CZ20033097A3 - Způsob odstranění plasmin(ogenu) z proteinových roztoků - Google Patents
Způsob odstranění plasmin(ogenu) z proteinových roztoků Download PDFInfo
- Publication number
- CZ20033097A3 CZ20033097A3 CZ20033097A CZ20033097A CZ20033097A3 CZ 20033097 A3 CZ20033097 A3 CZ 20033097A3 CZ 20033097 A CZ20033097 A CZ 20033097A CZ 20033097 A CZ20033097 A CZ 20033097A CZ 20033097 A3 CZ20033097 A3 CZ 20033097A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- plasmin
- ogen
- carrier
- amino acid
- blood
- Prior art date
Links
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 title claims abstract description 165
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 title claims abstract description 150
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 89
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 title description 17
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 42
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims abstract description 38
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims abstract description 38
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims abstract description 38
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims abstract description 13
- 229960000401 tranexamic acid Drugs 0.000 claims description 75
- GYDJEQRTZSCIOI-LJGSYFOKSA-N tranexamic acid Chemical compound NC[C@H]1CC[C@H](C(O)=O)CC1 GYDJEQRTZSCIOI-LJGSYFOKSA-N 0.000 claims description 73
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 52
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 40
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 claims description 39
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 38
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 36
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 24
- 239000004593 Epoxy Substances 0.000 claims description 20
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 claims description 19
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 claims description 17
- KHURTEAYLZEQHD-UHFFFAOYSA-N 3-n-propylpropane-1,1,3-triamine Chemical compound CCCNCCC(N)N KHURTEAYLZEQHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 13
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 13
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims description 10
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N Ethylenediamine Chemical compound NCCN PIICEJLVQHRZGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 8
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 claims description 7
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 6
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 claims description 6
- 239000003914 blood derivative Substances 0.000 claims description 6
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims description 5
- 239000011236 particulate material Substances 0.000 claims description 5
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 5
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims description 5
- UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 1,3-diaminopropan-2-ol Chemical compound NCC(O)CN UYBWIEGTWASWSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 claims description 4
- 101100008681 Glycine max DHPS1 gene Proteins 0.000 claims description 4
- PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N Maleimide Chemical compound O=C1NC(=O)C=C1 PEEHTFAAVSWFBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- UATJOMSPNYCXIX-UHFFFAOYSA-N Trinitrobenzene Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC([N+]([O-])=O)=CC([N+]([O-])=O)=C1 UATJOMSPNYCXIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N aldrithiol Chemical compound C=1C=CC=NC=1SSC1=CC=CC=N1 HAXFWIACAGNFHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 4
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 4
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000467 secondary amino group Chemical group [H]N([*:1])[*:2] 0.000 claims description 4
- 102000004411 Antithrombin III Human genes 0.000 claims description 3
- 108090000935 Antithrombin III Proteins 0.000 claims description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 claims description 3
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 claims description 3
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims description 3
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 3
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 claims description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004166 Lanolin Substances 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960005348 antithrombin iii Drugs 0.000 claims description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 claims description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 claims description 3
- 239000003925 fat Substances 0.000 claims description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 3
- NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N hexane-1,6-diamine Chemical compound NCCCCCCN NAQMVNRVTILPCV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 claims description 3
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 claims description 3
- 229940039717 lanolin Drugs 0.000 claims description 3
- 235000019388 lanolin Nutrition 0.000 claims description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 claims description 3
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 claims description 3
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 claims description 3
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 claims description 3
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 claims description 3
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 claims description 2
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 2
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 claims description 2
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 2
- PKWPJBDFDHJNER-UHFFFAOYSA-N 1-(aminomethyl)bicyclo[2.2.2]octane-4-carboxylic acid Chemical compound C1CC2(C(O)=O)CCC1(CN)CC2 PKWPJBDFDHJNER-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 158
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 68
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 60
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 60
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 46
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 34
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 34
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 31
- 125000006850 spacer group Chemical group 0.000 description 29
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 25
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 25
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 24
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 24
- 239000008213 purified water Substances 0.000 description 24
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 20
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 20
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 19
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 description 19
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 19
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 16
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 14
- WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 4-aminobenzenecarboximidamide Chemical compound NC(=N)C1=CC=C(N)C=C1 WPANETAWYGDRLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 12
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 9
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 description 8
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 7
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 7
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 6
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 6
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 6
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 6
- 239000004023 fresh frozen plasma Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 238000009413 insulation Methods 0.000 description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 5
- 230000001567 anti-fibrinolytic effect Effects 0.000 description 5
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 description 5
- 238000001261 affinity purification Methods 0.000 description 4
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 4
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 4
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- -1 amino carboxyl groups Chemical group 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 239000012148 binding buffer Substances 0.000 description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002806 plasmin inhibitor Substances 0.000 description 3
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 2
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 235000019766 L-Lysine Nutrition 0.000 description 2
- 101000882917 Penaeus paulensis Hemolymph clottable protein Proteins 0.000 description 2
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 2
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 2
- 125000002723 alicyclic group Chemical group 0.000 description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 2
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 2
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 125000000896 monocarboxylic acid group Chemical group 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 2
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 2
- 239000001384 succinic acid Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)C1=C([N+]([O-])=O)C=C([N+]([O-])=O)C=C1[N+]([O-])=O NHJVRSWLHSJWIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 2,4-diphenyl-4h-1,3-oxazol-5-one Chemical compound O=C1OC(C=2C=CC=CC=2)=NC1C1=CC=CC=C1 IEJPPSMHUUQABK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- URLOWBXNQIYFHV-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid;1-hydroxypyrrolidine-2,5-dione Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O.NCCCCCC(O)=O URLOWBXNQIYFHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 241001598984 Bromius obscurus Species 0.000 description 1
- 101150096839 Fcmr gene Proteins 0.000 description 1
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 1
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 1
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N L-arginine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N N-phenyl amine Chemical group NC1=CC=CC=C1 PAYRUJLWNCNPSJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940122791 Plasmin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 1
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical group 0.000 description 1
- 125000002490 anilino group Chemical group [H]N(*)C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 229960003589 arginine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 235000010233 benzoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001559 benzoic acids Chemical group 0.000 description 1
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 1
- 230000005540 biological transmission Effects 0.000 description 1
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000004359 castor oil Substances 0.000 description 1
- 235000019438 castor oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000113 cyclohexyl group Chemical group [H]C1([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(*)C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 1
- DAEAPNUQQAICNR-GFCOJPQKSA-N dadp Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 DAEAPNUQQAICNR-GFCOJPQKSA-N 0.000 description 1
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N glycerol triricinoleate Natural products CCCCCC[C@@H](O)CC=CCCCCCCCC(=O)OC[C@@H](COC(=O)CCCCCCCC=CC[C@@H](O)CCCCCC)OC(=O)CCCCCCCC=CC[C@H](O)CCCCCC ZEMPKEQAKRGZGQ-XOQCFJPHSA-N 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 108010064755 lys-plasmin Proteins 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N nonanoic acid Chemical compound CCCCCCCCC(O)=O FBUKVWPVBMHYJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000009928 pasteurization Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 239000011546 protein dye Substances 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011552 rat model Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000011877 solvent mixture Substances 0.000 description 1
- 238000013112 stability test Methods 0.000 description 1
- 238000012430 stability testing Methods 0.000 description 1
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 229920002554 vinyl polymer Polymers 0.000 description 1
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 1
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 1
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6435—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
- C07K1/22—Affinity chromatography or related techniques based upon selective absorption processes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21007—Plasmin (3.4.21.7), i.e. fibrinolysin
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Solid-Sorbent Or Filter-Aiding Compositions (AREA)
- Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
- Polysaccharides And Polysaccharide Derivatives (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
Description
Způsob odstranění plasmin(ogenu) z proteinových roztoků
Oblast techniky
Vynález se týká pryskyřice a způsobu pro specifické odstranění plasmin(ogenu) a jeho derivátů z proteinových roztoků, přičemž výsledný proteinový roztok lze použít pro intravenózní podání a pro lokální aplikace, tj. jako nosnou matrici pro dlouhodobé uvolňování a hojení ran, bud' jako jedinou účinnou složku, nebo v kombinaci s dalšími farmaceuticky přijatelnými účinnými látkami. Odstranění plasmin(ogenu) by zajistilo integritu a funkci proteinového roztoku při delších inkubačních periodách. Vynález se rovněž týká výroby vysoce purifikovaného plasmin(ogenu) pro terapeutické použití.
Dosavadní stav techniky
Plasmin(ogen) nebo jeho aktivní molekula plasmin (dále jen plasmin(ogen)) velmi často kontaminuje proteinové roztoky, a zejména ty proteinové roztoky, které jsou extrahovány z tekutin nebo z orgánů živočichů. Přítomnost plasmin(ogenu) v proteinovém roztoku představuje několik hrozeb pro přijatelnost proteinového roztoku jako stabilního farmaceutického produktu, v důsledku známé proteolytické aktivity této molekuly na různé proteiny a peptidy na arginylpeptidových a lysylpeptidových vazbách (Weinstein M.J., Doolittle R.F. Differential specificities of the thrombin, plasmin and trypsin with regard to synthetic and natural substrates and inhibitors RF Biochim. Biopliys. Acta 1972; 258: str. 577 až 590 a Ling C.M.,
01-2465 - 03-Če • φ · · • · · · · φφφ • φφφφφ φ φ φφφφφ
Summaria L., Robbins K.C.; Mechanism of formation of bovine plasmin (ogen) activator from human plasmin; J. Biol. chem. 1965; 240: str. 4212-B); a na bazických aminokyselinách, pro jeho stimulační aktivitu na různé tkáně, zejména na centrální nervovou tkáň a pro jeho roli pří navázání (Chen Z.L., Strickland S., Neuronal death in the hippocampus is promoted by plasmincatalyzed degradation; Liminin. Cell. 1997; 91: str. 917 až 925) a pravděpodobně při přenášení prionů v krvi savců (Fischer M.B., Roeckl C., Parízek P., Schwarz H.P., Aguzzi A. Binding of disease associated prion protein to plasmin(ogen); Nátuře 2000; 408: str. 479 až 483).
Pro purifikaci plasmin(ogenu) z proteinových roztoků, a tedy pro odstranění plasmin(ogenu) z proteinového roztoku, bylo vyvinuto několik chromatografických způsobů.
Tyto způsoby jsou v podstatě založeny na dvou principech. Podstatou první skupiny způsobů je několik po sobě jdoucích purifikačních kroků, které využívají různé rozpustnosti, isoelektrického bodu nebo distribuce molekulových hmotností (Alkjaerisig N. ; The purification and properties of human plasmin(ogen); Biochem. J. 1963; 93: str. 171 až 182). Protože základním cílem těchto způsobů je purifikace plasmin(ogenu), dochází k tomu, že se při jejich provádění zcela zbortí původní složení proteinového roztoku. Druhá skupina způsobů je založena na jednostupňové afinitní purifikaci. Základem purifikace je navázání plasmin(ogenu) na různé syntetické ligandy na bázi ω-aminokarboxylově kyseliny, které se mohou vázat na lysinová vazebná místa na těžkém řetězci plasmin(ogenu). Tato místa, která sestávají z pěti struktur vzájemně propojených třemi disulfidickými můstky s vnitřní sekvenční homologií, známých jako tzv. plasmin(ogenové) „kringles
01-2465-03-Če • · • · · · · • · · · · · · ····· · · · ···· (smyčky), které jsou umístěny na NH2 plasmin (ogenovém) těžkém řetězci a daleko od katalytického místa umístěného na COOH lehkém řetězci, vážou fibrin(ogen). Další možností pro afinitní chromatografií je navázání plasmin(ogenu) přes katalytické místo, které je místem potenciálně méně specifického navázání, protože může vázat mnoho proteinů, jakými jsou například serinproteázy mající podobnou nebo nižší afinitu k arginylpeptidové a lysylpeptidové vazbě a bazickým aminokyselinám. Souhrnem lze vyvodit závěr, že obecně je plasmin(ogenová) afinitní chromatografie prováděna za použití ligandu, který je chemicky a iontově podobný ω-aminokarboxylové kyselině neboli substrátu plasminového katalytického místa. Ligand se naváže na pryskyřici přes odpovídající distanční člen neboli linker. Nicméně ideální afinitní pryskyřice pro odstranění plasmin(ogenu) není v podstatě stejnou pryskyřicí, o které se zjistilo, že je ideální pryskyřicí pro purifikaci plasmin(ogenu). Takové pryskyřice by měly obsahovat ligand, který váže plasmin (ogen) při vysoké afinitě a má velmi nízkou afinitu k ostatním proteinům, jakými jsou další serinproteázy, a zejména má velmi nízkou afinitu pro fibrinogen, který je hlavním proteinem v Cohnově frakci plasmy I nebo v kryoprecipitátu. Rovněž je důležité, že odstranění plasmin(ogenu) použitím dané afinitní chromatografie může být prováděno v širokém rozsahu pufrů a není omezeno pouze na určitý pufr, který může znamenat nebezpečí pro stabilitu a integritu proteinů v roztoku, přičemž cílem zájmu není plasmin(ogen), ale právě tyto proteiny.
Antifibrinolytická schopnost (schopnost inhibovat navázání plasmin(ogenu) na fibrinogen s vysokou afinitou) těchto ω-aminokarboxylových kyselin závisí na přítomnosti • · • · · ·
01-2465-03-Če volné aminoskupiny a karboxylové skupiny a na vzdálenosti mezi COOH-skupinou a atomy uhlíku, na které se váže NH2-skupina (Markwardt 1978). Například, pokud jde o kyselinu ε-aminokapronovou (EACA) a p-aminobenzamidin (PAMBA), ukázalo porovnání antifibrinolytických aktivit EACA a PAMBA, že druhá jmenovaná je přibližně třikrát aktivnější. Shimura a kol. (1984) navrhl pryskyřici, ve které byl p-aminobenzamidin navázán na mikročástice hydrofilního vinylpolymeru přes část distančního členu (linkeru) . Při použití této pryskyřice byl Shimura a kol. schopen separovat plasmin a plasmin(ogen) pomocí vysokovýkonné afinitní chromatografie. Skutečnost, že se plasmin(ogen) nemohl eluovat kyselinou 6-aminohexanovou a že do elučního pufru musela být zahrnuta 3M močovina, naznačila dvoumístnou interakci plasminu s tímto imobilizovaným ligandem, tj . s místy vážícími lysin na těžkém řetězci a s katalytickým místem na lehkém řetězci. To může vysvětlit zjištění dalších vědců, podle kterých p-aminobenzamidin odstraňuje rovněž některé další proteiny.
Pro afinitní purifikaci plasmin(ogenu) se vyrábí a používá další pryskyřice, kterou je lysinová pryskyřice. Nicméně antifibrinolytická schopnost lysinu je velmi nízká, a nízká je tedy i jeho vazebná afinita. Váže se rovněž na další proteiny a jeho specifičnost je závislá na pufru.
Moroz L.A., Gilmore N.J. Fibrinolysis in normál plasma and blood: evidence for significant mechanisms independent of the plasminogen-plasmin systém, Blood 1976, 48, str. 531 až 545 popisuje přípravu plasmin(ogenu) prosté plasmy afinitní chromatografií. Pokud jde o použité způsoby, byly zveřejněny výsledky pozorování naznačující, že způsoby, které kulminují v generaci fibrinolytického enzymu plasmin, sehrávají nejvýše minimální úlohu při spontánní nebo
01-2465-03-Če • · · · · · • · · · · · • ··· · · · · • · · ···· · · ····· bazální fibrinolytické aktivitě měřitelné v normální lidské plasmě. Pro měření fibrinolytické aktivity se použila kyselina tranexamová společně s dalšími inhibitory proteáz, jakými jsou například inhibitory plasminu. Pro přípravu plasmin(ogenu) prosté plasmy se použil způsob Deutsch a Meltz, Science 170; str. 1095 až 1096, 1997.
Iwamoto v Thrombos. Diathes. Heamorrh. (Stuttg.), 1975, 33, str. 573 popisuje specifické navázání kyseliny tranexamové na plasmin. Přesto, že je kyselina tranexamová identifikována jako účinný ligand plasminu, se ukazuje, že antifibrinolytický účinek kyseliny tranexamové je výsledkem nejen navázání na plasmin(ogen) , ale rovněž zesílení kooperace přírodních antiplasminů. Z toho plyne závěr, že navázání kyseliny tranexamové na pevný nosič odstraní z plasmy kromě plasmin(ogenu) i přírodní antiplasminy. Rovněž by se dalo usuzovat, že tranexamové kyseliny mohou způsobovat tvorbu agregátů (konglomerátů) s inhibitory plasminu. Tento postřeh je založen na diskrepanci, kterou lze odhalit, pokud se porovná antifibrinolytické aktivita kyseliny ε-aminokapronové a kyseliny tranexamové vedoucí k 98% a 91% inhibici v urokinázou stimulované plasmě vs. plasmě, kterou byla heparinizovaná orální krev (65 % a 39 % pro kyselinu ε-aminokapronovou, resp. kyselinu tranexamovou - srovnávací tabulky 2 a 7 v odkazu Moroz a kol.). Dalo by se očekávat, že díky svému vysokému vazebnému poměru budou kyselina tranexamová a kyselina ε-aminokapronová dobrými kandidáty pro vysoce afinitní ligandy. Nicméně rovněž by se dalo očekávat, že tyto ligandy budou blokovat afinitní kolonu v důsledku navázání komplexů plasminu a inhibitoru plasminu.
01-2465-03-Če
Stručný popis obrázků
Obr. 1 znázorňuje gradientovou gelovou SDS-PAGE (5% až 12% polyakrylamid) 7 pg proteinů eluovaných dvěma způsoby (popsanými v odstavci „Materiál a metoda) se třemi různými pryskyřicemi: TEA-sefaróza, Lys-Ceramic Hyper DF a
Lys-sefaróza 4B. Pásy: 1 - Glu plasminogen; 2 - fibrinogen; 3 - albumin; 4 - imunoglobulin G; 5 - molekulový hmotn. markér; eluční píky: 6 - TEA za použití metody 1; 7 - TAE za použití metody 2; 8 - lysin-Ceramic Hyper D za použití metody 1; 9 - lysin-sefaróza za použití metody 1;
- lysin-Ceramic Hyper D za použití metody 1;
- lysin-sefaróza za použití metody 1.
Podstata vynálezu
Vynález je založen na zjištění, že je rigidní aminokyselina schopna specificky vázat plasmin(ogen). Výrazem „specifické navázání se v kontextu popisu přihlášky vynálezu rozumí, že se ze směsi obsahující proteiny, jakými jsou například plasmin(ogen) a fibrinogen, odstraní v podstatě pouze plasmin(ogen), zatímco fibrinogen zůstane ve směsi téměř nedotčen. Výhodně se odstraní alespoň 85 % až 99 % plasmin(ogenu) a alespoň 85 % fibrinogenu zůstane ve směsi. Výhodněji se odstraní alespoň 98,0 % až 99,9 % plasmin(ogenu) neboli ve směsi zůstane 95 % až 99 % fibrinogenu.
Aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny jsou od sebe odsazeny o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodně o 0,7 nm, a rigidní aminokyselina je kovalentně navázána na nosič přes aminoskupinu aminokyseliny. Jako zvláště výhodná se jeví kyselina tranexamová ve své trans ·· 0000
01-2465-03-Če ·· · ·· · · » 0 · 0
000 0 000
00000 0 0 0000 · · 0 0 0
0 0 0 0 * konfiguraci a kyselina 4-aminomethylbicyklo[2.2.2.]oktan-1-karboxylové (EMBOCA).
Překvapivě se zjistilo, že kyselina ε-aminokapronová nefunguje tak dobře jako kyselina tranexamová a že potom, co se kyselina tranexamová naváže na pevný povrch, ztrácí veškerou svou mimoplasmin(ogenovou) vazebnou kapacitu (takzvaná kooperace) a pryskyřice odstraní z plasmy nebo produktů plasmy pouze plasmin(ogen). I po navázání na kolonu si kyselina ε-aminokapronová zachová svou mimoplasmin(ogenovou) aktivitu a stále na sebe váže fibrinogen a další proteiny přítomné v plasmě, zatímco mimoplasmin(ogenová) aktivita kyseliny tranexamové podle vynálezu je zcela eliminována. Nicméně afinita pryskyřice na bázi kyseliny tranexamové ku plasmin(ogenu) není nikterak ovlivněna.
Rigidní aminokyselina je přichycena ke vhodnému distančnímu členu, v podstatě delšímu než 3 atomy uhlíku, a nosič a afinitní materiál tedy mohou odstranit plasmin(ogen) ze směsi obsahující proteiny bez další změny složení proteinového roztoku. Odstranění lze realizovat v přítomnosti různých pufrů. Způsob podle vynálezu je rovněž vhodný pro výrobu čistých frakcí plasmin(ogenu) po eluci z afinitního nosiče.
Vynález se týká způsobu specifického odstranění nebo izolace plasmin(ogenu) v přítomnosti fibrinogenu ze směsi obsahující plasmin(ogen), přičemž tento způsob spočívá v uvedení směsi do kontaktu s rigidní aminokyselinou, přičemž aminoskupina aminokyseliny a karboxylové skupina aminokyseliny jsou od sebe vzdáleny o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodně ·· ···*
01-2465-03-Če • · · * • #··· · · přibližně o 7 nm, a rigidní aminokyselina je kovalentně navázána na nosič přes aminoskupinu aminokyseliny.
Výhodně se směs u způsobu podle vynálezu zvolí z množiny sestávající z tělesných tekutin, jakými jsou například krev, krevní frakce, kryoprecipitát, buněčné kultury, extrakty zvířecích tkání, například bovinní plíce, bovinní střeva nebo želatina z extraktů zvířecích kostí, albumin bovinního séra, a stejně tak živočišné s vodou nemísitelné tuky, jako například lanolin (PC-fosfatidylcholin).
Způsob podle vynálezu lze použít pro získání vysoce purifikovaného plasmin(ogenu) z příslušných směsí. Po uvedení směsi do kontaktu, například s chromatografickým materiálem, na který je navázána rigidní aminokyselina, lze plasmin(ogen) eluovat z pevného afinitního materiálu. Rovněž zde lze použít takzvané principy extrakce pevné fáze. Plasmin(ogen) lze eluovat roztokem obsahujícím ligand, který konkuruje vazebným místům rigidní aminokyseliny, například kyseliny tranexamové v proteinu plasmin(ogenu). Těmito ligandy jsou zpravidla ε-aminokyseliny, výhodně lysin. Lysin lze například použít v koncentracích 0,85 % hmotn. až 0,99 % hmotn. Možné jsou i další koncentrace, zejména pokud je iontová síla elučního média vyvážená dalšími přísadami, například elektrolyty.
Eluci plasmin(ogenu) z pevné fáze lze provádět za absence elučního pufru způsobem, který extrahuje pufrové složky, například dialýzou. Plasmin(ogen), který lze získat způsobem podle vynálezu, je charakteristický velmi vysokou čistotou. Tato jedinečná vlastnost je zřejmá následujících údajů.
01-2465-03-Če ·· ·»»» ·» 9 ·» * φ φ · · Φ · · * φ
9 9 9 9 9 · 9 9 9 9
999 999 9999 99 9 ·»·« • ΦΦ Φ·· Φ Φ Φ
9 Φ Ο · 9 9 9
Souhrnná tabulka 1: Srovnání specifické aktivity, purifikačního faktoru a izolace plasmin(ogenu) z kryodeficitní FFP plasmy za použití výhodného zatížení a elučních podmínek pro každou z pryskyřic
| Použitá pryskyřice | Metoda | Specifická aktivita (mg plasmin (ogenu) /mg proteinu) | Purifi- kační faktor | Izolace |
| TEA-sefaróza 4B | 2 | 0,794 | 567 | 91,6 |
| Lysin-Ceramic Hyper DF | 2 | 0,444 | 444 | 10,9 |
| Lysin-sefaróza 4B | 1 | 0,121 | 101 | 11,6 |
Souhrnná tabulka 2: Srovnání odstranění plasmin(ogenu) z kryo-deficitní FFP plasmy za použití výhodných podmínek zatížení pro každou pryskyřici
| Použitá pryskyřice | Metoda | Odstranění (%) |
| TEA-sefaróza 4B | 1 a 2* | 99,5 |
| Lysin-Ceramic Hyper DF | 1 | 54,6 |
| Lysin-sefaróza 4B | 1 | 58,0 |
*Oba způsoby jsou identické a zahrnují sbírku nenavázaného píku
Jak je patrné ze souhrnné tabulky, pokud se použily komerčně dostupné pryskyřice s imobilizovanými lysinovými ligandy a TEA pryskyřice za optimalizovaných chromatografických podmínek, potom byla izolace a specifická aktivita plasmin(ogenu) vyšší v případě TEA pryskyřice (souhrnná tabulka 1). Za zmínku rovněž stojí zjištění, že TEA pryskyřice je mnohem účinnější při odstraňování plasmin(ogenu) (jak naznačil test v případě Glu-plasmin(ogenu)) z kryo-deficitní plasmy, než lysinová pryskyřice (souhrnná tabulka 2).
• · · ·
01-2465-03-Če
Čistota eluátů byla testována pomocí SDS-gelové elektroforézy. Eluáty tří různých pryskyřic (TEA-sefaróza, Lys-Ceramic Hyper DF a Lys-sefaróza 4B) se podrobily SDS-PAG při zatížení a 5% až 12% gradientem akrylamidu a při zatížení 7 pg proteinu na pás. Výsledný gel zabarvený Coomassie modří je znázorněn na obr. 1.
Obr. 1 znázorňuje gradientovou gelovou SDS-PAGE (5% až 12% polyakrylamid) 7 pg proteinů eluovaných dvěma způsoby (popsanými v odstavci „Materiál a metoda) se třemi různými pryskyřicemi: TEA-sefaróza, Lys-Ceramic Hyper DF a Lys-sefaróza 4B. Pásy: 1 - Glu-plasminogen; 2 - fibrinogen; 3 - albumin; 4 - imunoglobulin G; 5 - molekulový hmotn. markér; eluční píky: 6 - TEA za použití metody 1; 7 - TAE za použití metody 2; 8 - lysin-Ceramic Hyper D za použití metody 1; 9 - lysin-sefaróza za použití metody 1;
- lysin-Ceramic Hyper D za použití metody 1;
- lysin-sefaróza za použití metody 1.
Výsledné proteinové pásy a čistota produktu dobře korelují se specifickou aktivitou plasmin(ogenu), jak naznačuje souhrnná tabulka 1. Z toho vyplývá, že použití TEA-sefarózové pryskyřice vede k získání vysoce purifikovaného plasmin(ogenu) pouze s minimální kontaminací albuminem. Zdá se, že pro použití tohoto produktu pro klinické indikace není potřebná žádná další purifikace.
Předmětem vynálezu je rovněž přípravek obsahující plasmin(ogen).
Předmětem vynálezu je dále nosič mající na sobě kovalentně navázánu rigidní aminokyselinu, přičemž aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny jsou od sebe vzdáleny o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodně o 0,7 nm.
01-2465-03-Če
44 4
Nosičem pro provádění způsobu podle vynálezu je výhodně chromatografický materiál, který je schopen vázat rigidní aminokyselinu, kde jsou aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny od sebe vzdáleny o 0,6
0,7 nm. Vzdálenost mezi skupinou je udržována v konstitucí aminokyseliny.
nm až 0,8 nm, výhodně o aminoskupinou a karboxylovou podstatě konstantní rigidní
Rigiditu aminokyseliny lze generovat alicyklickými kruhy, výhodně cyklohexanovým kruhem, kde jsou aminoskupina a karboxylová skupina uspořádány v 1,4-poloze alicyklického kruhu. Do rozsahu vynálezu rovněž spadají aromatické systémy, například substituované benzoové kyseliny nebo anilinem substituovaná kyselina octová.
Podle vynálezu má na sobě nosič výhodně navázány aminokyseliny zvolené z množiny sestávající z kyseliny tranexamové a EMBOCA.
Chromatografickým materiálem, který lze použít v rámci způsobu podle vynálezu, je například hydrofilní materiál, jakým je například agaróza, celulóza, sklo s řízenou velikostí pórů, silikagely, dextrany nebo organický uměle připravený polymer, například na bázi polyakrylamidů polystyrenů. Typické materiály jsou komerčně dostupné pod obchodními označeními Sephacryl (Pharmacia, Švédsko), Ultragel (Biosepara, Francie), TSK-Gel Toyopearls (Toso Corp., Japonsko), HEMA (Alltech Ass. (Deerfield, II, USA), Eupergit (Rohm Pharma, Darmstadt, Německo). Rovněž lze použít materiály na bázi azlaktonů (3M, St. Paul, Minn, USA). Zvláště výhodným materiálem je agaróza nebo sefaróza. Tyto materiály jsou komerčně dostupné, například od společnosti Sigma, St. Louis.
• · · ·
01-2465-03-Če • · · · · · · • · · ···· · • · · · · · ···· · · • · · · · · · • 9 9 ·· φ
U výhodného provedení se způsob podle vynálezu provádí za použití částicového chromatografického materiálu nebo materiálu, který má formu monolitického bloku. Částicový materiál lze suspendovat ve vhodném médiu a výslednou suspenzi lze použít například v chromatografické koloně. Nicméně způsob podle vynálezu lze rovněž provádět ve vsázce. Dále lze použít polymery ve formě částicového materiálu nebo rovněž ve formě membrán.
Kyselina tranexamová je vázána na nosič výhodně přes linker, zejména bifunkční linker, mezi nosičem a kyselinou tranexamovou. Pokud se použije bifunkční linker, potom může být zvolen z množiny sestávající z nosiče aktivovaného N-hydroxysukcinimidem, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylaminem (DADPA), 1,β-di-aminohexanem, kyselinou sukcinovou, 1,3-diamino-2-propanolem, ethylendiaminem (EDA), TNB, pyridyldisulfidem, jodacetamidem, maleimidem nebo jejich kombinací.
Nosič pro provádění způsobu podle vynálezu je výhodně modifikován zbytkem, který reaguje s primární nebo sekundární aminoskupinou.
Podle způsobu podle vynálezu se směs inkubuje s nosičem po dostatečnou časovou periodu a po uvedení směsi do kontaktu s nosičem, na kterém je navázána kyselina tranexamová, eluuje neutrálním vodným roztokem obsahujícím sodné soli, vápenaté soli a pufrové soli. Následně lze plasmin nebo plasmin(ogen) eluovat vodným roztokem obsahujícím dostatečné množství lysinu nebo jeho ekvivalentu, který konkuruje kovalentně navázané kyselině tranexamové.
• · · ·
01-2465-03-Če ·· · ··· · · · • · · · · · · ···· • · · · · · ···· · · · ···
Předmětem vynálezu je směs odvozená z přírodních zdrojů, která je v podstatě prostá plasmin(ogenu) a plasminu.
Směsí podle vynálezu je zejména krev, krevní derivát nebo krevní frakce a kryoprecipitát.
Krevním derivátem podle vynálezu je zejména z plasmy odvozený faktor srážlivosti krve nebo směs faktorů srážlivosti krve, jakými jsou například FVIII, FIX, fibrinogen, fibronektin, αι-antitrypsin, antithrombin III, von Willebrandův faktor, albumin, imunoglobulin.
Předmětem vynálezu je dále nosič mající na sobě kovalentně navázanou kyselinu tranexamovou. Nosičem podle vynálezu je výhodně chromatografický materiál, výhodněji hydrofilní chromatografický materiál, jakým jsou například dextrany nebo výše zmíněný organický uměle připravený polymer. Zvláště výhodným nosičem jsou agaróza nebo sefaróza, na kterých je navázána kyselina tranexamová.
Chromatografický materiál, který tvoří nosič, může mít formu částicového materiálu nebo monolitického bloku. Druhý jmenovaný je popsán v Hermanson G.T., Mallia A.K. a Smith P.K. 1992 „Immobilization Affinity Ligand Techniques str. 454, Academie Press, lne. San Diego, USA, jehož obsah je zde uveden formou odkazu.
U dalšího výhodného provedení podle vynálezu je kyselina tranexamová vázána na nosič přes linker mezi nosičem a kyselinou tranexamovou. Je výhodné, pokud nosič nemá funkční skupiny, které jsou schopné kovalentně vázat kyselinu tranexamovou. Potom se nosič nejprve funkcionalizuje a následně uvede do reakce s linkerem, který je schopen vázat kyselinu tranexamovou. Ramena neboli • · · ·
01-2465-03-Če řetězce distančního členu jsou molekulami s nízkou molekulovou hmotností, které se použijí jako vmezeřené linkery mezi nosičem nebo matricí a afinitním ligandem, kterým je podle vynálezu aminokyselina mající rigidní strukturu, přičemž aminoskupina je o 0,6 nm až 0,7 nm odsazena od karboxylové skupiny. Pro snadné navázání na ligand a nosič obsahují distanční členy výhodně dvě funkční skupiny na obou koncích. Distančním členem je zpravidla uhlovodíková sloučenina mající na svých koncích dvě funkční skupiny. Jeden ze dvou konců se kovalentně naváže za použití konvenčních nebo o sobě známých reakcí na matrici. Druhý konec se kovalentně naváže na ligand za použití dalšího vazebného postupu.
Výhodně je linkerem bifunkční linker, jakým je například nosič aktivovaný N-hydroxysukcinimidem, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylaminem (DADPA), 1,6-diaminohexanem, kyselinou sukcinovou, 1,3-diamino-2-propanolem, ethylendiaminem (EDA), TNB, pyridyldisulfidem, jodacetamidem, maleimidem nebo jejich kombinací.
Vzhledem ke komerční dostupnosti celé řady funkcionalizováných nosičů může být výhodné použit jako výchozí produkt nosič, který je modifikován zbytkem, který reaguje s primárními nebo sekundárními aminoskupinami.
Způsob podle vynálezu je dále podrobněji popsán na příkladech přípravy v podstatě plasmin(ogenu) prostého kryoprecipitátu, který může být výchozím materiálem pro celou řadu produktů odvozených z krve.
Kryoprecipitát se podrobí afinitní chromatografií s imobilizovaným ligandem, čímž se získá adsorbovaná frakce a
01-2465-03-Če • · • · ♦ · • · ···· ·· · • · · · · · · 9 9 · 9 9 9 9 · • * 9 9 9 9 99 9 9 9 9 • · · · · · · ·· 9 99 9 neadsorbovaná frakce. Látka, kterou adsorbované frakce, je plasmin(ogen).
lze eluovat z
Imobilizovaným ligandem může být libovolný analog, který může reagovat s lysinovými vazebnými místy plasmin(ogenu). Způsob přípravy imobilizovaných ligandů, které lze použít podle vynálezu, bude popsán níže. Následující příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými nároky.
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Imobilizace různých ligandů na bázi ε-aminokarboxylové kyseliny
Za účelem hodnocení odstraňování plasmin(ogenu) z roztoků odvozených z plasmy byla buď připravena, nebo zakoupena řada ligandů (pokud jsou komerčně dostupné) na bázi ε-aminokarboxylové kyseliny v kombinaci s různými distančními členy v několika pryskyřicích. Následující tabulka sumarizuje všechny studované kombinace (čísla pod pryskyřicemi se týkají odstavce, ve kterém je syntéza konkrétní kombinace popsána).
01-2465-03-Če
Tabulka 1
| Ligand Linker | p-Benzamidin | Arginin | Kyselina tranexamová | Kyselina ε-amino- hexanová | Lysin |
| Kyselina N-hydroxy- sukcinová | Sefaróza 4B (1) | ||||
| DADPA | Agaróza 4 % (2) | Agaróza 4 % (3) | Agaróza 4 % (4) | ||
| CNBr | Sefaróza 4B (5) | Sefaróza 4B (6) | |||
| Epoxy | Sefaróza 6B (10) | Sefaróza 6B (7) | Sefaróza 6B (8) | Ceramic Hyper DF (9) |
1) N-Hydroxysukcinimidester kyseliny ε-aminohexanové sefaróza 4B se zakoupila u společnosti Sigma.
2) Výroba p-aminobenzamidinu agarózy 4 %
Následující postup se použil pro imobilizaci diaminodipropylaminu (DADPA) na agaróze 4 % (Pierce), reakce se prováděla na gelu aminem zakončeného distančního členu, který se následně modifikoval anhydridem.
ml DADPA-Agarózového gelu se propláchlo purifikovanou vodou a následně se gel suspendoval ve stejném objemu purifikované vody. Suspenzní směs se pozvolna míchala 1 h při teplotě místnosti a během této doby se přidalo 2,5 g anhydridu kyseliny sukcinové. Na konci míchání se sukcinylovaný gel postupně propláchl purifikovanou vodou, 1M NaCl a opět purifikovanou vodou, s cílem odstranit přebytek nezreagované kyseliny sukcinové.
01-2465-03-Če ·
4 • · · • 44 4 4
4
Negativní test s TNBS (Sigma) naznačil, že veškeré aminy DADPA byly úspěšně blokovány kyselinou sukcinovou.
Imobilizovaný sukcinilovaný DADPA se propláchl 250 ml purifikované vody, potom se přebytek vody odsál a mokrý koláč se přemístil do 500ml kádinky. Gel se resuspendoval ve 25 ml 0,1M MES pufru s pH hodnotou 4,7 a zatímco se pozvolna míchal, přidalo se 0,25 g p-aminobenzamidinu (Sigma) a 0,75 g EDC (Pierce). Po dobu 1 h se pH hodnota reakční směsi udržovala na 4,7 kontinuálním přidáváním 0,5M NaOH. Reakční směs se následně nechala stát přes noc při teplotě místnosti a za kontinuálního pomalého míchání.
Gel se postupně propláchl 0,5 1 každé z následujících látek: purifikovanou vodou, O,1M octanem sodným s hodnotou pH 4,7, 0,5M hydrogenuhličitanem sodným a purifikovanou vodou.
Imobilizovaný p-aminobenzamidin se skladoval až do následného použití v 0,02% azidu sodném při 4 °C.
3) Arginin-agaróza 4 %
Syntéza arginin-agarózy 4 % se výhodně prováděla výše popsaným postupem pro přípravu p-aminobenzamidin-agarózy 4 % (viz 2)).
4) Kyselina tranexamová (TEA)-agaróza 4 %
Syntéza kyseliny tranexamové (TEA)-agarózy 4 % se výhodně prováděla výše popsaným postupem pro přípravu p-aminobenzamidin-agarózy 4 % (viz 2).
01-2465-03-Če • · · »· · • · · · · · * · · ♦ · · · · • · » · · · · · · · · · · • · ♦ © © * • · ♦ © © ·
5) Arginin-sefaróza 4B
Pro imobilizaci argininu nebo kyseliny tranexamové na CNBr-sefaróze 4B (Pharmacia) jako distančním gelu se použil následující postup. Syntézy dvou ligandu při dvou různých koncentracích (10 mmol/ml nebo 0,01 mmol/ml suchého gelu) byly podobné, jak je zmíněno v tomto a následujícím odstavci (5 a 6) .
2,5 g CNBr-Aktivované sefarózy 4B se suspendovalo v 50 ml lmM HCl. Gel se nechal 10 min bobptnat při teplotě místnosti a potom se 15 min proplachoval 500 ml lmM HCl na skleněné fritě.
Arginin se rozpustil ve 12,5 ml vazebného pufru, 0,lM NaHCO3 s pH hodnotou 8,3, který obsahoval 0,514 NaCl. Vazebný roztok obsahující ligand se v umělohmotné zkumavce smísil s gelem a tato zkumavka se následně udržovala přes noc při 4 °C za současného protřepávání nakláněním.
Na konci inkubace se z této směsi vypláchl přebytek ligandu desetinásobným objemem vazebného pufru, vztaženo k objemu gelu, přes skleněnou fritu. Proteinový roztok se ve třech cyklech propláchl 50 ml pufru při střídajících se pH hodnotách (0,lM acetátový pufr s pH hodnotou 4 obsahující 0,514 NaCl a následně 0,lM Tris-HCl pufr s pH hodnotou 8 obsahující 0,5M NaCl). Imobilizovaná arginin-sefaróza 4B se skladovala až do následného použití v 0,02% azidu sodném při 4 °C.
6) Kyselina tranexamová (TEA)-sefaróza 4B
Tato syntéza se prováděla výše popsaným postupem pro arginin-sefarózu 4B (viz odstavec 5) .
01-2465-03-Če • · • · · • · · · ·
7) Arginin-sefaróza 6B
Arginin se ve dvou různých koncentracích (2 mmol nebo 0,2 mmol/ml suchého gelu) navázal na komerčně dostupnou imobilizovanou epoxy-sefarózou 6B (Pharmacia) následujícím postupem:
2,5 g Epoxy-aktivované sefarózy 6B se suspendovalo ve 200 ml purifikované vody. Gel se nechal přibližně 5 min bobtnat při teplotě místnosti a následně se 1 h proplachoval 500 ml purifikované vody přidávané v alikvotních podílech přes skleněnou fritu.
ml Vazebného pufru (0,lM NaHCO3 s pH hodnotou 9,3 a 0,5M NaCl) a zbobtnalý gel se nalilo do dvou zkumavek obsahujících arginin. Směsi se mísily v umělohmotné zkumavce přes noc při teplot místnosti.
Na konci inkubace se ze směsi vypláchl přebytek ligandu pětinásobným objemem vazebného činidla, vztaženo k objemu gelu, přes skleněnou fritu. Produkt se propláchl ve třech cyklech s měnící se pH hodnotou (0,lM acetátový pufr s pH hodnotou 4,0 a 0,5M NaC pufr a následný průplach 0,lM Tris-HCl pufrem s pH hodnotou 8 a 0,5M NaCl). Imobilizovaná arginin-sefaróza 6B se skladovala až do následného použití v 0,02% azidu sodném při 4 °C.
8) Kyselina tranexamová (TEA)-sefaróza 6B
Tato syntéza se výhodně prováděla výše popsaným postupem pro arginin-sefarózu 6B (viz odstavec 7).
• 0 0 0 • ·
01-2465-03-Če
0 · 0 0 0 • 0 · 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0000 0 0 0 0 0 · •0 « 00 « • · 00 0
9) L-Lysin epoxy-aktivovaný Ceramic Hyper DF Hydrogel se zakoupil od společnosti Sigma.
10) p-Aminobenzamidin kovalentně navázaný na sefaróze 6B se zakoupil od společnosti Pharmacia.
Příklad 2
Sledování různých pryskyřic použitých při afinitní chromatografií při odstraňování plasmin(ogenu)
Pro následující studii se použil kryoprecipitát lidské plasmy obsahující 1 IU/ml plasmin(ogenu) a 50 mg/ml fibrinogenu.
Alikvotní podíly zamrazeného kryoprecipitátu se nechaly roztát při 37 °C a dialyzovaly proti pufru BN1 (0,12 M NaCl, 10 mM Tri Na-citrát, 1 mM CaCl2 při pH hodnotě 7,0). Tento proteinový roztok se přefiltroval přes filtr mající hloubku 5 pm, čímž se získal čirý roztok. 5ml Válec injekční stříkačky o průměru 8,36 mm se naplnil
1,5 ml (objem za mokra) následujících afinitních pryskyřic popsaných v příkladu 1: imobilizovaná kyselina ε-aminohexanová (sefaróza 4B využívající CNBr jako distanční člen), imobilizovaný p-aminobenzamidin/arginin/TEA (agaróza 4 % používající DADPA jako distanční člen), imobilizovaný arginin/TEA (sefaróza 4B používající CNBr jako distanční člen), imobilizovaný arginin/TEA (sefaróza 6B používající epoxy jako distanční člen) a imobilizovaný L-lysin (Ceramic Hyper DF Hydrogel používající epoxy jako distanční člen). Gelová náplň se optimalizovala následujícím postupem: gelová náplň se propláchla čtyřmi objemy i) purifikované
01-2465-03-Če ··©··· ·· · ·· · * · · · · · · © · • ♦ · · · © · · · · · • · * · · · ··©· · © © ··· • · · ··© © · © ·© © ·· · ·© © vody, ii) 1 M NaCl, iii) purifikované vody, iv) TLN 0,1 pufru (Tris 0,05 M lysin 0,02 M, 0,1 M NaCl, pH hodnota 9,0), v) TLN 1 pufru (Tris 0,05 M, lysin 0,02 M a 1 M NaCl, pH 9,0) a vi) purifikované vody. Všechny vzorky, koncentrace a průplachové pufry se aplikovaly na válec stříkačky po 1 min odstřeďování při frekvenci otáčení 1000 min'1 při 25 °C. Vyvážení se provedlo čtyřmi objemy BN1 a předfiltrovaný zahuštěný kryoprecipitát se nanesl na pryskyřici (2:1 obj./obj.) a tato směs se potom 1 h inkubovala při teplotě místnosti. Alikvotní podíly nenavázaných „spin průplachů se po každém odstřeďování shromažďovaly v umělohmotných zkumavkách. Pryskyřice se propláchla alespoň 13 objemy kolony BN1 pufru až do dosažení O.D28o 0,02. Eluce plasmin(ogenu) se prováděla za použití TLN 1 pufru a následným propláchnutím čtyřmi objemy vrstvy 3 M NaCl. Minikolony se těsně uzavřely a skladovaly při 4 °C.
Pryskyřice, které během procesu degradovaly nebo které odstranily méně než 50 % plasmin (ogenu) , se ze studie brzy vyloučily. Výsledky jsou shrnuty v tabulce 2.
♦ · ♦ « · ·
01-2465-03-Če • · ·· · ·
Tabulka 2: Odstranění plasmin(ogenu) v navázaném materiálu využívajícím různé imobilizované ligandy BN1 pufrem
| Imobilizované ligandy | Odstranění plasmin(ogenu) (%) |
| Kyselina ε-aminohexanová využívající CNBr jako distanční člen | 13,36 |
| p-Aminobenzamidin využívající DADPA jako distanční člen | Žádné (kolona byla ucpaná) |
| p-Aminobenzamidin využívající epoxy jako distanční člen | 19,78 |
| Arginin využívající DADPA jako distanční člen | 6,04* |
| TEA (vysoká konc.) využívající CNBr jako distanční člen | 0 |
| TEA (nízká konc.) využívající CNBr jako distanční člen | 0 |
| Arginin (nízká konc.) využívající CNBr jako distanční člen | 23,25 |
| Arginin (nízká konc.) využívající epoxy jako distanční člen | 0 |
| Arginin (vysoká konc.) využívající epoxy jako distanční člen | 5,61 |
* Tento údaj je průměrnou hodnotou tří měření
Výše uvedená tabulka ukazuje, že nej lepší ligandy pro odstranění plasmin(ogenu) z kryoprecipitátu obsahovaly afinitní gely, které byly dostatečně objemné proto, aby odolaly sledu nanesení, průplachů a eluce bez zborcení nebo gely, které zachytily více než 50 % použitého fibrinogenu.
Tabulka 3 ukazuje jak účinnost různých typů gelů při odstraňování plasmin(ogenu), tak jejich účinnost při zachycení fibrinogenu v zahuštěném kryoprecipitátu.
01-2465-03-Če
ΦΦ ···· • Φ φ • φ φφφ • φ φ φ φφφ φ φφφφ φ φ φ φφφφ • · φ φφφ φφ φ φφ φ φφ φ
Reziduální plasmin(ogen) přítomný v kryoprecipitátu se adsorboval pryskyřicemi, zatímco fibrinogen nikoliv, a tak se získal výsledný supernatant v podstatě prostý plasmin(ogenu).
Obsah fibrinogenu se měřil testem doby srážlivosti, zatímco obsah plasmin(ogenu) se měřil chromogenním testem.
Vypočtená množství plasmin(ogenu) a fibrinogenu izolovaná z lysinových gelů sloužila jako zlatý standard pro všechny další použité gelové ligandy. Výsledky obsažené v tabulce 2 naznačují, že pouze TEA ligandy s epoxy distančním členem poskytly vynikající výsledky při odstraňování plasmin(ogenu) a při izolaci fibrinogenu (viz tabulka 3).
Vysoká koncentrace imobilizované TEA poskytla vynikající výsledky při odstranění plasmin(ogenu) a podobně dobré výsledky při izolaci fibrinogenu jako ligand navázaný na lysin: 89 % vs. 92 % pro izolaci fibrinogenu a 89 % vs. 56 % pro odstranění plasmin(ogenu). Účinnost všech ostatních pryskyřic, jak při odstraňování plasmin(ogenu) tak při izolaci fibrinogenu byla mnohem nižší.
01-2465-03-Če •9 ···· ·· 9 ·
9 9 • 9 9 9 •9 9 999
9 9
9
Tabulka 3: Souhrn dat získaných pro izolaci fibrinogenu a odstranění plasmin(ogenu) v navázaném materiálu používajícím různé imobilizované ligandy BNI pufrem
| Imobilizované ligandy | Odstranění plasmin(ogenu) (%) | Izolace fibrinogenu (%) |
| Lysin používající epoxy jako distanční člen | 56* | 92* |
| TEA používající DADP jako distanční člen | 49 | 84 |
| TEA (nízká konc.) používající epoxy jako distanční člen | 44,35 | 88,62 |
| TEA (vysoká konc.) používající epoxy jako distanční člen | 89 | 89 |
| Arginin (vysoká konc.) používající CNBr jako distanční člen | 91,26 | 49 |
* Tato hodnota je průměrem tří měření
Příklad 3
Vliv pufrového fosfátu a BNI na profil afinitní chromatografie lysinem a TEA-imobilizované pryskyřice
Kryoprecipitát se ošetřil hydroxidem hlinitým s cílem adsorbovat faktory srážlivosti závislé na vitaminu K a následně se 4 h inkuboval se směsí detergentních rozpouštědel (SD-1 % Tri (n-butyl)fosfát, 1 % Triton X-100) při 30 °C, čímž se inaktivovaly viry s lipidovou obálkou. SD Reakční činidla se odstranila extrakcí ricinovým olejem a hydrofobní interakční chromatografií a přípravek se následně pasterizoval (10 h při 60 °C) v přítomnosti sacharózy a glycinu jako stabilizátorů.
·· ··<·
01-2465-03-Če ϊ ί . ί ϊ Ϊ.Χ. .
• · · · · · ·· · ·· ·
Po pasterizaci se sacharóza a glycin odstranily diafiltraci. Před sterilní filtrací se přidala kyselina tranexamová (TEA) a arginin hydrochlorid jako stabilizační činidla. Alikvotní podíly stabilizovaného produktu se udržovaly až do svého použití při -30 °C.
Alikvotní podíly zamrazeného virově inaktivovaného kryoprecipitátu se nechaly roztát při 37 °C a dialyzovaly proti pufru BN1 (pufr byl tvořen 0,12 M NaCl, 0,01 M Tri Na-citrát, 1 mM CaCl2 při pH hodnotě 7,0) nebo alternativně proti 25 mM fosfátového pufru. Druhý zmiňovaný roztok se přefiltroval přes filtr s hloubkou 5 pm a poskytl čirý roztok.
Kolona o průměru 10 mm (Biorad, USA) se naplnila 6 ml (objem za mokra) imobilizované TEA (TEA sefaróza 6B) nebo imobilizovaného lysinu (Ceramic Hyper DF/sefaróza 4B) a propláchla čtyřmi objemy každého z následujících roztoků v daném pořadí: i) purifikovaná voda, ii) 1M NaCl, iii) purif ikovaná voda, iv) TLN 0,1 pufr (0,1 M NaCl, lysin 0,02 M, Tris 0,05 M při pH hodnotě 9,0), v) TLN 1 pufr (1 M NaCl, lysin 0,02 M, Tris 0,05 M při pH hodnotě 9) a vi) purifikovaná voda. Rovnováhy se dosáhlo použitím čtyř objemů BN1 nebo alternativně fosfátového pufru. Přefiltrovaný kryoprecipitát se zaváděl do kolony rychlostí 100 μΐ/min.
Vzorky nenavázaného materiálu se j ímaly do umělohmotných zkumavek a pryskyřice se propláchla 16 objemy kolony BN1 pufru nebo fosfátového pufru. Eluce plasmín (ogenu) se prováděla za použití TLN 1 pufru a za následného propláchnutí čtyřmi objemy 3M roztoku NaCl, čtyřmi objemy purifikované vody a čtyřmi objemy 25% roztoku ethanolu obohaceného 1 M NaCl.
·· ··»· ·· ·
01-2465-03-Če ϊ ί .* . ί ί ί.ί. .
• · · · * · ·· · 99 9
Tabulka 4 ilustruje účinnost při odstraňování plasmin(ogenu) různými druhy pryskyřic a účinnost při izolaci fibrinogenu. Obsah fibrinogenu se měřil testem doby srážlivosti (Claussův test), zatímco obsah plasmin(ogenu) se měřil chromogenním testem.
Porovnání různých pryskyřic naznačilo, že pokud se použije BN1 pufr, potom dochází k zachycení 95,4 % až 96,4 % obsahu fibrinogenu v nenavázaném píku. Naopak, pokud se použije fosfátový pufr, potom je množství izolovaného fibrinogenu nízké. Překvapivě se zjistilo, že pouze imobilizovaná TEA pryskyřice umožňuje jak vysoké odstranění plasmin(ogenu), tak vysokou izolaci fibrinogenu.
Výsledky získané při použití lysinové pryskyřice rovněž demonstrují zvýšení účinnosti při použití BN1 pufru v porovnání s fosfátovým pufrem.
Tabulka 4: Souhrn dat získaných při testování izolace fibrinogenu a plasmin(ogenu) za použití imobilizovaných pryskyřic a buď BN1 pufru, nebo fosfátového pufru
| Imobilizované ligandy | Odstranění plasmin (ogenu) (%) | Izolace f ibrinogenu (%) |
| TEA (vysoká konc.) epoxy + BN1 pufr | 77,1 | 96,4 |
| Lysin-epoxy + BN1 pufr | 68,87 | 95,4 |
| Lysin-epoxy + fosfátový pufr | 100 | 66,9 |
| Lysin CNBr + BN1 pufr | 62,5 | 121,8 |
| Lysin CNBr + fosfátový pufr | 100 | 62,2 |
01-2465-03-Če • φ φφφ φφφφ φφ · φφ ♦ · · φ φ φφφφ φ · • * φ φ φ φ « φ φ φ • · φ φ φ φ φφ φ φφ φ
Příklad 4
Alikvotní podíly zamrazeného virově inaktivovaného kryoprecipitátu se nechaly roztát při 37 °C a dialyzovaly proti pufru BN1 (0,12 M NaCl, 0,01 M Tri Na-citrát, 1 mM CaCl2 při pH hodnotě 7,0) nebo alternativně proti 25 mM fosfátového pufru. Druhý jmenovaný roztok se přefiltroval přes filtr o hloubce 5 pm, s cílem odstranit nerozpustné látky.
Kolona o průměru 26 mm (Pharmacia, Švédsko) se naplnila 50 ml (objem za mokra) imobilizované TEA (TEA sefaróza 6B) a propláchla čtyřmi objemy purifikované vody a stejným objemem TLN 0,1 pufru (0,1 M NaCl, lysin 0,02 M, Tris 0,05 M při pH hodnotě 9,0), TLN 1 pufru (1 M NaCl, lysin 0,02 M, Tris 0,05 M při pH hodnotě 9) a purifikované vody. Rovnováhy se dosáhlo čtyřmi objemy BN1 pufru (NaCl, Tri Na-citrát, CaCl2 při pH hodnotě 7,0) a přefiltrovaný BAC se vedl kolonou rychlostí 700 μΐ/ml.
Vzorky nenavázaného materiálu se jímaly do umělohmotné nádoby a pryskyřice se propláchla alespoň třemi objemy BN1 pufru, vztaženo k objemu gelu. Eluce plasmin(ogenu) se prováděla za použití TLN 1 pufru a následného propláchnutí 3 M NaCl.
Nenavázané frakce získané ve dvou bězích se sloučily a udržovaly při 4 °C až do zahuštění. Nakonec se BAC zahustil přibližně na svůj původní objem diafiltrací za použití membrány 100 „cut-off a proti pufru B1 (glycin, NaCl, Tri Na-citrát, CaCl2 při pH hodnotě 7) a následnou filtrací přes 0,45pm filtr. Do filtrátu se přidala 2 % argininu.
·· ····
01-2465-03-Če • · φ φ φ • · · • Φ Φ
ΦΦ ·
9Φ Φ Φ Φ · • 9 9 · · Φ 99·· · · ·
·· · • 9 9 φφφ • · · φ · · · · · ·
Pro účely stabilizačních testů se výsledný produkt sterilně přefiltroval přes 0,2pm filtr.
Jak naznačuje tabulka 5, použití větší a delší kolony zvýšilo účinnost TEA ligandu tak, že se izolovalo 100 % fibrinogenu a množství odstraněného plasmin(ogenu) bylo nižší než množství plasmin(ogenu) detekovatelné chromogenním testem.
Porovnání produktu před a po diafiltraci odhalilo ztrátu 33 % obsahu fibrinogenu. Tento jev lze vysvětlit technickými problémy, které se objevují pouze v laboratorním měřítku. Imobilizovaná TEA pryskyřice poskytla nepochybně vynikající výsledky jak při odstraňování plasmin(ogenu), tak při izolaci fibrinogenu.
Tabulka 5: Souhrn dat získaných při testování fibrinogenu a plasmin(ogenu) izolovaných v nenavázaném píku (každá hodnota je průměrem dvou měření)
| Vzorek | Izolace fibrinogenu (%) | Izolace plasmin(ogenu) (%) |
| Po naplnění | 100 | 0 |
| Po naplnění a diafiltraci | 66,2 | 0* |
* Izolace plasmin(ogenu) po 3,7násobném zahuštění sloučených vzorků
Žádná reziduální TEA nebyla nalezena ani v eluovaném proteinovém roztoku ani v zahuštěném ultrafiltrovaném produktu. Analýza reziduální koncentrace kyseliny tranexamové se prováděla pomocí HPLC.
Za použití stejné pryskyřice a výše popsaných podmínek (příklad 4) se provedly čtyři další běhy odstraňování plasmin(ogenu). Obecně lze říci, že výsledky dosažené u ·* ···· • · • · · • ···· získaným a ·· · • · · • · · · * · · ···· • · · ·· · v eluovaném
01-2465-03-Če ! J • · ·· všech testovaných vzorků byly podobné prvním výše diskutovaným výsledkům.
Žádná reziduální TEA nebyla nalezena ani proteinovém roztoku ani v zahuštěném ultrafiltrovaném produktu. Analýza reziduální koncentrace kyseliny tranexamové se prováděla pomocí HPLC.
Při testování na krysím modelu nebyly u proužků před odstraněním plasmin(ogenu) ani po jeho odstranění pozorovány žádné adheze.
U kryoprecipitátu se před a po odstranění plasmin(ogenu) určovala degradace za inkubace při teplotě místnosti. Údaje uvádějící procenta srážlivých proteinů (pomocí UV absorbance) na různých vzorcích uvádí tabulka 6.
Tabulka 6: Procento srážlivého proteinu po inkubaci dvojitě virově inaktivovaného zahuštěného kryoprecipitátu před a po odstranění plasmin(ogenu) epoxy sefarózou 6B ligovanou na kyselině tranexamové při teplotě místnosti
| Inkubační doba (týdny) | ||
| 0 1 | 2 3 4 5 6 | |
| Před ošetřením | 62,91 0 | 0 0 0 0 0 |
| Po ošetření | 73,44 70,80 | 68,24 65,69 63,69 63,84 62,46 |
Testy stability se prováděly za použití proužků připravených z kryoprecipitátu před a po odstranění plasmin(ogenu), které se inkubovaly při 37 °C v přítomnosti pufru. Tyto proužky se ošetřily přidáním nebo vypuštěním glycinu a/nebo argininu. Výsledky jsou shrnuty v níže uvedené tabulce 7.
• · · · • · • · · • · · ·
01-2465-03-Če
Tabulka 7: Degradační doba u proužků před a po odstranění plasmin(ogenu)
| Formulace | Degradační doba proužku (dny) | ||||||
| 0 | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | |
| Před ošetřením | ++ + | ||||||
| Před ošetřením +2% arginin | +++ | - | — | — | — | ||
| Před ošetřením + 2% arginin + 1% glycin | +++ | - | - | - | - | - | - |
| Po ošetření | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | - |
| Po ošetření + 2°% arginin + 1 % glycin | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ | - |
+++ Tato data znamenají existenci proužku - Tato data znamenají degradaci proužku
1. Studie popsané v následujících příkladech se prováděly na kryo-deficitní sloučené čerstvé zamražené plasmě odebrané normálním zdravým dárcům. V důsledku vysoké koncentrace antiplasminu a malého množství plasminu u normálních zdravých dárců (1) nelze plasmin detekovat pomocí funkčního (chromogenního) testu (Schreiber
A.D., Kaplan A.P., Austen K.F. Plasma inhibitors of the components of the fibrinolytic pathway, man. J. Clin. Invest 52: str. 1394 až 1401, 1973) . Je možné demonstrovat odstranění, purifikaci a izolaci plasminu vzorků plasmy zdravého dárce z TEA pryskyřice. Nicméně komerční ELISA kit pro detekci velmi nízkých množství Glu-plasmin(ogenu) a, jak se zjistilo v předcházejících studiích, i TEA pryskyřice má stejnou afinitu pro obě formy plasmin(ogenu), a stejně tak pro plasmin • · « ·
01-2465-03-Če (Fredenburgh J.P., Nesheim M.E. Lys-plasmin(ogen) is a significant itermediate in the activation of Gluplasmin(ogen) during fibrinolysis in vitro, J. Biol.
Chem. 267, str. 26150 až 26156, 1992 a Miyashita C. ,
Wenzel E., Heiden M. Plasmin(ogen): a brief introduction into ist biochemistry and function, Haemostasis 1: str. 7 až 13, 1988.)
2. Měření Glu-plasmin(ogenu) lze tedy použít jako indikátor celkového množství plasmin(ogenu) v plasmě.
• 0000 0 0 0 0000
Příklad 5
Chromatografický krok
Tyto studie se prováděly ve snaze stanovit účinnost imobilizované TEA na sefaróze 4FF při odstraňování plasmin(ogenu) z kryo-deficitní čerstvé zamražené plasmy (FFP) obsahující 1 IU/ml plasmin(ogenu). Alikvotní podíly kryo-deficitní čerstvě zamražené plasmy se nechaly roztát při 37 °C a filtrovaly přes filtr mající hloubku 3 pm ve snaze odstranit nerozpustné proteiny.
Kolona o průměru 10 mm (Pharmacia, Švédsko) se naplnila 2 ml (objem za mokra) imobilizované TEA a propláchla čtyřmi objemy purifikované vody a stejným objemem TLN-0,1 pufru (0,lM NaCl, lysin 0,02M, Tris 0,05M při pH hodnotě 9,0), TLN-1 pufru (1M NaCl, lysin 0,02M, Tris 0,05M při pH hodnotě 9,0) a purifikované vody. Rovnováha se vytvořila použitím čtyř objemů BN1 pufru (0,12M NaCl, 0,01M Tri Na-citrát, lmM CaCl2 při pH hodnotě 7,0) a přefiltrovaná plasma (přibližně
IU • · · ·
01-2465-03-Če • · · · · · · • · · · · · * · · · · • · · · · ······· · ···· ··· · · · ··· • · · · · · · · · plasmin(ogenu)) se vedla skrze kolonu při rychlosti ml/min.
Protékající materiál se jímal a zamrazil v umělohmotné lahvi a pryskyřice se propláchla alespoň třemi objemy BN1 pufru, vztaženo k objemu kolony. K eluci plasmin(ogenu) se použil TLN-1 pufr a následný průplach přibližně třemi objemy 3M NaCl-roztoku, dvěma objemy purifikované vody a dvěma objemy 2 0 % ethanolu + 1 M NaCl (metoda 1) . U druhé metody (metoda 2) se použil stejný postup jako v případě metody 1, ale doplnil se dalším průplachem 3 M NaCl, který předcházel eluci plasmin(ogenu).
Analytické testy
Test detekce Glu-plasmin(ogenu)
Imunclone Glu-plasmin(ogen) ELISA kit (American Diagnostica, Greenwich, CT, USA), použitý v těchto experimentech, je enzym vážící sendvičový imunotest specifický pro detekci přirozených hladin lidského Glu-plasmin(ogenu). Kvantitativní mezní hodnota tohoto testu (podle nejnižší standardní kalibrační křivky) v plasmě nebo v derivátech plasmy je 0,063 pg/ml.
Aktivita plasminu
Fibrinolytický test se prováděl s cílem semikvantifikovat aktivitu plasminu v eluátech. Stručně řečeno, plasmin(ogenu) prostý fibrinogen (Enzyme Research) se inkuboval s různými koncentracemi normální odebrané plasmy (Unicalibrator, Stago) nebo purifikovaného plasmin(ogenu) ······ ··· ·· · • 9 · · ·
9 9999 999
| 01-2465-03-Če | 9 9 9 9 9 9 33 | 9 9 999 9 999 9 999 9999 99 9 9999 9 99 9 99 9 |
| eluovaného z | afinitních kolon v přítomnosti | přebytku |
| streptokinázy. | Čas, po kterém byla degradace | sraženiny |
| kompletní, se | zaznamenal a porovnal s časem | kompletní |
degradace sraženiny vzorku.
Určení proteinu
Celkový protein se testoval za použití Bradfordovy metody (Bradford M.M. A rapid and sensitive method for quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding, Anal. Biochem. 72: str. 248 až 254, 1976). Tabulky 8a a 8b ukazují výsledky chromatografického odstranění a purifikace
Glu-plasmin(ogenu) TEA ligandem. Tabulka 8a shrnuje získané výsledky týkající se purifikace plasmin(ogenu). Tato tabulka ukazuje, že metoda 2 má o něco lepší výsledky při purifikaci plasmin(ogenu) než metoda 1 při 567násobné purifikaci a výtěžku 91,6 %. Tabulka 8b ukazuje, že se z nenavázané frakce odstranilo průměrně 99,5 % plasmin(ogenu), což většinou odpovídá množství izolovanému v eluátu (tabulka 8a) .
01-2465-03-Če • · · · · · • · · · « ► · » · « > · · » · · • · ·
Tabulka 8a: Vliv dalšího průplachu TEA pryskyřice 3M chloridem sodným (metoda 1 vs. metoda 2) na specifickou aktivitu, purifikaci a izolaci plasmin(ogenu) z plasmy
| Metoda 1 | Metoda 1 | Metoda 2 | Metoda 2 | |
| Frakce | Výchozí materiál | Eluát | Výchozí materiál | Eluát |
| Objem (ml) | 40 | 13,2 | 40 | 20 |
| Protein (mg/ml) | 46,96 | 0,291 | 55,41 | 0,180 |
| Glu-plasmin (ogen) | 65,4 | 18,2 | 78,0 | 142,9 |
| Plasmin (ogen) (IU/ml) | neprováděno | -0,5 | -1 | |
| Specifická aktivita(mg plasmin(ogenu)/mg proteinu) | 0,0014 | 0,625 | 0,0014 | 0,794 |
| Purifikační faktor | 446 | 567 | ||
| Izolace plasmin (ogenu) | 91,8 | 91,6 |
Tabulka 8b: Odstranění plasmin(ogenu) z plasmy (průměr výsledků pro dvě metody)*
| Metoda | Chromato- grafická frakce | Glu-plasmin (ogen) (průměr, pg/ml) | Objem (průměr, ml) | Odstranění plasmin(ogenu) (%) |
| 1 & 2* | Plasma | 71,7 | 40,0 | 99,5 |
| Nenavázaná frakce | 0,18 | 83,5 |
* Metody 1 a 2 jsou identické a zahrnují jímání nenavázané (protékající) frakce.
01-2465-03-Ce ·· ·
Příklad 6
Vliv chromatografických podmínek na účinnost imobilizovaného-lysinového ligandu při afinitní purifikaci plasmin(ogenu)
Chromatografický krok
Afinitní purifikace používající pryskyřici s imobilizovaným-lysinovým ligandem se testovala za použití dvou komerčně dostupných lysinových pryskyřic. Použila se chromatografická metoda zdokumentovaná v literatuře (viz Robbins K.C., Summaria L. Plasmin(ogen) and Plasmin. Methods Enzymol. 45: str. 257 až 273, 1976., pro níže popsanou metodu 2) a rovněž metoda, která byla vyvinuta v laboratoři vynálezců (níže popsaná metoda 1).
Do kolon o průměru 10 mm (Pharmacia, Švédsko) se umístily dvě imobilizované lysinové pryskyřice (Ceramic Hyper DF vyráběná společností Biosepra a sefaróza 4B vyráběná společností Pharmacia) . Každá kolona obsahovala 2 ml (objem za mokra) pryskyřice.
Alikvotní podíly kryo-deficitní čerstvé zamrazené plasmy se nechaly roztát při 37 °C a přefiltrovaly přes filtr mající hloubku 3 pm za vzniku čirého roztoku.
Chromatografický krok se prováděl za použití jedné z následujících metod.
Metoda 1
Kolona se propláchla čtyřmi objemy každého z následujících roztoků: 1) purifikovanou vodou, 2)
01-2465-03-Če • · ··· φφφ • * · · · · φ · · φ • · * · ♦ ···· · φ φ φφφ • · φ · · φ φ φ ·
TLN-0,1, 3) TLN-1 a 4) purifikovanou vodou. Rovnováha se vytvořila pomocí čtyř objemů BN1. Přefiltrovaná plasma (40 ml) se do kolony zaváděla rychlostí 1 ml/min. Vzorky protékajícího materiálu se jímaly do umělohmotných lahví a pryskyřice se propláchla BN1 pufrem. Eluce plasmin(ogenu) se prováděla pomocí TLN-1 pufru a pomocí následného průplachu 3 M NaCl roztokem, dvěma objemy purifikované vody a dvěma objemy 20 % ethanol + 1 M NaCl.
Metoda 2 (ref. 5)
Alikvotní podíly kryo-deficitní čerstvé zamrazené plasmy (40 ml) se přefiltrovaly přes filtr mající hloubku 3 pm. Do 40 ml přefiltrované plasmy se přidaly 4 ml 0,5M Tris, 0,2M lysinu, 1M NaCl pufru při pH hodnotě 9.
Kolona se propláchla čtyřmi objemy purifikované vody a rovnováhy se dosáhlo přidáním 0,1 M fosfátového pufru při pH hodnotě 7,4. Naředěná plasma protékala pryskyřicí rychlostí 1 ml/min. Vzorky nenavázaného materiálu se jímaly v umělohmotných lahvích a pryskyřice se proplachovala 0,lM fosfátovým pufrem při pH hodnotě 7,4 až do okamžiku, kdy absorbance vytékajícího proudu při 280 nm dosáhla základní linie. Plasmin(ogen) se následně eluoval 0,2M kyselinou ε-aminokapronovou rozpuštěnou v 0,lM fosfátovém pufru při pH hodnotě 7,4 a jímal do umělohmotné nádoby. Po eluci následoval průplach přibližně dvěma objemy 3M NaCl roztoku a purifikované vody.
Tabulky 9a a 9b porovnávají odstranění a purifikaci plasmin(ogenu) pomocí dvou různých komerčně dostupných imobilizovaných-lysinových pryskyřic a dvou různých purifikačních metod. Ačkoliv byl zjištěn relativně malý • ©
01-2465-03-Če rozdíl při izolaci plasmin(ogenu) z eluátů (tabulka 9a), je patrné, že při použití metody 2 a pryskyřice Ceramic Hyper DF se dosáhlo mnohem vyšší purifikace plasmin(ogenu).
Výsledky ukazují, že použití pryskyřice Lys-Ceramic Hyper DF a chromatografické metody 2 poskytuje 444násobnou purifikaci. Navíc většina plasmin(ogenu) se izolovala v píkových frakcích (76,5 % v nenavázané frakci + 10,9 % v eluátu a pouze přibližně 10 % zavedeného plasmin(ogenu) nebylo započteno). Nicméně z nenavázané frakce se odstranilo pouze 23,5 % plasmin(ogenu).
Tabulka 9a: Specifická aktivita, purifikační faktor a izolace plasmin(ogenu) z plasmy za použití dvou různých komerčně dostupných imobilizovaných-lysinových pryskyřic a dvou různých chromatografických metod
| Frakce | Metoda 1 | Metoda 2 | ||||
| Náplň | Eluát | Náplň | Eluát | |||
| Ceramic Hyper DF | Sefaróza 4B | Ceramic Hyper DF | Sefaróza 4B | |||
| Objem (ml) | 40 | 8,1 | 7,2 | 40 | 8,2 | 9,8 |
| Protein (mg/ml) | 55,94 | 0,347 | 0,345 | 60,05 | 0,0719 | 0,672 |
| Glu- -plasmin (ogen) (pg/ml) | 65,4 | 40,3 | 41,9 | 60,8 | 32,2 | 19,9 |
| Specifická aktivita (mg plasmin (ogenu) / mg proteinu) | 0,0012 | 0,116 | 0,121 | 0,001 | 0,444 | 0,030 |
| Purifikační faktor | 97 | 101 | 444 | 30 | ||
| Izolace (%) | 12,5 | 11,6 | 10,9 | 8,2 |
0 ···· • 0 • •t
0 0 0
01-2465-03-Če
Tabulka 9b: Odstranění plasmin(ogenu) z nenavázaných píků pro obě metody
| Metoda | Použitá pryskyřice | Chromato- grafická frakce | Objem (ml) | Glu- -plasmin (ogen) pg/ml | Celkem Glu- -plasmin (ogen) (pg) | Odstranění plasmin (ogenu) (%)* |
| 1 | Ceramic Hyper DF | Plasma | 40 | 65,4 | 2616 | 54,6 (45,4) |
| Nenavázaná | 72 | 16,5 | 1188 | |||
| Sefaróza 4B | Plasma | 40 | 65,4 | 2616 | 58,0 (42,0) | |
| Nenavázaná | 82 | 13,4 | 1099 | |||
| 2 | Ceramic Hyper DF | Plasma | 40 | 60,8 | 2432 | 23,5 (76,5) |
| Nenavázaná | 89 | 20,9 | 1860 | |||
| Sefaróza 4B | Plasma | 40 | 60,8 | 2432 | 33,0 (67,0) | |
| Nenavázaná | 91 | 17,9 | 1629 |
* Hodnoty v závorkách reprezentují plasmin(ogen) izolovaný z nenavázaného píku
Claims (31)
- PATENTOVÉ NÁROKY • · ·1. Způsob specifického odstraňování nebo izolace plasmin(ogenu) nebo plasminu v přítomnosti fibrinogenu ze směsi obsahující plasmin(ogen) nebo plasmin, vyznačující se tím, že se směs uvede do kontaktu s rigidní aminokyselinou, kde jsou aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny od sebe odsazeny o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodně o 0,7 nm, a rigidní aminokyselina je kovalentně navázána na nosič přes aminoskupinu aminokyseliny.
- 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že směs se zvolí z množiny sestávající z tělních tekutin, jakými jsou například krev, krevní frakce, kryoprecipitát, buněčné kultury, extrakty živočišných tkání, jakými jsou například bovinní plíce, bovinní střeva nebo želatina extrahovaná ze zvířecích kostí, albumin bovinního séra, a stejně tak živočišné s vodou mísitelné tuky, jakým je například lanolin (PC-fosfatidylcholin).
- 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nosičem je chromatografický materiál.
- 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že na nosič je navázána rigidní aminokyselina, kde jsou aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny vzájemně odsazeny o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodně o 0,7 nm.• ·· · * · · · • · · · · Φ ···· · · ···· • · · · • ·· ·01-2465-03-Če
- 5. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že chromatografickým materiálem je hydrofilní materiál, jakým jsou například agaróza, celulóza, sklo s kontrolovanými póry, silikagely, dextrany nebo organický uměle připravený polymer, například na bázi polyakrylamidů polystyrenů.
- 6. Způsob podle nároku 3, vyznačuj ící se tím, že chromatografickým materiálem je agaróza nebo sefaróza.
- 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že chromatografickým materiálem je částicový materiál nebo materiál ve formě monolitického bloku.
- 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující rigidní aminokyselina je navázána na nosič nosičem a kyselinou tranexamovou.se tím, že přes linker
- 9. Způsob podle nároku linkerem je bifunkční linker.8, vyznačuj ící se tím, ze
- 10. Způsob podle nároku 9, vyznačující se tím, že se bifunkční linker zvolí z množiny sestávající z nosiče aktivovaného N-hydroxysukcinimidem, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylaminem (DADPA), 1,6-diaminohexanem, kyselinou sukcinovou, 1,3-diamino-2-propanolem, ethylendiaminem (EDA), TNB, pyridyldisulfidem, jodacetamidem, maleimidem nebo jejich kombinací.00 0 · 0 ·00 0 • 0 · • 0 0 00 0 00 0 • 0001-2465 - 03-Če • · • 000 • ·0 0 • · 0 0 0
- 11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že nosič je modifikován zbytkem, který reaguje s primární nebo sekundární aminoskupinou.
- 12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že po uvedení směsi do kontaktu s nosičem, na kterém je navázána kyselina tranexamová, se směs inkubuje s nosičem po časovou periodu dostatečnou pro navázání plasmin(ogenu) nebo plasminu a eluuje neutrálním vodným roztokem obsahujícím sodné soli, vápenaté soli a pufrové soli.
- 13. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že po kontaktování směsi se plasmin nebo plasmin(ogen) eluuje vodným roztokem obsahujícím dostatečné množství ligandu konkurujícího plasmin(ogenovým) vazebným místům na rigidní aminokyselině navázané na nosiči.
- 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že ligandem je lysin.
- 15. Směs odvozená z přírodních zdrojů, která je v podstatě prostá plasmin(ogenu).
- 16. Směs podle nároku 15, vyznačující se tím, že je krevním derivátem, krví nebo krevní frakcí nebo kryoprecipitátem.01-2465-03-Če ·· 9999 99 · •9 · · · 9 • · 9 9 · · · • · 9 9 9 · 9999 •9 9 · · · • 9 99 9 9 • · 9 99 9 9999 9 9
- 17. Směs podle nároku 16, vyznačující se tím, že krevním derivátem je z plasmy odvozený faktor srážlivosti krve nebo směs faktorů srážlivosti krve, albumin, imunoglobulin, fibrinogen, fibronektin, ai-antitrypsin, anti-thrombin III a von Willebrandův faktor.
- 18. Frakce obsahující plasmin(ogen) a/nebo plasmin získatelná způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14.
- 19. Nosič, vyznačující se tím, že má na sobě kovalentně navázanou rigidní aminokyselinu, kde jsou aminoskupina aminokyseliny a karboxylová skupina aminokyseliny od sebe vzdáleny o 0,6 nm až 0,8 nm, výhodně o 0,7 nm.
- 20. Nosič podle nároku 19, vyznačující se tím, že se aminokyselina zvolí z množiny sestávající z kyseliny tranexamové a kyseliny 4-aminomethylbicyklo[2.2.2]oktan-1-karboxylové.
- 21. Nosič podle nároku 19 nebo 20, vyznačující se tím, že je vyroben z chromatografického materiálu.
- 22. Nosič podle nároku 19, vyznačující se tím, že chromatografickým materiálem je hydrofilní materiál, jakým je například agaróza, celulóza, sklo s řízenými póry, ·· ··· ·01-2465-03-Če silikagely, dextrany nebo organický uměle připravený polymer, například na bázi polyakrylamidů polystyrenů.
- 23. Nosič podle nároku 19, vyznačující se tím, že chromatografickým materiálem je agaróza nebo sefaróza.
- 24. Nosič podle nároku 19, vyznačující se tím, že chromatografickým materiálem je částicový materiál nebo materiál ve formě monolitického bloku.
- 25. Nosič podle nároku 19, vyznačující se tím, že kyselina tranexamová je navázána na nosič přes linker mezi nosičem a kyselinou tranexamovou.
- 26. Nosič podle nároku 25, vyznačující se tím, že linkerem je bifunkční linker.
- 27. Nosič podle nároku 26, vyznačující se tím, že bifunkční linker se zvolí z množiny sestávající z nosiče aktivovaného N-hydroxysukcinimidem, DAPA, CNBr, epoxy, diaminodipropylaminem (DADPA), 1,6-diaminohexanem, kyselinou sukcinovou, 1,3-diamino-2-propanolem, ethylendiaminem (EDA), TNB, pyridyldisulfidem, jodacetamidem, maleimidem nebo jejich kombinací.01-2465-03-Če ·· · · · · ·· · • ♦ ♦ • · · · * · · ·· · • · · · • ·· «
- 28. Nosič podle nároku 19, vyznačující se tím, že je modifikován zbytkem, který reaguje s primární nebo sekundární aminoskupinou.
- 29. Směs odvozená z přírodních zdrojů tím, že je v podstatě prostá plasmin(ogenu) vyznačující se a plasminu.
- 30. Směs podle nároku 29, vyznačující se tím, že přírodním zdrojem je krev, krevní derivát nebo krevní frakce, kryoprecipitát, buněčné kultury, extrakty živočišných tkání, jakými jsou například bovinní plíce, bovinní střeva nebo želatina extrahovaná ze zvířecích kostí, albumin bovinního séra, a stejně tak živočišné s vodou mísitelné tuky, jakým je například lanolin (PC-fosfatidylcholin).
- 31. Směs podle nároku 30, vyznačující se tím, že krevním derivátem je zejména z plasmy odvozený faktor srážlivosti krve nebo směs faktorů srážlivosti krve, jako například FVIII, FIX, fibrinogen, fibronektin, a.i-antitrypsin, anti-thrombin III, von Willebrandův faktor, albumin a imunoglobulin.
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US29196801P | 2001-05-21 | 2001-05-21 | |
| EP01115157 | 2001-06-21 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ20033097A3 true CZ20033097A3 (cs) | 2004-06-16 |
Family
ID=26076623
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ20033097A CZ20033097A3 (cs) | 2001-05-21 | 2002-05-17 | Způsob odstranění plasmin(ogenu) z proteinových roztoků |
Country Status (19)
| Country | Link |
|---|---|
| US (4) | US20040197891A1 (cs) |
| EP (1) | EP1390485B1 (cs) |
| JP (1) | JP4385097B2 (cs) |
| KR (1) | KR100871454B1 (cs) |
| AT (1) | ATE342353T1 (cs) |
| AU (1) | AU2002314081B2 (cs) |
| CA (1) | CA2447789C (cs) |
| CZ (1) | CZ20033097A3 (cs) |
| DE (1) | DE60215338T2 (cs) |
| EE (1) | EE05485B1 (cs) |
| ES (1) | ES2274044T3 (cs) |
| HU (1) | HU228899B1 (cs) |
| IL (2) | IL158754A0 (cs) |
| MX (1) | MXPA03010616A (cs) |
| PL (1) | PL205685B1 (cs) |
| RU (2) | RU2458067C2 (cs) |
| SK (1) | SK288005B6 (cs) |
| WO (1) | WO2002095019A1 (cs) |
| ZA (1) | ZA200309030B (cs) |
Families Citing this family (68)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL158754A0 (en) | 2001-05-21 | 2004-05-12 | Omrix Biopharm Sa | Removal of plasmin(ogen) from protein solutions |
| SE526038C2 (sv) * | 2002-07-08 | 2005-06-21 | Gambro Lundia Ab | Polymeraffinitetsmatris, förfarande för framställning därav och anvädning därav |
| CA2514474C (en) | 2003-01-30 | 2014-05-06 | Avner Yayon | Freeze-dried fibrin matrices and methods for preparation thereof |
| US7067123B2 (en) | 2003-04-29 | 2006-06-27 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Glue for cartilage repair |
| US7901457B2 (en) | 2003-05-16 | 2011-03-08 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cartilage allograft plug |
| DE102004009400A1 (de) | 2004-02-24 | 2005-09-08 | Zlb Behring Gmbh | Fibrinogen Reinigung |
| US7335508B2 (en) | 2004-07-22 | 2008-02-26 | Prochon Biotech Ltd. | Porous plasma protein matrices and methods for preparation thereof |
| US7837740B2 (en) | 2007-01-24 | 2010-11-23 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Two piece cancellous construct for cartilage repair |
| US9358318B2 (en) | 2004-10-20 | 2016-06-07 | Ethicon, Inc. | Method of making a reinforced absorbable multilayered hemostatic wound dressing |
| JP5191736B2 (ja) | 2004-10-20 | 2013-05-08 | エシコン・インコーポレイテッド | 吸収性止血材 |
| US7815926B2 (en) | 2005-07-11 | 2010-10-19 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Implant for articular cartilage repair |
| JP2007068497A (ja) * | 2005-09-09 | 2007-03-22 | Nihon Pharmaceutical Co Ltd | プラスミンの精製法 |
| EP1926459B1 (en) | 2005-09-19 | 2015-01-07 | Histogenics Corporation | Cell-support matrix having narrowly defined uniformly vertically and non-randomly organized porosity and pore density and a method for preparation thereof |
| US20070134231A1 (en) * | 2005-12-13 | 2007-06-14 | Jani Dharmendra M | Method for prolonging activity of autodegradable enzymes and compositions thereof |
| RU2443413C2 (ru) | 2006-11-02 | 2012-02-27 | Омрикс Биофармасьютикалс Лтд. | Способ микронизации |
| US8435551B2 (en) | 2007-03-06 | 2013-05-07 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cancellous construct with support ring for repair of osteochondral defects |
| US8409499B2 (en) | 2007-06-07 | 2013-04-02 | Ethicon, Inc. | Method for establishing a sterilizing dose for radiation sensitive products |
| US7704453B2 (en) | 2007-06-07 | 2010-04-27 | Ethicon, Inc. | Method for establishing a sterilizing dose for radiation sensitive products |
| EP2011524A1 (en) * | 2007-07-02 | 2009-01-07 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Fibrin glue with a visualization agent |
| EP2034010A1 (en) | 2007-08-30 | 2009-03-11 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Compositions suitable for repair and/or treatment of injured spinal tissue |
| EP2265220A1 (en) | 2008-03-05 | 2010-12-29 | Musculoskeletal Transplant Foundation | Cancellous constructs, cartilage particles and combinations of cancellous constructs and cartilage particles |
| US10039865B2 (en) | 2008-09-22 | 2018-08-07 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Implantable device comprising a substrate pre-coated with stabilized fibrin |
| EP2398394B1 (en) * | 2009-02-20 | 2021-08-04 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Device for administering an at least two-component substance |
| AU2011210356B2 (en) | 2010-01-28 | 2015-05-28 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method for improved fibrin sealing |
| JP6039550B2 (ja) * | 2010-05-18 | 2016-12-07 | アッヴィ・インコーポレイテッド | タンパク質の精製装置および方法 |
| IL207586A0 (en) | 2010-08-12 | 2010-12-30 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | A fibrin based therapeutic preparation and use thereof |
| JP5836577B2 (ja) * | 2010-09-14 | 2015-12-24 | 株式会社カネカ | クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを精製または除去するアフィニティ担体の製造方法、その精製方法、除去方法 |
| JPWO2012036140A1 (ja) * | 2010-09-14 | 2014-02-03 | 株式会社カネカ | クリングル配列を有する蛋白質またはペプチドを精製または除去するアフィニティ担体、及びそれを用いた精製方法、除去方法 |
| RU2603103C2 (ru) * | 2010-09-20 | 2016-11-20 | Октафарма Аг | Способ получения фибриногена с использованием сильной анионообменной смолы и содержащий фибриноген продукт |
| IL210162A0 (en) | 2010-12-21 | 2011-03-31 | Omrix Biopharmaceuticals | Viral inactivated platelet extract, use and preparation thereof |
| IL213375A0 (en) | 2011-06-05 | 2011-07-31 | Omrix Biopharmaceuticals | Device for spraying fluids in proximity to a surface |
| US9688959B2 (en) | 2011-06-27 | 2017-06-27 | Emory University | Compositions, uses, and preparation of platelet lysates |
| IL213864A0 (en) * | 2011-06-30 | 2011-08-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Method for removing a lytic enzyme from a heterogeneous mixture |
| CA3078563A1 (en) | 2011-12-29 | 2013-07-04 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Method and device for fast dissolution of solid protein composition |
| US10130346B2 (en) | 2012-07-24 | 2018-11-20 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Device and method for the application of a curable fluid composition to a bodily organ |
| US20140154233A1 (en) * | 2012-12-05 | 2014-06-05 | Csl Limited | Method of purifying therapeutic proteins |
| EP3848058A1 (en) | 2012-12-20 | 2021-07-14 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Viral inactivated biological mixture |
| BR112015015703A2 (pt) | 2012-12-30 | 2020-02-04 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | dispositivo e método para a aplicação de uma composição fluida curável a uma porção de um órgão do corpo |
| USD754325S1 (en) | 2013-06-06 | 2016-04-19 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Device of a curable fluid composition to a bodily organ |
| IL230151A0 (en) | 2013-12-24 | 2014-09-30 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | One-component fibrin glue containing a polymerization inhibitor |
| IL230150A0 (en) | 2013-12-24 | 2014-09-30 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | One-component fibrin glue containing zymogens |
| IL231230A0 (en) | 2014-02-27 | 2014-08-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Fibrinogen preparation |
| IL231792A0 (en) | 2014-03-27 | 2014-08-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Device and method for the preparation and administration of one-component fibrin glue |
| IL234246A0 (en) | 2014-08-21 | 2014-11-30 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Stabilized thrombin |
| IL235751A0 (en) | 2014-11-18 | 2015-02-26 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | An addition to the spray dryer |
| BR112017010250A2 (pt) | 2014-11-18 | 2018-01-02 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | aparelho para secagem por aspersão e método de uso do mesmo |
| US10077420B2 (en) | 2014-12-02 | 2018-09-18 | Histogenics Corporation | Cell and tissue culture container |
| CN107427535A (zh) | 2015-02-16 | 2017-12-01 | 纳雅康医疗有限公司 | 经修饰的血凝块 |
| CN107406840B (zh) | 2015-02-25 | 2021-05-28 | 奥姆里克斯生物药品有限公司 | 用于纯化和定量凝血酶及其降解多肽的方法 |
| IL242984A0 (en) | 2015-12-08 | 2016-02-29 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Thrombin microcapsules, their preparation and how to use them |
| US10159720B2 (en) | 2015-12-08 | 2018-12-25 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Thrombin microcapsules, preparation and uses thereof |
| WO2017083248A1 (en) | 2015-11-11 | 2017-05-18 | Ethicon, Inc. | Sealant formulation and uses thereof |
| IL242924A0 (en) | 2015-12-03 | 2016-04-21 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Syringe system for storing and mixing two ingredients |
| EP3506915B1 (en) | 2016-09-01 | 2024-03-06 | Plas-Free Ltd | Human blood-derived products having decreased fibrinolytic activity and uses thereof in hemostatic disorders |
| IT201600091964A1 (it) * | 2016-09-13 | 2018-03-13 | Kedrion Spa | Processo per la purificazione del plasminogeno a partire da plasma umano. |
| IL247821A0 (en) | 2016-09-14 | 2017-01-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Adhesive preparations and their use |
| AU2018231623B2 (en) * | 2017-03-09 | 2024-07-18 | Previpharma Consulting Gmbh | Preparing and use of Glu-plasminogen from blood fractions |
| IL256405A (en) | 2017-12-19 | 2018-01-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Wound bandage and method for its production |
| CA3089175A1 (en) * | 2018-02-28 | 2019-09-06 | Plas-free Ltd. | Extracorporeal device and matrix for removing fibrinolytic proteins from biological fluids, methods and uses thereof |
| WO2020121290A1 (en) | 2018-12-12 | 2020-06-18 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | High concentrated protein compositions for preventing tissue adhesion |
| IL263679A (en) | 2018-12-12 | 2019-03-31 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd | Kits, methods, and compositions for preventing tissue adhesion |
| CN111760556B (zh) * | 2020-07-09 | 2023-06-30 | 江苏尤里卡生物科技有限公司 | 一种尿激酶吸附剂及其制备方法和应用 |
| CN116322920A (zh) | 2020-11-09 | 2023-06-23 | 武田药品工业株式会社 | 使用氧化硅吸附从血浆中纯化fviii |
| EP4341393A1 (en) | 2021-06-08 | 2024-03-27 | PreviPharma Consulting GmbH | Process for isolating plasminogen from a blood plasma fraction |
| CN113533594A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-10-22 | 长沙都正生物科技股份有限公司 | 用于测定氨甲环酸含量的方法及试剂盒 |
| US12415015B2 (en) | 2021-09-16 | 2025-09-16 | Ethicon, Inc. | Kit for composition for tissue tract sealing |
| WO2023119277A1 (en) | 2021-12-21 | 2023-06-29 | Omrix Biopharmaceuticals Ltd. | Highly soluble fibrinogen compositions |
| US20250108142A1 (en) | 2023-09-28 | 2025-04-03 | Ethicon, Inc. | Methods for treating leakage from a gastrointestinal site |
Family Cites Families (15)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3943245A (en) * | 1974-02-14 | 1976-03-09 | Armour Pharmaceutical Company | Purification of plasminogen |
| SU979508A1 (ru) * | 1980-07-23 | 1982-12-07 | Ордена Трудового Красного Знамени Институт Биохимии Им.А.В.Палладина | Способ получени иммобилизованного плазминогена |
| US4639513A (en) * | 1984-02-02 | 1987-01-27 | Cuno Inc. | Intravenously injectable immunoglobulin G (IGG) and method for producing same |
| US4639543A (en) | 1985-02-04 | 1987-01-27 | Richard J. Birch | Semiconductor devices having a metallic glass substrate |
| JPS6391080A (ja) | 1986-10-03 | 1988-04-21 | Kanegafuchi Chem Ind Co Ltd | ヒト組織プラスミノゲン活性化因子の精製法 |
| GB8902771D0 (en) * | 1989-02-08 | 1989-03-30 | Bioprocessing Ltd | Improvements in or relating to affinity chromatography |
| WO1990012091A1 (en) | 1989-04-07 | 1990-10-18 | Cancerforskningsfondet Af 1989 | Urokinase-type plasminogen activator receptor |
| SU1727839A1 (ru) | 1990-05-30 | 1992-04-23 | МГУ им.М.В.Ломоносова | Способ получени фибриногена |
| US5792835A (en) * | 1991-09-05 | 1998-08-11 | Baxter International Inc. | Method of preparing a topical fibrinogen complex |
| DK82592D0 (da) * | 1992-06-23 | 1992-06-23 | Novo Nordisk As | Fremstilling af proteiner |
| US5362859A (en) * | 1992-07-27 | 1994-11-08 | Sepracor, Inc. | High-capacity affinity supports and methods for the preparation and use of same |
| JPH08225461A (ja) | 1995-02-21 | 1996-09-03 | Green Cross Corp:The | プラスミノーゲンの精製方法およびプラスミノーゲン製剤 |
| JP3763598B2 (ja) | 1995-09-11 | 2006-04-05 | 旭電化工業株式会社 | トラネキサム酸の製造方法 |
| US6451978B2 (en) * | 2000-01-21 | 2002-09-17 | Biovitrum Ab | Purification of antithrombin-III-α and β |
| IL158754A0 (en) * | 2001-05-21 | 2004-05-12 | Omrix Biopharm Sa | Removal of plasmin(ogen) from protein solutions |
-
2002
- 2002-05-17 IL IL15875402A patent/IL158754A0/xx unknown
- 2002-05-17 EP EP02740615A patent/EP1390485B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 RU RU2008130356/10A patent/RU2458067C2/ru active
- 2002-05-17 DE DE60215338T patent/DE60215338T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 CZ CZ20033097A patent/CZ20033097A3/cs unknown
- 2002-05-17 ES ES02740615T patent/ES2274044T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 JP JP2002592482A patent/JP4385097B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 MX MXPA03010616A patent/MXPA03010616A/es active IP Right Grant
- 2002-05-17 AU AU2002314081A patent/AU2002314081B2/en not_active Expired
- 2002-05-17 AT AT02740615T patent/ATE342353T1/de active
- 2002-05-17 KR KR1020037015108A patent/KR100871454B1/ko not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 WO PCT/EP2002/005462 patent/WO2002095019A1/en not_active Ceased
- 2002-05-17 HU HU0600110A patent/HU228899B1/hu not_active IP Right Cessation
- 2002-05-17 PL PL365808A patent/PL205685B1/pl unknown
- 2002-05-17 EE EEP200300578A patent/EE05485B1/xx not_active IP Right Cessation
- 2002-05-17 US US10/477,519 patent/US20040197891A1/en not_active Abandoned
- 2002-05-17 CA CA2447789A patent/CA2447789C/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-05-17 RU RU2003136746/13A patent/RU2344143C2/ru active
- 2002-05-17 SK SK1420-2003A patent/SK288005B6/sk not_active IP Right Cessation
- 2002-05-20 US US10/150,490 patent/US7125569B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2003
- 2003-11-05 IL IL158754A patent/IL158754A/en unknown
- 2003-11-20 ZA ZA2003/09030A patent/ZA200309030B/en unknown
-
2006
- 2006-10-17 US US11/581,753 patent/US7641918B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2008
- 2008-10-29 US US12/289,499 patent/US8563288B2/en not_active Expired - Fee Related
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CZ20033097A3 (cs) | Způsob odstranění plasmin(ogenu) z proteinových roztoků | |
| AU2002314081A1 (en) | Removal pf plasmin(Ogen) from protein solutions | |
| DK168693B1 (da) | Terapeutisk aktive konjugater med forbedret vævsbindingsspecificeret samt fremgangsmåde til fremstilling deraf | |
| JPH05227962A (ja) | ウイルス安全性精製ヒトトロンビン | |
| WO2006088741A2 (en) | Procoagulants based on metal-chelating lipids | |
| US8617863B2 (en) | Composition, method, and kit for preparing plasmin | |
| AU2004212324B2 (en) | Albumin solution and method for the production thereof | |
| HK1060902B (en) | Removal of plasmin(ogen) from protein solutions | |
| RS66365B1 (sr) | Postupak za prečišćavanje plazminogena polazeći od humane plazme | |
| CZ211299A3 (cs) | Derivát von Willebrandova faktoru, zařízení tento derivát obsahující a způsob isolace proteinů | |
| Smith et al. | Altered chromatographic behaviour of mitochondrial ADP/ATP translocase induced by stabilization of the protein by binding of 6′-O-fluorescein-atractyloside | |
| JP2714817B2 (ja) | ウロキナーゼ前駆体の製造方法 | |
| JPH0759191B2 (ja) | ヒトプラスミン−α２−プラスミンインヒビタ−複合体の製造方法およびその分離方法 |