CZ20033465A3

CZ20033465A3 - Vakcína Mycoplasma bovis a způsoby potlačování pneumonia u zvířat

Info

Publication number: CZ20033465A3
Application number: CZ20033465A
Authority: CZ
Inventors: Robin Lee Keich; David Ross Mcgavin; Robert John Yancey
Original assignee: Pfizer Products Inc.
Priority date: 2001-07-02
Filing date: 2002-06-27
Publication date: 2004-12-15
Also published as: YU102103A; IL159516A0; TNSN03154A1; PL373891A1; HUP0501188A2; MA27048A1; US20030147914A1; PE20030239A1; WO2003004052A1; BR0210798A; EP1401488A1; UY27365A1; OA12640A; CA2452580A1; SK15802003A3; PA8549801A1; HN2002000162A; JP2004536106A; GT200200139A; IS7078A

Description

Předmětem vynálezu je vakcínové formulace Mycoplasma bovis a způsoby léčení nebo prevence choroby nebo poruchy u zvířete, která je vyvolána patogenem Mycoplasma bovis. Vakcína Mycoplasma bovis může být přípravkem obsahující inaktivované celé buňky nebo jejich části nebo modifikovaným živým přípravkem, podjednotkovou vakcínou nebo NA nebo DNA vakcínou.

Dosavadní stav techniky

Mycoplasma bovis je významným globálním patogenem masného nebo mléčného skotu v ustájených nebo intenzivních chovech.

Nej častěji uváděnou klinickou manifestací je pneumonie u telat, která je často doprovázena artritidou. Tento stav je také znám jako pneumonicko-arthritický syndrom. Etiologická role tohoto patogenu je také dávána do souvislosti s mastitis, otitis a reprodukčními chorobami u krav a býků. S respirační chorobou vyvolanou M. bovis jsou spojeny značné ekonomické ztráty, jelikož M. bovis souvisí s až 36% mortalitou při respirační chorobě hovězího skotu (BRD). Za účelem snížení mortality se často používá léčení antibiotiky, jelikož v současné době plně licencované vakcíny nejsou k dispozici. Prevence M. bovis také může snižovat náchylnost zvířat k jiným respiračním chorobám. Bakterální vakcína M. bovis, která by byla vysoce účinná a bezpečná u mladých telat, by tedy v živočišné výrobě byla velmi cenná.

9 9 • · · • ·

9 9

9 999

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou vakcíny Mycoplasma bovis a způsoby léčení nebo prevence choroby nebo poruchy vyvolané infekcí Mycoplasma bovis, jejichž podstata spočívá v tom, že se zvířeti podá účinné množství vakcíny Mycoplasma bovis a farmaceuticky vhodný nosič. Vakcíny podle tohoto vynálezu se podávají v množství, které je dostatečné pro vyvolání nebo posílení buněčné nebo humorální primární nebo sekundární imunitní odpovědi specifické vůči Mycoplasma bovis. V jednom provedení je zvířetem tele. Způsobem vakcinace podle vynálezu se u telat dosahuje ochrany při expozici patogenu Mycoplasma bovis. Kromě toho se způsobem vakcinace podle vynálezu u telat dosahuje vyšší imunokompetence, a tedy vyšší odolnosti vůči jiným patogenům vyvolávajícím BRD, například snížené náchylnosti k infekcím a jimi vyvolaným chorobám, jako jsou bovinní herpesvirus typu 1 (BHV-1), virus bovinní virové diarey (BVDV), bovinní respirační syncitiální virus (BRSV), virus parainfluenzy (PI3), Pasteurella multocida, Haemophilus somnus, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma californicum, Mycoplasma bovirhinitis, Mycoplasma dispar, Mycoplasma canis, Manheimia haemolytica a další. Předmětem vynálezu jsou také vakcíny Mycoplasma bovis a způsoby eradikace Mycoplasma bovis z infikovaných stád, jejichž podstata spočívá v tom, že se zvířeti podá účinné množství vakcíny Mycoplasma bovis a farmaceuticky vhodný nosič.

Vakcína Mycoplasma bovis podávaná podle tohoto vynálezu může obsahovat další složky, jako adjuvant a popřípadě druhý antigen nebo další antigeny pro použití v kombinované vakcíně. Druhý antigen je zvolen ze souboru zahrnujícího bovinní herpesvirus typu 1 (BHV-1), virus bovinní virové diarey (BVDV), bovinní respirační syncitiální virus (BRSV), virus parainfluenzy (PI3), Pasteurella multocida, Haemophilus

4444 44 • · · · · ··· ··· · · · · * · · · •44 4 44444 4444

4 4 · 4 · 4

444 4 4 44 4 4 4 somnus, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma californicum, Mycoplasma bovirhinitis, Mycoplasma dispar, Mycoplasma canis a Manheimia haemolytica a další.

Předmětem vynálezu je dále způsob přípravy vakcíny Mycoplasma bovis, jehož podstata spočívá v tom, že se izolát Mycoplasma bovis kultivuje ve vhodném médiu; Mycoplasma bovis se za účelem inaktivace ošetří binárním ethyleniminem a za účelem formulace očkovací látky se inaktivovaná Mycoplasma bovis smísí s farmaceuticky vhodným nosičem.

Předmětem vynálezu je dále kit, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje Mycoplasma bovis a adjuvant a popřípadě antigen, jako antigen zvolený ze souboru zahrnujícího bovinní herpesvirus typu 1 (BHV-1), virus bovinní virové diarey (BVDV), bovinní respírační syncitiální virus (BRSV), virus parainfluenzy (PI3), Pasteurella multocida, Haemophilus somnus, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma californicum, Mycoplasma bovirhinitis, Mycoplasma dispar, Mycoplasma canis a Manheimia haemolytica a další.

Popis obr, na výkresech

Na obr. 1 je graficky znázorněna střední hodnota tělesné teploty ve skupině bezprostředně před a po experimentální expozici M. bovis. Telata vakcinovaná dvěma dávkami bakterinu M. bovis (skupina A) ve dnech 4 až 8, 10 až 18 a 20 vykazují významně nižší tělesnou teplotu než zvířata ošetřená placebem (skupina B).

Na obr. 2 je graficky znázorněna střední hodnota tělesné teploty ve skupině bezprostředně před a po experimentální expozici M. bovis. Telata vakcinovaná dvěma dávkami bakterinu M. bovis (skupina A, B a C) ve dnech 7 až 17 vykazují významně • * • ·

nižší tělesnou teplotu než zvířata ošetřená placebem (skupina D) .

Na obr. 3 je graficky znázorněna střední hodnota tělesné teploty ve skupině bezprostředně před a po experimentální expozici M. bovis. Telata vakcinovaná dvěma dávkami bakterinu M. bovis (skupiny 2, 3, 4 a 5) ve dnech 5 až 20 vykazují významně nižší tělesnou teplotu než zvířata ošetřená placebem (skupina 1).

Následuje podrobnější popis vynálezu.

Předmětem vynálezu je tedy vakcína a způsob léčení nebo prevence chorob a poruch u zvířat vyvolaných infekcí Mycoplasma bovis, jehož podstata spočívá v tom, že se zvířatům podává účinné množství inaktivované vakcíny Mycoplasma bovis a farmaceuticky vhodný nosič. Předmětem vynálezu jsou také způsoby výroby vakcín M. bovis a kity, které takové vakcíny obsahují. Jako příklady kmenů Mycoplasma bovis je možno uvést kmeny ATCC 25025 (deponoval R. G. Wittler 8. října 1968),

25523 (deponoval R. G. Wittler 22. října 1969) a 27368 (deponoval R. G. Wittler 5. července 1972). Tyto kmeny byly uloženy ve sbírce American Type Culture Collection, 1801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA. V přednostním provedení izolát Mycoplasma bovis v bakterinu obsahuje jeden nebo více z následujících kmenů 2300, 3625, 16150, 20518 a 5063.

Do rozsahu vynálezu spadá jakýkoliv izolát Mycoplasma bovis, který lze formulovat na účinný bakterin. V přednostním provedení je na účinný bakterin možno formulovat izoláty Mycoplasma bovis inaktivované binárním ethyleniminem. Izoláty Mycoplasma bovis kmenů 2300, 3625, 16150, 20518 a 5063 byly deponovány podle Budapeštské smlouvy o mezinárodním uznávání uložení organismů pro účely patentového řízení ve sbírce • · • · • ··· · ·· · · ♦ · · * · ♦ · ; ··$ · · j ^etj ······ · · · · · · ·

American Type Culture Collection, 1801 University Boulevard, Manassas, VA 20110-2209, USA a označeny jako kmeny PTA-3558, PTA-3559, PTA-3560, PTA-3561 a PTA-3685.

V některých provedeních vakcína, které se používá při způsobu podle tohoto vynálezu, obsahuje inaktivovaný přípravek z celých buněk M. bovis nebo jejich částí (bakterin) nebo modifikovanou živou vakcínu a adjuvant.

Za účelem zpřehlednění je popis dále členem na podkapitoly, ve kterých jsou popsány nebo ilustrovány některé znaky, provedení nebo použití tohoto vynálezu, na něž se však rozsah vynálezu neomezuje.

Definice a zkratky

Zkratkou M. uvedenou před druhovým jménem se rozumí rod Mycoplasma.

Pod pojmem léčení nebo prevence se v tomto textu v souvislosti s infekcí Mycoplasma bovis rozumí inhibice replikace baktérie Mycoplasma bovis, inhibice šíření nebo přenosu Mycoplasma bovis, nebo zabránění Mycoplasma bovis v kolonizaci hostitele, a zmírnění symptomů choroby nebo poruchy vyvolané infekcí Mycoplasma bovis nebo urychlení odstranění M. bovis z organismu zvířete. Léčení je považováno za terapeutické, pokud dochází ke snížení bakteriální nálože, poklesu bakteriálních infekcí, zmenšení plicních lézí, snížení teplot v rektu a/nebo vzestupu hmotnosti a/nebo růstu. Způsob podle vynálezu je například účinný při prevenci nebo potlačování pneumonie, respiračních infekcí a plicních lézí, snižování hladiny M. bovis v plicích, snižování teploty a zvyšování hmotnostních přírůstků u zvířat, zejména u skotu.

• · • ·

4 4 • · · · ·

4 · 4 · · • · · 4 4 · • 44 · · · · 4 •44 4 44444 • · 4 4 4

Pod pojmem vakcína M. bovis se v tomto textu rozumí vakcína, která je užitečná při prevenci nebo léčení poruchy nebo choroby vyvolané infekcí M. bovis. Do rozsahu tohoto pojmu spadá jakákoliv vakcína, která je účinná při léčení nebo prevenci infekce virulentní M. bovis u skotu. Jako vakcínu M. bovis, kterou je možno použít, lze například uvést přípravky z celých buněk M. bovis nebo jejich částí, inaktivované nebo modifikované živé vakcíny, podjednotkové vakcíny obsahující jeden nebo více polypeptidů nebo proteinů pocházejících z M. bovis nebo imunogenní fragmenty takových proteinů nebo polypeptidů nebo jeden nebo více genů nebo nukleových kyselin pro jeden nebo více polypeptidů nebo proteinů pocházejících z M. bovis nebo jejich imumogenních fragmentů. Polypeptidy, proteiny, imunogenní fragmenty takových polypeptidů a proteinů pocházející z M. bovis nebo geny nebo nukleové kyseliny M. bovis je možno syntetizovat nebo získat metodami genového inženýrství, které jsou známy. Při způsobu podle tohoto vynálezu se jako vakcíny M. bovis přednostně používá bakterinu.

Pod pojmem imunogenní fragment, jak se ho používá v tomto textu, se rozumí fragment proteinu M. bovis, který je v hostitelském živočichu schopen vyvolat imunitní odezvu. Jako neomezující příklady imunitní odezvy je možno uvést vyvolání buněčné a/nebo humorální imunity.

Pod pojmem živočich se rozumí zvíře, jako savec, nikoliv člověk.

Pod pojmem skot se rozumí hovězí dobytek, jako býčci, býci, krávy a telata. Způsobu podle vynálezu se přednostně používá u zvířat, nikoliv u lidí, nejvýhodněji u telat.

• · · · • · • · · • ·

Pod pojmem bakterin se rozumí přípravek z inaktivovaných buněk M. bovis nebo jejich částí vhodný pro použití jako vakcína.

Pod pojmem imunologicky účinné množství se rozumí takové množství vacíny M. bovis, které je dostatečné pro vyvolání imunitní odezvy u subjektu, kterému je podáno. Jako neomezující příklady imunitní odezvy lze uvést vyvolání buněčné a/nebó humorální imunity. Účinné množství bakcíny M. bovis například znamená, že bakterin zabrání mykoplasmové pneumonii nebo zmírní její závažnost.

Pod pojmem adjuvant se rozumí potenciátor imunitní odezvy.

Pod pojmem farmaceuticky vhodný nosič se rozumí nosičové médium, které neinterferuje s efektivností biologické aktivity účinné přísady, je chemicky inertní a není toxické pro subjekt, kterému je podáno.

Vakcína obsahující inaktivované buňky (celé buňky nebo jejich části) a modifikovaná živá vakcína

Předmětem vynálezu je vakcína Mycoplasma bovis a způsob její výroby, jehož podstata spočívá v tom, že se izolát Mycoplasma bovis kultivuje ve vhodném médiu; Mycoplasma bovis se za účelem inaktivace ošetří binárním ethyleniminem a za účelem formulace bakterinu se inaktivovaná Mycoplasma bovis smísí s farmaceuticky vhodným nosičem. V jednom provedení se Mycoplasma bovis izoluje z plicní tkáně. V jiném provedení se Mycoplasma bovis izoluje z tkáně lymfatických uzlin. Vhodné nosiče jsou v tomto oboru dobře známy a jako jejich příklady je možno uvést destilovanou nebo deionizovanou vodu, solný roztok nebo minerální olej. Kromě inaktivovaných bakteriálních • · · · · ízolátů bakterínový produkt také může obsahovat vhodné množství jednoho nebo více obvyklých adjuvantů. Jako neomezující příklady vhodných adjuvantů lze uvést minerální gely, například hydroxid hlinitý; povrchově aktivní látky, jako lysolecithin,- glykosidy, například saponin a deriváty saponinu, jako Quil A nebo GPI-0100; kationtové povrchově aktivní látky, například DDA (kvarterní hydrokarbylamoniumhalonigenidy, polyoly typu Pluronic; polyanionty a víceatomové ionty; polyakrylové kyseliny, neiontové blokové polymery, například Pluronic F-125 (B.A.S.F., USA); Avridine a Rantidine; peptidy; rekombinantní mutantní labilní toxiny, například leukotoxin (LT) nebo cholerový toxin; chemicky vázané nebo close proximity molekulární přenašeče; minerální oleje, například Montanide ISA-50 (Seppic, Paříž, Francie), karbopol, Amphigen (Hydronics, USA, Omana, NE, USA), Alhydrogel (Superfos Biosector, Frederikssund, Dánsko), olejové emulze, například emulze minerálních olejů, jako BayolF/Arlacel A, a vody, nebo emulze rostlinných olejů, vody a emulgátoru, jako lecithinu; kamenec, cholesterol cytokiny a kombinace adjuvantů. Víceatomové ionty také mohou fungovat jako dispergační, zahušúovací a protispékavá činidla, která umožňují vakcínu resuspendovat po delší době usazování jako monodispersní suspenzi. Kombinace adjuvantů mohou být ve vodné, zapouzdřené (řízené nebo odložené uvolňování) nebo mikrozapouzdřené formě. Imunogen také může být začleněm do liposomů nebo konjugován s polysacharidy a/nebo jinými polymery k použití v očkovací formulaci. Jako další látky, které mohou být obsaženy v bakterinovém produktu pro použití při způsobech podle vynálezu, je možno uvést například jednu nebo více konzervačních látek, jako dvoj sodnou nebo čtyřsodnou sůl kyseliny ethylendiamintetraoctové (EDTA), merthiolát apod. Vakcíny se připravují jako kapalné aplikační formy nebo pevné aplikační formy s konečnou úpravou rozpustné složky nebo mikročásticového přípravku, který se před použitím resuspenduje ve farmaceutic• · ky vhodném ředidle. Jako neomezující příklady způsobů přípravy rozpustných složek nebo mikročástic lze uvést biacervaci, kongelgaci, sušení rozprašováním, mikrobublinkové sušení, superkritickou solvataci/zapouzdření a lyofilizaci. V přednostním provedení se při formulaci bakterinu používá izolátu Mycoplasma bovis 2300. V dalším provedení se při formulaci bakterinu používá kombinace adjuvantů Quil A, Amphigen a cholesterol.

Konkrétní podmínky, za kterých se izolát kultivuje, se mohou lišit v závislosti na konkrétním složení kultivačního média a konkrétním typu kultivovaného izolátu. V typickém provedení se však izolát kultivuje po dobu asi 24 hodin až asi 72 hodin, měřeno od doby inkubace do doby sklizně. Na takto kultivovaný virulentní izolát Mycoplasma bovis se za účelem jeho inaktivace působí binárním ethyleniminem (BEI), jak je popsáno v US patentu 5 565 205, nebo ho lze inaktivovat vodným roztokem formaldehydu, glutaraldehydem, teplem, ozářením, BPL nebo jiným známým způsobem. Například v případě použití BEI se kultura izolátu může uvést do styku s BEI o koncentraci od asi 2 do asi lOmM. Kultura se poté inkubuje za podmínek, které jsou účinné pro inaktivaci Mycoplasma bovis, například po dobu alespoň 24 hodin při 37°C. BEI kultura se poté zneutralizuje přídavkem thiosíranu sodného v koncentraci, která je účinná pro neutralizaci, například v koncentraci 2 až lOmM.

Získanou, inaktivovanou, Mycoplasma bovis lze poté zkoncentrovat, což se provádí koncentračními způsoby, které jsou v tomto oboru pro takové organismy známé. Nakonec se výsledná izolovaná koncentrovaná a inaktivovaná Mycoplasma bovis za účelem formulace bakterinu smísí s farmaceuticky vhodným nosičem. Bakterin je také možno připravit kteroukoliv z několika modifikací výše popsaného způsobu, které budou odborníkům v tomto oboru zřejmé.

·♦·· • · · • · · • *· ·

Izoláty M. bovis lze také za použití známých způsobů získat přímo z infikovaných plicních lézí skotu. Izoláty M. bovis lze také za použití známých způsobů získat přímo z tkáně infikovaných lymfatických uzlin skotu. Do rozsahu vynálezu také spadá příprava živých vakcín Mycoplasma bovis, jako je atenuace virulentních kmenů pasážováním, což je způsob, který je v tomto oboru znám.

Jako vhodné přípravky vakcín podle vynálezu je možno uvést přípravky pro injekční podávání, jako kapalné roztoky nebo suspenze; také lze připravovat pevné formy vhodné pro přípravu kapalného roztoku nebo kapalné suspenze před aplikací. Přípravek také může být emulgován.

Inaktivované izoláty Mycoplasma bovis je také možno kombinovat s bakteriemi a viry, jejichž neomezujícími příklady jsou bovínní herpesvirus typu 1 (BHV-1), virus bovinní virové diarey (BVDV), bovinní respirační syncitiální virus (BRSV), virus parainfluenzy (PI3), Pasteurella multocida, Haemophilus somnus, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma californicum, Mycoplasma bovirhinitis, Mycoplasma dispar, Mycoplasma canis, Manheimia haemolytica.

Podjednotkové vakcíny

Způsob podle vynálezu je také možno provádět za použití podjednotkových vakcín, které obsahují purifikované imunogenní proteiny, polypeptidy a imunogenní fragmenty takových proteinů a polypeptidů M. bovis. Takové proteiny a polypeptidy je možno připravovat za použití známých způsobů, například jako extrakty připravené za použití povrchově aktivních činidel, nebo extrakty připravené tepelnou, chemickou a mechanickou extrakcí. Způsobů, které jsou odborníkům v tomto oboru dobře • · · · • · ·· · známy, se dále může použít pří stanovování čistoty nebo homogenity proteinů, jako je elektroforéza vzorku na polyakrylamidovém gelu a následná vizualizace jediného pásu polypeptidu na barvicím gelu. Vysoké rozlišení je možno stanovit za použití HPLC nebo jiných podobných způsobů, které jsou odborníkům v tomto oboru známy.

V konkrétním provedení vakcína, které se používá podle tohoto vynálezu, obsahuje alespoň jeden protein M. bovis, jehož neomezujícím příkladem je P13, P18, P21, P25-26, P33-34, P39-40, P45-46, P50, P54-58, P77, P82, P87-89, P97 a P175.

V jiných provedeních podjednotková vakcína podle tohoto vynálezu obsahuje alespoň jednu další imunogenní nebo antigenní molekulu, kterou není protein nebo polypeptid M. bovis nebo fragment takového proteinu nebo polypeptidu M. bovis, a kterou je přednostně virový nebo bakteriální antigen. V přednostním provedení je antigenem bovinní herpesvirus typu 1 (BHV-1), virus bovinní virové diarey (BVDV), bovinní respirační syncitiální virus (BRSV), virus parainfluenzy (PI3), Pasteurella multocida, Haemophilus somnus, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma californicum, Mycoplasma bovirhinitis, Mycoplasma dispar, Mycoplasma canis nebo Manheimia haemolytica. Taková kompozice je užitečná jako kombinovaná vakcína. Podjednotkové vakcíny a kombinované vakcíny podle vynálezu je možno používat při způsobech podle vynálezu za účelem léčení nebo prevence chorob nebo poruch vyvolaných infekcí M. bovis.

V dalším konkrétním provedení imunogenní fragmenty takových proteinů nebo polypeptidů mají sekvenci, která obsahuje alespoň 10, alespoň 20, alespoň 30, alespoň 40, alespoň 50 nebo alespoň 100 po sobě jdoucích aminokyselin imunogenních proteinů a polypeptidů, kterých se používá při způsobu podle • « · · vynálezu, jejichž neomezujícími příklady jsou P13, P18, P21, P25-26, P33-34, P39-40, P45-46, P50, P54-58, P77, P82, P87-89 P97 a P175.

Proteiny M. bovis k použití ve vakcínách jsou v podstatě čisté nebo homogenní. Při způsobu podle vynálezu se používá proteinů nebo polypeptidů, které jsou typicky purifikací zbavené hostitelských buněk, jež exprimují rekombinantní nukleotidové sekvence kódující tyto proteiny. Takovou purifikaci proteinů je možno provádět řadou dobře známých způsobů (například viz Methods In Enzymology; 1990, Academie Press, lne., San Diego, Protein Purification: Principles and practice, 1982, Springer-Verlag, New York, USA).

Purifikované polypeptidy a proteiny M. bovis a jejich imunogenní fragmenty lze také připravovat synteticky.

Polypeptidy a proteiny M. bovis a jejich imunogenní fragmenty je také možno exprimovat a dodávat za použití živých rekombinantních virových a bakteriálních vektorů, jako je adenovirus a Salmonella. Příslušné vektory jsou v tomto oboru také známy a jsou dostupné, nebo je lze připravit známými způsoby.

Genové vakcíny a NA vakcíny

Způsob podle vynálezu lze také provádět za použití genů nebo nukleových kyselin M. bovis, které kódují imunogenní proteiny, polypeptidy a imunogenní fragmenty takových proteinů a polypeptidů. Takové geny a nukleové kyseliny mohou být exprimovány in vivo a lze je připravovat známými způsoby.

V konkrétním provedení vakcína, které se používá při tomto vynálezu, obsahuje alespoň jeden gen nebo nukleovou kyselinu • 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9 9 9 9 9 9 9 9

-, ~ 9 9 9 9 9 999 9 9 9 999 · ······;

99 99 9 kódující protein M. bovis, jehož neomezujícími příklady jsou P13, P18, P21, P25-26, P33-34, P39-40, P45-46, P50, P54-58,

P77, P82, P87-89, P97 a P175.

V dalším konkrétním provedení geny nebo nukleové kyseliny, kterých se používá při způsobu podle vynálezu, kódují imunogenní fragmenty proteinů nebo polypeptidů M. bovis a mají sekvenci, která obsahuje alespoň 10, alespoň 20, alespoň 30, alespoň 40, alespoň 50 nebo alespoň 100 po sobě jdoucích aminokyselin imunogenních proteinů a polypeptidů, kterých se používá při způsobu podle vynálezu, jejichž neomezujícími příklady jsou P13, P18, P21, P25-26, P33-34, P39-40, P45-46,

P50, P54-58, P77, P82, P87-89 P97 a P175 .

V jiných provedeních způsobu podle tohoto vynálezu se použité geny nebo nukleové kyseliny podávají známými způsoby, jako je například techniky vstřelování gene gun nebo použití bezjehlových zařízení pro dodávku.

V ještě dalších provedeních způsobu podle tohoto vynálezu je genovou nebo NA vakcínou DNA vakcína. Nukleová kyselina nebo geny mohou být přítomny spolu s liposomy nebo jinými činidly usnadňujícími transfekci, která jsou v tomto oboru známa.

Způsoby přípravy a dodávky DNA vakcín jsou známé (viz například Krishnan, B. R., Current Status of DNA vaccines in veterinary medicine, Advanced Drug Delivery Reviews, Elsevier Science (2000) ) .

Dávkování, způsoby podávání a léčení

Podle tohoto vynálezu alespoň jedna dávka účinného množství vakcíny M. bovis podaná zvířeti, přednostně teleti o stáří 1 až 10 týdnů, poskytuje efektivní imunitu vůči pozdější expozici M. bovís. Vakcína M. bovis se přednostně podává ve věku 7 až 28 dnů a znovu ve věku asi 28 až 48 dnů. Účinné množství bakterinové vakcíny M. bovis obsahuje asi lxlO⁶ až asi 5xlO¹⁰ jednotek tvořících kolonie (CFU) na dávku. V přednostním provedení bakterinová vakcína, která poskytuje efektivní imunitu obsahuje asi lxlO⁸ až asi 5xlO¹⁰ CFU na dávku, výhodněji asi 5xl0⁸ až asi 5xlO¹⁰ CFU na dávku

Podle tohoto vynálezu je efektivní množství bakterinové vakcíny M. bovis pro podávání asi 0,5 až asi 5,0 ml, přednostně asi 1,5 ml až asi 2,5 ml, a výhodněji asi 2 ml.

Množství vakcíny M. bovis, která je podjednotkovou vakcínou obsahující proteiny nebo polypeptidy nebo imunogenní fragmenty takových proteinů nebo polypeptidů, účinné při způsobu podle vynálezu je asi 0,01 /xg až asi 200 /ig.

Množství vakcíny M. bovis, která je vakcínou obsahující jeden nebo více genů nebo nukleových kyselin (přednostně DNA) kódujících imunogenní proteiny nebo polypeptidy nebo imunogenní fragmenty takových proteinů nebo polypeptidů M. bovis, které je účinné při způsobu podle vynálezu je asi 0,1 Mg až asi 200 mg. Podle tohoto vynálezu je podávání možno provádět známými způsoby, jako je podávání perorální, intranasální, mukosální, topické, transdermální a parenterální (například intravenosní, intraperitoneální, intradermální, subkutánní nebo intramuskulární). Podávání lze také provádět za použití bezjehlových zařízení pro dodávku. Možné je také kombinované podávání, při němž se například použije nejprve parenterálního způsobu a poté mukosálního způsobu. Přednost se dává podávání subkutánnímu nebo intramuskulárnímu.

• 4 · • 4

44··

• 4 4 • · · 4 • 4 4 4 4 4

4 4

4

Do rozsahu vynálezu spadá způsob vakcinace jedinou dávkou, který eliminuje nezbytnost podávat telatům další dávky, aby se vytvořila nebo udržela imunita vůči M. bovis.

Podle tohoto vynálezu se podáváním účinného množství bakterinu Mycoplasma bovis telatům o stáří asi 3 a 6 týdnů dosáhne efektivní imunity vůči respiračním infekcím, jako je pneumonie, zmenšení plicních lézí, snížení hladiny M. bovis v plicích, snížení teplot a zvýšení hmotnostních přírůstků.

Předmětem vynálezu je způsob imunizace telat proti infekci Mycoplasma bovis, jehož podstata spočívá v tom, že se teleti podá alespoň jedna dávka, přednostně dvě dávky, bakterinu tak, že dojde k imunizaci telete proti infekci Mycoplasma bovis. V přednostním provedení se bakterin podává subkutánně. Dávka bakterinu přednostně obsahuje asi 2 ml bakterinu, přičemž každý mililitr obsahuje asi 2,5x10® jednotek tvořících kolonie (CFU) Mycoplasma bovis. Je žádoucí bakterin teleti podat dvakrát: jednou asi 3 týdny a jednou asi 6 týdnů od narození telete.

Předmětem vynálezu je také podávání účinného množství bakterinu Mycoplasma bovis zvířatům, přednostně telatům, za účelem léčení nebo prevence poruch, jako pneumonie, arthritis, mastitis, otitis a reprodukčních poruch u takových zvířat.

Očkovací kity

Předmětem vynálezu je dále farmaceutický kit, jehož podstata spočívá v tom, že obsahuje jeden nebo více obalových prostředků, které obsahují jednu nebo více složek vakcínových formulací podle tohoto vynálezu. Předmětem vynálezu je tedy způsob imunizace zvířat nebo léčení nebo prevence různých chorob nebo poruch u zvířat, jehož podstata spočívá v tom, že ····

ΦΦ Φ

• 9 9 · Φ · · φ ·· · · ΦΦΦ

Φ ΦΦΦ · Φ Φ ΦΦΦ • · Φ Φ Φ Φ

ΦΦ ΦΦ ΦΦ · se zvířeti podá účinná imunizační dávka vakcíny podle tohoto vynálezu. V přednostním provedení kit obsahuje v obalovém prostředku inaktivovaný izolát Mycoplasma bovis a adjuvant zvolený z Quil A nebo GPI-0100, DDA, saponinu, cholesterolu, aluminum gelu, adjuvantů typu Carbopol, Amphigen, Alhydrogel, olej ve vodě, voda v oleji, cytokinů nebo kombinaci adjuvantů.

V jiném provedení kit podle vynálezu ve stejném obalovém prostředku nebo druhém obalovém prostředku popřípadě obsahuje antigeny zvolené z antigenů, jejichž neomezujícími příklady jsou bovinní herpesvirus typu 1 (BHV-1), virus bovinní virové diarey (BVDV), bovinní respirační syncitiální virus (BRSV), virus parainfluenzy (PI3), Pasteurella multocida, Haemophilus somnus, Mycoplasma mycoides, Mycoplasma agalactiae, Mycoplasma californicum, Mycoplasma bovirhinitis, Mycoplasma dispar, Mycoplasma canis nebo Manheimia haemolytica.

Balení

Vakcínové kompozice mohou být v případě potřeby přítomny v balení nebo dávkovači, které mohou obsahovat jednu nebo více jednotkových aplikačních forem obsahujících účinnou přísadu. Balení může například obsahovat kovovou nebo plastovou folii, jako blistrové balení. Balení nebo dávkovač může být doprovázen pokyny pro podávání. Je také možno připravovat kompozice obsahující sloučeninu podle vynálezu formulovanou za použití kompatibilního farmaceutického nosiče, formulaci umístit do vhodného obalového prostředku a označit indikací.

Vynález je blíže objasněn v následujících příkladech provedení. Tyto příklady mají výhradně ilustrativní charakter a rozsah vynálezu v žádném ohledu neomezují.

Příklady provedení vynálezu ···· ·· «

Příklad 1

Materiály a metody

Zvířata

Za účelem vakcinace se získají zdravá kříženecká telata o stáří asi 14 dnů. Telatům se před zahájením zkoušky ponechá sedm dnů na aklimatizaci. Telatům se denně podává koncentrovaná nemedikovaná strava bez jakýchkoliv známých kontaminantů nebo pesticidů a ponechá se jim volný přístup k vodě.

Vakcíny

Bakteriny obsahují celé buňky bakterie M. bovis inaktivované pomocí BEI ve vhodné koncentraci na dávku. Kromě toho každý vakcínový přípravek obsahuje fosfátem pufrovaný solný roztok (PBS) a vhodný adjuvant. Placebo obsahuje buď PBS nebo PBS a adjuvant typu olej ve vodě.

Expozice

Každému teleti se intranasálně ve třech po sobě následujících dnech podá 10 nebo 12 ml čerstvé kultury M. bovis [přibližně 1x10® až lxlO¹⁰ CFU/ml]. Viditelný počet (CFU/ml) expozičního inokula se stanoví krátce po dokončení každé zkušební expozice.

Postup

Každé z telat se označí ušní značkou s jedinečným číslem. Zvířata se randomizovaně z hlediska věku přidělí do ohrad a skupin.

♦ 9 ····

9 • 9 99

9 ·

• 99 99 9 • 9

9 • 9 • 99 •

9 • 99 9 »999

Zvířata se v den O subkutánně (levá strana krku) a den 21 (pravá strana krku) vakcinují 2 ml odpovídající vakcíny nebo placeba.

Všechna zvířata se zváží 1 den před expozicí, 7 dní po expozici, 14 dní po expozici a asi 3 týdny po expozici.

Teplota v rektu se měří každé ránu 1 den před expozicí, bezprostředně před expozicí a 20 dní po expozici.

Shromažďují se krevní vzorky odebírané z jugulární vény od každého telete. Vzorky se odebírají asi 1 den před první vakcinací, 1 den před druhou vakcinací, 1 den před expozicí (asi 3 týdny po druhé vakcinací), 7 dní po expozici, 14 dní po expozici a při pitvě (asi 3 týdny po expozici). Sérum z každého krevního vzorku se až do hodnocení za použití M. bovis ELISA kitu (Chekit M. bovis Šero) připraveného firmou Bommeli AG (Hoechst Roussel Vet Diagnostics, Liebenfeld-Bern,

Švýcarsko) uchovává při -20°C. Plotny pro ELISA se čtou za použití čtečky Multiscan při vlnové délce 405 nm. Hodnoty optické density (OD) se převedou na procentní hodnoty vzhledem k hodnotě OD pozitivního kontrolního séra podle následující rovnice: % hodnota (OD vzorku - OD negativního séra)/(OD pozitivního séra - OD negativního séra) x 100. Hodnoty nižší než 60 % jsou považovány za negativní. Séra s procentní hodnotou 60 až 80 % jsou považována za suspektní a séra vykazující OD vyšší než 80 % jsou považována za pozitivní.

Zvířata se usmrtí přibližně 3 týdny po experimentální expozici M. bovis. Teleta se usmrtí euthanazií a makroskopicky se zhodnotí všechny jejich hlavní orgány kromě centrálního nervového systému.

« ···· ·· · • ··* • · • · ·· ·* • » · · • · · * • 9 · ··· • · · ·· ·· ·· · « 9 · • · · · • · ···*

9 9

9

Plíce se vyjmou a makroskopicky hodnotí z hlediska charakteristických lézí, které lze přičítat infekci M. bovis. Léze se zanesou do standardního plicního diagramu. Procento makroskopického poškození na každý plicní lalok se váží za použití následujících podílů jednotlivých plicních laloků na celkové hmotnosti plic.

Plicní lalok	Procentní podíl plic
Levý apikální	5
Pravý apikální	6
Střední	5
Levý kardiální	6
Pravý kardiální	7
Přídatný	4
Levý diafragmatický	32
Pravý diafragmatický	35

Vážené hodnoty plicních laloků se sečtou, aby se stanovilo procento celých plic s makroskopickými lézemi (Pointon et al., 1992). Kromě toho se pro výpočet procentního zmenšení použije následující rovnice

Střední procento poškození plic léčené skupiny

Zmenšení (%) = 100 - Střední procento poškození plic kontrolní skupiny

Plíce se dále perfundují 50 ml PBS. Učiní se pokusy izolovat a stanovit viditelné počty M. bovis z kapaliny bronchiální laváže. Viditelný počet M. bovis (CFU/ml) se stanoví tak, že se kapalina bronciálni laváže sériově ředí na odpovídající koncentraci a naředěné kapaliny se navzorkují na odpovídající agarové médium.

• · · · φφφ • · · φφφφφ

Příklad 2

V rámci tohoto příkladu se hodnotí účinnost bakterinu M. bovis u mladých telat. Dvacetčtyři zdravých kříženeckých telat se randomizovaně z hlediska věku přiděli do skupin.

Zvířata se v den 0 subkutánně (levá strana krku) a den 21 (pravá strana krku) vakcinují 2 ml odpovídající vakcíny nebo placeba. Ošetřované skupiny a použité vakcíny jsou uvedeny v tabulce 1.

Tabulka 1

Ošetřovaná skupina	Zkoušené vakcíny (2ml dávka)	Počet zvířat
A	M. bovis (5xl0⁸ CFU) + Amphigen	11
B	Placebo (PBS + Amphigen)	13

Expozice zvířat se provádí výše popsaným způsobem 3 týdny po druhé vakcinaci. Každému z telat se intranasálně ve třech po sobě následujících dnech podá 10 ml čerstvé kultury M. bovis.

Viditelný počet (CFU/ml) pro každé expoziční inokulum se stanoví 1 hodinu po dokončení zkušební expozice M. bovis. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2.

) · ·· · • · · · • · · · · > · · * 1 ·····

Tabulka 2

Viditelný počet (CFU/ml) expozičního inokula M. bovis

Expoziční kultura	CFU/ml
Den 1	5,0 x 10⁹
Den 2	1,0 x 10⁹
Den 3	1,2 x 10⁹

Všechna zvířata se zváží 1 den před expozicí, 7 dní po expozici, 14 dní po expozici a asi 3 týdny po experimentální expozici M. bovis. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 3. Telata, kterým byl podán zkoušený bakterin M. bovis (ošetřovaná skupina A), měly vyšší hmotnostní přírůstky než skupina vakcinovaná placebem (ošetřovaná skupina B).

Tabulka 3

Souhrnný přehled tělesných hmotností po experimentální expozici Mycoplasma bovis (střední tělesná hmotnost ± standardní odchylka)

Ošetřovaná skupina	Před expozicí	1 týden po expozici	2 týdny po expozici	3 týdny po expozici	Hmotnostní přírůstek
A	98,4	98,7	107,3	114,6	19,8
	±1,2,9	±13,9	±13,6	±12,9
B	104,0	106,8	109,9	113,0	9,0
	±15,6	±14,7	±14,1	±14,7

Teplota v rektu se měří každé ráno 1 den před expozicí, bezprostředně před expozicí a po dobu 20 dnů po expozici M. bovis. Výsledky jsou souhrnně znázorněny na obr. 1. Zvířata vakcinovaná bakterinem M. bovis (ošetřovaná skupina A) mají ve srovnání se zvířaty vakcinovanými placebem (ošetřovaná skupina B) nižší tělesnou teplotu ve dnech 4 až 8, 10 až 18 a v den 20 .

Odezva vyjádřená pomocí specifické protilátky proti M. bovis v séru (IgG) je souhrnně uvedena v tabulce 4. Vzorky séra s hodnotami střední procentické optické denzity nad 80 % pozitivního kontrolního séra jsou považovány za pozitivní na M. bovis. Všechna telata před vakcinací byla na M. bovis negativní. Telata, kterým byl podán zkoušený bakterin M. bovis (ošetřovaná skupina A), byla před druhou vakcinací séropozitivní na M. bovis a séropozitivita se udržela v průběhu celé zkoušky. Zvířata v ošetřované skupině B (zvířata vakcinovaná placebem) byla séronegativní až do 2 týdnů po experimentální expozici M. bovis.

Tabulka 4

Souhrnný přehled protilátky (IgG) proti Mycoplasma bovis v séru (Střední procentické hodnoty optické denzity vzhledem k pozitivnímu kontrolnímu séru ± standardní odchylka)

Ošetřovaná skupina	A	B
Před vakcinací	26,4+29,1	29,9±39,5
Před 2. vakcinací	210,2±79,5	71,4±64,8
Před expozicí	94,6	24,9±42,2
1 týden po expozici	342,6±12,6	77,5±55,5
2 týdny po expozici	392,5±11,3	250,7±79,7
3 týdny po expozici	385,4±13,2	326,6±50,0

φφφφ

Φ φφφ φφφ φ φ

Všechna zvířata se usmrtí přibližně 3 týdny po experimentální expozici M. bovis. Plíce se vyjmou a makroskopicky hodnotí z hlediska charakteristických lézí, které lze přičítat infekci M. bovis. Procentní skóre poškození plic a procentní zmenšení plicních lézí jsou souhrnně uvedeny v tabulce 5. Telata, kterým byl podán zkoušený bakterin M. bovis (ošetřovaná skupina A) vykázala 71,2% snížení skóre plicních lézí ve srovnání se zvířaty vakcinovanými placebem (ošetřovaná skupina B). Tyto výsledky ukazují, že dvě dávky zkoušeného bakterinu M. bovis jsou u telat schopny indukovat ochranu po experimentální expozici.

Příklad 3

V rámci tohoto příkladu se hodnotí účinnost různých bakterinů M. bovis u mladých telat. Dvacetčtyři zdravých kříženeckých telat se randomizovaně z hlediska věku přidělí do skupin.

Tabulka 1

Ošetřovaná skupina	Zkoušené vakcíny (2ml dávka)	Počet zvířat
A	M. bovis (5x10⁸ CFU) + Amphigen + Alhydrogel	14
B	M. bovis (5x10⁸ CFU) + Amphigen + QuilA/cholesterol	14
C	M. bovis (5x10⁸ CFU) + Amphigen	15

φ ·

D

Placebo (PBS)

15

Expozice zvířat se provádí výše popsaným způsobem 3 týdny po druhé vakcinaci. Každému z telat se intranasálnš ve třech po sobě následujících dnech podá 12 ml čerstvé kultury M. bovis.

Tabulka 2

Viditelný počet (CFU/ml) expozičního inokula M. bovis

Expoziční kultura	CFU/ml
Den 1	2,2 x 10⁹
Den 2	3,2 x 10⁹
Den 3	1,7 x 10⁹

Všechna zvířata se zváží 1 den před expozicí, 7 dní po expozici, 14 dní po expozici a asi 3 týdny po experimentální expozici M. bovis. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 3. Telata, kterým byl podán zkoušený bakterin M. bovis (ošetřované skupiny A, B a C), měly vyšší hmotnostní přírůstky než skupina vakcinovaná placebem (ošetřovaná skupina D).

Tabulka 3

Souhrnný přehled tělesných hmotností po experimentální expozici Mycoplasma bovis (střední tělesná hmotnost (kg) + standardní odchylka)

··« · ····· · · · · • · · · · · · •4 ·· ·· ·

Ošetřovaná	Před	1 týden	2 týdny	3 týdny	Hmotnostní
skupina	expozicí	po expozici	po expozici	po expozici	přírůstek
A	79,79	88,00	98,43	103,71	23,92
	±12,29	±13,86±	±12,35	±10,76	±5,99
B	78,21	86,93	98,29	105,21	27,00
	±9,50	±9,90	±8,47	±9,32	±5,23
C	78,07	86,60	98,00	104,00	25,93
	±16,78	±17,11	±20,92	±21,56	±8,80
D	78,93 ±19,16	88,60 ±20,44	94,43 ±20,01	96,93 ±20,89	18,00

Teplota v rektu se měří každé ráno 1 den před expozicí, bezprostředně před expozicí a po dobu 20 dnů po expozici M. bovis. Výsledky jsou souhrnně znázorněny na obr. 2. Zvířata, kterým byly podány dvě dávky vakcíny M. bovis (ošetřované skupiny A, B a C) mají ve srovnání se zvířaty vakcinovanými placebem (ošetřovaná skupina D) nižší střední hodnotu tělesné teploty ve dnech 7 až 17.

Odezvy vyjádřené pomocí specifické protilátky proti M. bovis v séru (IgG) jsou souhrnně uvedeny v tabulce 4. Vzorky séra s hodnotami střední procentické optické denzity nad 80 % pozitivního kontrolního séra jsou považovány za pozitivní na M. bovis. Všechna telata před vakcinací byla na M. bovis negativní. Telata, kterým byl podán zkoušený bakterin M. bovis (ošetřované skupiny A, B a C), byla před druhou vakcinací séropozitivní na M. bovis a séropozitivita se udržela v průběhu celé zkoušky. Zvířata v ošetřované skupině D (zvířata vakcinovaná placebem) byla séronegativní až do 3 týdnů po experimentální expozici M. bovis.

• ·

Tabulka 4

Ošetřovaná skupina	A	B	C	D
Před vakcinací	negativní	negativní	negativní	negativní
Před 2.	244,3	262,1	184,5	36,9
vakcinací	±66,0	±86,9	±60,6	±70,6
Před	314,7	309,9	292,2	37,2
expozicí	±10,5	±33,6	±93,7	±81,0
1 týden po	134,9	139,5	141,1	37,4
expozici	±7,4	±7,5	±9,1	±27,9
2 týdny po	115,5	114,9	118,9	53,2
expozici	±8,0	±7,5	±7,5	±39,4
3 týdny po	142,5	145,0	140,4	100,5
expozici	±6,9	±4,1	±7,7	±99,6

Všechna zvířata se usmrtí přibližně 3 týdny po experimentální expozici M. bovis. Plíce se vyjmou a makroskopicky hodnotí z hlediska charakteristických lézí, které lze přičítat infekci M. bovis. Procentní skóre poškození plic a procentní zmenšení plicních lézí jsou souhrnně uvedeny v tabulce 5. Telata, kterým byl podán zkoušený bakterin M. bovis (ošetřované skupiny A, B a C), vykázala nižší skóre poškození plic ve srovnání se zvířaty vakcinovanými placebem (ošetřovaná skupina D). Tyto výsledky ukazují, že dvě dávky zkoušeného bakterinu M. bovis jsou u telat schopny indukovat ochranu po experimentální expozici.

• ·

• · φφφ • · · φφφ ··· φ φ φφφφ • ΦΦΦ φ φ φ φ ·

Tabulka 5

Souhrnný přehled procentních skóre poškození plic Vážená střední procentuální hodnota ± standardní odchylka

Ošetřovaná skupina	Procentuální poškození plic	Procento zmenšení
A	1,71±3,03	77,5
B	1,49±3,23	80,4
C	3,61±6,17	52,5
D	7,60±15,93	—

Každá plíce se perfunduje 50 ml PBS. Výsledky izolace M. bovis ze vzorků bronchiální laváže přibližně 21 dnů po experimentální expozici M. bovis jsou souhrnně uvedeny v tabulce 6. Telata, kterým byly podány zkoušené bakteriny M. bovis (ošetřované skupiny A, B a C), měly sníženou incidenci a hladinu viditelných jednotek M. bovis ve vzorcích plicní laváže ve srovnání s telaty vakcinovanými placebem (ošetřovaná skupina D).

Tabulka 6

Souhrnný přehled izolace M. bovis z kapaliny plicní laváže

Ošetřovaná skupina	Počet zvířat pozitivních na M. bovis	CFU/ml
A	5/14	1,93xl0²
B	1/14	42,9
C	9/15	1,34xl0⁶
D	12/14	4,50xl0⁶

• 4 4 4 4 · ♦ · • · · · 4 4 · · 4 4 ·

4 4 > *φ·44 4444

4 4 4 4 4 4

Závěr: u telat, kterým byl podán zkoušený bakterin M. bovis (ošetřované skupiny A, B a C) se vyvinulo méně plicních lézí, tato telata měla nižší teploty v rektu, zvýšené hmotnostní přírůstky a sníženou hladinu viditelných M. bovis v izolátech ze vzorků plicní laváže ve srovnání se zvířaty, které byly ošetřeny placebem (skupina D). Tyto výsledky ukazují, že dvě dávky bakterinů M. bovis jsou schopny vyvolat sérologickou odezvu a ochranu před experimentální expozicí M. bovis.

Příklad 4

V rámci tohoto příkladu se hodnotí účinnost různých bakterinů M. bovis u mladých telat po homologické nebo heterologické expozici. 83 zdravých kříženeckých telat se randomizovaně z hlediska věku přidělí do skupin.

Tabulka 1

Ošetřovaná skupina	Zkoušené vakcíny (2ml dávka)	Počet zvířat
1	Placebo (PBS)	16
2	M. bovis kmen 2300 (5xl0⁸ CFU) + Amphigen + QuilA/cholesterol	17
3	M. bovis kmen 3625 (5xl0⁸ CFU) + Amphigen + GPI-OlOOA/cholesterol	16
4	M. bovis kmen 3625 (5xl0⁸ CFU) + Amphigen + QuilA/cholesterol	15

···· · · ♦· • 9 9 9 9

999 9 · · ·

999 9 999

9 · ·

9·9 99 99 • · 999

5

M. bovis kmen 5063 (5xl0⁸ CFU) + Amphigen + QuilA/cholesterol

17

Expozice zvířat se provádí výše popsaným způsobem 4 týdny po druhé vakcinaci. Každému z telat se intranasálně ve třech po sobě následujících dnech podá 12 ml čerstvé kultury M. bovis (6 ml na nozdru).

Viditelný počet (CFU/ml) pro každé expoziční inokulum se stanoví 1 hodinu po dokončení zkušební expozice M. bovis.

Všechna zvířata se zváží 1 den před expozicí a asi 3 týdny po experimentální expozici M. bovis. Výsledky jsou souhrnně uvedeny v tabulce 2. Telata, kterým byly podány zkoušené bakteriny M. bovis (ošetřované skupiny 2, 3, 4 a 5) , měla vyšší hmotnostní přírůstky než skupina vakcinovaná placebem (ošetřovaná skupina 1).

Tabulka 2

Souhrnný přehled denních hmotnostních přírůstků po experimentální expozici Mycoplasma bovis (průměrný denní přírůstek (kg))

Ošetřovaná skupin	Průměrný denní přírůstek
1	0,3
2	0,5
3	0,7
4	0,6
5	0,9

Teplota v rektu se měří každé ráno těsně den před expozicí (den 47) a po dobu 20 dnů po expozici M. bovis. Výsledky jsou souhrnně znázorněny na obr. 3. Zvířata, kterým byly podány dvě • 4 · · · · * · · ·· 4 4 • 4 4

4 ·

4 4 4

4 4 4 4

4 4 dávky vakcín M. bovis (ošetřované skupiny 2, 3, 4 a 5) mají ve srovnání se zvířaty vakcinovanými placebem (ošetřovaná skupina 1) nižší střední hodnotu tělesné teploty ve dnech 52 až 67.

Odezvy vyjádřené pomocí specifické protilátky proti M. bovis v séru (IgG) jsou souhrnně uvedeny v tabulce 3. Vzorky séra s hodnotami střední procentické optické denzity nad 0,8080 % pozitivního kontrolního séra jsou považovány za pozitivní na M. bovis. Všechna telata před vakcinací byla na M. bovis negativní. Telata, kterým byl podán zkoušený bakterin M. bovis (ošetřované skupiny 2, 3, 4 a 5) po vakcinaci vykázala protilátkovou odezvu. Zvířata v ošetřované skupině 1 (zvířata vakcinovaná placebem) byla séronegativní až do 3 týdnů po experimentální expozici M. bovis.

Tabulka 3

Ošetřovaná skupina	1	2	3	4	5
Před	7,04	2,77	7,40	8,34	5,54
vakcinací	±13,69	±10,47	±13,20	±14,00	±10,02
Před 2.	28,14	79,59	98,21	87,15	62,40
vakcinací	±31,58	±71,35	±102,30	±56,79	±72,18
Před	-5,33	49,78	69,77	65,43	68,31
expozicí	±52,24	±34,91	±27,44	±40,81	±20,88
3 týdny po	183,67	294,75	298,29	295,47	300,13
expozici	±51,32	±29,32	±21,13	±26,59	±22,91

·*«« 99 99 ·· ·

9 9 9 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 99 9 9 9 999 • 9 · · · 9 9

999 99 99 99 9

Všechna zvířata se usmrtí přibližně 3 týdny po experimentální expozici M. bovis. Plíce se vyjmou a makroskopicky hodnotí z hlediska charakteristických lézí, které lze přičítat infekci M. bovis. Střední hodnoty, stanovené pomocí metody nejmenších čtverců (LSM), procentních skóre poškození plic a procenta zmenšení plicních lézí jsou souhrnně uvedeny v tabulce 4. Telata, kterým byl podán zkoušený bakterin M. bovis (ošetřované skupiny 2, 3, 4 a 5), vykázala nižší střední hodnotu LSM skóre poškození plic ve srovnání se zvířaty vakcinovanými placebem (ošetřovaná skupina 1). Tyto výsledky ukazují, že dvě dávky zkoušených bakterinů M. bovis jsou u telat schopny indukovat ochranu po experimentální expozici.

Tabulka 4

Souhrnný přehled LSM středních hodnot procentních skóre poškození plic

Vážená střední procentuální hodnota

Ošetřovaná skupina	LSM Procentuální poškození plic	Procento zmenšení
1	6,5	—
2	0,7	89,23
3	0,9	86,15
4	2,8	56,92
5	2,9	55,38

Každá plíce se perfunduje 50 ml PBS. Výsledky přítomnosti M. bovis ze vzorků bronchiální laváže pomocí PCB přibližně 21 dnů po experimentální expozici M. bovis jsou souhrnně uvedeny v tabulce 5. Telata, kterým byly podány zkoušené bakteriny M. bovis (ošetřované skupiny 2, 3, 4 a 5), měla sníženou incidenci a hladinu M. bovis ve vzorcích plicní laváže pomocí φφφφφ φφ φφ ·· φφφ φφφφ φφ φφφφ φφφφ «φ φ φφφ φφφφφφ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ φφ φ

PCR ve srovnání s telaty vakcinovanými placebem (ošetřovaná skupina 1) .

Tabulka 5

Souhrnný přehled přítomnosti M. bovis stanovené pomocí PCR v kapalině plicní laváže

Ošetřovaná skupina	Počet zvířat pozitivních na M. bovis	Podíl pozitivních (%)
1	14/16	87,5
2	0/17	0
3	4/12	25,0
4	2/15	11,8
5	1/16	5,9

Závěr: u telat, kterým byly podány zkoušené bakteriny M. bovis (ošetřované skupiny 2, 3, 4 a 5) se vyvinulo méně plicních lézí, tato telata měla zvýšené průměrné denní hmotnostních přírůstky, nižší teploty v rektu a sníženou incidenci M. bovis ve vzorcích plicní laváže ve srovnání se zvířaty, které byly ošetřeny placebem (skupina 1). Tyto výsledky ukazují, že dvě dávky bakterinů M. bovis jsou schopny vyvolat sérologickou odezvu a ochranu před experimentální expozicí M. bovis. Kromě toho tyto výsledky ukazují, že vakcína, která obsahuje jediný kmen M. bovis je schopna telata chránit po experimentální expozici výrazně jinému kmeni.

9*99 9* 99 99

9 9999 9

999 9 9 9 9 9

9999 999 9 9 • * 9 9 9 9

999 999 99 99 99 9

9 9 9 9

999*

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

1. Vakcínová formulace pro imunizaci zvířete, vyznačující se tím, že obsahuje imunologicky účinné množství inaktivovaných buněk Mycoplasma bovis nebo jejich částí, a farmaceuticky vhodný nosič.
2. Vakcínová formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že obsahuje adjuvant.
3. Vakcínová formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že vakcína Mycoplasma bovis obsahuje od asi lxlO⁶ do asi 5xlO¹⁰jednotek tvořících kolonie, CFU, na dávku.
4. Fakcínová formulace podle nároku 1, vyznačující se tím, že vakcína Mycoplasma bovis dále obsahuje antigeny virového nebo bakteriálního respíračního, enterického nebo reprodukčního patogenu.
5. Způsob léčení nebo prevence choroby nebo poruchy u zvířete vyvolané infekcí Mycoplasma bovis, vyznačující se tím, že se zvířeti podá účinné množství vakcíny Mycoplasma bovis.
6. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že účinné množství vakcíny Mycoplasma bovis obsahuje od asi lxlO⁵ do asi 5xlO¹⁰ jednotek tvořících kolonie, CFU, na dávku.
7. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že množství podané vakcíny je od asi 0,5 do asi 5,0 ml.
8. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že množství podané vakcíny je od asi 1,5 do asi 2,5 ml.

4 9 4·

44 «4 44 4

4 4 4 4 9 «4

4 44 4 4 444

4 4 4 »44 4 4 4 444

4 4 4 4 4 4

44 94 49 ·
9. Způsob podle nároku 27, vyznačující se tím, že se asi 2 ml vakcíny dvakrát podají teleti.
10. Způsob přípravy vakcíny Mycoplasma bovis, vyznačující se tím, že se izolát Mycoplasma bovis kultivuje ve vhodném médiu; Mycoplasma bovis se za účelem inaktivace ošetří binárním ethyleniminem a za účelem formulace očkovací látky se inaktivovaná Mycoplasma bovis smísí s farmaceuticky vhodným nosičem.
11. Kit, vyznačující se tím, že v alespoň jednom obalovém prostředku obsahuje bakterin Mycoplasma bovis a adjuvant.
12. Bakterin, vyznačující se tím, že obsahuje inaktivovaný izolát Mycoplasma bovis v množství asi 5xl0⁸ jednotek tvořících kolonie na dávku bakterinu, ve farmaceuticky vhodném nosiči.
13. Bakterin podle nároku 12, vyznačující se tím, že dále obsahuje adjuvant. adjuvanty.
14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že účinné množství vakcíny Mycoplasma bovis se podá jednorázově.
15. Vakcínová formulace pro imunizaci zvířete, vyznačující se tím, že obsahuje imunologicky účinné množství inaktivovaných celých buněk Mycoplasma bovis nebo jejich částí, QuilA, Amphigen a cholesterol.