CZ20022702A3

CZ20022702A3 - Antiadhezivní sacharidy

Info

Publication number: CZ20022702A3
Application number: CZ20022702A
Authority: CZ
Inventors: Bernd Stahl; Günter Boehm
Original assignee: N. V. Nutricia
Priority date: 2000-02-16
Filing date: 2001-02-16
Publication date: 2003-01-15
Also published as: TR200202008T2; JP2003522796A; EP1267891A2; EP2298325A1; US7759324B2; NZ520642A; IL151274A; RU2267324C2; NO20111024L; SK11682002A3; NO331735B1; PT1267891E; HUP0300409A2; WO2001060378A2; EP1267891B1; CA2400244C; AU2001246441B2; ES2370478T3; NO20023846D0; WO2001060378A3

Description

Antiadhezivní sacharidy

POPIS VYNÁLEZU

Vynález souvisí s farmaceutickým nebo dietetickým přípravkem pro snížení anebo zabránění adhezi patogenních látek a organismů na eukaryotické buňky, zejména savčí buňky, které obsahují alespoň jeden antiadhezivní sacharid, obsahující na jednom ze svých konců kyselinu uronovou, a použití řečeného přípravku a v něm obsažených sacharidů pro uvedené účely.

Adheze patogenních organismů, spolu s látkami poškozujícími buňky k povrchu savčích buněk, je první krok a nezbytně nutný předpoklad pro infekci nebo poškození buňky. Interakce mezi patogeny a buňkami jsou tvořeny afinitou ligandu a receptoru, která je proto u patogenů důležitým faktorem virulence nebo toxicity. Jako patogeny budou brány v úvahu alespoň bakterie, viry, houby, jednobuněční nebo mnohobuněční paraziti, toxiny a kationty těžkých kovů. Glykostruktury hrají důležitou roli v afinitě ligandu a receptoru.

Jedna z možností snížení nebo kompletního zabránění této afinity ligandu a receptoru sestává ze zablokování příslušných receptorů na buněčném povrchu nebo na ligandu.

Použitím specifických testovacích systémů je možné ukázat, že různé směsi sacharidů snižují nebo dokonce kompletně zabraňují adhezi např. mikroorganismů na buněčný povrch, • · · viz: Kunz, C; Rudloff, S. Acta Paediatr. 1993, 82, 903-912. Lze tedy předpokládat, že aktivní sacharidy mají značnou analogii se strukturou receptoru nebo ligandu. V popsaných studiích bylo použito četných sacharidů živočišného i rostlinného původu a také produktů hydrolýzi rostlinných polysacharidů.

Složení a struktura sacharidů vyskytujících se v přírodě, a například sacharidů lidského mléka, je velmi složitá. To stejné však platí pro sacharidy rostlinného původu a produkty hydrolýzi rostlinných sacharidů. Z toho tedy vyplývá, proč antiadhezivní působení sacharidů prokázané pro patogeny savčích buněk bylo účinné ve většině případů se směsí sacharidů a ne se samostatnými purifikovanými strukturami.

Tak je například známo, že vodné extrakty, stejně jako šťávy, z různých rostlinných produktů, jsou aktivní proti onemocnění zažívacího a urogenitálního traktu způsobeného patogenními mikroorganismy. V dokumentu PCT/EP 94/03006 (WO 95/07084) je proto popsáno, že mrkvová polévka, ibiškový čaj (bladder tea), kokosové mléko atd., připravené určitým způsobem, značně snižují adherenci patogenních mikroorganismů k epiteliálním buňkám zažívacího a urogenitálního traktu. Předpokládá se, že zodpovědnost za toto působení nesou pektiny přítomné v rostlinných produktech, což jsou v podstatě řetězce galakturonidátů vázané 1,4 a-glykosidickou vazbou. Opravdu aktivní galakturonidáty s největší pravděpodobností tedy vyhovují různým kriteriím, jmenovitě stupni polymerace a methylace.

• · • · • · · ·

Předmětem předkládaného vynálezu je ukázat způsob, jak prostřednictvím sacharidů může být účinně snížena nebo úplně potlačena adheze patogenů,. a to interakcí s ligandy anebo povrchovými strukturami eukaryotických buněk, a zejména savčích buněk.

Úkol je vyřešen obeznámením se s patentovými nároky.

• · · • · · » ··· »· ··

Předmět vynálezu je mezi jiným farmaceutický nebo dietetický přípravek obsahující alespoň jeden antiadhezivní sacharid, který má na jednom ze svých konců uronovou kyselinu. Jak je obecně známo, mají sacharidy alespoň dva konce, ale mohou mít dokonce tři nebo více konců v případě, že jsou rozvětvené. Podle vynálezu, mohou být použity nerozvětvené sacharidy a také rozvětvené sacharidy. Na jednom z těchto konců je přítomna již zmiňovaná kyselina uronová, která má k dispozici koncovou COOH skupinu, která může být esterifikována. Přednostní uronové kyseliny nebo jednotky uronových kyselin jsou následující volné nebo esterifikované kyseliny: kyselina galakturonová, kyselina glukuronová, kyselina guluronová, kyselina iduronová, kyselina riburonová a kyselina jsou upřednostňovány kyselina kyselina manuronová, altruronová, zejména galakturonová a kyselina glukuronová.

Vynalezený přípravek obsahuje alespoň jeden antiadhezivní sacharid a proto určené druhy mají na jednom svém konci jednotku kyseliny uronové. Vynalezený přípravek se však také může vyznačovat několika antiadhezivními sacharidy, které mají terminální jednotku kyseliny uronové. Vynalezený preparát obsahuje přiměřenou směs několika takových antiadhezivních sacharidů.

• ··· • · • · · · · · • ··

Antiadhezivní sacharid, tímto se chápe sacharid v rámci předkládaného dokumentu, který obsahuje terminální jednotku kyseliny uronové a jmenovitě je nezávislý na tom, zda řečená jednotka kyseliny uronové má dvojnou vazbu nebo ne. Jinými slovy, termín antiadhezivní sacharidy označují celkové množství těch sacharidů, které mají jednotku kyseliny uronové vyznačující se dvojnou vazbou a těch sacharidů, které mají jednotku kyseliny uronové, ale nemají žádnou dvojnou vazbu. Podstata vynálezu tkví v tom, že jsou použity takové antiadhezivní sacharidy, které se vyznačují minimálním obsahem jednotek kyseliny uronové s dvojnou vazbou.

Antiadhezivní sacharidy mohou mít určený stupeň polymerace, který je obecně, a z toho důvodu také zde, označen zkratkou DP (degree of polymerization). Obvykle jsou však přítomny antiadhezivní sacharidy, které mají různé DP s těmi adhezivními ' sacharidy, mající určený stupeň polymerace, nebo může být DP také složeno různými způsoby. Jinými slovy, vynalezený přípravek obsahuje alespoň jeden určený druh antiadhezivního sacharidu, který má na jednom svém konci jednotku kyseliny uronové. Tento druh sacharidu má samozřejmě určený DP. Navíc může být přítomno několik odlišně složených antiadhezivních sacharidů, které mají stejný DP. Kromě toho mohou být přítomny antiadhezivní sacharidy, které mají různý DP, čímž jeden nebo několik druhů antiadhezivních sacharidů může být přítomno pro každý stupeň polymerace.

S definicí antiadhezivních sacharidů uvedenou podrobně shora, která zahrnuje na jednom konci jednotku kyseliny uronové, není zde uvedeno žádné prohlášení o charakteru dalších sacharidových jednotek nebo monomerních jednotek, z nichž jsou tyto antiadhezivní sacharidy složeny, kromě toho, že antiadhezivní sacharid se skládá pouze z jedné jediné jednotky (stupeň polymerace = DPI), jmenovitě jedné jednotky kyseliny uronové. Pokud má antiadhezivní sacharid DP 1, je složen výhradně z jedné jednotky kyseliny uronové tohoto typu. Jestliže má antiadhezivní sacharid DP 2 nebo vyšší, potom další sacharidové jednotky spojené s jednotkou kyseliny uronové mohou být jakéhokoliv potřebného původu.

až 100% přítomných jednotek kyseliny uronové patří k sacharidům, které poskytují dvojnou vazbu. Údaj v % tedy uvádí počet jednotek kyseliny uronové přítomných in toto, které mají dvojnou vazbu na jednom z konců sacharidů s takovou jednotkou kyseliny uronové týkající se celkového množství těchto jednotek kyseliny uronové, které mají dvojnou vazbu a eventuálně přítomná jednotka kyseliny uronové nemá takovou dvojnou vazbu na jednom konci antiadhezivního sacharidu nebo antiadhezivních sacharidů.

Mimochodem, jednotka kyseliny uronové na jednom konci antiadhezivního sacharidu je zde také zmiňována jako terminální jednotka kyseliny uronové.

Antiadhezivní sacharidy používané podle vynálezu, které mají takovou jednotku kyseliny uronové na jednom konci, mohou mít (v případě nerozvětveného řetězce) na druhém konci neredukující sacharidovou jednotku nebo také redukující sacharidovou jednotku. Přednostně, 10 až 100% antiadhezivních sacharidů majících terminální jednotku kyselinu uronové, mají takovou jednotku redukujícího

• · « · · · · · sacharidu na druhém konci (v případě nerozvětveného řetězce) nebo na jednom z dalších konců (v případě rozvětveného řetězce). Jinými slovy, 10 až 100% terminálních jednotek kyseliny uronové jsou umístěny na neredukujícím konci. Dokonce všechny přítomné terminální jednotky kyseliny uronové mohou být tedy přítomny na neredukujícím konci.

Přednostně, 50 až 100% dvojných vazeb je situováno mezi atomy C₄ a C₅ terminálních jednotek kyseliny uronové. I v tomto případě údaj v % uvádí počet dvojných vazeb, nezávisle na DP antiadhezivních sacharidů a sacharidových jednotek tvořících tyto antiadhezivní sacharidy. Zjištění dvojných vazeb a tedy i terminálních jednotek uronové kyseliny, které obsahují takovou dvojnou vazbu, může být provedeno spektroskopicky při vlnové délce 235 nm použitím molárního extinkčního koeficientu 5500 1/mol cm, viz TP Kravtchenko, I.Arnould, AGJ Voragen & W.Polník Carbohydr. Polymer 1992, 19, 237-242.

Stanovení sacharidů, které mají redukující konec, se provádí pomocí jodometrie podle přesného popisu v: Analytical Chemistry of Carbohydrates, H. Scherz, G. Bonn, Editor Thieme Organic Chemistry Monograph Series, Stuttgart, New York, Thieme Publishers 1998, strana 32. Sacharidy, které mají výlučně neredukující konce mohou být stanoveny klasickými analytickými metodami jako osmometrie, hmotová spektroskopie (např. MALDI-MS, ESI-MS), chromatografie (např. GPC, HPAEC, HPLC) a kapilární elektroforéza nebo kombinací těchto metod.

4 • · ·

4··· ··

44

Antiadhezivní sacharidy, používané podle vynálezu, se mohou také vyznačovat, kromě terminálních jednotek kyseliny uronové, nereduku j í cím koncem, a to tak, že např. redukující konec je následně přeměněn na neredukující konec. Tohoto může být dosaženo například oxidací, redukcí nebo také spojením redukujícího konce s dalšími molekulami. Mezi tyto další molekuly se počítají například proteiny, lipidy a technické polymery, jejichž pomocí jsou získávány (neo)glykokonjugáty. Tato následná modifikace redukujícího konce nemá žádný vliv na antiadhezivní působení antiadhezivních sacharidů používaných podle vynálezu. Tyto antiadhezivní sacharidy mohou být tedy také imobilizovány na známých nosičích přes původní redukující konec, například na obvyklém nosiči.

Má-li 10 až 100% přítomných terminálních jednotek kyseliny uronové dvojnou vazbu, pak to tedy samozřejmě znamená, že 0 až 90% přítomných terminálních jednotek kyseliny uronové takovou dvojnou vazbu nemá. Přednostně, 10 až 50% přítomných terminálních jednotek kyseliny uronové antiadhezivního sacharidu nebo antiadhezivních sacharidů má takovou dvojnou vazbu.

Jmenovitě bylo překvapivě zjištěno, že na rozdíl od poznatků, zpočátku uvedeného WO 95/07084, ani stupeň polymerace ani stupeň methylace není zodpovědný za zřetelnou antiadhezivní funkci, dokonce ani u některých ze zde popsaných sacharidů, které se mohou zbavit takové funkce. Sacharidy, které mají terminální jednotku kyseliny uronové s dvojnou vazbou naopak vykazovaly zřetelnou antiadhezivní funkci. Takové antiadhezivní sacharidy a zejména ty, jejichž jednotka kyseliny uronové má dvojnou • ·· vazbu situovanou mezi atomy C4 a C5 nejsou však získány podle znalostí zmíněného WO 95/07084, což zde bude později detailně diskutováno.

Pokud je to na základě vynálezu otázka antiadhezivního sacharidu, který má daný stupeň polymerace, potom se to týká pouze jednoho jediného antiadhezivního sacharidu. Může se to ' ale také týkat několika odlišně strukturovaných antiadhezivních sacharidů, jejichž společné znaky jsou za prvé daný stupeň polymerace a za další terminální jednotka kyseliny uronové.

Přednostně, přípravek vynálezu ukazuje ne pouze jeden nebo několik antiadhezivních sacharidů, které mají daný DP ale několik antiadhezivních sacharidů o různých stupních polymerace. Použité antiadhezivní sacharidy tímto mají přednostně stupeň polymerace DP 2 až DP 40, a zejména DP 2 až DP 10 a maximum DP 100. Přednostně, směs antiadhezivních sacharidů, které mají odlišné délky řetězce jsou použity. Také v tomto případě se to týká pouze jednoho jediného nebo několika sacharidových druhů nebo většiny jakýchkoliv požadovaných sacharidových druhů, s antiadhezivním sacharidem, který má určenou délku řetězce a daný stupeň polymerace.

Antiadhezivní sacharidy, které mají terminální jednotku kyseliny uronové situovanou výhradně na neredukujícím konci a mají dvojnou vazbu tak vykazují zvýšení antiadhezivního působení. Tyto antiadhezivní sacharidy jsou v rámci předkládaného dokumentu také označovány jako nesaturované sacharidy.

ft · ftftft • ·

• * * ftft · ft ft • ft·· «· ftftftft

Patentově používané antiadhezivní sacharidy, a od této chvíle také nesaturované antiadhezivní sacharidy, mohou být například získány z kyselých sacharidů a přednostně sacharidů obsahujících kyselinu uronovou štěpením pomocí enzymů nebo chemickým štěpením takovým způsobem, aby byl získán naznačený obsah jednotek kyseliny uronové obsahující dvojnou vazbu. Jako přednostní počáteční sacharidy mohou být použity tyto následující: pektiny, pektáty, algináty, chondroitiny, kyseliny hyaluronové, hepariny, heparany, bakteriální sacharidy a jiné sacharidy obsahující kyselinu uronovou. Přednostní počáteční suroviny jsou v tomto případě rostliny anebo části rostlin (jako mrkve, citrusové ovoce, řepy a jablka, viz C. Rolin, BU Nielsen & PE Glahn in Polysaccharides ed.S. Dimitriu, Marcel Dekker New York 1998. Mohou být také použity řasy, živočišné tkáně a bakteriální produkty.

Jsou-li nesaturované antiadhezivní sacharidy připravovány chemickým štěpením, pak to musí být provedeno stejně, aby dvojná vazba byla zavedena prostřednictvím β-eliminace, například pektiny jsou rozštěpeny v neutrálních nebo slabě alkalických podmínkách, viz MJH Keijbets & W. Pilník Carbohydr. Res. 1974, 33, 359-362.

Enzymové štěpení se provádí zejména pomocí lyas (jako jsou pektinlyasy nebo pektátlyasy) nebo enzymovými preparáty obsahujícími lyasu.

V případě chemického štěpení se pracuje v neutrálních až alkalických podmínkách, aby se tím dosáhlo požadovaného obsahu dvojných vazeb. Vhodným výběrem dalších parametrů

φφφ « • β ΦΦΦ jako teplota, ρΗ a koncentrace pufru, může být také ovlivněn stupeň esterifikace karboxylové skupiny anebo hydroxylové skupiny. Při vyšších stupních esterifikace použitých výchozích sloučenin, (např. pektinů), mohou být také získány patentově použité antiadhezivní sacharidy a proto i nesaturované antiadhezivní sacharidy štěpením, které je prováděno v slabě kyselém rozmezí.

Antiadhezivní působení nesaturovaných antiadhezivních sacharidů je také ovlivněno přítomností methylesterů karboxylové skupiny, stejně jako acetylesterů, např. na C-2 anebo C-3 atomu uronových kyselin. Toto se týká zejména galakturonových kyselin pektinů. Stupeň methylace nebo acetylace je přednostně 20 až 75 % a zejména 20 až 50%.

Jak již bylo vyloženo, dvojná vazba jednotek kyseliny uronové, jež je situována zejména na neredukujícím konci, je zvláště důležitá ve směsi antiadhezivních sacharidů přednostně použitých podle vynálezu. Ostatní sacharidové jednotky spojené s jednotkou kyseliny uronové, která má dvojnou vazbu nebo dokonce žádnou takovou vazbu nemá, mohou být výhradně jednotky kyselých sacharidů, výhradně jednotky neutrálních sacharidů nebo směs jednotek kyselých a neutrálních sacharidů. Čili jmenovitě jednotky neutrálních sacharidů stejně ovlivňují antiadhezivní působení nesaturovaných antiadhezivních sacharidů. To se v podstatě týká ramnosa, arabinosy, galaktosy, xylosy, glukosy, fukosy a apiosy, které mohou být následovně spojeny s feroylovými zbytky a fenolickými látkami. Toto platí zejména pro pektiny. Podíl neutrálních sacharidových jednotek tak přednostně činí maximálně 50 % a zejména 0 až 30 %.

• · 9 * β · * « 9«· · ·

•999 99

Μ «* ·“ *· ·· · · * ! * .

• · · » * * • 9 >99 · ·

9U9 >· >«<.·

Antiadhezivní působení antiadhezivních sacharidů nebo směsi antiadhezivních sacharidů zavedených do používání není závislé na koncentraci ve finálním produktu, ale spíš na zásobním množství. Proto, přípravek vynálezu může být složen výhradně z antiadhezivních sacharidů nebo směsi antiadhezivních sacharidů. Pro tento účel je přípravek například ve formě tablet nebo jako doplněk stravy. V případě farmakologického přípravku mohou být samozřejmě přítomny obvyklé farmakologicky tolerovatelné nosiče, ředidla anebo adjuvanty. Tyto antiadhezivní sacharidy mohou být také začleněny do jakéhokoliv požadovaného potravinového nebo farmaceutického přípravku obsahujícího další ingredience v případě potravin tuky, proteiny, minerály, stopové prvky, vitamíny a může se to týkat i dalších látek vhodných pro výrobu potravin. Kromě toho je možné použít antiadhezivní sacharidy, zavedené do použití vynálezem, ve spojení s jinými sacharidy jakéhokoliv požadovaného původu.

Podle přednostní formy, další uvažované sacharidy jsou směsi prebiotických sacharidů podle znalostí z WO 00/08948 s mezinárodním dokumentačním číslem PCT/EP99/05878 a z toho důvodu se to týká směsi prebiotického sacharidu dvou odlišných, v podstatě rozpustných sacharidových složek A a B, které zůstávají nestrávené v gastrointestinálním traktu a přicházejí do tlustého střeva neabsorbovány, se sacharidovou složkou A skládající se z alespoň jednoho monosacharidu nebo z alespoň jednoho oligosacharidů (disacharid až hexasacharid) nebo ze směsi dvou nebo několika těchto sacharidů, se sacharidovou složkou B skládající se z polysacharidu (heptasacharid a dále) nebo ze směsi dvou nebo několika polysacharidů, se sacharidovou • β • · · ··· ·· · • ···· ·· ··· · · • · ······ ···· ·· ··· ·· ·· ···· složkou Α=5 až 95 váhových %, a se sacharidovou složkou B=5 až 95 váhových % z celkového počtu sacharidových složek A+B(=100 váhových %), as alespoň 80 váhových% sacharidů sacharidové složky A a B, které jsou prebioticky aktivní. Pro účely předkládaného vynálezu mohou však tvořit sacharidovou složku A a sacharidovou složku B pouze takové sacharidy, které nevytváří antiadhezivní sacharidy obsahující kyselinu uronovou. Složkám A a B nejsou připsány žádné antiadhezivním sacharidy. Tyto sacharidy, které tvoří sacharidovou složku A a sacharidovou složku B, jsou dále pro zjednodušení označeny jako prebiotické sacharidy, ačkoliv pouze část těchto sacharidů je vlastně prebioticky aktivní.

Alespoň 80 váhových % sacharidů nazývaných prebiotické nebo sacharidů z celkového počtu sacharidových složek A a B jsou prebioticky aktivní. Přednostně, alespoň 80 váhových % sacharidů nazývaných prebiotické příslušejících k sacharidové složce A, a také alespoň 80 váhových % těchto příslušejících sacharidové složce B, jsou prebioticky aktivní. Jinak vyjádřeno, musí v každém případě přednostně alespoň 80 váhových % sacharidů nazývaných prebiotické sacharidových složek A a B dosáhnout tlustého střeva nestrávené (a proto neabsorbovatelné v tenkém střevě). Jinými slovy, sacharidy sacharidových složek A a B nejsou absorbovány a stráveny v gastrointestinálním traktu, ani v žaludku ani v tenkém střevě, ale dosahují jako takové tlustého střeva.

Jako rozpustné sacharidy sacharidových složek A a B, musí být chápány takové, které ve fyzikálním smyslu tvoří ve

vodě homogenní roztok o koncentraci alespoň 1 g/l při pokojové teplotě (např. podle Roempps Chemie Lexikon) .

Část prebioticky neaktivních sacharidů nebo sacharidů v sacharidových složkách A a B činí maximálně 20-wt %. Z těchto sacharidů, se to týká těch, to je pravda, které jsou rozpustné ale mohou být exkretovány nestrávené. Tyto sacharidy mohou fyzikálně působit tak, že zvyšují objem výkalů nebo také způsobují schopnost vazby vody.

Přednostně, prebiotické sacharidy skládající se ze sacharidové složky A mají jinou strukturu než prebiotické sacharidy skládající se ze sacharidové složky B. Dále přednostní je alespoň 80 váhových % prebiotických sacharidů sacharidových složek A a B, jmenovitě těch, které podporují mléčné bakterie anebo jsou bifidogenní. Hmotnostní procento sacharidové složky A je v tomto případě přednostně vyšší než hmotnostní procento sacharidové složky B. Sacharidová složka A přednostně tvoří 95 až 60 váhových % a zejména kolem 90 váhových %, zatímco sacharidová složka B tvoří přednostně 5 až 40 váhových % a zejména okolo 10 váhových %, s A+B=100 váhových %. Prebiotické sacharidy sacharidových složek A a B, nevykazují zejména žádné glukosové jednotky ve al-4 vazbě anebo al-6 vazbě. Prebiotické sacharidy sacharidové složky B jsou v tomto případě přednostně vystaveny z maximálně 100 monosacharidových jednotek.

Dále přednostně, alespoň 60 váhových % a zejména 80 až 100 váhových % prebiotických sacharidů sacharidové složky A náleží do skupiny galaktooligosacharidů, a alespoň 60 • · · • · · · · ·· • · · · · · · • · · · · • ··· · · · • · · · ···· · · ··· * · váhových % a zejména 80 až 100 váhových % prebiotických sacharidů sacharidové složky B náleží do skupiny fruktopolysacharidů.

Je-li takováto prebiotická směs přítomna v přípravcích vynálezu, potom váhový poměr antiadhezivního(ch) sacharidu (ů) ke směsi prebiotických sacharidů je přednostně 1:99 až 99:1, a zejména 1:10 až 10:1, a dále ještě zejména 1:1.

Kromě toho, s výjimkou antiadhezivních sacharidů a s výjimkou eventuálně přítomných směsí prebiotických sacharidů, další obvyklé sacharidy jakéhokoliv žádaného typu mohou být také přítomny v přípravcích vynálezu. V tomto případě mohou být zahrnuty nerozpustné sacharidy, rozpustné a také stravitelné sacharidy, obvyklé sacharidy sloužící především pro nutriční účely (např. škrob, maltodextrin, laktosa a sacharosa) nebo směs jednoho nebo několika těchto sacharidů. Antiadhezivní sacharidy tvoří v těchto případech přednostně 0,1 až 30 váhových % a zejména 1 až 10 váhových %.

Pomocí antiadhezivních sacharidů je dosaženo toho, že nedochází k vazbě patogenních látek na savčí buňky, nebo již navázané patogeny jsou odstraněny. Přídavkem prebiotických oligosacharidů je dosaženo toho, že je eliminována disfunkce střevní flóry, která se často objevuje ve spojení s patogeny. Navíc, patogeny v jiných místech vně gastrointestinálního traktu jako například v urogenitálním traktu, respiračním ústrojí, krevním systému a v kůži, jsou eliminovány systematickým působením rovnovážné střevní flóry.

Jelikož adheze patogenů je nezbytná pro jejich infektivitu nebo toxicitu u všech buněk savčího organismu, patentově používaný antiadhezivní sacharid může být použit nejen pro zabránění nebo snížení infekcí nebo poškození v gastrointestinálním traktu, ale mohou být použity ve všech buňkách.

Předmětem vynálezu je tedy proto použití vynalezených přípravků a v nich obsažených antiadhezivních sacharidů pro zabránění nebo snížení adheze patogenů k eukaryotickým buňkám, a zvláště savčím buňkám. Přednostně, jsou tyto sacharidy použity pro léčbu infekcí gastrointestinálního traktu, krevního systému, dýchacích cest, urogenitálního traktu, nosohltanových průchodů, a pro léčbu buněk gastrointestinálního traktu, krevního systému, dýchacích cest, urogenitálního traktu a také nosohltanových průchodů poškozených toxiny nebo kationty těžkých kovů. Předmětem vynálezu je z tohoto důvodu také použití aplikovaných adhezivních sacharidů pro přípravu dietetických nebo farmaceutických přípravků pro zmíněné léčebné účely.

Použití mimochodem není omezeno na střevně podávané potraviny nebo farmaceutické přípravky. Naopak, vynálezem používané antiadhezivní sacharidy mohou být také použity jako aktivní činidlo v nestřevně podávaných farmaceutických přípravcích. Jako přípravky vynálezu tedy mohou být považovány takovéto nestřevně podávané farmaceutické výrobky.

Zásobní množství vynálezem používaných antiadhezivních sacharidů, a tedy celkové množství sacharidů vykazujících terminální jednotku kyseliny uronové bez dvojné vazby, a ··· · »· · · ·· sacharidů stejně tak vykazujících terminální jednotku kyseliny uronové ale s dvojnou vazbou (nesaturované sacharidy), s 10 až 100 % přítomných terminálních jednotek kyseliny uronové vykazujících takovou dvojnou vazbu, je alespoň 8 mg/kg tělesné váhy za den, přednostně 8 až 20 mg/kg tělesné váhy za den, a zejména přibližně 10 mg/kg tělesné váhy za den. Tyto údaje se zejména týkají samotných nesaturovaných antiadhezivních sacharidů.

Je-li to otázka rozmezí v rámci předkládaných dokumentů, například rozmezí % nebo rozmezí mg, potom všechny střední hodnoty a tedy i všechny hodnoty ležící mezi koncovými hodnotami, a všechna užší rozmezí, zahrnutá těmito rozmezími, jsou také ukázána a nárokována těmito mezními údaji. Z tohoto důvodu tedy údaj 8 až 20 mg/kg zahrnuje všechny střední hodnoty, a zejména hodnoty celých čísel, např. 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 mg/kg. Údaje rozmezí 10 až 100% tedy tvoří zkrácené údaje, pro všechny představitelné střední hodnoty, a zejména pro

celých čísel	. 11, 12, 13, 14, :	L5,	16, 17,	18,	19,	20,	21,
22, 23, 24,	25, 26, 27, 28, 29,	30,	31, 32,	33,	34,	35,	36,
37, 38, 39,	40, 41, 42, 43, 44,	45,	46, 47,	48,	49,	50,	51,
52, 53, 54,	55, 56, 57, 58, 59,	60,	61, 62,	63,	64,	65,	66,
67, 68, 69,	70, 71, 72, 73, 74,	75,	76, 77,	78,	79,	80,	81,
82, 83, 84,	85, 86, 87, 88, 89,	90,	91, 92,	93,	94,	95,	96,
97, 98 a 99%	. Toto platí například	pro % údaje	pro	procento

jednotek kyseliny uronové obsahující dvojnou vazbu. Také všechna představitelná užší rozmezí jsou podobně zahrnuta a ukázána těmito údaji. Analogicky to platí pro celé rozmezí údaje týkající se váhových %, DP nebo jiných jednotek.

• *

0 0 0« 0000

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

V následujících příkladech jsou popsány přednostní přípravky vynálezu. Příklady 1 až 7 se zabývají přípravou antiadhezivních sacharidů, s obsahem alespoň 10 % jednotek kyseliny uronové obsahující dvojnou vazbu. Produkty získané v tomto případě představují preparáty výhradně vytvořené z antiadhezivních sacharidů. Příklady 8 až 13 popisují směsi antiadhezivních sacharidů a prebiotické sacharidové směsi v různých váhových poměrech.

Příklad 1 (enzymové štěpení) g GENU pektinu USP/100 (Hercules Co., Copenhagen, DK) je rozpuštěno v 1 1 50 mM NaOAc pufru (pH 5,0). K tomuto roztoku je přidáno 10 ml roztoku pektinlyasy (Sigma, Deisenhofen) . Konverze probíhá po dobu 24 h při 40°C. Reakce je zastavena zahřátím na 100°C po dobu 10 minut. Enzym a nepřeměněný pektin jsou odstraněny filtrací přes 50 kDa membránu. Filtrát je následně lyofilizován.

Příklad 2 (chemické štěpení) g GENU pektinu USP/100 (Hercules Co., Copenhagen, DK) je rozpuštěno v 1 1 0,2 M NH₃ uhličitanovém pufru (pH 6,8) a zahříváno 8 hodin při 80°C. Získané oligogalakturonidy jsou precipitovány jako soli kovů (např. sůl baria), filtrovány, promyty, sušeny, přeměněny na volné kyseliny pomocí iontoměniče DOWEX-50 H⁺ a lyofilizovány.

Příklad 3 (enzymové štěpení) g Laboron pektinu X-77 A (C.C.A. Klimmeck, Bad

Zwischenahn) je rozpuštěno v 1 1 50 mM acetátového pufru (pH 4,5). Štěpící proces probíhá s 1 ml roztoku pektinlyasy • to (Gist-Brocades Co., Seclin, France) po dobu 24 h při 45°C.

Reakce je zastavena zahřátím na 95°C po dobu 5 minut. Enzym a nepřeměněný pektin jsou odstraněny gelovou filtrací přes BioGel P2 nebo TosoHaas HW 40 S. Frakce oligosacharidů je následně lyofiiizována.

Příklad 4 (enzymové štěpení) g Gruenband pektinu (Obipektin, Bischofszell, Switzerland) je rozpuštěno v 1 1 50 mM acetátového pufru (pH 4,5). Přidají se 2 ml Pectinex 3 XL (Novo Nordisk Co., Dittingen, Switzerland). Roztok je zahříván po dobu 24 h při 50°C. Zastavení reakce je provedeno zahřátím na 95°C po dobu 5 minut. Vytvořené oligogalakturonidy jsou precipitovány ethanolem, promyty a usušeny.

Příklad 5 (chemické štěpení) g Gruenband pektinu (Obipektin, Bischofszell, Switzerland) je rozpuštěno v 1 1 0,1 M fosfátového pufru (pH 6,8) a zahříváno 1 hodinu na 90°C. Uvolněné oligogalakturonidy jsou precipitovány ethanolem, promyty a usušeny.

Příklad 6 (chemické štěpení) g GENU pektinu USP/100 (Hercules Co., Copenhagen, DK) je rozpuštěno v 1 1 0,1 M fosfátového pufru (pH 6,8) a zahříváno 1 hodinu na 95°C. Dlouhé řetězce polymerů jsou precipitovány kyselinou chlorovodíkovou při pH 2 a odstraněny centrifugací. Supematant obsahující oligogalakturonidy je lyofilizován.

• ♦ · · ···· to · · ··· ····♦ · • ··· · ······ · • · ·····* tt·· ·· ··· ·· ·· ·«··

Přiklad 7 (enzymové štěpení) g alginátu je rozpuštěno v 1 1 50 mM NaAc pufru (pH

4,6). K tomuto roztoku je přidáno 10 ml roztoku alginátlyasy. Štěpení probíhá po dobu 24 h při 40°C. Reakce je zastavena zahřátím na 100°C po dobu 10 minut. Enzym a nepřeměněný alginát jsou odstraněny filtrací přes 50 kDa membránu. Filtrát je následně lyofilizován.

Příklady 8 až 13

Pro přípravu přípravku, který obsahuje kromě antoadhezivních sacharidů, také prebiotické sacharidy, se postupuje následovně.

g oligogalakturonidů, které byly připraveny buď enzymovým štěpením podle jakéhokoliv z příkladů 1, 3, 4 anebo 7, nebo které byly připraveny chemickým štěpením, podle jakéhokoliv z příkladů 2, 5 anebo 6, byly před sušícím procesem přimíchány a smíchány s 10 g směsi prebiotického sacharidu s 9 podíly galakto-oligosacharidů (např. Elixor, Borculo Co., a Oligomate, Yakult Co.) a 1 podílem vysokomolekulátního inulinu (např. Raftiline HP, Orafti Co. Nebo Frutafit TEX nebo EXL., Sensus Co. nebo Fibruline LC HAT, Cosucra Co.) podle kvantitativních poměrů uvedených v následující tabulce.

··

99

9 9 9

9 9

999 9

9

9999 99 · ·• 99 9 · 9 · ·

9 9 9

9999

Příklad 01 i g o g a 1 a k t u r<5n<d y	8	9	10	11	12	13
Enzymové štěpení	10 g		10 g		10 g
Chemické štěpení		10 g		10 g		10 g
Prebiotická směs	10 g	10 g	90 g	90 g	10 g	10 g

Místo shora uvedené prebiotické sacharidové směsi galaktooligosacharidů a inulinu, mohou být použity sacharidové směsi, které jsou složeny z následujících složek:

α-galakto-oligosacharidy a inulin, β-galakto-oligosacharidy a galaktomanany, frukto-oligosacharidy a galaktomanany, frukto-oligosacharidy a arabinogalaktany, βgalaktooligosacharidy a arabinogalaktany a také xylooligosacharidy a galaktomanany.

φ φ

····

444 4 4 • 4 4

Φ Φ · 4 Φ 4

4 4

4444

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

Farmaceutický nebo dietetický preparát pro snížení anebo znemožnění adheze patogenních látek a organismů na eukaryotické buňky, zvláště na savčí buňky, obsahující antiadhezivní sacharid nebo několik antiadhezivních sacharidů, které mají jednotku kyseliny uronové (terminální jednotka kyseliny uronové) na jednom ze svých konců charakterizovaný tím, že

10 až 100 % přítomných terminálních jednotek kyseliny uronové řečených antiadhezivních sacharidů má dvojnou vazbu.
2. Farmaceutický nebo dietetický preparát patentového nároku 1 charakterizovaný tím, že

10 až 100 % antiadhezivních sacharidů, které mají terminální jednotku kyseliny uronové obsahují redukující konec, a obsahují terminální jednotku kyseliny uronové na jiném konci.
3. Farmaceutický nebo dietetický preparát patentového nároku 1 nebo 2 charakterizovaný tím, že

50 až 100 % dvojných vazeb je situováno mezi atomy C₄a C₅ terminální jednotky kyseliny uronové.
4. Farmaceutický nebo dietetický preparát jakéhokoliv z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že φφ φφ φφ φφφφ φφφ φ φ

φφ φ φφ • φ φ » φφφ φ φ φ φφφ φ φ φφφφ

10 až 50 % přítomných terminálních jednotek kyseliny uronové antiadhezivních sacharidů má dvojnou vazbu.
5. Farmaceutický nebo dietetický preparát jakéhokoliv z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že obsahuje antiadhezivní sacharidy, které mají terminální kyselinu uronovou, která má různý stupeň polymerace.
6. Farmaceutický nebo dietetický preparát jakéhokoliv z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že antiadhezivní sacharidy mají maximální stupeň polymerace DP 100, a zejména DP 2 až DP 40, a dále zejména DP 2 až DP 10.

terminální z výchozích
7. Farmaceutický nebo dietetický preparát jakéhokoliv z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že antiadhezivní sacharidy obsahující jednotku kyseliny uronové lze získat sacharidů obsahujících kyselinu uronovou, které jsou enzymově nebo chemicky štěpené takovým způsobem, že je získám uvedený obsah terminálních jednotek kyseliny uronové obsahujících dvojnou vazbu.

Farmaceutický nebo dietetický preparát jakéhokoliv z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že »φ φφφφ

ΡΦ ·· φ φ φ • · φ • *·· ·

I · »· φ φφ obsah antiadhezivních sacharidů popsaný v předešlých patentových nárocích v neutrálních sacharidových jednotkách je maximálně 50 % a zejména 0 až 30 %.

Farmaceutický nebo dietetický preparát jakéhokoliv z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že stupeň esterifikace antiadhezivních nároků popsaných v předchozích nárocích s ethanolem je do 75% a zejména 20 až 50%.
10. Farmaceutický nebo dietetický preparát jakéhokoliv z předcházejících patentových nároků charakterizovaný tím, že obsahuje kromě antiadhezivního(ich) sacharidu(ů) prebiotickou sacharidovou směs dvou různých, v podstatě rozpustných sacharidových složek A a B, které zůstávají nestrávené v gastrointestinálním traktu a přicházejí do tlustého střeva neabsorbované, že sacharidová složka A je sestavena alespoň z jednoho monosacharidu nebo alespoň jednoho oligosacharidů (disacharidu až hexasacharidu) nebo ze směsi několika těchto sacharidů, sacharidová složka B je sestavena z polysacharidu (heptasacharidu a výše) nebo ze směsi dvou nebo několika polysacharidů, sacharidová složka A = 5 až 95% váhových a sacharidová složka B = 5 až 95% váhových ze součtu sacharidových složek A+B (= 100% váhových) a že alespoň 80% váhových sacharidů ze sacharidové složky A a B jsou prebioticky aktivní a tím, že sacharidy, které vytvářejí sacharidovou složku A a sacharidovou « ·· • · 0 ·« * 0 0 • ««« 0 složku B nepředstavují antiadhezivní sacharidy podle patentového nároku 1.
11. Farmaceutický nebo dietetický preparát patentového nároku 10, charakterizovaný tím, že váhový poměr antiadhezivního(leh) sacharidu(ů) k prebiotické směsi sacharidů je od 1 : 99 do 99 : 1 a obzvláště od 1 : 10 do 10 : 1 a navíc obzvláště přibližně 1 :1.
12. Farmaceutický preparát jakéhokoli z předchozích patentových nároků, charakterizovaný tím, že obsahuje obvyklé, farmaceuticky přípustné nosiče, ředidla nebo další adjuvans.
13. Dietetický preparát jakéhokoli z nároků od 1 do 11, charakterizovaný tím, že obsahuje obvyklé potravinářské přísady a potravinové složky, včetně vitaminů a stopových prvků.
14. Použití antiadhezivních sacharidů popsaných v jakémkoli z patentových nároků od 1 do 9, které mají koncovou uronovou kyselinovou jednotku pro redukci anebo zabránění adheze patogenů ne eukaryotické buňky.
15. Použití antiadhezivních sacharidů patentového nároku

14 v množství nejméně 8 mg/kg za den a obzvláště od 8 do 20 mg/kg za den.

« « * ft • * « « ··· • · ••ftft ftft ftft ftft ft · · • · · • ftft ftftft ftft ftftftft
16. Požití patentového nároku 14 a 15 pro léčbu infekcí gastrointestinálního traktu, krevního systému, dýchacích cest, urogenitálního traktu a nosohltanového průchodu a pro léčbu poškození buněk gastrointestinálního traktu, krevního systému, dýchacích cest, urogenitálního traktu a nosohltanového průchodu způsobeného toxiny a kationty těžkých kovů.