CZ2012633A3 - Codeine hydroxylation using the strain of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 microorganism - Google Patents
Codeine hydroxylation using the strain of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 microorganism Download PDFInfo
- Publication number
- CZ2012633A3 CZ2012633A3 CZ20120633A CZ2012633A CZ2012633A3 CZ 2012633 A3 CZ2012633 A3 CZ 2012633A3 CZ 20120633 A CZ20120633 A CZ 20120633A CZ 2012633 A CZ2012633 A CZ 2012633A CZ 2012633 A3 CZ2012633 A3 CZ 2012633A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- codeine
- concentration
- culture
- formula
- ccm
- Prior art date
Links
- OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N codeine Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC OROGSEYTTFOCAN-DNJOTXNNSA-N 0.000 title claims abstract description 85
- 229960004126 codeine Drugs 0.000 title claims abstract description 44
- OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N hydrocodone Natural products C1C(N(CCC234)C)C2C=CC(O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC OROGSEYTTFOCAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 42
- 241000589155 Agrobacterium tumefaciens Species 0.000 title claims abstract description 21
- 230000033444 hydroxylation Effects 0.000 title claims description 12
- 238000005805 hydroxylation reaction Methods 0.000 title claims description 12
- 244000005700 microbiome Species 0.000 title abstract description 7
- 230000036983 biotransformation Effects 0.000 claims abstract description 21
- YPZPXTZKBNWUTF-QMVVXIJUSA-N (4r,4as,7s,7ar,12bs)-9-methoxy-3-methyl-1,2,4,7,7a,13-hexahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-4a,7-diol Chemical compound O[C@H]([C@@H]1O2)C=C[C@@]3(O)[C@H]4CC5=CC=C(OC)C2=C5[C@@]13CCN4C YPZPXTZKBNWUTF-QMVVXIJUSA-N 0.000 claims abstract description 14
- YPZPXTZKBNWUTF-UHFFFAOYSA-N 14beta-Hydroxy-codein Natural products O1C2C(O)C=CC3(O)C4CC5=CC=C(OC)C1=C5C23CCN4C YPZPXTZKBNWUTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 12
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000004280 Sodium formate Substances 0.000 claims abstract description 6
- HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M sodium formate Chemical compound [Na+].[O-]C=O HLBBKKJFGFRGMU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 6
- 235000019254 sodium formate Nutrition 0.000 claims abstract description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 abstract description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 29
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 28
- BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N morphine Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@H]23)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O BQJCRHHNABKAKU-KBQPJGBKSA-N 0.000 description 22
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 17
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 17
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 10
- 229960005181 morphine Drugs 0.000 description 10
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 8
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 7
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 7
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 7
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 7
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 7
- YYCRAERBSFHMPL-XFKAJCMBSA-N (4r,4as,7ar,12bs)-4a-hydroxy-9-methoxy-3-methyl-2,4,7a,13-tetrahydro-1h-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-7-one Chemical compound O=C([C@@H]1O2)C=C[C@@]3(O)[C@]4([H])N(C)CC[C@]13C1=C2C(OC)=CC=C1C4 YYCRAERBSFHMPL-XFKAJCMBSA-N 0.000 description 6
- YYCRAERBSFHMPL-UHFFFAOYSA-N 14beta-Hydroxycodeinone Natural products O1C2C(=O)C=CC3(O)C4CC5=CC=C(OC)C1=C5C23CCN4C YYCRAERBSFHMPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 5
- FQXXSQDCDRQNQE-UHFFFAOYSA-N markiertes Thebain Natural products COC1=CC=C2C(N(CC3)C)CC4=CC=C(OC)C5=C4C23C1O5 FQXXSQDCDRQNQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 5
- FQXXSQDCDRQNQE-VMDGZTHMSA-N thebaine Chemical compound C([C@@H](N(CC1)C)C2=CC=C3OC)C4=CC=C(OC)C5=C4[C@@]21[C@H]3O5 FQXXSQDCDRQNQE-VMDGZTHMSA-N 0.000 description 5
- 229930003945 thebaine Natural products 0.000 description 5
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 4
- 240000001090 Papaver somniferum Species 0.000 description 4
- 235000008753 Papaver somniferum Nutrition 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 3
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WYMBHLXUDPDGQJ-BRJGLHKUSA-N (4r,4as,7s,7ar,12bs)-3-methyl-1,2,4,7,7a,13-hexahydro-4,12-methanobenzofuro[3,2-e]isoquinoline-4a,7,9-triol Chemical compound O([C@H]1[C@H](C=C[C@]23O)O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O WYMBHLXUDPDGQJ-BRJGLHKUSA-N 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 2
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 2
- 239000006142 Luria-Bertani Agar Substances 0.000 description 2
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BRUQQQPBMZOVGD-XFKAJCMBSA-N Oxycodone Chemical compound O=C([C@@H]1O2)CC[C@@]3(O)[C@H]4CC5=CC=C(OC)C2=C5[C@@]13CCN4C BRUQQQPBMZOVGD-XFKAJCMBSA-N 0.000 description 2
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 2
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 2
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 2
- 239000002361 compost Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- 229960002085 oxycodone Drugs 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 2
- MFXFQKMUCYHPFQ-BKRJIHRRSA-N 6-monoacetylcodeine Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=C[C@H](OC(C)=O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC MFXFQKMUCYHPFQ-BKRJIHRRSA-N 0.000 description 1
- 208000007848 Alcoholism Diseases 0.000 description 1
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186073 Arthrobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000194110 Bacillus sp. (in: Bacteria) Species 0.000 description 1
- 108020005199 Dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 241000192652 Desmonostoc muscorum Species 0.000 description 1
- 239000008896 Opium Substances 0.000 description 1
- UQCNKQCJZOAFTQ-ISWURRPUSA-N Oxymorphone Chemical compound O([C@H]1C(CC[C@]23O)=O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O UQCNKQCJZOAFTQ-ISWURRPUSA-N 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 241000589180 Rhizobium Species 0.000 description 1
- 241000042002 Trametes sanguinea Species 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 201000007930 alcohol dependence Diseases 0.000 description 1
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 1
- -1 alkali metal formate Chemical class 0.000 description 1
- 229930013930 alkaloid Natural products 0.000 description 1
- 125000000746 allylic group Chemical group 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000000954 anitussive effect Effects 0.000 description 1
- 239000003434 antitussive agent Substances 0.000 description 1
- 229940124584 antitussives Drugs 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012824 chemical production Methods 0.000 description 1
- XYYVYLMBEZUESM-CMKMFDCUSA-N codeinone Chemical compound C([C@H]1[C@H](N(CC[C@@]112)C)C3)=CC(=O)[C@@H]1OC1=C2C3=CC=C1OC XYYVYLMBEZUESM-CMKMFDCUSA-N 0.000 description 1
- 230000017858 demethylation Effects 0.000 description 1
- 238000010520 demethylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- XYYVYLMBEZUESM-UHFFFAOYSA-N dihydrocodeine Natural products C1C(N(CCC234)C)C2C=CC(=O)C3OC2=C4C1=CC=C2OC XYYVYLMBEZUESM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013663 drug dependence Diseases 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000013028 medium composition Substances 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 229930013053 morphinan alkaloid Natural products 0.000 description 1
- PFBSOANQDDTNGJ-YNHQPCIGSA-N morphinone Chemical compound O([C@H]1C(C=C[C@H]23)=O)C4=C5[C@@]12CCN(C)[C@@H]3CC5=CC=C4O PFBSOANQDDTNGJ-YNHQPCIGSA-N 0.000 description 1
- UZHSEJADLWPNLE-GRGSLBFTSA-N naloxone Chemical compound O=C([C@@H]1O2)CC[C@@]3(O)[C@H]4CC5=CC=C(O)C2=C5[C@@]13CCN4CC=C UZHSEJADLWPNLE-GRGSLBFTSA-N 0.000 description 1
- 229960004127 naloxone Drugs 0.000 description 1
- DQCKKXVULJGBQN-XFWGSAIBSA-N naltrexone Chemical compound N1([C@@H]2CC3=CC=C(C=4O[C@@H]5[C@](C3=4)([C@]2(CCC5=O)O)CC1)O)CC1CC1 DQCKKXVULJGBQN-XFWGSAIBSA-N 0.000 description 1
- 229960003086 naltrexone Drugs 0.000 description 1
- HKOIXWVRNLGFOR-KOFBORESSA-N norcodeine Chemical compound O[C@H]([C@@H]1O2)C=C[C@H]3[C@H]4CC5=CC=C(OC)C2=C5[C@@]13CCN4 HKOIXWVRNLGFOR-KOFBORESSA-N 0.000 description 1
- HKOIXWVRNLGFOR-UHFFFAOYSA-N norcodeine Natural products O1C2C(O)C=CC3C4CC5=CC=C(OC)C1=C5C23CCN4 HKOIXWVRNLGFOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229950004392 norcodeine Drugs 0.000 description 1
- 229960001027 opium Drugs 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 229960005118 oxymorphone Drugs 0.000 description 1
- 150000004965 peroxy acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 230000000630 rising effect Effects 0.000 description 1
- 239000010865 sewage Substances 0.000 description 1
- 239000010802 sludge Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000011117 substance-related disease Diseases 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Resení se týká zpusobu biotransformace kodeinu pomocí kmene mikroorganismu Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947, který hydroxyluje kodein na 14-hydroxykodein. Tato sloucenina je jediným produktem, kdyz se biotransformace provádí ve fosfátovém pufru doplneném kosubstrátem, kterým je formiát sodný. 14-hydroxykodein je dulezitým meziproduktem pro prípravu farmaceuticky úcinných látek.The present invention relates to a method for the biotransformation of codeine using the strain of the microorganism Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 which hydroxylates codeine to 14-hydroxycodeine. This compound is the only product when the biotransformation is carried out in a phosphate buffer supplemented with a cosubstrate, which is sodium formate. 14-hydroxycodeine is an important intermediate for the preparation of pharmaceutically active substances.
Description
Vynález se týká procesu pro hydroxylaci kodeinu vzorce 1, na 14-hydroxykodein vzorce 2 a 14-hydroxykodeinon vzorce 3 kmenem mikroorganismu Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947. Při hydroxylaci vzniká převážně 14-hydroxykodein vzorce 2.The invention relates to a process for the hydroxylation of codeine of formula 1 to 14-hydroxycodeine of formula 2 and 14-hydroxycodeinone of formula 3 with a strain of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947. The hydroxylation produces predominantly 14-hydroxycodeine of formula 2.
R 89-1 ---------->~ hydroxylaceR 89-1 ----------- ~ hydroxylation
Tato sloučenina je důležitým meziproduktem pro přípravu farmaceuticky účinných látek.This compound is an important intermediate for the preparation of pharmaceutically active substances.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Kodein, morfm a thebain patří mezi přírodní alkaloidy, které jsou produkovány mákem setým (Papaver somniferum). Zavedení hydroxyl skupiny do C-14 pozice morfin alkaloidové struktury je využíváno pro přípravu látek oxycodon (světová produkce 65 t/rok), naloxon (37 kg/rok), oxymorphon (2,4 t/rok) a naltrexon (853 kg/rok), které se v medicíně používají jako analgetika, antitussiva a léky pro odvykání drogové a alkoholové závislosti. Nejpoužívanější výchozí surovinou pro chemickou výrobu těchto opiátů je kodein a thebain z Ur , Ur přírodním opiovém extraktu. Thebain je konvertován oxidací (peroxykyselinou) na 14- hydroxykodeinon (López, D, Quióoa, E., Riguera, R. 1994 Tetrahedron Lett., 31,5727-5730).Codeine, morphine and thebaine are natural alkaloids produced by the poppy (Papaver somniferum). Introduction of the hydroxyl group into the C-14 position of the morphine alkaloid structure is used to prepare oxycodone (world production 65 t / year), naloxone (37 kg / year), oxymorphone (2.4 t / year) and naltrexone (853 kg / year) ) that are used in medicine as analgesics, antitussives, and drugs to stop drug and alcohol dependence. The most commonly used starting material for the chemical production of these opiates is codeine and thebaine from Ur, Ur natural opium extract. Thebaine is converted by oxidation (peroxyacid) to 14-hydroxycodeinone (Lopez, D, Quioo, E., Riguera, R. 1994 Tetrahedron Lett., 31,5727-5730).
Vzhledem k tomu, že kodein a morfm jsou mnohem dostupnější než thebain, jsou tedy perspektivními prekurzory pro přípravu 14-hydroxyopiátů. Popsané chemické metody vykazují nízké výtěžky, hromadění těžko separovatelných vedlejších produktů a nutnost použití nežádoucích těžkých kovů (Zhang,Q., Rich,J.O., Cotterill, C., Pantaleone D.P., Michels, P.C. 2005 J.Am.Chem.Soc. 127,7286-7287).Since codeine and morphine are much more accessible than thebaine, they are therefore promising precursors for the preparation of 14-hydroxyopiates. The chemical methods described show low yields, the accumulation of hardly separable by-products and the necessity of using unwanted heavy metals (Zhang, Q., Rich, JO, Cotterill, C., Pantaleone DP, Michels, PC 2005 J. Am.Chem.Soc. 127, 7286-7287).
« 1«1
Počátky zájmu o získání efektivnějších analgetik z přírodních opiátů pomocí biotransformací spadá do 60. let. První práce popisující schopnost basidiomycety Trametes sanguinea transformovat thebain pomocí allylic, oxygenací a demetýlací na 14x t hydroxyeodeinon a následnou redukcí na 14-hydroxycodein popsal Iizuka a kol. (Iizuka, K., Okuda, S., Aida, K., Asai, T., Tsuda, K., Yamada, M., Seki, I. 1960 I.Chem.Pharm.Bull. 8,1056-7 a Iizuka, K., Yamada, M., Suzuki, J., Seki, I., Aida, K., Okuda, S., Asay, T., Tsuda, K. 1962, Chem. Pharm. Bull. 10, 67-70).The beginnings of interest in obtaining more effective analgesics from natural opiates by biotransformation date back to the 1960s. The first work describing the ability of the basidiomycet Trametes sanguinea to transform thebaine by allylic, oxygenation and demethylation to 14x t hydroxyeodeinone and subsequent reduction to 14-hydroxycodein was described by Iizuka et al. (Iizuka, K., Okuda, S., Aida, K., Asai, T., Tsuda, K., Yamada, M., Seki, I. 1960 I. Chem.Pharm.Bull. 8,1056-7 and Iizuka, K., Yamada, M., Suzuki, J., Seki, I., Aida, K., Okuda, S., Asay, T., Tsuda, K. 1962, Chem. -70).
Tsuda, K. (1964, I.A.M. Symposium on Microbiology No.6, Institute of Appl. Microbiol., University of Tokyo, Tokyo, Japan) popsal u Trametes sanguinea (a dalších 120 kmenů basidiomycet z testovaných 1200 různých bakteriálních a plísňových kmenů) konverzi thebainu na 14-hydroxycodeinon a 14-hydroxyčodein. Podobné výsledky byly publikovány v jiné nezávislé studii s plísní Trametes cinnabarina (Gróger, D and Schmauder, H.P. 1969, Experentia 25, 95-96).Tsuda, K. (1964, IAM Symposium on Microbiology No.6, Institute of Appl. Microbiol., University of Tokyo, Tokyo, Japan) described in Trametes sanguinea (and another 120 basidiomycetes from 1200 different bacterial and fungal strains tested) conversion thebaine to 14-hydroxycodeinone and 14-hydroxycodein. Similar results have been published in another independent study with Trametes cinnabarina (Gröger, D and Schmauder, H.P. 1969, Experentia 25, 95-96).
Mikrobiální transformace morfiových alkaloidů byla rovněž popsána u bakteriálních kmenů. Liras, P. a Umbreit, W.W. (1975, Appl. Microbiol. 30, 262-266) popsali konverzi morfinu na 14-hydroxymorfin klidovými buňkami Arthrobacter sp.Microbial transformation of morphine alkaloids has also been described in bacterial strains. Liras, P. and Umbreit, W.W. (1975, Appl. Microbiol. 30, 262-266) described the conversion of morphine to 14-hydroxymorphine by resting Arthrobacter sp.
Nízká koncentrace 14-hydroxymorfinu, jako produktu biotransformace, byla také nalezena u Pseudomonas testosteronii. U tohoto kmene byly popsány a - a β-hydroxysteroid dehydrogenázy, které produkovaly morfinon a kodeinon z kodeinu nebo morfinu v přítomnosti NAD+ (Liras, P., Kasparian, S.S. Umbreit, W.W. 1975, Appl. Microbiol. 30, 650-656).Low concentrations of 14-hydroxymorphine as a biotransformation product have also been found in Pseudomonas testosteronii. In this strain, α- and β-hydroxysteroid dehydrogenases have been described which produced morphinone and codeinone from codeine or morphine in the presence of NAD + (Liras, P., Kasparian, SS Umbreit, WW 1975, Appl. Microbiol. 30, 650-656) .
Také u rodu Bacillus sp. byla popsána transformace morfinu a kodeinu na 14r Λ ' hydrxymorfinon a 14-hydroxycodeinon (Madyastha, K.M., Reddy, G.V.B. 1994, J.Chem. Soc. Perkin Trans. 1 (8), 911-912).Also in Bacillus sp. the transformation of morphine and codeine into 14R-hydroxymorphinone and 14-hydroxycodeinone has been described (Madyastha, K.M., Reddy, G.V.B. 1994, J. Chem. Soc. Perkin Trans. 1 (8), 911-912).
Harder, P.A. a Kunz, D.A. (1989 United States Patent No. 4 798 792) patentovali bakteriální hydroxylaci kodeinu a jeho ve vodě rozpustné soli na 14-hydroxykodein kmeny rodu Streptomyces. Nejvyšší konverze vykazoval kmen Streptomyces griseus NRRL B8090. Při použití bohatého media obsahujícího sojovou mouku v průběhu 30 denní kultivace a při počáteční koncentraci kodeinu lmM (0,29 mg/ml). Po 27 dnech bylo u tohoto kmene získáno 0,2 mm (63 mg/l) 14-OH kodeinu a 0,03 mm (8,55 mg/l) norkodeinu.Harder, P.A. and Kunz, D.A. (1989 United States Patent No. 4,798,792) patented bacterial hydroxylation of codeine and its water-soluble salts to 14-hydroxycodeine strains of the genus Streptomyces. Streptomyces griseus NRRL B8090 showed the highest conversion. When using a rich medium containing soy flour during a 30 day culture and at an initial codeine concentration of 1 mM (0.29 mg / ml). After 27 days, 0.2 mm (63 mg / l) of 14-OH codeine and 0.03 mm (8.55 mg / l) of norodeine were obtained in this strain.
Zhang, Q., Rich, J.O., Cotterill, I.C., Pantaleone, D.P., Michels, P.C. 2005,Zhang, Q., Rich, J.O., Cotterill, I.C., Pantaleone, D.P., Michels, P.C. 2005,
J.Am.Chem.Soc. 127, 7286-7287 popsali u Mycobacterium neoaurum (MTP650) schopnost hydroxylace kodeinu na 14-hydroxykodein a mechanismus reakcí.J.Am.Chem.Soc. 127, 7286-7287 described in Mycobacterium neoaurum (MTP650) the ability of hydroxylation of codeine to 14-hydroxycodeine and the mechanism of reactions.
« < < * ' t i « f « * r * i t „ \ * · ‘ ‘ ‘ ε « t « ti ‘4· í · II li «··»«<·<<<Ε ε ε · · · · · · · · · · · II · · II · · · · ·
Biokonverzi kodeinu na semi-syntetické deriváty opiátů (6-acetylkodein, oxykodon, norkodein, morfin) popsali u Nostoc muscorum Niknam a kol. (Nikam, S., Faramazi, M.A., Abdi, K., Yazdi, M.T., Amini, M., Rastegar, H. 2010, World J. Microbiol. Biotechnol. 26, 119-123). Derivát 14-OH kodein nebyl detekován. Optimální koncentrace kodeinu pro biotransformaci celými buňkami byla 0,5 - 1,0 mg/ml: deriváty byly identifikovány po konverzi v délce 5 až 10 dní.Bioconversion of codeine to semi-synthetic opioid derivatives (6-acetyl codeine, oxycodone, norcodeine, morphine) has been described by Nostoc muscorum Niknam et al. (Nikam, S., Faramazi, M.A., Abdi, K., Yazdi, M.T., Amini, M., Rastegar, H. 2010, World J. Microbiol. Biotechnol. 26, 119-123). The 14-OH codeine derivative was not detected. The optimum codeine concentration for whole cell biotransformation was 0.5 - 1.0 mg / ml: derivatives were identified after conversion for 5 to 10 days.
Wick, A., Wagner, M., Ternem, T.A. 2011, Environ. Sci. Technol. 46, 3374-3385 popsali transformační dráhy kodeinu aktivovaným kalem z čistírny za aerobních podmínek. Jednou z popsaných drah je hydroxylace kodeinu v C-14 pozici. Výchozí koncentrace kodeinu byla 5 mg/1.Wick, A., Wagner, M., Ternem, T.A. 2011, Environ. Sci. Technol. 46, 3374-3385 described codeine transformation pathways by activated sludge from a sewage treatment plant under aerobic conditions. One of the described pathways is the hydroxylation of codeine at the C-14 position. The initial codeine concentration was 5 mg / L.
Hydroxylace kodeinu 1 na 14-hydroxykodein 2 a 14-hydroxykodeinon 3 kmeny mikroorganismu rodu Rhizobium byla popsána v naší přihlášce pod číslem PV2011-761 (.Hydroxylation of codeine 1 to 14-hydroxycodein 2 and 14-hydroxycodeinone 3 strains of a microorganism of the genus Rhizobium has been described in our application under the number PV2011-761 (.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Podstatou vynálezu je nový způsob pro hydroxylaci kodeinu za pomoci kmene mikroorganismu Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947, který hydroxyluje kodein vzorceSUMMARY OF THE INVENTION The present invention provides a novel method for the hydroxylation of codeine using a Rhizobium radiobacter strain R89-1 CCM 7947, which hydroxylates codeine of the formula:
kosubstrátem. Specifické podmínky biotransformace vedou preferenčně k produktu vzorce 2.kosubstrátem. The specific conditions of biotransformation preferentially lead to the product of formula 2.
Biologický materiál, který obsahoval Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 byl suspendován v 0,1 M fosfátovém pufru pH 7,0, výchozí koncentrace kodeinu se pohybovala v rozmezí 1 až 6 g/1.The biological material containing Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 was suspended in 0.1 M phosphate buffer pH 7.0, the initial codeine concentration ranging from 1 to 6 g / l.
Jako kosubstrát byla použita glukóza, izopropylalkohol, glycerol a formiát alkalického kovu. V případě, kdy byl jako kosubstrát použit formiát sodný, hydroxylace vede preferenčně k 14-hydroxykodeinu vzorce 2. Ve výhodném provedení podle tohoto vynálezu se použije vodný roztok formiátu sodného o koncentraci 2,5 g/1.Glucose, isopropyl alcohol, glycerol and alkali metal formate were used as cosubstrate. Where sodium formate has been used as the cosubstrate, hydroxylation preferably results in the 14-hydroxycodeine of Formula 2. Preferably, an aqueous solution of sodium formate at a concentration of 2.5 g / l is used.
Biotransformace se provádí například v 500 ml kultivačních baňkách s 50 ml buněčné suspenze na rotační třepačce při 200 ot/min a při teplotě v rozmezí 28 až 30 °C.Biotransformation is carried out, for example, in 500 ml culture flasks with 50 ml cell suspension on a rotary shaker at 200 rpm and at a temperature in the range of 28 to 30 ° C.
Za těchto podmínek byl na rozdíl od podmínek uvedených v naší přihlášce PV 2011-761, získán pouze 14-hydroxykodein vzorce 2, při počáteční koncentraci kodeinu 1 g/1 byla úplná (100%) konverze kodeinu pozorována už po 24 hodinách, při počáteční koncetraci 6 g/1 bylo pak úplné konverze dosaženo po 72 hodinách.Under these conditions, in contrast to the conditions of our application PV 2011-761, only 14-hydroxycodeine of formula 2 was obtained, with an initial codeine concentration of 1 g / l, complete (100%) conversion of codeine was observed after 24 hours; 6 g / l was then complete conversion after 72 hours.
Způsob podle tohoto vynálezu umožňuje modifikovat hydroxylaci kodeinu za vzniku preferenčně jednoho produktu, 14-hydroxykodeinu vzorce 2, v optimalizovaném provedení vede dokonce ke 100% zisku sloučeniny vzorce 2.The process according to the invention makes it possible to modify the hydroxylation of codeine to give a preferentially one product, 14-hydroxycodeine of formula 2, in an optimized embodiment even to 100% yield of the compound of formula 2.
ΛΛ
Mikroorganismus Rhizobium radiobacter Κ89-1ψ, který se používá v tomto vynálezu, je uložen v České sbírce mikroorganismů (Czech Collection of Microorganisms) Masarykovy University v Brně, Tvrdého 14, pod označením CCM 7947.The Rhizobium radiobacter Κ89-1ψ microorganism used in the present invention is deposited with the Czech Collection of Microorganisms at Masaryk University in Brno, Tvrdého 14, under the designation CCM 7947.
V následujících příkladech je uveden postup získání mikroorganismu podle tohoto patentu a příklady vedoucí k optimalizaci procesu hydroxylace.The following examples show the procedure for obtaining the microorganism of this patent and examples leading to the optimization of the hydroxylation process.
Přehled obrázkůOverview of pictures
Obr. 1: Časový průběh koncentrace biomasy (X, ) a biotransformační aktivity (konverze,♦) v jednorázové kultuře kmene Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 na LBTE mediu dle Příkladu 4.Giant. 1: Time course of biomass concentration (X 1) and biotransformation activity (conversion, ♦) in a single culture of Rhizobium radiobacter strain R89-1 CCM 7947 on LBTE medium according to Example 4.
Obr. 2: Časový průběh koncentrace biomasy (X, ) a biotransformační aktivity (konverze,!) v jednorázové kultuře kmene Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 na LBTE mediu s glukózou (0,5%) v míchaném bioreaktoru dle Příkladu 5Giant. 2: Time course of biomass concentration (X1) and biotransformation activity (conversion,!) In a single culture of Rhizobium radiobacter strain R89-1 CCM 7947 on LBTE medium with glucose (0.5%) in a stirred bioreactor according to Example 5
Obr.;3: Časový průběh koncentrace biomasy (X, ) a biotransformační aktivity (konverze, ♦) v přítokované kultuře kmene Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 v míchaném bioreaktoru při kultivační teplotě 30 °C v LBTE mediu s glukózou (1,0 %) dle Příkladu 6.Fig. 3: Time course of biomass concentration (X,) and biotransformation activity (conversion, ♦) in fed culture of Rhizobium radiobacter strain R89-1 CCM 7947 in a stirred bioreactor at 30 ° C culture temperature in LBTE medium with glucose (1.0 %) according to Example 6.
4* » » »4 * »» »
» • · · • · ·· • · ·· • * · · · · • *t » · « ·• · t t t t t t t t t
Příklady provedeníExamples
Příklad 1Example 1
Izolace kmene Rhizobium radiobacter R89-1Isolation of Rhizobium radiobacter R89-1
Kmen Rhizobium radiobacter R89-1 byl získán ze zeminy kompostu, kde byly kompostovány zbytky z výroby máku. 10 g zeminy bylo resuspendováno ve 100 ml fyziologického roztoku (9 g/1 NaCl ) a třepáno (200 ot/min) po dobu 1 h. Autochtonní mikroflora byla příslušně naředěna ve fyziologickém roztoku a vyseta na LB agar. Jednotlivé morfologicky odlišné kolonie izolátů, narostlé 3 dny při 28 °C, byly přeočkovány na čerstvý LB agar a po nárůstu při 28 °C byla u nich stanovena schopnost hydroxylace kodeinu vzorce 1 na 14-OH-kodein vzorce 2 a 14-OH-kodeinon vzorce 3 následujícím způsobem: 2 ml LB media doplněné kodeinem v koncentraci 0,1 g/1 v 12 jamkových destičkách pro kultivaci (mcwp) byly inokulovány příslušným izolátem a po 72 h kultivace (28 °C a 200 ot./min) bylo k 1 ml vzorku přidáno 0,1 ml NH4OH a 0,5 ml TBME a kultivační kapalina byla extrahována po dobu 20 min. Po odstředění (15 min, 10 000 ot./min) byla organická fáze použita pro kvantitativní stanovení kodeinu vzorce 1, 14-hydroxykodeinu vzorce 2 a 14-hydroxykodeinonu vzorce 3 pomocí HPLC za následujících podmínek:The Rhizobium radiobacter R89-1 strain was obtained from compost soil where poppy residue was composted. 10 g of soil was resuspended in 100 ml saline (9 g / l NaCl) and shaken (200 rpm) for 1 h. The autochthonous microflora was appropriately diluted in saline and plated on LB agar. Individual morphologically different colonies of isolates, grown at 28 ° C for 3 days, were resuspended on fresh LB agar and, after rising at 28 ° C, were assessed for the ability to hydroxylate codeine 1 to 14-OH-codeine 2 and 14-OH-codeinone. of formula 3 as follows: 2 ml of LB medium supplemented with codeine at 0.1 g / l in 12 well culture plates (mcwp) were inoculated with the appropriate isolate and after 72 h of culture (28 ° C and 200 rpm), 1 ml sample added 0.1 ml NH 4 OH and 0.5 ml TBME and the culture liquid was extracted for 20 min. After centrifugation (15 min, 10,000 rpm), the organic phase was used for quantitative determination of codeine of formula 1, 14-hydroxycodeine of formula 2 and 14-hydroxycodeinone of formula 3 by HPLC under the following conditions:
Kolona: C-18 Hibar Lichrom manu-fixColumn: C-18 Hibar Lichrom man-fix
Eluční směs: voda+0,1% TFA: MeOH (4:1 V/V)Elution mixture: water + 0.1% TFA: MeOH (4: 1 v / v)
Průtok: 1,3 ml/minFlow rate: 1.3 ml / min
Nanášený objem: 0,05 mlApplication volume: 0.05 ml
Detekce při vlnové délce: 220 a 214 nmDetection at 220 and 214 nm
Teplota kolony: 40 °CColumn temperature: 40 ° C
Čas analýzy: 5 minAnalysis time: 5 min
Retenční časy:Retention times:
Látka vzorce 1 kodein 2,6 min,Formula 1 codeine 2.6 min,
Látka vzorce 2 14-hydroxykodein 2,2 minCompound of Formula 2 14-hydroxycodeine 2.2 min
Látka vzorce 3 14-hydroxykodeinon 3,6 minCompound of formula 3 14-hydroxycodeinone 3.6 min
Z 2000 testovaných izolátů (sbírkové kmeny a izoláty z přírodních materiálů) byly získány 2 bakteriální kmeny vykazující schopnost hydroxylovat sloučeninu vzorce 1 naFrom 2,000 isolates tested (collection strains and isolates from natural materials), 2 bacterial strains were obtained showing the ability to hydroxylate the compound of Formula 1 to
-•x produkty vzorců 2 a 3. Tyto kmeny byly kultivovány v 50 ml LB media v 500; ml kultivačních baňkách následujícím způsobem: medium bylo inokulováno koloniemi kmenů narostlými na LB agaru a baňky byly inkubovány na rotačním třepacím stroji (200 <ÍA.X products of formulas 2 and 3. These strains were cultured in 50 ml of LB medium at 500; ml culture flasks were as follows: medium was inoculated with LB agar-grown colonies and incubated on a rotary shaker (200 µA).
ot/min, 28 30 °C) po dobu 24 h (první vegetativní generace). 2 ml narostlé kultury byly použity pro inokulaci třech paralelních baněk s 50 ml LBTE půdy s přídavkem kodeinu v koncentraci 0,1 g/l (druhá vegetativní generace), které byly kultivovány za stejných podmínek. Po 48 h kultivace (28 °C a 200 ot/min) byl vzorek kultury extrahován TBME (viz výše) a organická fáze byla použita pro kvantitativní stanovení biokonverze pomocí HPLC (viz výše). Z obou testovaných kmenů byl vybrán přírodní izolát ze vzorku kompostu s odpady ze zpracování máku, který vykazoval konverzi 100%. Kmen byl označen jako R89-1 a deponován ve sbírce mikroorganismů pod číslem CCM7947.rpm, 28 30 ° C) for 24 h (first vegetative generation). 2 ml of the grown cultures were used to inoculate three parallel flasks with 50 ml of LBTE broth added with codeine at a concentration of 0.1 g / l (second vegetative generation), which were cultured under the same conditions. After 48 h culture (28 ° C and 200 rpm), the culture sample was extracted with TBME (see above) and the organic phase was used for quantitative determination of bioconversion by HPLC (see above). From both strains tested, a natural isolate was selected from a sample of compost with poppy waste, which showed a conversion of 100%. The strain was designated R89-1 and deposited in the collection of microorganisms under number CCM7947.
Příklad 2Example 2
Optimalizace složení kultivačního media Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947Optimization of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 culture medium composition
Optimalizace složení media pro růst i konverzi probíhala v 12 jamkových mcwp jako je uvedeno v Příkladu 1.Optimization of media composition for both growth and conversion proceeded in 12 well mcwp as shown in Example 1.
Složení kultivačních medií: minerální medium (M9):Composition of culture media: mineral medium (M9):
glukóza, sacharóza, xylóza, glycerol, sorbitol v koncentracích: 1; 5; 10; 15 a 20 g/l komplexní substráty:glucose, sucrose, xylose, glycerol, sorbitol at concentrations of: 1; 5; 10; 15 and 20 g / l complex substrates:
kaseinový hydrolyzát (CH) 20 a 50 g/l kvasničný extrakt (YE) 20 a 50 g/l trypton (TRY) 20 a 50 g/l • · · · komplexní medium Luria-Bertani (LB):casein hydrolyzate (CH) 20 and 50 g / l yeast extract (YE) 20 and 50 g / l trypton (TRY) 20 and 50 g / l • Luria-Bertani (LB) complex medium:
stopové prvky (TE)trace elements (TE)
Tab.2 Vliv media a komplexního zdroje na nárůst (ODóoo) Rhizobium radiobacterTab.2 Effect of medium and complex source on Rhizobium radiobacter growth (OD 600)
R89-1 CCM 7947a konverzi kodeinu (0,2 g/1)R89-1 CCM 7947a codeine conversion (0.2 g / l)
Na základě výsledků uvedených v Tab.2 byla pro další optimalizaci vybrána živná půda LB+TE (LBTE). Vliv zdroje uhlíku a energie je uveden v Tab. 3.Based on the results shown in Table 2, LB + TE (LBTE) was selected for further optimization. The effect of carbon and energy sources is shown in Tab. 3.
» f í ♦ í»F ♦ í
Tab.3 Vliv zdroje uhlíku a energie na nárůst (OD6oo) Rhizobium radiobacter R89-1Tab.3 Effect of carbon source and energy on growth (OD 6 oo) of Rhizobium radiobacter R89-1
CCM 7947 a konverzi kodeinu (0,2 g/l) v mediu LBTE,CCM 7947 and codeine conversion (0.2 g / l) in LBTE medium,
Optimálním zdrojem uhlíku a energie je glukóza a sacharóza v 0,5% koncentraci. Xylóza a sorbitol jsou rovněž použitelným zdrojem uhlíku a energie.Optimal sources of carbon and energy are glucose and sucrose in 0.5% concentration. Xylose and sorbitol are also a useful source of carbon and energy.
Příklad 3Example 3
Optimalizace kultivačních podmínek pro Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947Optimization of culture conditions for Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947
Vliv pH na růst buněk byl sledován v 12 jamkových mcwp při 29 °C: 2,0 ml LBTE media s příslušným počátečním pH bylo inokulováno 40 μΐ kultury (24 h, 29 °C, LBTE medium příslušného pH). Vliv pH na konverzi kodeinu byl sledován rovněž v 12 jamkových mcwp při 29 °C s tím rozdílem, že byla použita 10% buněčná suspenze připravená následujícímThe effect of pH on cell growth was monitored in 12 well mcwp at 29 ° C: 2.0 mL of LBTE medium with appropriate initial pH was inoculated with 40 µ 40 of culture (24 h, 29 ° C, LBTE medium of appropriate pH). The effect of pH on codeine conversion was also monitored in 12 well mcwp at 29 ° C, except that a 10% cell suspension prepared by the following:
8’ • t I t8 ’• t I t
» t · způsobem: kultura narostlá v LBTE (24 h, pH 7,0, 29 °C) byla stočena a resuspendována v čerstvém LBTE mediu s příslušným počátečním pH. Po 48 h konverzi byla stanovena koncentrace látek vzorců l,2a3jakje uvedeno v Příkladě 1.In this way, the culture grown in LBTE (24 h, pH 7.0, 29 ° C) was centrifuged and resuspended in fresh LBTE medium at the appropriate initial pH. After 48 h conversion, the concentration of the compounds of formulas 1, 2a and 3 as set forth in Example 1 was determined.
Tab.4 Vliv počáteční hodnoty pH LBTE media na nárůst (ODéoo) kultury Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 a konverzi kodeinu (0,2 g/1)Tab.4 Effect of initial pH value of LBTE medium on growth (OD 600) of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 culture and codeine conversion (0.2 g / l)
Vliv teploty na růst buněk byl sledován v 12 jamkových mcwp při počátečním pH media 7,0 : 2,0 ml LBTE media bylo inokulováno 40 μΐ kultury narostlé v LBTE mediu (24 h, 29 °C). Vliv teploty na konverzi kodeinu byl sledován v 12 jamkových mcwp při počátečním pH media 7,0 s tím rozdílem, že byla použita 10% buněčná suspenze připravená stejně jako při sledování vlivu pH (tento příklad). Po 48 h konverze při různých teplotách byla stanovena koncentrace látek vzorců 1,2 a 3 jak je uvedeno v Příkladě 1.The effect of temperature on cell growth was monitored in 12 well mcwp at an initial pH of 7.0: 2.0 mL of LBTE medium was inoculated with 40 µΐ of culture grown in LBTE medium (24 h, 29 ° C). The effect of temperature on codeine conversion was monitored in 12 well mcwp at an initial pH of 7.0, except that a 10% cell suspension prepared as in pH monitoring was used (this example). After 48 h conversion at different temperatures, the concentration of the compounds of formulas 1, 2 and 3 was determined as described in Example 1.
Tab.5 Vliv teploty na růst (ODďoo) kultury Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 a konverzi kodeinu (0,2 g/1)Tab.5 Effect of temperature on Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 growth (ODDo) and codeine conversion (0.2 g / l)
• » · ·• »· ·
Příklad 4Example 4
Jednorázová kultivace kmene Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 na LBTE mediu v míchaném bioreaktoruSingle culture of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 strain on LBTE medium in a stirred bioreactor
Jednorázová kultivace na LBTE mediu proběhla v míchaném bioreaktoru Biostat MD: pracovní objem 6 1, vzdušnění 6 1 vzduchu/min, počáteční frekvence míchání 300 ot/min, při teplotě 30 °C a počátečním pH 7,2. Medium bylo inokulováno 5% kulturou druhé generace (viz Příklad 1, s tím rozdílem, že v 500jnl kultivačních baňkách bylo 100 ml LBTE media). pH media a koncentrace rozpuštěného kyslíku nebyly během kultivace regulovány. V průběhu kultivace v bioreaktoru byly v pravidelných časových intervalech odebírány vzorky kultury a stanovena koncentrace biomasy (suchá hmotnost buněk, X) a schopnost buněk hydroxylovat kodein vzorce 1 na 14-OH-kodein vzorce 2 a 14-OH-kodeinon vzorce 3 (buněčný pelet ze 2 ml kultivační kapaliny byl uschován při -30 °C). Po skončení kultivace byly všechny vzorky resuspendovány ve 2 ml LBTE media s kodeinem v koncentraci 0,2 g/1 a po 48 h konverze stanovena koncentrace látek vzorců 1, 2 a 3 jak je uvedeno v Příkladě 1). Maximální koncentrace suché hmotnosti biomasy (1,7 g/L) bylo dosaženo v 16. h kultivace, maximální konverze látky vzorce 1 (82%) až na konci kultivace (25. hodina). Časový průběh i koncentrace biomasy (X, ) a biotransformační aktivity je uveden v Obr 11.Single cultivation on LBTE medium was performed in a Biostat MD stirred bioreactor: working volume 6 L, aeration 6 L air / min, initial mixing frequency 300 rpm, at 30 ° C and initial pH 7.2. The medium was inoculated with 5% second generation culture (see Example 1, except that there were 100 ml of LBTE medium in 500 µl culture flasks). The pH of the medium and the dissolved oxygen concentration were not regulated during cultivation. During culture in the bioreactor, culture samples were taken at regular time intervals and the biomass concentration (dry cell weight, X) and the ability of the cells to hydroxylate codeine of formula 1 to 14-OH-codeine of formula 2 and 14-OH-codeinone of formula 3 were determined. of 2 ml culture liquid was stored at -30 ° C). At the end of the culture, all samples were resuspended in 2 ml of LBTE medium with codeine at a concentration of 0.2 g / l and after 48 h conversion the concentrations of the compounds of formulas 1, 2 and 3 were determined as described in Example 1). The maximum dry mass concentration of biomass (1.7 g / L) was reached at 16 h of cultivation, maximum conversion of compound of formula 1 (82%) only at the end of the cultivation (25 hr). The time course and concentration of biomass (X 1) and biotransformation activity are shown in Fig. 11.
Příklad 5Example 5
Jednorázová kultivace kmene Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 na LBTE mediu s glukózou v míchaném bioreactoru.Single culture of Rhizobium radiobacter strain R89-1 CCM 7947 on LBTE medium with glucose in a stirred bioreactor.
Jednorázová kultivace proběhla za stejných podmínek jako v Příkladu 4 s tím rozdílem, že do media byla na počátku kultivace přidána glukóza v koncentraci 0,5%. Maximální koncentrace suché hmotnosti biomasy (5,7 g/1) bylo dosaženo v 16. h, maximální konverze látky vzorce 1 (100%) v 18.h kultivace. Časový průběh koncentrace biomasy (X, ) a biotransformační aktivity (konverze,♦) v míchaném bioreaktoru je uveden v Obr. 2.A single culture was performed under the same conditions as in Example 4 except that glucose was added to the medium at the beginning of the culture at a concentration of 0.5%. The maximum dry weight concentration of biomass (5.7 g / l) was reached at 4 pm, the maximum conversion of the compound of formula 1 (100%) at 18 h of culture. The time course of biomass concentration (X 1) and biotransformation activity (conversion, ♦) in the stirred bioreactor is shown in Fig. 2. 2.
Příklad 6Example 6
Přítokovaná (fed-batch, 40% roztok glukózy) kultivace Rhizobium radiobacter R89-1Fed-batch (40% glucose solution) culture of Rhizobium radiobacter R89-1
CCM 7947 na LBTE mediu s glukózou v míchaném bioreaktoruCCM 7947 on LBTE medium with glucose in a stirred bioreactor
10‘ *10 ‘*
« t«T
t « · f » · • * · $ · • ·t «· f»
Přítokovaná kultivace proběhla za stejných podmínek jako v Příkladu 5 s tím rozdílem, že počáteční koncentrace glukózy byla 1,0% a od 13. h do 22. h kultivace byl do reaktoru přidáván 40% roztok glukózy, tak, aby byla udržována koncentrace rozpuštěného kyslíku v mediu (pC>2) v rozmezí 25 /^35% hodnoty maximálního nasycení media kyslíkem. Hodnota pH byla regulována čpavkem na hodnotě 7,5. Obr. 3 uvádí časový průběh koncentrace biomasy a biotransformační aktivity. Za tohoto režimu kultivace bylo dosaženo maximální koncentrace suché hmotnosti biomasy (11,9 g/1) i maximální konverze látky vzorce 1 (100%) ve 20. h kultivace.The fed-batch culture was carried out under the same conditions as in Example 5 except that the initial glucose concentration was 1.0% and from 1pm to 10pm a 40% glucose solution was added to the reactor to maintain dissolved oxygen concentration. in the medium (pC > 2) in the range of 25/35% of the maximum oxygen saturation of the medium. The pH was adjusted to 7.5 with ammonia. Giant. 3 shows the time course of biomass concentration and biotransformation activity. Under this culture regime, both the maximum biomass dry weight concentration (11.9 g / L) and the maximum conversion of the compound of Formula 1 (100%) were achieved at 20 hr culture.
Příklad 7Example 7
Vliv počáteční koncentrace kodeinu vzorce 1 na jeho biotransformaci 10% buněčnou suspenzí v LBTE mediuInfluence of initial codeine concentration of formula 1 on its biotransformation by 10% cell suspension in LBTE medium
Buňky z konce kultivace uvedené v Příkladu 6 byly stočeny, promyty fyziologickým roztokem a resuspendovány do LBTE media tak, aby výsledná koncentrace buněk byla 10% (vlhká hmotnost buněk). Biotransformace byly prováděny v 500jml kultivačních baňkách s 50 ml buněčné suspenze na rotační třepačce při 200 ot/min a 29 °C. Substrát vzorce 1 byl do reakční směsi přidán v čase t = 0 a jeho výchozí koncentrace byla 1,0 f 6,0 g/1.The cells from the end of the culture described in Example 6 were centrifuged, washed with saline and resuspended in LBTE medium to a final cell concentration of 10% (wet cell weight). Biotransformations were performed in 500 µl culture flasks with 50 ml cell suspension on a rotary shaker at 200 rpm and 29 ° C. The substrate of formula 1 was added to the reaction mixture at t = 0 and its initial concentration was 1.0 f 6.0 g / l.
Příklad 8Example 8
Biokonverze kodeinu vzorce 1 10% buněčnou suspenzí ve fosfátovém pufruBioconversion of codeine 1 with 10% cell suspension in phosphate buffer
11'11 '
I · ·I · ·
Biokonverze probíhala za stejných podmínek jako v Příkladu 7 s tím rozdílem, že buňky byly resuspendovány v 0,1 Jvl fosfátovém pufru (H3PO4, pH upraveno přídavkem NaOH) pH 7,0, výchozí koncentrace kodeinu se pohybovala v rozmezí 1 až 6 g/1.The bioconversion was carried out under the same conditions as in Example 7 except that the cells were resuspended in 0.1 µl phosphate buffer (H 3 PO 4, pH adjusted by addition of NaOH) pH 7.0, the initial codeine concentration ranging from 1 to 6 g / l. .
Příklad 9Example 9
Vliv kosubstrátů na biokonverzi kodeinu 1 10% buněčnou suspensí ve fosfátovém pufruInfluence of cosubstrates on codeine 1 bioconversion by 10% cell suspension in phosphate buffer
Biokonverze probíhala za stejných podmínek jako v Příkladu 8, s tím rozdílem, že k reakční směsi byly přidány kosubstráty pro regeneraci kofaktorů (glukóza, isopropylalkohol, glycerol a formiát sodný. Výchozí koncentrace kodeinu se pohybovala v rozmezí 1 až 24 g/1.The bioconversion was carried out under the same conditions as in Example 8, except that cosubstrates were added to the reaction mixture to regenerate the cofactors (glucose, isopropyl alcohol, glycerol and sodium formate. The initial concentration of codeine ranged from 1 to 24 g / l.
Nejvyšší konverze bylo dosaženo v přítomnosti formiátu sodného (2,5 g/1). Za těchto podmínek vznikal pouze 14-hydroxykodein vzorce 2.The highest conversion was achieved in the presence of sodium formate (2.5 g / l). Under these conditions, only 14-hydroxycodeine of formula 2 was formed.
Příklad 10Example 10
Biotransformace morfinu vzorce 4 10% buněčnou suspenzí ve fosfátovém pufruBiotransformation of morphine 4 with 10% cell suspension in phosphate buffer
12* i ‘ ř «12 * i ‘« «
Biotransformace morfinu vzorce 4 proběhla za stejných podmínek jako v Příkladu 9 s tím rozdílem, že výchozí koncentrace morfinu byla 1 g/1. Ve 24. h byla hodnota konverze morfinu 100%.The biotransformation of morphine of formula 4 was carried out under the same conditions as in Example 9 except that the initial morphine concentration was 1 g / l. At 24h, the morphine conversion value was 100%.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120633A CZ2012633A3 (en) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | Codeine hydroxylation using the strain of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 microorganism |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ20120633A CZ2012633A3 (en) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | Codeine hydroxylation using the strain of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 microorganism |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ304116B6 CZ304116B6 (en) | 2013-10-30 |
| CZ2012633A3 true CZ2012633A3 (en) | 2013-10-30 |
Family
ID=49457289
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20120633A CZ2012633A3 (en) | 2012-09-13 | 2012-09-13 | Codeine hydroxylation using the strain of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 microorganism |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ2012633A3 (en) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4798792A (en) * | 1985-09-09 | 1989-01-17 | E. I. Du Pont De Nemours And Company | Bacterial hydroxylation of codeine |
| CZ2011761A3 (en) * | 2011-11-23 | 2013-01-02 | Zentiva, K.S. | Strain of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 microorganism hydroxylating codeine to 14-OH codeine and 14-OH-codeinone |
-
2012
- 2012-09-13 CZ CZ20120633A patent/CZ2012633A3/en not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ304116B6 (en) | 2013-10-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Chen et al. | Epigenetic modifier-induced biosynthesis of novel fusaric acid derivatives in endophytic fungi from Datura stramonium L. | |
| JPH0412110B2 (en) | ||
| CN101974464A (en) | Streptomyces and process for preparing antimycin antibiotics by fermentation using same | |
| JP2018524000A (en) | Use of microbacterial strains for the production of antibacterial agents | |
| Liu et al. | Efficient microbial synthesis of key steroidal intermediates from bio-renewable phytosterols by genetically modified Mycobacterium fortuitum strains | |
| JP2002535977A5 (en) | ||
| Kyslíková et al. | Biotransformation of codeine to 14-OH-codeine derivatives by Rhizobium radiobacter R89-1 | |
| CN107868757B (en) | Endophytic fungi and application thereof | |
| CN102382780A (en) | Microbacterium oxydans and method for preparing chiral bis(trifluoromethyl) phenyl ethanol by using same | |
| CZ303607B6 (en) | Codeine-hydrolyzing strain of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 microorganism to 14-OH-codeine and 14-OH-codeinone | |
| WO2013153554A1 (en) | Fermentation process for the production of rapamycin | |
| CZ2012633A3 (en) | Codeine hydroxylation using the strain of Rhizobium radiobacter R89-1 CCM 7947 microorganism | |
| EP2029763A2 (en) | Biocatalytic oxidation process useful in the manufacture of moxidectin | |
| CN104232696B (en) | The method that asymmetric reduction prochiral carbonyl compounds produce chiral alcohol | |
| CN103484375A (en) | Fusarium oxysporum SC1301 capable of biologically synthesizing testolactone, and synthesis method | |
| HU196627B (en) | Microbiological process for producing y alpha-hydroxy-4-androstene-3,17-dione | |
| US4798792A (en) | Bacterial hydroxylation of codeine | |
| Ata et al. | Novel microbial transformations of sclareolide | |
| CN1189568C (en) | Biotransfer process for preparing artemisine compounds | |
| Gandomkar et al. | Biotransformation of 6α-santonin and 1, 2-dihydro-α-santonin by Acremonium chrysogenum PTCC 5271 and Rhizomucor pusillus PTCC 5134 | |
| Goeke et al. | Production of the Staurosporine Aglycon K-252c with a Blocked Mutant of the Staurosporine Producer Strain Streptomyces longisporoflavus and by Biotransformation of Staurosporine with Streptomyces medioddicm ATCC 13279 | |
| CZ2016482A3 (en) | Strain of the microorganism Raoultella sp. KDF8 CCM 8678 degrading active pharmaceutical ingredients from the following group: diclofenac, codeine, ibuprofen and ketoprofen | |
| NZ239808A (en) | Preparation of 13-beta-22,23-dihydro avermectin aglycones using streptomyces cultures; the strains ma-6762 and ma-6763 | |
| JP4439079B2 (en) | Method for producing pravastatin | |
| Chaudhary | Fungal biotransformation of morphine alkaloids |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20190913 |