pravděpodobně možný iprostřednictvím hmyzu sajícího krev, i když k tomuto jevu dosud chybí přesvědčivé důkazy. Přirozeným hostitelem v přírodě jsou především drobní hlodavci, ale i ptáci a vysoká zvěř. Tvoří tak přírodní rezervoár infekce.
Člověk je v infekčním řetězci slepým článkem, k dalšímu šíření již nedochází. V současné době je lymeská borelióza nej častěji diagnostikovanou antropozoonózou na území Evropy a Severní Ameriky. Její výskyt má navíc místy stoupající tendenci.
Klinický průběh Lymeské boreliózy má obecně tři stadia. Jejich manifestace však nemusí proběhnout u všech infikovaných jedinců. První stadium je charakterizováno chřipko vitým průběhem, často provázeným kožními příznaky v místě vniknutí infekce. Kožní projevy jsou charakteristické a jsou označovány jako erythema migrans. Pokud infekce není léčena, případně eliminována imunitním systémem hostitele, může progredovat do dalšího stadia s postižením kloubů, nervového systému, kůže, vzácněji srdce, očí apod. Asi 10% pacientů bez ohledu na antibiotickou léčbu vykazuje dlouhodobé klinické příznaky. Jedním z možných vysvětlení je indukce autoimunitních procesů.
Závažné poškození savčího organismu, stejně jako problémy s diagnostikou a terapií Lymeské boreliózy jsou významným podnětem pro vývoj vakcíny. Možnost vývoje vakcíny podporují také poznatky o tom, že protilátková imunitní odpověď je dostatečná k ochraně organismu před touto mikrobiální infekcí.
Z mikrobiologického pohledu jsou mikroorganismy druhového komplexu Borrelia burgdorferi s.l. charakterizovány spirálním tvarem, který je určován především bičíky zakotvenými v periplazmatickém prostoru. Povrch borélií je tvořen lipoproteiny OspA, OspB, OspC, OspD, OspE,OspF, případně dalšími, z nichž některé mohou být terčem protektivní imunitní odpovědi (Kumaru OS, Schulze RJ, Rodnin MV, Ladokhin AS, Ziickert WR., J Bacterial. 2011 Jun;193(11):2814-25; Livey I, O'Rourke M, Traweger A, Savidis-Dacho H, Crowe BA, Barrett PN, Yang X, Dunn JJ, Luft BJ, Clinlnfect Dis. 2011 Feb;52 Suppl 3:s266-70; Chen S, Ziickert WR., J Bacteriol. 2011 Dec;193(23):6724-32; Tilly K, Bestor A, Rosa PA., Mol Microbiol. 2013 Jul;89(2):216-27)
Schopnost vyvolávat protektivní odpověď byla popsána na příklad u „outer surface“ proteinů OspA, OspB, OspC, fibronektin vážícího proteinu BBK32 a proteinů vážící dekorin DbpA a DbpB (Gilmore RD 1996 Infect Immun 64:2234-2239).
Povrchové proteiny (outer surface proteins ) jsou vesměs determinovány genovými sekvencemi umístěnými v plasmidech a jsou značně variabilní v rámci druhu a jejich exprese je jemně regulována v asociaci s podmínkami životního cyklu bakterie.
V trávicím traktu klíštěte jsou na povrchu borelií exprimovány hlavně proteiny OspA a OspB, které zde mají funkci adhezivních molekul. V průběhu sání krve klíštětem se snižuje exprese těchto proteinů a zvyšuje se exprese OspC. Během přechodu do diseminované fáze choroby dochází k poklesu exprese OspC a na povrchu borelie se objevuje protein VlsE vyznačující se vysokou antigenní variabilitou, která je podmíněna genovou rekombinací multidoménovéhoVlsE genu (Obonyo M, Munderloh UG, Fingerle V, Wilske B, KurttiTJ, J ClinMicrobiol. 1999 Jul;37(7):2137-41; Xu Q, McShan K, Liang FT., Microbiology. 2008 Nov;154(Pt 11):3420-9. doi: 0.1099/mic.0.2008/019737-0.)
Protein OspA byl popsán jako první ze skupiny vnějších povrchových lipoproteinů (Barbour et al., 1983 Infect Immun. 41(2):795-804). OspA má molekulární hmotnost 31 kDa. Společně s proteinem OspB je exprimován na povrchu borélii v žaludku klíštěte (Howe et al., 1985 Science. 227(4687):645-6). Hlavní funkcí proteinuOspA je vazba na glykoprotein TROSPA přítomný na buňkách žaludečního epitelu klíštěte. Při sání klíštěte se jeho exprese významně snižuje. Další předpokládanou funkcí OspA je vazba na plasminogen v krvi savčího hostitele. V analogii s jinými mikroorganismy je schopnost vazby antigenu OspA na plasminogen vnímána jako faktor virulence. (Lahteenmaki et al., 2001 FEMS Microbiol Rev. 25(5):53152).
Protein OspC je jedním z nadějných kandidátů pro konstrukci preventivní vakcíny proti Lymeské borelióze. Byl identifikován v roce 1992 jako druhý antigen (po OspA) který indukuje protektivní imunitní odpověď (Preac-Mursic, Wilske et al. 1992 Infection 20(6):342-9).OspC gen je lokalizována na cirkulámím plazmidu o velikosti 27 kb (Marconi,R.T., Samuels,D.S. and Garon,C.F. (1993) J.Bacterial., 175, 926±932). Jde o lipoprotein o molekulové hmotnosti 22±23 kDa skládající se z 210 aminokyselin. Je tvořen převážně alfa helikálními strukturami propojeným smyčkami. Lipidový triacylglycerolový motiv umožňuje jeho ukotvení v buněčné membráně. Protektivita po aplikaci pokusným zvířatům byla potvrzena již počátkem devadesátých let 20. století. Jako problematická se ale záhy ukázala variabilita proteinu (Preac-Mursic V, Wilske B, Patsouris E et al 1992 Infection 20:342-349). Postupně bylo popsáno 38 strukturních variant antigenů OspC. Některé z nich se se zvýšenou frekvencí objevují u boreliových mikroorganismů vyvolávajících systémová onemocnění u člověka. Klony nesoucí tyto antigeny jsou proto označovány jako invazívní klony (Seinost,G.,Dykhuizen, D.E., Dattywyler,R.J, Golde,W.T.,Dunn,JJ, Wang,I.-N., Wormser,G.P., Schriefer.M.E. andLuft,B.J. 1999 Infect. Immun., 67, 3518±3524.)
První veterinární vakcína proti borrelióze byla vyvinuta ve Spojených státech vr. 1990 pro psy. Šlo o celobuněčnou vakcínu založenou na bakterinech uvolněných z mikroorganismů homogenizací kultury. (Levy SA, Lissman BA, Ficke CM., 1993 J Am Vet Med Assoc. Jun l;202(ll):1834-8; Wormser, GP., 1995 Ann Intern Med 123,627 - 629).
Výsledky pokusů o přenos protektivní imunity pomocí séra získaného ze zvířat imunizovaných některým z vnějších povrchových antigenů naznačily možnost přípravy subjednotkové vakcíny. Hlavními kandidátními antigeny pro takovou vakcínu se staly vnější povrchové proteiny OspA, B, C a D. Intenzívně byl studován zejména protein OspA. Protektivní efekt této subjednotkové vakcíny byl potvrzen experimentálně u myší, křečků a králíků (Fikrig E et al., 1990 Science Oct 26; 250(4980):553-6; Fikrig E et al., 1992 Infectlmmun. Mar; 60(3):773-7). Laboratorní testy potvrdily, že aplikace tohoto proteinu ve formě purifikováného, lipidováného rekombinantního proteinu indukuje protektivní imunitu při parenterálním podání a chrání proti infekci boreliemi podanými nejen injekční cestou, ale též prostřednictvím infikovaného klíštěte, jako přirozeného vektoru. Potvrdilo se také, že infekční klíšťata sající na takto imunizovaných zvířatech ztrácejí svou infekciozitu (Keller D et al., 1994 JÁMA. Jun 8;271(22): 1764-8; Fikrig E et al., 1992 ProcNatlAcadSci USA. Jun 15;89(12):5418-21).
První komerční monovalentní vakcína byla proto založena na antigenů OspA. Vakcína byla schválena Food and Drug Administration (FDA) v roce 1998 (Steere AC et al., N Engl J Med. 1998 Jul 23;339(4):209-15). Zvláštností této vakcíny je skutečnost, že interakce mezi hostitelskou protilátkou a patogenem probíhá mimo tělo hostitele - v žaludku klíštěte. Nedostatkem této vakcíny byla monovalentní kompozice. Vakcína byla připravena z proteinu OspA Borrelia burgdorferi sensu stricto. Tato genomospecies je dominantním infekčním původcem Lymeské boreliózy na severoamerickém kontinentu. Může tak být efektivní pro obyvatelstvo USA. Pro evropské podmínky však není optimální. OspA antigen připravený z kmene Borrelia burgdorferi sensu stricto nemůže pokrýt variabilitu OspA antigenů všech tří genomospecies na evropském kontinentu.
Ferritin II je klíčovým proteinem, který zajišťuje homeostázu sajícího klíštěte, které přijímá enormní množství železa ve formě hemoglobinu z hostitelovy krve. Bylo prokázáno, že vakcinování králíků rekombinantním klíštěcím Ferritin II proteinem významně snižuje sání klíšťat na vakcinovaných králících. (Hajdusek et al. 2010 Vaccine 28, 2993-2998)
Přechod od živých vakcín k bezpečnějším avšak méně imunogenním vakcínám, založených na rekombinantních antigenech vyžaduje nová strukturně definovaná adjuvans stimulující protilátkovou i T-buněčnou imunitu. V případě boreliové infekce opsonizační a zejména komplement aktivující protilátky jsou považovány za klíčový mechanismus protekce hostitele. Preparáty schválené pro klinickou aplikaci jsou převážně odvozené od hydroxidu hlinitého, fosforečnanu hlinitého, nebo původního síranu hlinitodraselného. Tato adjuvans indukují převážně Th2 orientovanou imunitní odezvu spojenou s tvorbou neutralizačních protilátek. Jediná alternativa schválená pro klinickou (humánní) aplikaci potencující částečně i buněčnou efektorovou imunitu jsou MF59 (Novartis) a AS03 (GSK), (olejové emulze). Tato adjuvans indukují jen mírnou Thl imunitní odpověď nezbytnou k tvorbě opsonizačních a komplement aktivujících protilátek. Tyto o požadavky v plném rozsahu splňují originální, plně syntetické, nepyrogenní, molekulární adjuvans na bázi glykopeptidů normuramylového typu. Kombinací strukturních změn v sacharidové a peptidové části jejich molekul byla eliminována z klinického hlediska netolerovatelná vysoká pyrogenita spojená obecně s muramylovými glykopeptidy (Ledvina M., Ježek J, Šaman D., Hříbalová V.: Collect. Czech. Chem. Commun. 1998, 63, 590-598; Ledvina M., Zyka D., Ježek J, Trnka T., Šaman D.: Collect. Czech. Chem. Commun. 1998, 63, 577-589). Vzhledem k amfifilnímu charakteru těchto adjuvans, danému přítomností hydrofobní a polámí/hydrofilní domény v jejich molekule, jsou tyto látku schopny vytvářet stabilní micelámí struktury a lze je efektivně zabudovat do lipidové dvoj vrstvy liposomálních nosičových systémů (Turánek J., Masek J, Raška M., Ledvina M., in: Biomedical Science, Engineering and Technology, Application of Liposomes for Construction of Vaccines, InTech, January, 2012, 653-678.).
Liposomy, vesikly z fosfolipních membrán, představují biokompatibilní a víceúčelové nosiče pro přípravu cílených léčiv a konstrukci rekombinantních vakcín. Liposomy jsou nanočásticové systémy schválené FD A pro aplikaci v humánní medicíně. Jejich použití jako adjuvans bylo popsáno Gragoriadisem a Allisonem (Nature252, 252,1974). Použití metalochelatačních liposomů pro konstrukci rekombinantních vakcín bylo popsáno (Křupka et al. Journal of Controlled Release 160 (2012) 374-381; Mašek et al. 151 (2011) 193-201; Mašek et al. Analytical Biochemistry 408 (2011) 95-104)
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu je chimérický polyepitopový rekombinantní antigen obsahující dva až deset imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, PKa, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko, a orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B, I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borrelia garinii Pbi.
Imunodominantním úsekem je zde míněna sekvence zahrnující alespoň jeden epitop.
Tento chimérický polyepitopový antigen je základem vakcíny proti Lymeské borelióze pro humánní i veterinární použití.
Ve výhodném provedení je podstatou vynálezu polyepitopový rekombinantní antigen obsahující dva až deset, s výhodou sedm, imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující OspC orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B, I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borrelia garinii Pbi.
V jiném výhodném provedení je podstatou vynálezu polyepitopový rekombinantní antigen obsahujícího dva až deset, s výhodou osm, imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, PKa, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko.
Imunodominantní úseky jsou sloučeny do fúzního proteinu v pořadí umožňujícím imunologické rozpoznání jednotlivých epitopů (tj. orientované sekvence). Na N-terminálním konci je kfúznímu proteinu s výhodou připojena sekvence šesti histidinů (His tag), umožňující metalochelatační vazbu na liposomální nosič. Takový způsob fixace rekombinantního proteinu k lipozomálnímu nosiči zajišťujě imunologicky výhodnou orientaci fúzního proteinu tak, že imunodominantní C-terminální aminokyselinové sekvence jsou přístupnější pro indukci imunitní odpovědi.
Předmětem vynálezu je dále vakcinační konstrukt, obsahující mikro- nebo nano-partikulámí nosič (tj. nanopartikulární nosič s velikostí částic do 1 mikrometru, mikropartikulámí nosič s velikostí částic do 100 mikrometrů) obsahující metalochelatačně vážící složku, chimérický polyepitopový rekombinantní antigen vázaný prostřednictvím metalochelatačně vážící složky, a s výhodou dále adjuvans a/nebo Ferritin II.
S výhodou je nosičem liposom s inkorporovaným metalochelatačním lipidem (např. DOGSNi-NTA (Avanti Polar Lipids, USA)) jako metalochelatačně vážící složkou pro vazbu antigenů, popřípadě molekulárního adjuvans a/nebo Ferritin II rekombinantního proteinu na povrch liposomu. Nosičem může být i farmaceuticky přijatelný polymer, jako například kopolymery kyseliny mléčné a glykolové, polymery a kopolymery na bázi kyseliny akrylové a methakrylové, akrylátů, methakrylátů, např. hydroxymethylmethakrylátu. Nosičem mohou rovněž být částice na bázi anorganických materiálů, např. hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitodraselný, křemičitanové hydrogely.
Předmětem vynálezu je také vakcína k prevenci Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití, obsahující chimérický polyepitopový rekombinantní antigen podle vynálezu, a alespoň jedno adjuvans. Vakcína může případně obsahovat pomocné látky, jako jsou rozpouštědla, stabilizátory, emulgátory, nosiče, apod.
K prevenci šíření borelií z místa kousnutí klíštětem do celého organismu je nejvhodnější využít vakcínu obsahující rekombinantní polyepitopový antigen obsahující imunodominantní úseky OspC.
Adjuvans může být s výhodou vybráno ze skupiny zahrnující hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý, síran hlinitodraselný, molekulární adjuvans na bázi normuramylových glykopeptidů popsaná v WO 2009/115782 (obecné vzorce I a II), adjuvans založená na disperzi částic na bázi polymemích polyakrylátových nosičů (například PetGelA).
Molekulární adjuvans na bázi normuramylových glykopeptidů jsou zejména vybrána ze skupiny zahrnující:
LAbu—D-iGIn-OH
MT01
6-<?-(2-Tetradecylhexadekanoyl)-jV-acetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D-isoglutamin,
OH
OH .-Abu—D-iGIn-OH
MT02
2-Deoxy-2-stearoylamino-P-D-glucopyranosyl-(l —>4)-A-acetylnormuramoyl-L-2aminobutanoyl-D-isoglutamin,
Ό
L-Abu—D-iGIn-OH
MT03
6-O-Stearoyl-A-acetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D-isoglutamin,
MT04
2-Deoxy-2-(2-tetradecylhexadekanoylamino)-P-D-glucopyranosyl-(l —>4)-Aacetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D-isoglutamin,
A-Acetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D- isoglutaminyl-L-lysin(stearoyl),
OH
MT06
A-Acetylnormuramoyl-L-2-aminobutanoyl-D- isoglutaminyl-L-lysin(2tetradecylhexadekanoyl),
2-Acetamido-2-deoxy-p-D-glucopyranosyl-(l -*4)-A-acetylnormuramoyl- L-2aminobutanoyl-D- isoglutaminyl-L-lysin(stearoyl),
MT08
2-Acetamido-2-deoxy-p-D-glucopyranosyl-(l -*4)-;V-acetylnormuramoyl- L-2aminobutanoyl-D- isoglutaminyl-L-lysin(2-tetradecylhexadekanoyl).
Vakcína s výhodou obsahuje vakcinační konstrukt podle vynálezu.
Ve výhodném provedení jsou OspC antigeny vybrány ze skupin borelií zahrnující:
NP_047005 - gi| 11497007: OspC skupina A (B31MI) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 1)
| 1 | MKKNTLSAIL | MTLFLFISCN | NSGKDGNTSA | NSADESVKGP | NLTEISKKIT |
| 51 | DSNAVLLAVK | EVEALLSSID | EIAAKAIGKK | IHQNNGLDTE | NNHNGSLLAG |
| 101 | AYAISTLIKQ | KLDGLKNEGL | KEKIDAAKKC | SETFTNKLKE | KHTDLGKEGV |
| 151 | TDADAKEAIL | KTNGTKTKGA | EELGKLFESV | EVLSKAAKEM | LANSVKELTS |
| 201 | PVVAESPKKP |
EF053525 - gi| 117574163: OspC skupina B (LDP73) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 2)
| 1 | NNSGKDGNTS | ANSADESVKG | PNLTEISKKI | TDSNAVLLAV | KEVEALLSSI |
| 51 | DELAKAIGKK | IKNDGSLDNE | ANRNESLLAG | AYTISTLITQ | KLSKLNGSEG |
| 101 | LKEKIAAAKK | CSEEFSTKLK | DNHAQLGIQG | VTDENAKKAI | LKANAAGKDK |
| 151 | GVEELEKLSG | SLESLSKAAK | EMLANSVKEL | TSPVVAESPK | KP |
AF467874 - gi|23507072: OspC skupina I (B331) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 3)
| 1 | MKKNTLSAIL | MTLFLFISCN | NSGKDGNTSA | NSADESVKGP | NLTEISKKIT |
| 51 | ESNAVVLAVK | EVETLLTSID | ELAKAIGKKI | KNDVSLDNEA | DHNGSLISGA |
| 101 | YLISTLITKK | ISAIKDSGEL | KAEIEKAKKC | SEEFTAKLKG | EHTDLGKEGV |
| 151 | TDDNAKKAIL | KTNNDKTKGA | DELEKLFESV | KNLSKAAKEM | LTNSVKELTS |
| 201 | PVVAESPKKP |
EF053517 - gi| 117574147: OspC skupina K (LDP74) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 4)
| 1 | NNSGKDGNTS | ANSADESVKG | PNLTEISKKI | TESNAVVLAV | KEIETLLASI |
| 51 | DELATKAIGK | KIQQNGGLAV | EAGHNGTLLA | GAYTISKLIT | QKLDGLKNSE |
| 101 | KLKEKIENAK | KCSEDFTKKL | EGEHAQLGIE | NVTDENAKKA | ILITDAAKDK |
| 151 | GAAELEKLFK | AVENLAKAAK | EMLANSVKEL | TSPIVAESPK | KP |
YP 063261 - gi|51038597: OspC skupina PBi B. garinii (SEQ ID NO. 5)
| 1 | MKKNTLSAIL | MTLFLFISCN | NSGGDSASTN | PDESAKGPNL | TVISKKITDS |
| 51 | NAFLLAVKEV | EALLSSIDEL | SKAIGKKIKN | DGTLDNEANR | NESLIAGAYE |
| 101 | ISKLITQKLS | VLNSEELKEK | IKEAKDCSEK | FTTKLKDSHA | ELGIQSVQDD |
| 151 | NAKKAILKTH | GTKDKGAKEL | EELFKSLESL | SKAAQAALTN | SVKELTNPVV |
| 201 | AETPKKP |
YP 709265 - gi| 111074118: OspC skupina PKo B. afzelii (SEQ ID NO. 6)
| 1 | MKKNTLSAIL | MTLFLFISCN | NSGKGGDSAS | TNPADESAKG | PNLTEISKKI |
| 51 | TDSNAFVLAV | KEVETLVLSI | DELAKKAIGQ | KIDNNNGLAA | LNNQNGSLLA |
| 101 | GAYAISTLIT | EKLSKLKNLE | ELKTEIAKAK | KCSEEFTNKL | KSGHADLGKQ |
| 151 | DATDDHAKAA | ILKTHATTDK | GAKEFKDLFE | SVEGLLKAAQ | VALTNSVKEL |
| 201 | TSPVVAESPK | KP |
Ze zvolených OspC anti genů byly vybrány úseky odpovídající a3-L5-a4-L6-a5 úsekům jednotlivých OspC proteinů viz následující tabulka.a dále C' terminální úsek odvozený z OspC PKo.
| Označení v databázi GeneBank | Vybraný sekvenční úsek - | Zařazení OspC antigenu podle skupiny |
| pořadí aminokyselin | ||
| NP_047005 - gi| 11497007 | 128-196 | B. burgdorferi skupina A (B31MI) |
| EF053525 -gi|l 17574163 | 109-178 | B. burgdorferi skupina B (LDP73) |
| AF467874 - gi|23507072 | 128-196 | B. burgdorferi skupina I (B331) |
| EF053517 - gi|l 17574147 | 110-178 | B. burgdorferi skupina K (LDP74) |
| YP 063261 - gij51038597 | 125-193 | B. garinii skupina PBi |
| YP709265- gi|111074118 | 130-211 | B. afzelii skupina Pko |
Ve výhodném provedení má chimérický polyepitopový rekombinantní antigen založený na OspC antigenech připojeny Ν' konci tři peptidové úseky: 1) hexa His kotva (His tag) umožňující purifikaci proteinu pomocí Ni-NTA afinitní chromatografie a přípravu metalochelatačních proteoliposomů, 2) štěpné místo pro thrombin umožňující odstranit His tag kotvu z rekombinantního proteinu pro imunodetekční ELISA aplikace stanovující hladiny anti genem navozených specifických protilátek u imunizovaných jedinců, 3) T7 epitop umožňující snadnou detekci rekombinantního proteinu během biotechnologické přípravy a purifíkace pomocí anti T7 protilátky a celkový protein má následující sekvenci (SEQ ID NO. 7):
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSMKKCSE EFSTKLKDNH
AQLGIQGVTD ENAKKAILKA NAAGKDKGVE ELEKLSGSLE SLSKAAKEML 101 ANSVKKKCSE DFTKKLEGEH AQLGIEQVTD ENAKKAILIT DAAKDKGAAE 151 LEKLFKAVEN LAKAAKEMLA NSVKKKCSET FTNKLKEKHT DLGKEGVTDA 201 DAKEAILKTQ GTKTKGAEEL GKLFESVEVL SKAAKEMLAN SVKKKCSEEF 251 TAKLKGEHTD LGKEGVTDDN AKKAILKTNN DKTKGADELE KLFESVKQLS 301 KAAKEMLTNS VKKDCSEKFT TKLKDSHAEL GIQSVQDDNA KKAILKTHGT 351 KDKGAKELEE LFKSLESLSK AAQAALTNSV KKKCSEEFTN KLKSGHADLG 401 KQDATDDHAK AAILKTHATT DKGAKEFKDL FESVEGLLKA AQVALTNSVK 451 ELTSPVVAES PKKN nebo v jiném výhodném provedení má chimérický polyepitopový rekombinantní antigen založený na OspC následující sekvenci (SEQ ID NO. 16).
MASMTGGQQM GRGSMKKCSE EFSTKLKDNH AQLGIQGVTD ENAKKAILKA
NAAGKDKGVE ELEKLSGSLE SLSKAAKEML ANSVKKKCSE DFTKKLEGEH 101 AQLGIEQVTD ENAKKAILIT DAAKDKGAAE LEKLFKAVEN LAKAAKEMLA 151 NSVKKKCSET FTNKLKEKHT DLGKEGVTDA DAKEAILKTQ GTKTKGAEEL 201 GKLFESVEVL SKAAKEMLAN SVKKKCSEEF TAKLKGEHTD LGKEGVTDDN 251 AKKAILKTNN DKTKGADELE KLFESVKQLS KAAKEMLTNS VKKDCSEKFT 301 TKLKDSHAEL GIQSVQDDNA KKAILKTHGT KDKGAKELEE LFKSLESLSK 351 AAQAALTNSV KKKCSEEFTN KLKSGHADLG KQDATDDHAK AAILKTHATT 401 DKGAKEFKDL FESVEGLLKA AQVALTNSVK ELTSPVVAES PKKN
Ve výhodném provedení jsou OspA antigeny vybrány ze skupiny borelií zahrnující: >X80257.1 - gi|258153: OspA-PBi B. garinii (SEQ ID NO. 8)
| 1 | MKKYLLGIGL | ILALIACKQN | VSSLDEKNSV | SVDLPGEMKV | LVSKEKDKDG |
| 51 | KYSLMATVDK | LELKGTSDKS | NGSGTLEGEK | SDKSKAKLTI | SEDLSKTTFE |
| 101 | IFKEDGKTLV | SKKVNSKDKS | SIEEKFNAKG | ELSEKTILRA | NGTRLEYTEI |
| 151 | KSDGTGKAKE | VLKDFALEGT | LAADKTTLKV | TEGTVVLSKH | IPNSGEITVE |
| 201 | LNDSNSTQAT | KKTGKWDSNT | STLTISVNSK | KTKNIVFTKE | DTITVQKYDS |
| 251 | AGTNLEGNAV | EIKTLDELKN | ALK |
>S48322 - gi|258151: OspA-PKo B. afzelii (SEQ ID NO. 9)
| 1 | MKKYLLGIGL | ILALIACKQN | VSSLDEKNSA | SVDLPGEMKV | LVSKEKDKDG |
| 51 | KYSLKATVDK | IELKGTSDKD | NGSGVLEGTK | DDKSKAKLTI | ADDLSKTTFE |
| 101 | LFKEDGKTLV | SRKVSSKDKT | STDEMFNEKG | ELSAKTMTRE | NGTKLEYTEM |
| 151 | KSDGTGKAKE | VLKNFTLEGK | VANDKVTLEV | KEGTVTLSKE | IAKSGEVTVA |
| 201 | LNDTNTTQAT | KKTGAWDSKT | STLTISVNSK | KTTQLVFTKQ | DTITVQKYDS |
| 251 | AGTNLEGTAV | EIKTLDELKN | ALK |
>X80251 - gi|984067: OspA-PHeiR. burgdorferi (SEQ ID NO. 10)
| 1 | MKKYLLGIGL | ILALIACKQN | VSSLDEKNSV | SVDLPGGMKV | LVSKEKDKDG |
| 51 | KYSLMATVEK | LELKGTSDKN | NGSGTLEGEK | TDKSKVKLTI | AEDLSKTTFE |
| 101 | IFKEDGKTLV | SKKVTLKDKS | STEEKFNEKG | EISEKTIVRA | NGTRLEYTDI |
| 151 | KSDKTGKAKE | VLKDFTLEGT | LAADGKTTLK | VTEGTVTLSK | NISKSGEITV |
| 201 | ALDDTDSSGN | KKSGTWDSGT | STLTISKNRT | KTKQLVFTKE | DTITVQNYDS |
251 AGTNLEGKAV EITTLKELKN ALK >X80252 - gi|984085:OspA-TN, N34, VS307, G25 B. garinii, PWudll B. burgdorferi (SEQ
ID NO. 11)
| 1 | MKKYLLGIGL | ILALIACKQN | VSSLDEKNSV | SVDLPGGMTV | LVSKEKDKDG |
| 51 | KYSLEATVDK | LELKGTSDKN | NGSGTLEGEK | TDKSKVKLTI | ADDLSQTKFE |
| 101 | IFKEDGKTLV | SKKVTLKDKS | STEEKFNEKG | ETSEKTIVRA | NGTRLEYTDI |
| 151 | KSDGSGKAKE | VLKDFTLEGT | LAADGKTTLK | VTEGTVVLSK | NILKSGEITV |
| 201 | ALDDSDTTQA | TKKTGKWDSK | TSTLTISVNS | QKTKNLVFTK | EDTITVQKYD |
| 251 | SAGTNLEGKA | VEITTLKELK | DALK |
>X80182 - gi|984069: OspA-PKa B. burgdorferi (SEQ ID NO. 12)
MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGEMKV LVSKEKNKDG
KYDLIATVDK LELKGTSDKN NGSGVLEGVK ADKSKVKLTI SDDLGQTTLE
101 VFKEDGKTLV SKKVTSKDKS STEEKFNEKG EVSEKIITRA DGTRLEYTGI
151 KSDGSGKAKE VLKGYVLEGT LTAEKTTLVV KEGTVTLSKN ISKSGEVSVE
201 LNDTDSSAAT KKTAAWNSGT STLTITVNSK KTKDLVFTKE NTITVQQYDS
251 NGTKLEGSAV EITKLDEIKN ALK >X80256 - gi|984079: OspA-PBr B. garinii (SEQ ID NO. 13)
MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGGMKV LVSKEKDKDG
KYSLMATVEK LELKGTSDKS NGSGVLEGEK ADKSKAKLTI SQDLNQTTFE
101 IFKEDGKTLV SRKVNSKDKS STEEKFNDKG KLSEKVVTRA NGTRLEYTEI
151 KNDGSGKAKE VLKGFALEGT LTDGGETKLT VTEGTVTLSK NISKSGEITV
201 ALNDTETTPA DKKTGEWKSD TSTLTISKNS QKPKQLVFTK ENTITVQNYN
251 RAGNALEGSP AEIKDLAELK AALK >X80254 - gi|984081: OspA-T25 B. garinii (SEQ ID NO. 14)
MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGEMKV LVSKEKDKDG
KYSLEATVDK LELKGTSDKN NGSGVLEGVK AAKSKAKLTI ADDLSQTKFE
101 IFKEDGKTLV SKKVTLKDKS STEEKFNDKG KLSEKVVTRA NGTRLEYTEI
151 QNDGSGKAKE VLKSLTLEGT LTADGETKLT VEAGTVTLSK NISESGEITV
201 ELKDTETTPA DKKSGTWDSK TSTLTISKNS QKTKQLVFTK ENTITVQKYN
251 TAGTKLEGSP AEIKDLEALK AALK
Ze zvolených OspA antigenů byly vybrány oblasti odpovídající C terminální soudkovité oblasti tvořené β14 až β21 listy jednotlivých výše uvedených OspA viz následující tabulka a C' terminální a helix OspA proteinu. Chimérický OspA polyepitop neobsahuje sekvence, které byly v dřívějších studiích identifikovány jako potenciálně zkříženě autoreaktivní s lidským LFA-1 proteinem (oblast aminokyselin 165-173).
| Označení v databázi GeneBank | Oblast sekvence v aminokyselinách | Zařazení OspA antigenů podle skupiny |
| X80257.1 -gi|258153 | 178-258 | B. garinii PBi |
| S48322 - gi|258151 | 178-258 | B. afzelii PKo |
| X80251 -gi|984067 | 179-258 | B. burgdorferi PHei |
| X80252 - gi 984085 | 178-259 | B. garinii TN, N34, VS307, G25 B. burgdorferi PWudll |
| X80182 - gi|984069 | 179-258 | B. burgdorferi PKa |
| X80256 - gi 984079 | 179-259 | B. garinii PBr |
| X80254 - gi|984081 | 179-259 | B. garinii T25 |
Ve výhodném provedení má chimérický rekombinantní fúzní protein založený na OspA antigenech připojeny na Ν' konci tři peptidové úseky: 1) hexa His kotva (His tag) umožňující purifikaci proteinu pomocí Ni-NTA afinitní chromatografie a přípravu metalochelatačních proteoliposomů, 2) štěpné místo pro thrombin umožňující odstranit His tag kotvu z rekombinantního proteinu pro imunodetekční ELISA aplikace stanovující hladiny antigenem navozených specifických protilátek u imunizovaných jedinců, 3) T7 epitop umožňující snadnou detekci rekombinantního proteinu během biotechnologické přípravy a purifikace pomocí anti T7 protilátky následující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO. 15)
MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSLKVTEG TVVLSKHIPN
SGEITVELND SNSTQATKKT GKWDSNTSTL TISVNSKKTK NIVFTKEDTI 101 TVQKYDSAGT NLEGNLEVKE GTVTLSKEIA KSGEVTVALN DTNTTQATKK 151 TGAWDSKTST LTISVNSKKT TQLVFTKQDT ITVQKYDSAG TNLEGTLKVT 201 EGTVTLSKNI SKSGEITVAL DDTDSSGNKK SGTWDSGTST LTISKNRTKT 251 KQLVFTKEDT ITVQNYDSAG TNLEGKTLKV TEGTVVLSKN ILKSGEITVA
301 LDDSDTTQAT KKTGKWDSKT STLTISVNSQ KTKNLVFTKE DTITVQKYDS
351 AGTNLEGKLV VKEGTVTLSK NISKSGEVSV ELNDTDSSAA TKKTAAWNSG
401 TSTLTITVNS KKTKDLVFTK ENTITVQQYD SNGTKLEGSL TVTEGTVTLS
451 KNISKSGEIT VALNDTETTP ADKKTGEWKS DTSTLTISKN SQKPKQLVFT
501 KENTITVQNY NRAGNALEGS LTVEAGTVTL SKNISESGEI TVELKDTETT
551 PADKKSGTWD SKTSTLTISK NSQKTKQLVF TKENTITVQK YNTAGTKLEG
601 SAVEITKLDE IKNALKKDLE ALKAALK nebo v jiném výhodném provedení má chimérický rekombinantní fúzní protein založený na OspA antigenech následující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO. 17)
MASMTGGQQM GRGSLKVTEG TVVLSKHIPN SGEITVELND SNSTQATKKT
GKWDSNTSTL TISVNSKKTK NIVFTKEDTI TVQKYDSAGT NLEGNLEVKE 101 GTVTLSKEIA KSGEVTVALN DTNTTQATKK TGAWDSKTST LTISVNSKKT 151 TQLVFTKQDT ITVQKYDSAG TNLEGTLKVT EGTVTLSKNI SKSGEITVAL 201 DDTDSSGNKK SGTWDSGTST LTISKNRTKT KQLVFTKEDT ITVQNYDSAG 251 TNLEGKTLKV TEGTVVLSKN ILKSGEITVA LDDSDTTQAT KKTGKWDSKT 301 STLTISVNSQ KTKNLVFTKE DTITVQKYDS AGTNLEGKLV VKEGTVTLSK 351 NISKSGEVSV ELNDTDSSAA TKKTAAWNSG TSTLTITVNS KKTKDLVFTK 401 ENTITVQQYD SNGTKLEGSL TVTEGTVTLS KNISKSGEIT VALNDTETTP 451 ADKKTGEWKS DTSTLTISKN SQKPKQLVFT KENTITVQNY NRAGNALEGS 501 LTVEAGTVTL SKNISESGEI TVELKDTETT PADKKSGTWD SKTSTLTISK 551 NSQKTKQLVF TKENTITVQK YNTAGTKLEG SAVEITKLDE IKNALKKDLE 601 ALKAALK
Přehled vyobrazení
Obr. 1 Trojrozměrný prediktivní model struktury chimérického OspA polyepitopu (polyOspA) podle příkladu 1. Predikce byla provedena pomocí programu Phyre 2.
Obr. 2 Výsledky purifikace rekombinantního chimérického OspA polyepitopu (polyOspA) podle příkladu 1 pomocí afinitní chromatografie s Ni-NTA agarosou. Bakterie exprimující polyOspA byly lyžovány za nativních podmínek a lyzát byl nanesen na Ni-NTA kolonu a poté byla kolona postupně promývána pufrem s rostoucí koncentrací imidazolu. Jednotlivé promývací frakce (Promytí 1-10 mM imidazol, Promytí 2-30 mM imidazol, Promytí 3-40 mM imidazol, Promytí 4 - 60 mM imidazol, Promytí 5 - 80 mM imidazol) a eluění frakce, provedené pufrem s koncentrací imidazolu 250 mM tvořené 3 objemy kolony (Eluce 1 až Eluce 6) byly naneseny na 10% SDS-PAGE, rozděleny v elektrickém poli. Gel byl poté barven pomocí Coomassie Brilliant Blue.
Obr. 3 Trojrozměrný prediktivní model struktury chimérického OspC polyepitopu (polyOspC) podle příkladu 2. Predikce byla provedena pomocí programu Phyre 2.
Obr. 4 Výsledky purifikace rekombinantního chimérického OspC (polyOspC) polyepitopu podle příkladu 2 pomocí afmitní chromatografie s Ni-NTA agarosou. Bakterie exprimující polyOspC byly lyžovány za nativních podmínek a lyzát byl nanesen na Ni-NTA kolonu a poté byla kolona postupně promývána pufrem s rostoucí koncentrací imidazolu. Jednotlivé promývací frakce jsou označeny použitou koncentrací imidazolu 10 mM - až 80 mM imid a eluční frakce, provedené pufrem s koncentrací imidazolu 250 mM tvořené 1.5 objemu kolony (Eluce 1 až Eluce 10) byly naneseny na 10% SDS-PAGE, rozděleny v elektrickém poli. Gel byl poté barven pomocí Coomassie Brilliant Blue.
Obr. 5 Distribuce velikostí OspA polyepitopu (polyOspA) (Příklad 3).
Velikost polyOspA (200pg/ml v PBS) byla měřena pomocí dynamického rozptylu světla na přístroji ZetaSizer ZS (Malvem, UK).
Obr. 6 Graf teplotní stability antigenů polyOspA (Příklad 3).
Teplotní stabilita polyOspA (200pg/ml v PBS) byla měřena pomocí dynamického rozptylu světla na přístroji ZetaSizer ZS (Malvem, UK).
Obr. 7 Distribuce velikostí OspC polyepitopu (polyOspC) (Příklad 3).
Velikost polyOspC (200pg/ml v PBS) byla měřena pomocí dynamického rozptylu světla na přístroji ZetaSizer ZS (Malvem, UK).
Obr. 8 Graf teplotní stability antigenů polyOspC (Příklad 3).
Teplotní stabilita polyOspC (200pg/ml v PBS) byla měřena pomocí dynamického rozptylu světla na přístroji ZetaSizer ZS (Malvern, UK)
Obr. 9 Vliv polohy His tag-u na C- a N- konci na termální denaturaci antigenů polyOspC (Příklad 3). Charakteristiky byly získány pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie (koncentrace proteinů 1 mg/ml v PBS). A) polyOspC His tag na N-konci; B) polyOspC His tag na C-konci.
Obr. 10 Charakteristika termálního přechodu antigenů polyOspA (Příklad 3). Charakteristika byly získány pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie (koncentrace proteinu 1 mg/ml v PBS). PolyOspA His tag na N-konci.
Obr. 11 Schéma struktury liposomální vakcinační částice na bázi metalochelatačních nanoliposomů s molekulárním adjuvans (Příklad 4). Vlevo je výsek povrchu liposomu z nějž vystupuje do středu obrázku DOGS-NTA (pro vazbu antigenů na povrch liposomu) a v dolní části obrázku lipofilní nepyrogenní derivát muramyl dipeptidu (norAbuMDP) jako adjuvans.
Vpravo nahoře rekombinantní protein s kotvou 6 histidinů, které se prostřednictvím komplexů niklu (Ni) na metalochelatačním lipidu DOGS-NTA nekovalentně navazují na povrch liposomu.
Obr. 12 Průkaz vazby rekombinantního antigenu na metalochelatační liposomy pomocí změny distribuce velikosti liposomů po vazbě polyepitopového antigenu (polyOspC) (Příklad 4). Změna distribuce velikosti byla měřena pomocí přístroje ZetaSizer ZS (Malvem, UK). Vložený obrázek z TEM ukazuje liposom bez navázaného proteinu (A) a molekuly polyOspC vázány na povrch liposomu (bíle šipky) a průkaz proteinu pomocí imunoznačení nanočásticemi zlata (černé šipky) (B).
Obr. 13 Výsledky stanovení hladiny sérových protilátek myší imunizovaných polyepitopem polyOspA a polyOspC (Příklad 5). Reaktivita protilátek byla stanovena pomocí ELISA. Na dno ELISA panelu byl navázán rekombinantní polyOspA (horní řada panelů) nebo polyOspC (dolní řada panelů). Myší séra byla naředěna identicky a poté nanesena do jednotlivých jamek. Vazba sérové protilátky specificky reagující s OspA nebo OspC byla prokázána sekundární protilátkou proti celkovému myšímu IgG, nebo IgGl, nebo IgG2a značenou peroxidázou a poté barevnou reakcí s orthofenylendiaminem. Rekombinantní polyepitopy polyOspA a polyOspC použité k imunizaci mají N-terminální His tag.
A. polyOspC nebo polyOspA
B. polyOspC nebo polyOspA (adjuvans: Alum)
C. polyOspC nebo polyOspA (adjuvans: Montanid - PET GEL A)
D. polyOspC nebo polyOspA (adjuvans: metalochelatační liposomy s molekulárním adjuvans MT06)
E. polyOspC nebo polyOspA (adjuvans: metalochelatační liposomy s molekulárním adjuvans MT06)
Obr. 14 Reakce sér myší imunizovaných polyOspC s divokými OspC proteiny izolovanými z různých druhů borelií (Příklad 5). Séra myší imunizovaných rekombinantními OspC proteiny s N terminálně připojenou His kotvou byla testována s diagnostickými stripy (Anti-Borrelia EUROLINE-RN-AT (IgM) obsahujícími políčka s OspC všech tří patogenních kmenů - B. garinii, B. burgdorferi, B. afzelii. A - sérum myši imunizované chimérickým polyepitopem OspC (polyOspC), B - sérum myši imunizované rekombinantním OspC z B. burgdorferi B31, C - kontrola - sérum myši vakcinované rekombinantním HIS značeným antigenem z Candida albicans hps90.
A - chimérický OspC polyepitop (polyOspC)
B - OspC z B. burgdorferi B31
C - kontrolní sérum (negativní)
Obr. 15 Stanovení protilátkové odpovědi psů proti OspA B. afzelii (A), B. garinii (B) a B. burgdorferi (C) po aplikaci chimérického rekombinantního antigenů polyOspA v kombinaci s různými adjuvans.
Experimentální vakcíny byly podány i.d. a s.c., protilátková odpověď byla sledována v průběhu 83 dnů. Molekulární adjuvans MT03 v kombinaci s PET GEL A bylo podáno ve formě micel.
Obr. 16: Stanovení protilátkové odpovědi psů proti OspC B. afzelii (A), B. garinii (B) a B. burgdorferi (C) po aplikaci chimérického rekombinantního antigenů polyOspC v kombinaci s různými adjuvans.
Experimentální vakcíny byly podány i.d. a s.c., protilátková odpověď byla sledována v průběhu 83 dnů.
Obr. 17 Indukce specifické protilátkové odpovědi psů proti rekombinantnímu Ferritinu II formulovanému s různými adjuvans.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1. Příprava antigenů: OspA polyepitop
Polyepitop OspA je připraven rekombinantní technologií z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii náležejících do skupin PHei, PKa, (Borrelia burgdorferi s.s.), PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 (Borrelia garinii) a PKo (Borrelia afzelii), charakteristických svou invazivitou a tedy schopností vyvolat systémové infekce. V databázi GenBank jsou OspA proteiny, jejichž fragmenty byly složeny do vakcinačního OspA polyepitopu, uvedeny pod následujícím označením s aminokyselinovou sekvencí:
X80257.1 - gi|258153: OspA-PBi B. garinii (SEQ ID NO. 8)
| 1 | MKKYLLGIGL | ILALIACKQN | VSSLDEKNSV | SVDLPGEMKV | LVSKEKDKDG |
| 51 | KYSLMATVDK | LELKGTSDKS | NGSGTLEGEK | SDKSKAKLTI | SEDLSKTTFE |
| 101 | IFKEDGKTLV | SKKVNSKDKS | SIEEKFNAKG | ELSEKTILRA | NGTRLEYTEI |
| 151 | KSDGTGKAKE | VLKDFALEGT | LAADKTTLKV | TEGTVVLSKH | IPNSGEITVE |
| 201 | LNDSNSTQAT | KKTGKWDSNT | STLTISVNSK | KTKNIVFTKE | DTITVQKYDS |
251 AGTNLEGNAV EIKTLDELKN ALK
S48322 - gi|258151: OspA-PKo B. qfzelii (SEQ ID NO. 9)
MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSA SVDLPGEMKV LVSKEKDKDG
KYSLKATVDK IELKGTSDKD NGSGVLEGTK DDKSKAKLTI ADDLSKTTFE
101 LFKEDGKTLV SRKVSSKDKT STDEMFNEKG ELSAKTMTRE NGTKLEYTEM
151 KSDGTGKAKE VLKNFTLEGK VANDKVTLEV KEGTVTLSKE IAKSGEVTVA
201 LNDTNTTQAT KKTGAWDSKT STLTISVNSK KTTQLVFTKQ DTITVQKYDS
251 AGTNLEGTAV EIKTLDELKN ALK
X80251 - gi|984067: OspA-PHei B. burgdorferi (SEQ ID NO. 10)
MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGGMKV LVSKEKDKDG
KYSLMATVEK LELKGTSDKN NGSGTLEGEK TDKSKVKLTI AEDLSKTTFE
101 IFKEDGKTLV SKKVTLKDKS STEEKFNEKG EISEKTIVRA NGTRLEYTDI
151 KSDKTGKAKE VLKDFTLEGT LAADGKTTLK VTEGTVTLSK NISKSGEITV
201 ALDDTDSSGN KKSGTWDSGT STLTISKNRT KTKQLVFTKE DTITVQNYDS
251 AGTNLEGKAV EITTLKELKN ALK
X80252 - gi|984085:OspA-TN, N34, VS307, G25 B. garinii, PWudll B. burgdorferi (SEQ
ID NO. 11)
| 1 | MKKYLLGIGL | ILALIACKQN | VSSLDEKNSV | SVDLPGGMTV | LVSKEKDKDG |
| 51 | KYSLEATVDK | LELKGTSDKN | NGSGTLEGEK | TDKSKVKLTI | ADDLSQTKFE |
| 101 | IFKEDGKTLV | SKKVTLKDKS | STEEKFNEKG | ETSEKTIVRA | NGTRLEYTDI |
| 151 | KSDGSGKAKE | VLKDFTLEGT | LAADGKTTLK | VTEGTVVLSK | NILKSGEITV |
| 201 | ALDDSDTTQA | TKKTGKWDSK | TSTLTISVNS | QKTKNLVFTK | EDTITVQKYD |
| 251 | SAGTNLEGKA | VEITTLKELK | DALK |
X80182 - gi|984069: OspA-PKa B. burgdorferi (SEQ ID NO. 12)
| 1 | MKKYLLGIGL | ILALIACKQN | VSSLDEKNSV | SVDLPGEMKV | LVSKEKNKDG |
| 51 | KYDLIATVDK | LELKGTSDKN | NGSGVLEGVK | ADKSKVKLTI | SDDLGQTTLE |
| 101 | VFKEDGKTLV | SKKVTSKDKS | STEEKFNEKG | EVSEKIITRA | DGTRLEYTGI |
| 151 | KSDGSGKAKE | VLKGYVLEGT | LTAEKTTLVV | KEGTVTLSKN | ISKSGEVSVE |
| 201 | LNDTDSSAAT | KKTAAWNSGT | STLTITVNSK | KTKDLVFTKE | NTITVQQYDS |
251 NGTKLEGSAV EITKLDEIKN ALK
X80256 - gi|984079: OspA-PBr B. garinii (SEQ ID NO. 13)
MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGGMKV LVSKEKDKDG
KYSLMATVEK LELKGTSDKS NGSGVLEGEK ADKSKAKLTI SQDLNQTTFE
101 IFKEDGKTLV SRKVNSKDKS STEEKFNDKG KLSEKVVTRA NGTRLEYTEI
151 KNDGSGKAKE VLKGFALEGT LTDGGETKLT VTEGTVTLSK NISKSGEITV
201 ALNDTETTPA DKKTGEWKSD TSTLTISKNS QKPKQLVFTK ENTITVQNYN
251 RAGNALEGSP AEIKDLAELK AALK
X80254 - gi|984081: OspA-T25 B. garinii (SEQ ID NO. 14)
MKKYLLGIGL ILALIACKQN VSSLDEKNSV SVDLPGEMKV LVSKEKDKDG
KYSLEATVDK LELKGTSDKN NGSGVLEGVK AAKSKAKLTI ADDLSQTKFE
101 IFKEDGKTLV SKKVTLKDKS STEEKFNDKG KLSEKVVTRA NGTRLEYTEI
151 QNDGSGKAKE VLKSLTLEGT LTADGETKLT VEAGTVTLSK NISESGEITV
201 ELKDTETTPA DKKSGTWDSK TSTLTISKNS QKTKQLVFTK ENTITVQKYN
251 TAGTKLEGSP AEIKDLEALK AALK
Pro konstrukci polyepitopu OspA byly použity úseky odpovídající C terminální soudkovité oblasti tvořené β14 až β21 listy jednotlivých výše uvedených OspA proteinů viz následující tabulka. Polyepitop je ukončen C' terminálním a helixem. Chimérický OspA polyepitop neobsahuje sekvence, které byly v dřívějších studiích identifikovány jako potenciálně zkříženě autoreaktivní s lidským LFA-1 proteinem (oblast aminokyselin 165-173). OspA polyepitop dále obsahuje na Ν' konci tři peptidové úseky: 1) hexa His kotvu (His tag) umožňující purifikaci proteinu pomocí Ni-NTA afmitní chromatografie a přípravu metalochelatačních proteoliposomů, 2) štěpné místo pro thrombin umožňující odstranit His tag kotvu z rekombinantního proteinu pro imunodetekční ELISA aplikace stanovující hladiny antigenem navozených specifických protilátek u imunizovaných jedinců, 3) T7 epitop umožňující snadnou detekci rekombinantního proteinu během biotechnologické přípravy a purifikace pomocí anti T7 protilátky.
| Označení v databázi GeneBank | Oblast sekvence v aminokyselinách | Zařazení OspA antigenu podle skupiny |
| X80257.1 - gi|258153 | 178-258 | B. garinii PBi |
| S48322- gi 258151 | 178-258 | B. afzelii PKo |
| X80251 -gi|984067 | 179-258 | B. burgdorferi PHei |
| X80252 - gi|984085 | 178-259 | B. garinii TN, N34, VS307, G25 B. burgdorferi PWudll |
| X80182 - gi|984069 | 179-258 | B. burgdorferi PKa |
| X80256 - gi|984079 | 179-259 | B. garinii PBr |
| X80254 - gi|984081 | 179-259 | B. garinii T25 |
Výsledný polyepitop OspA má následující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO. 15):
| 1 | MGSSHHHHHH | SSGLVPRGSH | MASMTGGQQM | GRGSLKVTEG | TVVLSKHIPN |
| 51 | SGEITVELND | SNSTQATKKT | GKWDSNTSTL | TISVNSKKTK | NIVFTKEDTI |
| 101 | TVQKYDSAGT | NLEGNLEVKE | GTVTLSKEIA | KSGEVTVALN | DTNTTQATKK |
| 151 | TGAWDSKTST | LTISVNSKKT | TQLVFTKQDT | ITVQKYDSAG | TNLEGTLKVT |
| 201 | EGTVTLSKNI | SKSGEITVAL | DDTDSSGNKK | SGTWDSGTST | LTISKNRTKT |
| 251 | KQLVFTKEDT | ITVQNYDSAG | TNLEGKTLKV | TEGTVVLSKN | ILKSGEITVA |
| 301 | LDDSDTTQAT | KKTGKWDSKT | STLTISVNSQ | KTKNLVFTKE | DTITVQKYDS |
| 351 | AGTNLEGKLV | VKEGTVTLSK | NISKSGEVSV | ELNDTDSSAA | TKKTAAWNSG |
| 401 | TSTLTITVNS | KKTKDLVFTK | ENTITVQQYD | SNGTKLEGSL | TVTEGTVTLS |
| 451 | KNISKSGEIT | VALNDTETTP | ADKKTGEWKS | DTSTLTISKN | SQKPKQLVFT |
| 501 | KENTITVQNY | NRAGNALEGS | LTVEAGTVTL | SKNISESGEI | TVELKDTETT |
| 551 | PADKKSGTWD | SKTSTLTISK | NSQKTKQLVF | TKENTITVQK | YNTAGTKLEG |
| 601 | SAVEITKLDE | IKNALKKDLE | ALKAALK |
Trojrozměrný prediktivní model struktury tohoto chimérického OspA polyepitopu je na Obr. 1. Fúzní chimérický rekombinantní protein (polyOspA), složený z imunodominantních oblastí OspA proteinů popsaných u klinicky nej významnějších kmenů Borelií, fúzovaný na Ν' konci s His tag kotvou pro metaloafmitní purifikaci. Genový konstrukt pro polyOspA byl vložen do plasmidu pET28 umožňujícím indukovanou expresi genu v bakteriálním systému po přídavku isopropyl-3-D-thiogalaktosidu. Protein byl exprimován v bakteriálním kmeni E. coli BL21 (DE3) a purifikován z bakteriálního lyzátu pomocí metaloafmitní chromatografie za nativních podmínek s využitím vazby His tágu na Ni-NTA agarosu. K promytí kolony a eluci cílového proteinu byly použity pufry obsahující imidazol jako kompetitor afmitní vazby.
Výstup purifikace OspA polyepitopu pomocí afmitní chromatografie s Ni-NTA agarosou je na Obr. 2.
Příklad 2: Příprava antigenů: OspC polyepitop
Polyepitop OspC je připraven rekombinantní technologií z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto, Borrelia garinii a Borrelia afzelii náležejících do skupin A, B, I a Kb (Borrelia burgdorferi s. s.), Pbi (Borrelia garinii) a PKo, (Borrelia afzelii), charakteristických svou invazivitou a tedy schopností vyvolat systémové infekce. V databázi GenBank jsou OspC proteiny, jejichž fragmenty byly složeny do vakcinačního OspC polyepitopu, uvedeny pod následujícím označením s aminokyselinovou sekvencí:
NP_047005 - gi| 11497007: OspC skupina A (B31MI) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 1)
| 1 | MKKNTLSAIL MTLFLFISCN NSGKDGNTSA NSADESVKGP NLTEISKKIT |
| 51 | DSNAVLLAVK EVEALLSSID EIAAKAIGKK IHQNNGLDTE NNHNGSLLAG |
| 101 | AYAISTLIKQ KLDGLKNEGL KEKIDAAKKC SETFTNKLKE KHTDLGKEGV |
| 151 | TDADAKEAIL KTNGTKTKGA EELGKLFESV EVLSKAAKEM LANSVKELTS |
| 201 | PVVAESPKKP |
EF053525 - gi| 117574163: OspC skupina B (LDP73) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 2)
| 1 | NNSGKDGNTS ANSADESVKG PNLTEISKKI TDSNAVLLAV KEVEALLSSI |
| 51 | DELAKAIGKK IKNDGSLDNE ANRNESLLAG AYTISTLITQ KLSKLNGSEG |
| 101 | LKEKIAAAKK CSEEFSTKLK DNHAQLGIQG VTDENAKKAI LKANAAGKDK |
| 151 | GVEELEKLSG SLESLSKAAK EMLANSVKEL TSPVVAESPK KP |
AF467874 - gi|23507072: OspC skupina I (B331) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 3)
| 1 | MKKNTLSAIL MTLFLFISCN NSGKDGNTSA NSADESVKGP NLTEISKKIT |
| 51 | ESNAVVLAVK EVETLLTSID ELAKAIGKKI KNDVSLDNEA DHNGSLISGA |
| 101 | YLISTLITKK ISAIKDSGEL KAEIEKAKKC SEEFTAKLKG EHTDLGKEGV |
| 151 | TDDNAKKAIL KTNNDKTKGA DELEKLFESV KNLSKAAKEM LTNSVKELTS |
| 201 | PVVAESPKKP |
EF053517 - gi| 117574147: OspC skupina K (LDP74) B. burgdorferi (SEQ ID NO. 4)
101
151
NNSGKDGNTS
DELATKAIGK
KLKEKIENAK
GAAELEKLFK
ANSADESVKG
KIQQNGGLAV
KCSEDFTKKL
AVENLAKAAK
PNLTEISKKI
EAGHNGTLLA
EGEHAQLGIE
EMLANSVKEL
TESNAVVLAV
GAYTISKLIT
NVTDENAKKA
TSPIVAESPK
KEIETLLASI
QKLDGLKNSE
ILITDAAKDK
KP
YP_063261 - gi|51038597: OspC skupina PBi B. garinii (SEQ ID NO. 5)
| 1 | MKKNTLSAIL | MTLFLFISCN | NSGGDSASTN | PDESAKGPNL | TVISKKITDS |
| 51 | NAFLLAVKEV | EALLSSIDEL | SKAIGKKIKN | DGTLDNEANR | NESLIAGAYE |
| 101 | ISKLITQKLS | VLNSEELKEK | IKEAKDCSEK | FTTKLKDSHA | ELGIQSVQDD |
| 151 | NAKKAILKTH | GTKDKGAKEL | EELFKSLESL | SKAAQAALTN | SVKELTNPVV |
| 201 | ΆΕΤΡΚΚΡ |
YP709265 - gi| 111074118: OspC skupina PKo B. afzelii (SEQ ID NO. 6)
| 1 | MKKNTLSAIL | MTLFLFISCN | NSGKGGDSAS | TNPADESAKG | PNLTEISKKI |
| 51 | TDSNAFVLAV | KEVETLVLSI | DELAKKAIGQ | KIDNNNGLAA | LNNQNGSLLA |
| 101 | GAYAISTLIT | EKLSKLKNLE | ELKTEIAKAK | KCSEEFTNKL | KSGHADLGKQ |
| 151 | DATDDHAKAA | ILKTHATTDK | GAKEFKDLFE | SVEGLLKAAQ | VALTNSVKEL |
| 201 | TSPVVAESPK | KP |
Pro konstrukci polyepitopu OspC byly použity úseky odpovídající a3-L5-a4-L6-a5 úsekům jednotlivých OspC proteinů, viz následující tabulka. Polyepitop je ukončen C' terminálním úsekem odvozeným z OspC PKo. Protein dále obsahuje na Ν' konci tři peptidové úseky: 1) hexa His kotvu (His tag) umožňující purifíkaci proteinu pomocí Ni-NTA afinitní chromatografie a přípravu metalochelatačních proteoliposomů, 2) štěpné místo pro thrombin umožňující odstranit His tag kotvu z rekombinantního proteinu pro imunodetekční ELISA aplikace stanovující hladiny antigenem navozených specifických protilátek u imunizovaných jedinců, 3) T7 epitop umožňující snadnou detekci rekombinantního proteinu během biotechnologické přípravy a purifikace pomocí anti T7 protilátky.
| Označení v databázi GeneBank | Vybraný sekvenční úsek - pořadí aminokyselin | Zařazení OspC antigenu podle skupiny |
| NP_047005 - gi| 11497007 | 128-196 | B. burgdorferi skupina A (B31MI) |
| EF053525 - gi|l 17574163 | 109-178 | B. burgdorferiskwpina B (LDP73) |
| AF467874 - gi|23507072 | 128-196 | B. burgdorferi skupina I (B331) |
| EF053517 - gi|l 17574147 | 110-178 | B. burgdorferi skupina K (LDP74) |
| YP_063261 - gi|51038597 | 125-193 | B. garinii skupina PBi |
| YP_709265- gi|l 11074118 | 130-211 | B. afzelii skupina Pko |
Výsledný polyepitop OspC má následující aminokyselinovou sekvenci (SEQ ID NO. 7):
| 1 | MGSSHHHHHH | SSGLVPRGSH | MASMTGGQQM | GRGSMKKCSE | EFSTKLKDNH |
| 51 | AQLGIQGVTD | ENAKKAILKA | NAAGKDKGVE | ELEKLSGSLE | SLSKAAKEML |
| 101 | ANSVKKKCSE | DFTKKLEGEH | AQLGIEQVTD | ENAKKAILIT | DAAKDKGAAE |
| 151 | LEKLFKAVEN | LAKAAKEMLA | NSVKKKCSET | FTNKLKEKHT | DLGKEGVTDA |
| 201 | DAKEAILKTQ | GTKTKGAEEL | GKLFESVEVL | SKAAKEMLAN | SVKKKCSEEF |
| 251 | TAKLKGEHTD | LGKEGVTDDN | AKKAILKTNN | DKTKGADELE | KLFESVKQLS |
| 301 | KAAKEMLTNS | VKKDCSEKFT | TKLKDSHAEL | GIQSVQDDNA | KKAILKTHGT |
| 351 | KDKGAKELEE | LFKSLESLSK | AAQAALTNSV | KKKCSEEFTN | KLKSGHADLG |
| 401 | KQDATDDHAK | AAILKTHATT | DKGAKEFKDL | FESVEGLLKA | AQVALTNSVK |
| 451 | ELTSPVVAES | PKKN |
3-D prediktivní model struktury tohoto chimérického OspC polyepitopu je na Obr. 3. Fúzní chimérický rekombinantní protein (polyOspC), složený z imunodominantních oblastí OspC proteinů popsaných u klinicky nej významnějších kmenů Borelií, fúzovaný na Ν' konci s His tag kotvou pro metaloafmitní purifikaci. Genový konstrukt pro polyOspC byl vložen doplasmidu pET28 umožňujícím indukovanou expresi genu v bakteriálním systému po přídavku isopropyl-[3-D-thiogalaktosidu. Protein byl exprimován v bakteriálním kmeni E. coli BL21 (DE3) a purifikován z bakteriálního lyzátu pomocí metaloafmitní chromatografie za nativních podmínek s využitím vazby His tágu na Ni-NTA agarosu. K promytí kolony a eluci cílového proteinu byly použity pufry obsahující imidazol jako kompetitor afinitní vazby. Výstup purifikace OspC polyepitopu pomocí afinitní chromatografie s Ni-NTA agarosou je na Obr. 4.
Příklad 3: Charakterizace antigenů
Velikost antigenu a teplotní stabilita
Hydrodynamický poloměr a teplotní stabilita antigenu byla hodnocena metodou dynamického rozptylu světla (DLS).(ZetaSizer ZS, Malvem). Teplotní gradient byl zvolen v rozmezí 10 až 60 °C, rychlost gradientu 0,5 °C/ min. Hydrodynamický průměr u antigenu polyOspA byl určen 5,3 nm, u antigenu polyOspC 6,1 nm. Výpočet byl proveden v modu maximálního počtu částic.
Obr. 5 a 6 ukazují distribuci velikostí, resp. teplotní stabilitu polyOspA . Obr. 7 a 8 ukazují distribuci velikostí, resp. teplotní stabilitu polyOspC.
Termální přechody a vliv polohy His tágu na C- a N- konci na termální denaturaci antigenu polyOspC včetně termodynamických parametrů termálního přechodu jsou zobrazeny na Obr.
9. Charakteristiky byly získány pomocí diferenciální skenovací kalorimetrie (NanoDSC II, TA Instruments, USA) (koncentrace proteinů 1 mg/ml v PBS). A) polyOspC His tag na Nkonci; B) polyOspC His tag na C-konci. Poloha His tag na N-konci zvyšuje teplotní stabilitu o přibližně 2 °C oproti C-terminálnímu umístění. polyOspA byl připraven s His tag na N-konci a jeho termální stabilita je vyšší než u polyOspA (Obr. 10).
Příklad 4: Liposomální formulace rekombinantních vakcín
Liposomální preparáty byly připraveny smícháním antigenů polyOspA nebo polyOspC (20 ug/dávka) s liposomy (0,3 mg lipidu/dávka). Jako komponenty pro tvorbu liposomů byly použity následující lipidy od firmy Avanti Polar Lipids (USA): Vaječný fosfatidyl cholin (EPC) (71 mol. %), palmitoyl-oleoyl fosfatidyl glycerol (POPG) (19 mol. %) a syntetický metalochelatační lipid DOGS-NTA-Ni (l,2-di-(9Z-octadecenoyl)-sn-glycero-3-[(N-(5-amino1-carboxypentyl)iminodiacetic acid) succinyl] (nickel salt)) (pro vazbu antigenu na povrch liposomů; 5 mol. %). Všechny lipidy byly pořízeny od firmy Avanti Polar Lipids, USA. Liposomy byly připraveny metodou hydratace lipidního filmu s následnou extruzí přes polykarbonátové filtry o velikosti pórů 200 nm (Millipore). Jako molekulární adjuvans inkorporované do liposomů byly použity monofosforyl lipid A (MPLA) nebo lipofilní derivát norAbuMDP (MT03) (struktura a chemický název je v příloze 1) v dávce 5 mol. %. Toto molekulární množství odpovídá 32,6 pg MPLA nebo 21,4 pg MT03 na vakcinační dávku.
Charakterizace liposomů
Kvalita liposomálních preparátů byla hodnocena metodami DLS (ZeteSizer ZS, Malvern) a TEM (EM Philips 208 S, Morgagni software, FEI, Brno, ČR). Povrch liposomů byl modifikován antigenem. Antigen se navázal pomocí His tag kotvy na metalochelatační lipid obsažený v liposomů.
Obr. 11 schematicky znázorňuje strukturu liposomální vakcinační částice. Obr. 12 znázorňuje změřené změny distribuce velikosti (metodou DLS), které jednoznačně potvrzují vazbu antigenu na metalochelatační lipid v liposomů - střední velikost metalochelatačních nanoliposomů je 48 nm, o navázání OspC polyepitopu se změní na 67 nm. Metoda TEM ukázala jednoznačně metalochelatační vazbu antigenů na liposom (vložený snímek na Obr.
13).
Příklad 5. Imunizace myší
Myši byly imunizovány rekombinantním OspA polyepitopem (panel OspA) nebo rekombinantním OspC polyepitopem (panel OspC) dvěma dávkami aplikovanými i.d. v intervalu 14 dní dle níže uvedených schémat.
A) bez adjuvans a liposomů polyOspA (20 pg/dávka) nebo polyOspC protein volný (20 pg/dávka)
B) ALUXID
Preparáty byly připraveny smícháním antigenu polyOspA nebo polyOspC (50 pg/dávka) a ALUXIDU (25 obj. % finálního objemu aplikované dávky).
C) PET GEL A
Preparáty byly připraveny přidáním antigenu polyOspA nebo polyOspC (50 pg/dávka) a PET GEL A (Seppic) (5 obj. % finálního objemu aplikované dávky).
D) liposomy MT03
Preparáty byly připraveny přidáním antigenu polyOspA nebo polyOspC (20 pg/dávka) k liposomům (0,3 mg lipidu/dávku) s obsahem MT03 (21,3 pg/dávku) a inkubovány nejméně 30 min při pokojové teplotě.
E) liposomy MPLA
Preparáty byly připraveny přidáním antigenu polyOspA nebo polyOspC (20 pg/dávka) k liposomům (0,3 mg lipidu na dávku) s obsahem MPLA (32,6 pg na dávku) a inkubovány 30 min při pokojové teplotě.
Jeden měsíc po druhé dávce byla odebrána séra a koncentrace OspA nebo OspC-specifických protilátek byly stanoveny pomocí ELISA, kde byly na dna jamek navázány rekombinantní proteiny v dávce 100 ng na jamku. Na ose jsou jednotlivé vakcinační preparáty označeny písmeny ve shodě s textem. V případě imunizace solubilním rekombinantním OspA polyepitopem prokázala ELISA jen prahovou antigenně specifickou reakci ve všech izotypech IgG i IgM (IgG viz Obr. 13, IgM neuvedeno). Imunizace rekombinantním solubilním OspC polyepitopem indukovala výraznější, byť stále velmi slabou imunitní protilátkovou odpověď. Naopak imunizace rekombinantními OspA a OspC polyepitopy ve formě metalochelatačních liposomů s jednotlivými adjuvans indukovala mnohem vyšší titry protilátek v jednotlivých izotypech IgG a IgM (pro IgM neuvedeno na obrázku). Klíčovým pozorováním je schopnost proteoliposomální formulace OspA i OspC polyepitopů s MT03 a MPLA adjuvans indukovat dominantní antigenně specifickou protilátkovou odpověď v izotypu IgG2a, který je u myší charakteristický schopností aktivovat klasickou dráhu komplementu a zprostředkovat opsonizační funkci, dva mechanismy, které v případě boreliových infekcí patří mezi hlavní obranné nástroje hostitele. Oproti tomu imunizace OspA a OspC proteoliposomy s hliníkovým adjuvans (Aluxid) a s GEL PET A indukovala převážně specifickou protilátkovou odpověď v izotypu IgGl, který zajišťuje neutralizční aktivitu protilátek, která v případě boreliových infekcí v protektivitě nedominuje.
Byla dokumentována (Obr. 14) schopnost chimérického OspC polyepitopů po imunizaci experimentálních myší indukovat protilátky, které reagují s OspC antigeny různých boreliových druhů: Borrelia. garinii, B. burgdorferi, B. afzelii (proužek A). Naopak imunizace myší rekombinantním OspC z B. burgdorferi indukovala pouze slabou odpověď protilátek, které nereagovaly se všemi testovanými OspC od hlavních druhů borelií (proužek B). Sérum neimunizované myši nereaguje s žádným OspC antigenem (proužek C).
Příprava micel adjuvans na bázi muramyl dipeptidu
Lipofilní analoga muramyldipeptidu (MDP) mají amfifilní charakter a proto jsou schopné se spontánně formovat do micel. Micelámí forma lipofilních analog MDP může být využita jako adjuvantní formulace pro přípravu rekombinantních vakcín buď samotná, nebo v kombinaci s dalšími látkami vykazujícími adjuvantní účinky.
Lipofilní derivát MDP se rozpustí v minimálním množství etanolu nebo DMSO a tento roztok je rychle zředěn vodou, roztokem vhodného pufru či fyziologickým roztokem.
Příklad složení roztoku micelámí formy MT03 o koncentraci Img MT03/ml :
| Složka | Množství |
| MT03 | 1 mg |
| Ethanol (96%) | 30pl |
| 0,9% NaCl | 970 pl |
Takto připravený roztok se smíchá s roztokem antigenu nebo případně dalšího adjuvans (PET GEL, Alum) tak, aby finální koncentrace obou složek odpovídala požadované imunizační dávce.
Velikost micel MT03 je vyjádřena jako hydrodynamický průměr v nanometrech a činí 8-10 nm. Kritická micelámí koncentrace MT03 při 25°C byla stanovena na 100 pg/ml, při 37 °C na 30 pg/ml (metoda DLS).
Kombinace lipofilních derivátů MDP s dalšími adjuvantními látkami
Micelámí formy lipofilních derivátů MDP mohou být kombinovány s dalšími adjuvantními látkami, jako jsou například soli aluminia nebo PET GEL A. Tím je dosaženo synergického účinku obou adjuvancií.
Příprava formulace PET GEL A potencované micelámí formou MT03
Připraví se roztok micel MT03 tak, jak je uvedeno výše. Odděleně se naředí roztok PET GEL A tak, aby po smíchání s roztokem micel MT03 bylo dosaženo požadované koncentrace obou adjuvancií.
Takto připravený roztok se smíchá s roztokem antigenu tak, aby finální koncentrace nebo množství všech složek odpovídala požadované imunizační dávce. Molekulární adjuvans MT03 nepůsobí agregaci antigeny nebo částic PET GEL (měřeno pomocí DLS, data neuváděna)
Formulace GEL PET A potencované micelámí formou MT03:
| Složka | Finální množství/dávka |
| MT03 GEL PET A 0,9% NaCl antigen polyOspA | 40,2 pg 10% roztok objem doplněn do finálního objemu 0,1 nebo 1 ml 50 pg |
Příklad 6: Sledování protilátkové odpovědi proti OspA u psů po imunizaci chimérickým proteinem polyOspA s adjuvantními přípravky Aluxid a PET GEL A, liposomální MT03 a PET GEL A + micelární MT03
Antigen: K imunizaci byl použit fuzní chimérický rekombinantní protein (polyOspA, polyOspA).
Zvířata
Do pokusu bylo zařazeno 20 psů ve věku 11-12 měsíců. Zvířata byla rozdělena do deseti skupin po dvou kusech. Jednotlivým zvířatům byl aplikován antigen nebo placebo s příslušným imunitním adjuvans ve třech dávkách v intervalu tří týdnů. Dávka antigenu (chimérický rekombinantní OspA protein - polyOspA, polyOspA) byla jednotně 50 pg v dávce. Vakcinační dávka byla 1,0 ml s.c. nebo 0,1 ml i.d. Placebo (= příslušné imunitní adjuvans) bylo zvířatům aplikováno subkutánně ve stejných časových intervalech a ve stejných dávkách (1,0 ml).
Adjuvancia:
Aluxid - Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant, Brenntag Biosector Denmark
PETGEL A-SEPPIC
MT03 liposomální
MT03 micelární + PET GEL A
Příprava liposomů
Liposomální preparáty (MT03 nebo MPLA) byly připraveny smícháním antigenů polyOspA (50 pg/dávka) s liposomy (0,82 mg lipidu/dávka). Jako komponenty pro tvorbu liposomů byly použity následující lipidy: EPC (71 mol. %), POPG (19 mol. %) a syntetický metalochelatační lipid DOGS-NTA-Ni (pro vazbu antigenu na povrch liposomů; 5 mol. %). Všechny lipidy byly pořízeny z Avanti Polar Lipids, USA. Liposomy byly připraveny metodou hydratace lipidního filmu s následnou extruzí přes polykarbonátové filtry o velikosti pórů 200 nm (Millipore). Jako molekulární adjuvans inkorporované do liposomů byly použity monofosforyl lipid A (MPLA) nebo lipofílní derivát norAbuMDP (MT03) v dávce 5 mol. %. Toto molekulární množství odpovídá 88 pg MPLA nebo 40 pg MT03 na vakcinační dávku.
V případě kontrolních skupin MT03 a MPLA byly použity pouze liposomy (0,82 mg/dávka) s obsahem 40 pg MT03 či 88 pg MPLA bez přídavku antigenů.
Příprava vakcinačních dávek:
polyOspA + Aluxid
Antigen - 50 pg
Aluxid - 10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.
polyOspA + PET GEL A
Antigen-50 pg
PET GEL A - 10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.
polyOspA + MT 03 liposomální
Antigen - 50 pg
Navázání antigenů na imunitní adjuvans bylo provedeno viz Příklad 4.
polyOspA + MT03 micelární + PET GEL A
Antigen - 50 pg
PET GEL A - 10% objemových
MT03 micelární - dle předpisu ( viz. Příklad 4))
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním
PLACEBO = Aluxid
Antigen - 0 pg
Aluxid -10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)
PLACEBO = PET GEL A
Antigen - 0 pg
PET GEL A - 10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)
PLACEBO = MT 03
Antigen - 0 pg
Příprava - VÚVeL
PLACEBO =MT03 micelární + PET GEL A
Antigen - 0 pg
PET GEL A + MT03 micelární - 10% objemových (dle předpisu viz. Příklad 4)
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)
Odběry krve
Krev byla všem zvířatům odebrána v den 0 (před primární vakcinací), v den 20 (před 1. revakcinací), v den 53 (před 2. revakcinací) a dále pak v intervalu přibližně jedenkrát za 4 týdny až do doby ukončení pokusu (minimálně 12 měsíců). Ze vzorků krve byla po koagulaci separována séra.
Sledování zvířat v průběhu pokusu:
Zvířata byla sledována denně, po dobu 14 dnů po každé aplikaci a byl hodnocen výskyt lokálních a celkových postvakcinačních reakcí.
Lokální, ani celkové postvakcinační reakce nebyly u žádného ze zvířat pozorovány.
Denně, 3 dny před každou aplikací, v den aplikace, 4 hodiny po aplikaci a dále pak po dobu 4 dnů po aplikaci byla všem zvířatům měřena tělesná teplota. V průběhu sledování nebyly naměřeny hodnoty tělesné teploty mimo fyziologické rozmezí.
Schéma experimentu:
| Skupina | Číslo pořadové | Číslo evidenční | Pohlaví | Imunizace | Dávka antigenu | Adjuvans | Aplikace | Dávka |
| 1 | 1 | 2404 | d' | 3 dávky (vakcinace + 2 revakcinace) v intervalu cca 21 dnů | 50 pg | ALUXID | s.c. | 1,0 ml |
| 2 | 2431 | ? | 50 pg | ALUXID | s.c. | 1,0 ml | ||
| 2 | 3 | 2412 | a | 50 pg | ALUXID | i.d. | 0,1 ml | |
| 4 | 2406 | ? | 50 pg | ALUXID | i.d. | 0,1 ml | ||
| 3 | 5 | 2418 | d' | 50 pg | PET GEL A | s.c. | 1,0 ml | |
| 6 | 2413 | ? | 50 pg | PET GEL A | s.c. | 1,0 ml | ||
| 4 | 7 | 2428 | (d | 50 pg | PET GEL A | i.d. | 0,1 ml | |
| 8 | 2407 | ? | 50 pg | PET GEL A | i.d. | 0,1 ml | ||
| 5 | 9 | 2424 | d | 50 pg | MT 03 | s.c. | 1,0 ml | |
| 10 | 2409 | ? | 50 pg | MT 03 | s.c. | 1,0 ml | ||
| 6 | 11 | 2405 | cd | 50 pg | MT 03 | i.d. | 0,1 ml | |
| 12 | 2419 | ? | 50 pg | MT 03 | i.d. | 0,1 ml | ||
| 7 | 13 | 2422 | d' | 50 pg | PET GEL A +MT03 Mlč | s.c. | 1,0 ml | |
| 14 | 2414 | ? | 50 pg | PET GEL A +MT03 Mlč | s.c. | 1,0 ml | ||
| 8 | 15 | 2429 | 50 pg | PET GEL A +MT03 MIC | i.d. | 0,1 ml | ||
| 16 | 2408 | 2 | 50 pg | PET GEL A +MT03 MIC | i.d. | 0,1 ml |
| 9 | 17 | 2417 | d' | - | ALUXID | s.c. | 1,0 ml | |
| 18 | 2415 | ? | - | PET GEL A | s.c. | 1,0 ml | ||
| 10 | 19 | 2427 | c? | - | MT 03 | s.c. | 1,0 ml | |
| 20 | 2416 | ? | - | PET GEL A +MT03 MIC | s.c. | 1,0 ml |
Časový harmonogram:
| Den —> | 0 | 20 | 53 | 83 | 111 | 133 | 139 | 166 | 195 | 223 | 251 | 279 | 307 | 335 | 363 |
| 2 | m | ||||||||||||||
| Datum —> | 11. | ri | rr | rZ | τί | TT | iZ | sd | r- | 00 | OS | o | 11. | ||
| iZ | •Z | so | so | OO n | rZ | o | Os n | sd n | oč | sd | tZ | ||||
| Imunizace | + | + | + | ||||||||||||
| Odběr krve | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
Stanovenípostvakcinačních anti OspA protilátek v sérech psů metodou EL1SA
Antigeny použité pro potažení mikrotitrační destičky • Antigen rOspA B. afzelii
Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7010 (E coli BL21(DE3)/pDEST17).
• Antigen rOspA B. garinii
Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7019 (E. coli BL21(DE3)/pCRT7/NT).
• Antigen rOspA B. burgdorferi sensu stricto
Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7012 (E. coli BL21(DE3)/pDEST17).
Příprava antigenu pro potažení mikrotitrační destičky
Pro potažení mikrotitrační destičky byly použity rekombinantní OspA proteiny uvedené výše.
Kontrolní pozitivní séra
Kontrolní pozitivní séra byla připravena imunizací psů inaktivovanými kmeny B. afzelii, B. garinii a B. burgdorferi sensu stricto s Freundovým adjuvans. Kontrolní negativní sérum bylo připraveno z nevakcinovaného psa.
Vyhodnocení protilátkové odpovědi po imunizaci pokusných zvířat na základě dosažených hodnot OD450
Měření OD: OD se měří při vlnové délce 450 nm proti hodnotě BLANK.
Hodnocení: Pro hodnocení se použije průměrná hodnota OD450 replikátů testovaného vzorku.
Zkouška je hodnotitelná, je-li: CV replikátů < 15%
Vyšetření zahrnuje 4 po sobě jdoucí odběry
1) iniciální (před vakcinací)
2) 3 týdny po vakcinaci (před 1. revakcinací)
3) 53 dnů pol. revakcinací (před 2. revakcinací)
4) 4 týdny po 2 revakcinací
Hodnoty OD450 jsou v grafech srovnávány s hodnotami OD450 kontrolního pozitivního a kontrolního negativního séra.
Průběh imunitní odpovědi psů na různé experimentální formulace vakcín s antigenem polyOspA jsou na Obr. 15.
Závěr:
Všechna adjuvans byla schopna navodit produkci specifických protilátek. Z hlediska indukce protilátkové odpovědi proti OspA B. afzelii, OspA B. garinii a OspA B. burgdorferi sensu stricto po vakcinaci psů chimérickým OspA (polyOspA) proteinem se jako nej lepší imunitní adjuvans jeví PET GEL A a PET GEL A ve směsi s micelámím MT03.
Příklad 7: Sledování protilátkové odpovědi proti OspC u psů po imunizaci chimérickým proteinem polyOspC s adjuvantními přípravky Aluxid a PET GEL A a s liposomálními adjuvans MT03 a MPLA
Antigen: K imunizaci byl použit fúzní chimérický rekombinantní protein (polyOspC, polyOspC).
Zvířata
Do pokusu bylo zařazeno 20 psů ve věku 10-13 měsíců. Zvířata byla rozdělena do deseti skupin po dvou kusech. Jednotlivým zvířatům byl aplikován antigen nebo placebo s příslušným imunitním adjuvans ve třech dávkách v intervalu tří týdnů. Dávka antigenů (chimérický rekombinantní OspC protein - polyOspC, polyOspC) byla jednotně 50 pg v dávce. Vakcinační dávka byla 1,0 ml s.c. nebo 0,1 ml i.d. Placebo (= příslušné imunitní adjuvans) bylo zvířatům aplikováno subkutánně ve stejných časových intervalech a ve stejných dávkách (1,0 ml).
Adjuvancia:
Aluxid - Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant, Brenntag Biosector Denmark
PET GEL A - SEPPIC liposomální MT03 liposomální MPLA
Příprava liposomů
Liposomální preparáty (MT03 nebo MPLA) byly připraveny smícháním antigenů polyOspC (50 pg/dávka) s liposomy (0,82 mg lipidu/dávka) analogicky k Příkladu 6.
Příprava vakcinačních dávek:
polyOspC + Aluxid
Antigen - 50 pg
Aluxid - 10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.
polyOspC + PET GEL A
Antigen - 50 pg
PET GEL A - 10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.
polyOspC + liposomální MT 03
Antigen - 50 pg Liposomy - 0,82 mg
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Roztoky antigenů a liposomů byly smíchány a inkubovány při pokojové teplotě alespoň 30 minut.
polyOspC + liposomální MPLA
Antigen - 50 pg
Liposomy - 0,82 mg
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Roztoky antigenů a liposomů byly smíchány a inkubovány při pokojové teplotě alespoň 30 minut.
PLACEBO=Aluxid
Antigen - 0 pg
Aluxid - 10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)
PLACEBO=PET GEL A
Antigen - 0 pg
PET GEL A - 10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 nebo 0,1 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány (protřepání obsahu lékovky)
PLACEBO =MT 03
Antigen - 0 pg
PLACEBO =MPLA
Antigen - 0 pg
Odběry krve
Krev byla všem zvířatům odebrána v den 0 (před primární vakcinací), v den 21 (před 1. revakcinací), v den 42 (před 2. revakcinací) a dále pak v intervalu přibližně jedenkrát za 4 týdny až do doby ukončení pokusu (minimálně 12 měsíců). Ze vzorků krve byla po koagulaci separována séra.
Sledování zvířat v průběhu pokusu:
Zvířata byla sledována analogicky k Příkladu 6.
Schéma experimentu:
| Skupina | Číslo pořadové | Číslo evidenční | Pohlaví | Imunizace | Dávka antigenu | Adjuvans | Aplikace | Dávka |
| 1 | 1 | 2214 | ? | 3 dávky (vakcinace + 2 revakcinace) v intervalu 21 dnů | 50 pg | ALUXID | s.c. | 1,0 ml |
| 2 | 2267 | <3 | 50 pg | ALUXID | s.c. | 1,0 ml | ||
| 2 | 3 | 2228 | ? | 50 pg | ALUXID | i.d. | 0,1 ml | |
| 4 | 2288 | 3 | 50 pg | ALUXID | i.d. | 0,1 ml | ||
| 3 | 5 | 2236 | ? | 50 pg | PET GEL A | s.c. | 1,0 ml | |
| 6 | 2303 | ? | 50 pg | PET GEL A | s.c. | 1,0 ml | ||
| 4 | 7 | 2289 | ? | 50 pg | PET GEL A | i.d. | 0,1 ml | |
| 8 | 2247 | 3 | 50 pg | PET GEL A | i.d. | 0,1 ml | ||
| 5 | 9 | 2294 | ? | 50 pg | MT 03 | s.c. | 1,0 ml | |
| 10 | 2304 | ? | 50 pg | MT 03 | s.c. | 1,0 ml | ||
| 6 | 11 | 2292 | 3 | 50 pg | MT 03 | i.d. | 0,1 ml | |
| 12 | 2215 | ? | 50 pg | MT 03 | i.d. | 0,1 ml | ||
| 7 | 13 | 2216 | ? | 50 pg | MPLA | s.c. | 1,0 ml | |
| 14 | 2305 | ? | 50 pg | MPLA | s.c. | 1,0 ml | ||
| 8 | 15 | 2266 | 3 | 50 pg | MPLA | i.d. | 0,1 ml |
| 16 | 2270 | $ | 50 pg | MPLA | i.d. | 0,1 ml | ||
| 9 | 17 | 2123 | - | ALUXID | s.c. | 1,0 ml | ||
| 18 | 2211 | - | PET GEL A | s.c. | 1,0 ml | |||
| 10 | 19 | 2212 | - | MT 03 | s.c. | 1,0 ml | ||
| 20 | 2246 | - | MPLA | s.c. | 1,0 ml |
Časový harmonogram:
| Den | 1 | 2 | 9 | 7 | 25 | 53 | 81 | 09 | 37 | 65 | 93 | 17 | 49 | 76 | |
| Datum | 26.4.13 | 17.5.13 | 7.6.13 | 4.7.13 | 1.8.13 | 29.8.13 | 26.9.13 | 24.10.13 | 21.11.13 | 19.12.13 | 16.1.14 | 13.2.14 | 9.3.14 | 10.4.14 | 7.5.14 |
| Imunizace | + | + | + | ||||||||||||
| Odběr krve | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
Stanovenípostvakcinačních anti OspC protilátek v sérech psů metodou ELISA
Antigeny použité pro potažení mikrotitrační destičky
Antigen rOspC B. afzelii
Antigen je rekombinantníprotein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7002 (E. coli BL21(DE3)/ pET28a).
Antigen rOspC B. garinii
Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7004 (E. coli BL21(DE3)/ pET28a).
Antigen rOspC B. burgdorferi sensu stricto
Antigen je rekombinantní protein izolovaný z geneticky modifikovaného kmene E. coli MSLB 7003 (E coli BL21(DE3)/ pET28a).
Příprava antigenů pro potažení mikrotitrační destičky
Pro potažení mikrotitrační destičky byly použity rekombinantní rOspC proteiny uvedené výše.
Kontrolní pozitivní séra
Byla připravena imunizací psů inaktivovanými kmeny B. afzelii, B. garinii a B. burgdorferi sensu stricto s Freundovým adjuvans. Kontrolní negativní sérum bylo připraveno z nevakcinovaného psa.
Vyhodnocení protilátkové odpovědi po imunizaci pokusných zvířat na základě dosažených hodnot OD450
Měření OD: OD se měří při vlnové délce 450 nm proti hodnotě BLANK.
Hodnocení: Pro hodnocení se použije průměrná hodnota OD45oreplikátůtestováného vzorku.
Zkouška je hodnotíte lná,je-li:CV replikátů< 15%
Vyšetření zahrnuje 4 po sobě jdoucí odběry
1) iniciální (před vakcinací)
2) 3 týdny po vakcinaci (před 1. revakcinací)
3) 3 týdny pol. revakcinací (před 2. revakcinací)
4) 4 týdny po 2 revakcinací
Hodnoty OD450 jsou v grafech srovnávány s hodnotami OD450 kontrolního pozitivního a kontrolního negativního séra.
Průběh imunitní odpovědi psů na různé experimentální formulace vakcín s antigenem polyOspA jsou na Obr. 16.
Závěr:
Vyhodnoceni antigenně specifické reakce protilátek indukovaných imunizací psů rekombinantním OspC polyepitopem sledovalo dva faktory: A) zkříženou reaktivitu psích hyperimunních sér s OspC antigeny z různých druhů borelií, B) schopnost konkrétního použitého adjuvans indukovat OspC-specifické sérové protilátky v jednotlivých izotypech IgG u psů. Jako příklad uvedena reakce jednotlivých izotypů psích IgG (po imunizaci OspC polyepeitopem s různými adjuvans) s OspC polyepitopem navázaným na dna jamek ELISA panelů a s purifikovaným rekombinantním OspC B. afzelii.
Všecha použitá testovaná adjuvans byla schopna navodit tvorbu specifických protilátek schopných rozeznat všechny tři typy OspC. Z hlediska indukce protilátkové odpovědi proti OspC B. afzelii, OspC B. garinii a OspC B. burgdorferi sensu stricto po vakcinaci psů chimérickým rekombinantním OspC proteinem (polyOspC) se jako nej lepší imunitní adjuvans jeví Aluxid (2% gel hydroxidu hlinitého).
Příklad 8 Protilátková odpověď proti rekombinantnímu antigenu rFerritin II. Sledování protilátkové odpovědi proti Ferritinu II u psů po aplikaci antigenu formulovaného s různými adjuvans
Antigem
Byl použit rekombinantní protein FERRITIN II.
Ferritin II je identifikovaný a charakterizovaný protein sekretovaný do plasmy klíštěte. Byly stanoveny nukleotidové sekvence genu Ferritinu II a byla určena jejich primární struktura. (Kopaček et al. 2003. Insect Biochemistry and Molecular Biology 33, 103-113) Ferritin II v těle klíštěte plní funkci protektivního proteinu, který váže a uchovává ionty železa uvolněné z hemoglobinu a zároveň výrazně eliminuje oxidativní stres způsobený vysokou koncentraci iontů železa. Ferritin je zodpovědný za eliminaci toxicity iontů železa přijatých z krve hostitele (Galay, et al.2014 PLOS ONE 9, e90661). Jestliže se podaří blokovat funkci Ferritinu, nebude schopno přisáté klíště parazitovat na hostiteli, protože dojde k jeho intoxikaci nehemově vázanými ionty železa. Zkrácením doby sání na hostiteli může dojít k zamezení přenosu klíšťaty přenášených patogenů (Hajdusek et al. 2010 Vaccine 28, 29932998). Blokování Ferritinu II lze provést reakcí se specifickou protilátkou za vzniku imunokomplexu. Specifické protilátky vzniknou v organismu po imunizaci antigenem.
Jako vhodný antigen pro imunizaci lze použít rekombinantní Ferritin II nebo jeho fragment připravený jak v prokaryotických (E. coli) tak eukaryotických (Pichia pastor is) expresních systémech.
Zvířata
Do pokusu bylo zařazeno 10 nevakcinovaných psů ve věku 3 - 4 měsíce. Zvířata byla rozdělena do 4 skupin po dvou nebo třech kusech. Jednotlivým zvířatům byl aplikován antigen s příslušným imunitním adjuvans ve třech dávkách v intervalu tří týdnů. Dávka antigenu (FERRITIN II) byla jednotně 50 pg v dávce. Vakcinační dávka byla 1,0 ml s.c.
Adjuvancia:
Aluxid - Aluminium Hydroxide Gel Adjuvant, Brenntag Biosector Denmark PET GEL A - (SEPPIC) liposomální MT05 liposomální MT06
Příprava vakcinačních dávek’.
FERRITIN II + Aluxid
Antigen-50 pg
Aluxid - 10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.
FERRITIN II + PET GEL A
Antigen - 50 pg
PET GEL A - 10% objemových
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.
FERRITIN II + MT 05
Antigen - 50 pg liposomální MT05 - 0,88mg
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním.
FERRITIN II + MT 06
Antigen - 50 pg liposomální MT06 - 0,88mg
Sterilní fyziologický roztok - ad 1,0 ml
Jednotlivé složky byly smíchány a homogenizovány roztřepáním
Příprava liposomů
Liposomální preparáty (MT05 nebo MT06) byly připraveny smícháním antigenu FERRITIN II (20 pg/dávka) s liposomy (0,88 mg lipidu/dávka). Jako komponenty pro tvorbu liposomů byly použity následující lipidy: EPC (71 mol. %), POPG (19 mol. %) a syntetický metalochelatační lipid DOGS-NTA-Ni (pro vazbu antigenů na povrch liposomů; 5 mol. %). Všechny lipidy byly pořízeny z Avanti Polar Lipids, USA. Liposomy byly připraveny metodou hydratace lipidního filmu s následnou extruzí přes polykarbonátové filtry o velikosti pórů 200 nm (Millipore). Jako molekulární adjuvans inkorporované do liposomů byly použity lipofilní deriváty norAbuMDP (MT05 nebo MT06) v dávce 5 mol. %. Toto molekulární množství odpovídá 56,4 nmol látky na vakcinační dávku (odpovídá 50 pg MT05 nebo 65 pg MT06).
Antigen použitý pro potažení mikrotitrační destičky
Rekombinantní klíštěcí FERRITIN II (Parazitologický ústav BC AV České Budějovice)
Odběry krve
Krev byla všem zvířatům odebrána v den 0 (před primární vakcinací), v den 21 (před 1. revakcinací), v den 42 (před 2. revakcinací) a dále pak v intervalu přibližně jedenkrát za 4 týdny až do doby ukončení pokusu (minimálně 12 měsíců). Ze vzorků krve byla po koagulaci separována séra.
Sledování zvířat v průběhu pokusu
Zvířata byla sledována denně, po dobu 14 dnů po každé aplikaci a byl hodnocen výskyt lokálních a celkových postvakcinačních reakcí. Lokální, ani celkové postvakcinační reakce nebyly u žádného ze zvířat pozorovány. Denně, 3 dny před každou aplikací, v den aplikace, 4 hodiny po aplikaci a dále pak po dobu 4 dnů po aplikaci byla všem zvířatům měřena tělesná teplota. V průběhu sledování nebyly naměřeny hodnoty tělesné teploty mimo fyziologické rozmezí.
Schéma experimentu:
| Skupí na | Číslo porado vé | Číslo evidenč ní | Pohlav i | Vakcinace 1,0 ml s.c. | Revakcinace 1,0 ml s.c. | 2. revakcinace 1,0 ml s.c. | |||
| Dávka antige nu | Adjuv ans | Dávka antige nu | Adjuv ans | Dávka antige nu | Adjuv ans | ||||
| 1 | 1 | 2003 | ? | 50 pg | Aluxid | 50 pg | Aluxid | 50 pg | Aluxid |
| 2 | 2004 | ? | 50 pg | Aluxid | 50 pg | Aluxid | 50 pg | Aluxid | |
| 2 | 3 | 2012 | Z | 50 pg | PET GEL A | 50 pg | PET GEL A | 50 pg | PET GEL A |
| 4 | 2013 | <3 | 50 pg | PET GEL A | 50 pg | PET GEL A | 50 pg | PET GEL A | |
| 3 | 5 | 2032 | ? | 50 pg | MT05 | 50 pg | MT05 | 50 pg | MT05 |
| 6 | 2037 | 3 | 50 pg | MT05 | 50 pg | MT05 | 50 pg | MT05 | |
| 7 | 2043 | 3 | 50 pg | MT05 | 50 pg | MT05 | 50 pg | MT05 | |
| 4 | 8 | 2053 | 3 | 50 pg | MT06 | 50 pg | MT06 | 50 pg | MT06 |
| 9 | 2054 | e | 50 pg | MT06 | 50 pg | MT06 | 50 pg | MT06 | |
| 10 | 2056 | 3 | 50 pg | MT06 | 50 pg | MT06 | 50 pg | MT06 |
Časový harmonogram:
| Den | 0 | 21 | 42 | 70 | 98 | 126 | 154 | 182 | 210 | 238 | 266 | 294 | 322 | 351 | 378 |
| Datum | 16.5.12 | 6.6.12 | 27.6.12 | 25.7.12 | 22.8.12 | 19.9.12 | 17.10.12 | 14.11.12 | 12.12.12 | 9.1.13 | 6.2.13 | 6.3.13 | 3.4.13 | 2.5.13 | 29.5.13 |
| Imunizace | + | + | + | ||||||||||||
| Odběr krve | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + | + |
Stanovení postvakcinačních anti FERII protilátek v sérech psů metodou ELISA
Antigeny použité pro potažení mikrotitrační destičky
Rekombinantní FERRITIN II (Parazitologický ústav BC AV České Budějovice)
Rekombinantní protein se skladuje v zamraženém stavu při teplotě -80°C.
Substance
Kontrolní pozitivní sérum FERRITIN II
Kontrolní sérum negativní
Kontrolní pozitivní séra byla připravena imunizací psů rekombinantním FERII s Freundovým adjuvans. Kontrolní negativní sérum bylo připraveno z nevakcinovaného psa.
Postup ELISA
ELISA panely byly potaženy 100 μΐ rekombinantního FERRITINU II.
Hodnocení
Pro hodnocení se použije průměrná hodnota OD450 replikátů testovaného vzorku.
Zkouška je hodnotitelná, je-li: CV replikátů <15%
Vyšetření zahrnuje 15 po sobě jdoucích odběrů
Hodnoty OD450 jsou v grafech srovnávány s hodnotami OD450 kontrolního pozitivního a kontrolního negativního séra.
Sledování protilátkové odpovědi psů proti FER II po subkutánní aplikaci je znázorněno na Obr. 17
Formulace rFerritinu II s různými adjuvans
FERRITIN II + Aluxid
FERRITIN II + PET GEL A
FERRITIN II + MT05
FERRITIN II + MT06
Závěr:
Použitá adjuvans jsou schopna navodit specifickou imunitní protilátkovou odpověď. Z hlediska indukce protilátkové odpovědi proti FER II po imunizaci psů se jako nej lepší imunitní adjuvans jeví Aluxid (2% gel hydroxidu hlinitého) a PET GEL A.
Claims (13)
- PATENTOVÉ NÁROKY1. Chimérický polyepitopový rekombinantní antigen, vyznačený tím, že obsahuje dva až deset imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, PKa, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko, a orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B, I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borrelia garinii Pbi.
- 2. Antigen podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje dva až deset, s výhodou sedm, imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující OspC orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspC z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto A, B, I, Kb, Borrelia afzelii Pko a Borrelia garinii Pbi.
- 3. Antigen podle nároku 2, vyznačený tím, že OspC sekvence jsou vybrány ze skupiny zahrnující:OspC-type B B. burgdorferi (SEQ ID NO. 18) KKCSEEFSTKLKDNHAQLGIQGVTDENAKKAILKANAAGKDKGVEELEKLSGSLESL SKAAKEMLANSVKOspC-type K B. burgdorferi (SEQ ID NO. 19) KKCSEDFTKKLEGEHAQLGIEQVTDENAKKAILITDAAKDKGAAELEKLFKAVENLA KAAKEMLANSVKOspC-type A B. burgdorferi (SEQ ID NO. 20) KKCSETFTNKLKEKHTDLGKEGVTDADAKEAILKTQGTKTKGAEELGKLFESVEVLS KAAKEMLANSVKOspC-type I B. burgdorferi (SEQ ID NO. 21) KKCSEEFTAKLKGEHTDLGKEGVTDDNAKKAILKTNNDKTKGADELEKLFESVKQL SKAAKEMLTNSVKOspC-PBi B. garinii (SEQ ID NO. 22)KDCSEKFTTKLKDSHAELGIQSVQDDNAKKAILKTHGTKDKGAKELEELFKSLESLSKAAQAALTNSVKOspC-Pko B. afzelii (SEQ ID NO. 23)KKCSEEFTNKLKSGHADLGKQDATDDHAKAAILKTHATTDKGAKEFKDLFESVEGLLKAAQVALTNSVKOspC C-terminální úsek (SEQ ID NO. 24)ELTSPVVAESPKKN
- 4. Antigen podle nároku 2, vyznačený tím, že má sekvenci (SEQ ID NO. 7)1 MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSMKKCSE EFSTKLKDNH51 AQLGIQGVTD ENAKKAILKA NAAGKDKGVE ELEKLSGSLE SLSKAAKEML 101 ANSVKKKCSE DFTKKLEGEH AQLGIEQVTD ENAKKAILIT DAAKDKGAAE 151 LEKLFKAVEN LAKAAKEMLA NSVKKKCSET FTNKLKEKHT DLGKEGVTDA 201 DAKEAILKTQ GTKTKGAEEL GKLFESVEVL SKAAKEMLAN SVKKKCSEEF 251 TAKLKGEHTD LGKEGVTDDN AKKAILKTNN DKTKGADELE KLFESVKQLS 301 KAAKEMLTNS VKKDCSEKFT TKLKDSHAEL GIQSVQDDNA KKAILKTHGT 351 KDKGAKELEE LFKSLESLSK AAQAALTNSV KKKCSEEFTN KLKSGHADLG 401 KQDATDDHAK AAILKTHATT DKGAKEFKDL FESVEGLLKA AQVALTNSVK 451 ELTSPVVAES PKKN
- 5. Antigen podle nároku 2, vyznačený tím, že má sekvenci (SEQ ID NO. 16)1 MASMTGGQQM GRGSMKKCSE EFSTKLKDNH AQLGIQGVTD ENAKKAILKA51 NAAGKDKGVE ELEKLSGSLE SLSKAAKEML ANSVKKKCSE DFTKKLEGEH101 AQLGIEQVTD ENAKKAILIT DAAKDKGAAE LEKLFKAVEN LAKAAKEMLA151 NSVKKKCSET FTNKLKEKHT DLGKEGVTDA DAKEAILKTQ GTKTKGAEEL201 GKLFESVEVL SKAAKEMLAN SVKKKCSEEF TAKLKGEHTD LGKEGVTDDN251 AKKAILKTNN DKTKGADELE KLFESVKQLS KAAKEMLTNS VKKDCSEKFT301 TKLKDSHAEL GIQSVQDDNA KKAILKTHGT KDKGAKELEE LFKSLESLSK351 AAQAALTNSV KKKCSEEFTN KLKSGHADLG KQDATDDHAK AAILKTHATT401 DKGAKEFKDL FESVEGLLKA AQVALTNSVK ELTSPVVAES PKKN
- 6. Antigen podle nároku 1, vyznačený tím, že obsahuje dva až deset, s výhodou osm, imunodominantních úseků vybraných ze skupiny zahrnující orientované sekvence imunodominantních úseků antigenů OspA z kmenů Borrelia burgdorferi sensu stricto PHei, PKa, Borrelia garinii PBi, TN, N34, VS307, G25, PBr, T25 a Borrelia afzelii Pko.
- 7. Antigen podle nároku 6, vyznačený tím, že OspA sekvence jsou vybrány ze skupiny zahrnující:OspA-PBi B. garinii (SEQ ID NO. 25) LKVTEGTVVLSKHIPNSGEITVELNDSNSTQATKKTGKWDSNTSTLTISVNSKKTKNI VFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGNOspA-PKo B. afzelii (SEQ ID NO. 26) LEVKEGTVTLSKEIAKSGEVTVALNDTNTTQATKKTGAWDSKTSTLTISVNSKKTTQ LVFTKQDTITVQKYDSAGTNLEGTOspA-PHei B. burgdorferi (SEQ ID NO. 27) LKVTEGTVTLSKNISKSGEITVALDDTDSSGNKKSGTWDSGTSTLTISKNRTKTKQLV FTKEDTITVQNYDSAGTNLEGKOspA-TN, N34, VS307, G25 B. garinii, PWudll B. burgdorferi (SEQ ID NO. 28) TLKVTEGTVVLSKNILKSGEITVALDDSDTTQATKKTGKWDSKTSTLTISVNSQKTKN LVFTKEDTITVQKYDSAGTNLEGKOspA-PKa B. burgdorferi (SEQ ID NO. 29)LVVKEGTVTLSKNISKSGEVSVELNDTDSSAATKKTAAWNSGTSTLTITVNSKKTKD LVFTKENTITVQQYDSNGTKLEGSOspA-PBr B. garinii (SEQ ID NO. 30) LTVTEGTVTLSKNISKSGEITVALNDTETTPADKKTGEWKSDTSTLTISKNSQKPKQL VFTKENTITVQNYNRAGNALEGSOspA-T25 B. garinii (SEQ ID NO. 31)LTVEAGTVTLSKNISESGEITVELKDTETTPADKKSGTWDSKTSTLTISKNSQKTKQLVFTKENTITVQKYNTAGTKLEGSOspA C-terminální úsek (SEQ ID NO. 32)AVEITKLDEIKNALK
- 8. Antigen podle nároku 6, vyznačený tím, že má sekvenci (SEQ ID NO. 15):1 MGSSHHHHHH SSGLVPRGSH MASMTGGQQM GRGSLKVTEG TVVLSKHIPN51 SGEITVELND SNSTQATKKT GKWDSNTSTL TISVNSKKTK NIVFTKEDTI 101 TVQKYDSAGT NLEGNLEVKE GTVTLSKEIA KSGEVTVALN DTNTTQATKK 151 TGAWDSKTST LTISVNSKKT TQLVFTKQDT ITVQKYDSAG TNLEGTLKVT 201 EGTVTLSKNI SKSGEITVAL DDTDSSGNKK SGTWDSGTST LTISKNRTKT 251 KQLVFTKEDT ITVQNYDSAG TNLEGKTLKV TEGTVVLSKN ILKSGEITVA 301 LDDSDTTQAT KKTGKWDSKT STLTISVNSQ KTKNLVFTKE DTITVQKYDS 351 AGTNLEGKLV VKEGTVTLSK NISKSGEVSV ELNDTDSSAA TKKTAAWNSG 401 TSTLTITVNS KKTKDLVFTK ENTITVQQYD SNGTKLEGSL TVTEGTVTLS 451 KNISKSGEIT VALNDTETTP ADKKTGEWKS DTSTLTISKN SQKPKQLVFT 501 KENTITVQNY NRAGNALEGS LTVEAGTVTL SKNISESGEI TVELKDTETT 551 PADKKSGTWD SKTSTLTISK NSQKTKQLVF TKENTITVQK YNTAGTKLEG 601 SAVEITKLDE IKNALKKDLE ALKAALK
- 9. Antigen podle nároku 6, vyznačený tím, že má sekvenci (SEQ ID NO. 17):1 MASMTGGQQM GRGSLKVTEG TVVLSKHIPN SGEITVELND SNSTQATKKT51 GKWDSNTSTL TISVNSKKTK NIVFTKEDTI TVQKYDSAGT NLEGNLEVKE101 GTVTLSKEIA KSGEVTVALN DTNTTQATKK TGAWDSKTST LTISVNSKKT151 TQLVFTKQDT ITVQKYDSAG TNLEGTLKVT EGTVTLSKNI SKSGEITVAL201 DDTDSSGNKK SGTWDSGTST LTISKNRTKT KQLVFTKEDT ITVQNYDSAG251 TNLEGKTLKV TEGTVVLSKN ILKSGEITVA LDDSDTTQAT KKTGKWDSKT301 STLTISVNSQ KTKNLVFTKE DTITVQKYDS AGTNLEGKLV VKEGTVTLSK351 NISKSGEVSV ELNDTDSSAA TKKTAAWNSG TSTLTITVNS KKTKDLVFTK401 ENTITVQQYD SNGTKLEGSL TVTEGTVTLS KNISKSGEIT VALNDTETTP451 ADKKTGEWKS DTSTLTISKN SQKPKQLVFT KENTITVQNY NRAGNALEGS501 LTVEAGTVTL SKNISESGEI TVELKDTETT PADKKSGTWD SKTSTLTISK551 NSQKTKQLVF TKENTITVQK YNTAGTKLEG SAVEITKLDE IKNALKKDLE601 ALKAALK
- 10. Vakcinační konstrukt, vyznačený tím, že obsahuje nano- nebo mikro-partikulámí nosič obsahující metalochelatačně vážící složku, chimérický polyepitopový rekombinantní antigen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 10 vázaný prostřednictvím metalochelatačně vážící složky, a dále jedno nebo více adjuvans a/nebo Ferritin II.
- 11. Vakcína k léčbě a prevenci Lymeské boreliózy pro humánní a veterinární použití, vyznačená tím, že obsahuje chimérický polyepitopový rekombinantní antigen podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, a alespoň jedno adjuvans a/nebo Ferritin II.
- 12. Vakcinační konstrukt podle nároku 10 nebo vakcína podle nároku 11, vyznačené tím, že adjuvans je vybrané ze skupiny zahrnující fosforečnan hlinitý, hydroxid hlinitý, síran hlinitodraselný a molekulární adjuvans na bázi normuramylových glykopeptidů, adjuvans na bázi disperse částic připravených z biokompatibilních polymerů.
- 13. Vakcína podle nároku 11 nebo 12, vyznačená tím, že obsahuje vakcinační konstrukt podle nároku 10.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-320A CZ2014320A3 (cs) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | Polyepitopový antigen, vakcinační konstrukt a vakcína pro prevenci lymeské boreliózy |
| PCT/CZ2015/000042 WO2015169271A1 (en) | 2014-05-09 | 2015-05-11 | Vaccine for prevention of lyme borreliosis |
| EP15727869.8A EP3139951B1 (en) | 2014-05-09 | 2015-05-11 | Vaccine for prevention of lyme borreliosis |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ2014-320A CZ2014320A3 (cs) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | Polyepitopový antigen, vakcinační konstrukt a vakcína pro prevenci lymeské boreliózy |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ2014320A3 true CZ2014320A3 (cs) | 2015-11-18 |
Family
ID=53373225
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ2014-320A CZ2014320A3 (cs) | 2014-05-09 | 2014-05-09 | Polyepitopový antigen, vakcinační konstrukt a vakcína pro prevenci lymeské boreliózy |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3139951B1 (cs) |
| CZ (1) | CZ2014320A3 (cs) |
| WO (1) | WO2015169271A1 (cs) |
Families Citing this family (8)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8986704B2 (en) | 2012-07-06 | 2015-03-24 | Valneva Austria Gmbh | Mutant fragments of OspA and methods and uses relating thereto |
| HUE043779T2 (hu) | 2014-01-09 | 2019-09-30 | Valneva Austria Gmbh | Az OspA mutáns fragmensei, valamint az ezzel kapcsolatos módszerek és alkalmazások |
| EP3609911B1 (en) | 2017-04-13 | 2023-07-05 | Valneva Austria GmbH | Multivalent ospa polypeptides and methods and uses relating thereto |
| BR112020019938A2 (pt) | 2018-04-03 | 2021-01-26 | Sanofi | polipeptídeos antigênicos de vírus sincicial respiratório |
| CN112512564A (zh) | 2018-04-03 | 2021-03-16 | 赛诺菲 | 铁蛋白蛋白 |
| KR20210018205A (ko) * | 2018-04-03 | 2021-02-17 | 사노피 | 항원성 OspA 폴리펩타이드 |
| CN112512566A (zh) | 2018-04-03 | 2021-03-16 | 赛诺菲 | 抗原性爱泼斯坦-巴尔病毒多肽 |
| IL297166A (en) | 2020-04-09 | 2022-12-01 | Valneva Austria Gmbh | Compositions comprising three ospa fusion proteins for medical use |
Family Cites Families (7)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0726955B1 (en) * | 1993-11-01 | 2004-04-07 | Brookhaven Science Associates | Chimeric proteins comprising borrelia polypeptides: uses therefor |
| EP1311682B1 (en) * | 2000-08-18 | 2007-12-12 | Research Foundation Of State University Of New York | Recombinant constructs of borrelia burgdorferi |
| CA2631733C (en) * | 2005-11-29 | 2017-08-01 | Virginia Commonwealth University | Polyvalent chimeric ospc vaccinogen and diagnostic antigen |
| GB2458473A (en) | 2008-03-17 | 2009-09-23 | Imuthes Ltd | 3'-O-allyl- and 3'-O-carboxymethyl- 2'-aminosaccharide derivatives, & amides thereof with peptides, as adjuvants |
| KR102230562B1 (ko) * | 2010-05-14 | 2021-03-22 | 박스알타 인코퍼레이티드 | Ｏｓｐａ 키메라 및 백신에서 그의 용도 |
| EP2630162A4 (en) * | 2010-10-20 | 2014-04-30 | Univ Virginia Commonwealth | POLYVALENTIC CHIMERIC OSPC VACCINOGEN AND DIAGNOSTIC ANTIGEN |
| KR20150038380A (ko) * | 2012-07-27 | 2015-04-08 | 백스터 인터내셔널 인코포레이티드 | 키메라 ospa 분자를 포함하는 조성물 및 이의 사용 방법 |
-
2014
- 2014-05-09 CZ CZ2014-320A patent/CZ2014320A3/cs unknown
-
2015
- 2015-05-11 WO PCT/CZ2015/000042 patent/WO2015169271A1/en not_active Ceased
- 2015-05-11 EP EP15727869.8A patent/EP3139951B1/en active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO2015169271A1 (en) | 2015-11-12 |
| EP3139951A1 (en) | 2017-03-15 |
| EP3139951B1 (en) | 2020-09-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ2014320A3 (cs) | Polyepitopový antigen, vakcinační konstrukt a vakcína pro prevenci lymeské boreliózy | |
| Federizon et al. | Immunogenicity of the Lyme disease antigen OspA, particleized by cobalt porphyrin-phospholipid liposomes | |
| Tifrea et al. | Increased immunoaccessibility of MOMP epitopes in a vaccine formulated with amphipols may account for the very robust protection elicited against a vaginal challenge with Chlamydia muridarum | |
| US12011486B2 (en) | MOMP telonanoparticles, and related compositions, methods and systems | |
| US9926344B2 (en) | Stabilised proteins for immunising against Staphylococcus aureus | |
| JP6894237B2 (ja) | 変異体ブドウ球菌抗原 | |
| Kobierecka et al. | Chicken anti-Campylobacter vaccine–comparison of various carriers and routes of immunization | |
| MXPA03006042A (es) | Vacuna de escherichia colienterohemorragica. | |
| JP2022552552A (ja) | 活性薬剤または治療剤の送達のための水中油型エマルジョン製剤 | |
| JP2017019873A (ja) | イヌのライム病のワクチン | |
| Křupka et al. | Enhancement of immune response towards non-lipidized Borrelia burgdorferi recombinant OspC antigen by binding onto the surface of metallochelating nanoliposomes with entrapped lipophilic derivatives of norAbuMDP | |
| Zheng et al. | Omp16-based vaccine encapsulated by alginate-chitosan microspheres provides significant protection against Haemophilus parasuis in mice | |
| Sharma et al. | Immune response characterization and vaccine potential of a recombinant chimera comprising B-cell epitope of Aeromonas hydrophila outer membrane protein C and LTB | |
| US20150202277A1 (en) | Stabilised proteins for immunising against staphylococcus aureus | |
| Nguyen et al. | A combined adjuvant and ferritin nanocage based mucosal vaccine against Streptococcus pneumoniae induces protective immune responses in a murine model | |
| Turánek et al. | Application of liposomes for construction of vaccines | |
| Yang et al. | Combination application of Pickering emulsion and BLS protein nanoparticles enhances vaccine efficacy | |
| US20150191513A1 (en) | Stabilised proteins for immunising against staphylococcus aureus | |
| Rios et al. | Rabies virus-vectored Lyme disease vaccine provides long-term protection against tick-transmitted Borrelia burgdorferi | |
| Zhou | Liposome Display of Recombinant ETEC Colonization Antigens Enhances Generation of Functional Antibodies in Mice | |
| WO2024226815A2 (en) | B-cell epitopes of treponema pallidum antigens for use in a syphilis vaccine | |
| Nourani et al. | Optimized Refolding Buffers Oriented Humoral Immune Responses Versus PfGCS1 Self-Assembled Peptide Nanoparticle | |
| Cunliffe | The rational structure-based design of a protein nanoparticle presenting a chimeric MenB antigen | |
| Lin | A Nanoliposomal Adjuvant Containing Cobalt-Porphyrin Phospholipids For Anthrax Protective Antigen | |
| Brock | Development of a Novel, Peptide-based Vaccine for Lyme Disease |