CZ20021823A3

CZ20021823A3 - Vícestupňový způsob přípravy vysoce přečištěných solí deferoxamin-mesylátu

Info

Publication number: CZ20021823A3
Application number: CZ20021823A
Authority: CZ
Inventors: Vilmos Keri; Zoltan Czovek; Attila Mezo
Original assignee: Biogal Gyogyszergyar Rt
Priority date: 1999-12-01
Filing date: 2000-11-30
Publication date: 2003-02-12
Also published as: RU2002114073A; HU227315B1; PL355328A1; AU1935101A; SK7472002A3; HUP9904454A2; JP2003515579A; CN1433399A; WO2001040164A1; KR20020067044A; MXPA02005377A; EP1235791A4; ZA200204030B; YU39602A; EP1235791A1; HU9904454D0; CA2392925A1

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy vysoce čistého deferoxamin B mesylátu.

Dosavadní stav techniky

Deferoxamin B, reprezentovaný vzorcem I, je polyhydroxamátový chelátor železa, který je použitelný pro snížení koncentrace železa v lidské plasmě.

' N H₂-j-(CH₂)₅- N-[J-(CH₂)2-|pNH]-(CH₂)₅-N—jj-CH₃ (j)

OH O O ² OH O

Systematický chemický název deferoxaminu B (který je také označován jako deferriferrioxamin B) je N'—[5—[[4—[[5— (acetylhydroxyamíno) pentyl] amino] -1, 4-dioxobutyl]hydroxiamino]pentyl]-N-(5-aminopentyl)-N-hydroxy-butandiamid. Deferoxamin B má výhodné vlastnosti, kterými jsou vysoká afinita pro trojmocné železo (Ka = 10³¹) a velmi nízká afinita pro vápník (Ka = 10²) . Goodman a Gilman. The Pharmacological Basis of Therapeutics 1668 (9. vydání, 1996).

Deferoxamin B je indikován pro léčbu akutní intoxikace železem a chronické intoxikace železem v důsledku ánemií. závislých na transfuzích. Podporuje vylučování železa u pacientů se sekundárním nadměrným přívodem železa v důsledku transfuzí, ke kterým dochází v důsledku léčby některých chronických anemií, jako je thalassemie. Dlouhodobá terapie zpomaluje akumulaci železa v játrech a zpomaluje nebo eliminuje progresi jaterní fibrosy. Physicians Desk

Reference 20ÍQ (54. vyd. 1999). Deferoxamin B není dobře absorbován při orálním podání, proto musí být aplikován parenterálně.

Průmyslové způsoby fermentace pro výrobu deferoxaminu B využívají bakteriální kmen Streptomycespilosus, který produkuje různé polyhydroxamatové sloučeniny, ale hlavně deferoxamin B, v kultivačním mediu chudém na železo. Belgický Patent č. 619,532. Deferoxamin B je obvykle izolován z fermentačního bujónu ve formě hydrochloridové soli. Hydrochloridová sůl není farmaceuticky přijatelná pro parenterální podání člověku. Proto musí být přeměněn na farmaceuticky přijatelnou sůl. Mesylátová sůl ke sůl deferoxaminu schválená FDA. US. Pharmacopeia & National Formulary nařizuje, že farmaceuticky čistý deferoxamin B mesylát neobsahuje více než 120 ppm chloridu. USP/NF 24/19, str. 499-500 (1999). Toto se ukázalo jako obtížně splnitelný standard a existuje potřeba vylepšených způsobů pro přeměnu deferoxaminu B produkovaného fermentací na farmaceuticky přijatelnou, čistou mesylátovou sůl pro podání pacientům.

Belgický patent 619,532 popisuje přečištění deferoxaminu B získaného fermentací za použití adsorpční chromatografie. Aktivovaný uhlík, aktivované infuziorové zeminy (např. fullerské hlinky) nebo iontoměničová pryskyřice (Asmit) jsou doporučenými adsorbenty. Alternativními adsorbenty jsou oxid hlinitý, magnesium-silikáty, silikagel, sádra a iontoměničové pryskyřice. Podle Belgického patentu č. 619,532 může být deferoxamin B eluován za použití mobilní fáze tvořené methanolem-vodou, pyridinem-vodou kyselinou octovoumethanolem.

-- k-π. St. -% ,Λ.,»(-ιΑ^^„(Λψ * ,í»v~>s»»if—«^'«'«Shííi-Í^éeaeří^iíáfei*^

Mezinárodní přihláška č. WO 93/09088 a Evropský patent 347,163 popisují chromatografií na silikagelu jako způsob pro přečištění deferoxaminu B produkovaného synteticky, nikoli mikrobiologicky.

Mezinárodní přihláška č. WO 93/03045 popisuje přečištění komplexů deferoxaminu B chelatujících železo a strukturálně příbuzných sloučenin za použití polystyrénové adsorpční pryskyřice.

U.S. Patenty č. 3,153,621 a 3,118,823 popisují částečné přečištění deferoxaminu B za použití iontoměničové pryskyřice. Předpokládá se, že při využití tohoto způsobu se získá směs deferoxaminu B s dalšími polyhydroxamáty, které jsou produkovány kmenem Štreptómyces pilosus.

Belgický Patent 616,139 popisuje, že deferoxamin B mesylát může být získán z hydrochloridové soli deferoxaminu B pomocí zpracování vodného roztoku deferoxamin hydrochloridu přes Dowex-1, X-16 aniontovou iontoměničovou pryskyřici (v OH formě), přidání kyseliny methanesulfonové v ekvivalentním množství ke vzniklé deferoxaminové bázi ve vodném roztoku a potom odpařením vody a nakonec přečištěním deferoxaminmesylátové soli rekrystalizací z vodného alkoholu nebo směsi voda-methanol-aceton.

U.S. Patent č. 5,374,771 popisuje přečištění surového deferoxamin B hydrochloridu iontoměničovou chromatografií a vícenásobnou rekrystalizací. Mesylátová.sůl se připraví přímo z přečištěného deferoxamin B hydrochloridu pomocí kontaktování s aniontovou iontoměničovou pryskyřicí obsahující mesylátový protiion. Deferoxamin B mesylát se získá z roztoku lyofilizací.

Bickel, H. et al., Helvetica Chimica Acta, 1385-1389 (1963), popisuje přečištěni baze deferoxaminu B pomoci vícenásobné rekrystalizace sze směsi voda-alkohol. Baze deferoxaminu B se připraví výměnou aniontu, odpařením do sucha a vícenásobnou rekrystalizací. Baze deferoxaminu B se potom suspenduje ve směsi voda -methanol a připraví se sůl s anorganickou kyselinou. Potom se roztok deferoxaminu B odpaří a zbytek se rekrystalizuje ze směsi voda-methanol.

Odstranění chloridového iontu z vodného roztoku deferoxaminu B je jedním z kroků v každém výše uvedeném způsobu pro přečištění deferoxaminu B z fermentačního bujónu.

V každém případě je chloridový iont odstraněn za použití aniontové iontoměničové pryskyřice. Nicméně, iontoměničové pryskyřice sami o sobě nejsou účinné pro izolaci deferoxamin B mesylátu bez chloridových iontů v dostatečné farmaceutické čistotě.

Výše uvedené způsoby přečištění, které využívají silikagel nebo oxid hlinitý .jako adsorbent jsou neúčinné, časově náročné a nákladné. Další běžné substituované-aktivované uhlí, infuziorové zeminy, magnesium-silikáty a sádra jsou špatnými adsorbenty pro deferoxamin. Z těchto důvodů v oboru přetrvává potřeba rychlého, levného a účinného způsobu pro získání deferoxamin B mesylátu z fermentačního bujónu, který by neobsahoval chloridový iont, nebo který by obsahoval chloridový iont v množství menším než 120 ppm.

Dále, výše uvedené způsoby neodstraňují účinně produkty fermentace, které jsou strukturálně příbuzné deferoxaminu B a které musí být odstraněny před použitím deferoxaminu B ve farmaceutickém produktu. Obvykle extrakt z fermentačního ~ ·>> * —t **r —> «... » ·. . rt ~ - rt- )W# H j rt· í bujónu pro produkci deferoxaminu obsahuje, vzhledem k deferoxaminu B, přibližně 6 až 20 mol% polyhydroxamátových sloučenin, které jsou strukturálně příbuzné deferoxaminu B. Mezi takové sloučeniny patří další deferoxaminy, jako je deferoxamin A, C, Di, D₂, E, F a G. Protože mají deferoxamin B a další deferoxaminy podobné chemické vlastnosti, není žádný ze známých způsobů přečištění nebo jejich kombinací schopen redukovat kvantitu nečistot pod přibližně 2 >5%.

V důsledku nejistých terapeutických a možných toxických účinků je důležité odstranit tyto nečistoty, a to také proto, aby bylo možné určit přesnou koncentraci deferoxaminu B v roztoku, jako je sterilní roztok pro injekce. USP/NF určuje, že injekční roztok deferoxaminu B obsahuje mezi 90,0 a 110 % uvedené koncentrace. USP/NF24/19, str. 500 (1999). Test pro určení koncentrace uvedené v USP/NF je fotometrický absorbanční test pro stanovení komplexů železa při 485 mm. Id. Strukturálně podobné nečistoty také tvoří komplexy, které absorbují světlo vlnové délky 485 nm, což vede k nadhodnocení obsahu deferoxaminu B. Zjistili jsme, že fotometrický test roztoku deferoxamin -B-mesylátu získaného fermentací za použití způsobůlznámých v oboru vede k nadhodnocení koncentrace deferoxaminu B o přibližně3 %. Proto existuje potřeba rychlého, účinného a levného testu pro získání deferoxamin B mesylátu z fermentačního bujónu ve formě bez jiných polyhydroxamátů tvořených metabolickými procesy v Streptomyces (např. pilosus nebo 101/87), stejně jako bez chloridového iontu.

Podstata vynálezu

Požadavek vysoké čistoty v lékách pro prevenci nežádoucích účinků způsobených nečistotami a potřeba přesného stanovení účinnosti deferoxamin B. mesylátu jsou splněny předkládaným vynálezem. Během našich pokusů s deferoxaminem B jsme zjistili, že vedlejší produkty fermentace, které jsou chemicky nepříbuzné deferoxaminu B a příbuzné substance s významně odlišnou polaritou, mohou být odstraněny adsorpční chromatografií, ale ostatní polyhydroxamáty nikoliv. Zjistili jsme, že nejúčinnějším způsobem pro redukci množství jiných polyhdroxámátů je srážení volné baze deferoxaminu B po předběžném přečištění adsorpční chromatografií. Také jsme zjistili, že při odpařování deferoxaminu B do sucha vznikají rozkladové produkty. Deferoxamin B je dostatečně stabilní v solidním stavu, ale je náchylný k rozkladu v koncentrovaném roztoku. Jak se odpařuje ředěný roztok deferoxaminu B, tak roste koncentrace roztoku a ta způsobuje rozklad a zisk produktu s nízkou čistotou. Zjistili jsme, že tento rozklad může být minimalizován zahuštěním a úpravou pH eluens z adsorpční pryskyřice na určité hodnoty a potom provedením přímého vysrážení volné baze deferoxaminu B z eluens.

Tak jsme objevili, že. pro účinné odstranění jak chloridových, tak polyhydroxamátových nečistot, minimalizaci tvorby produktů rozkladu a pro separaci nečistot na množství, kdy jsou zanedbatelné, je vhodné použít, postupně, chromatografií na adsorpční pryskyřici, vysrážení volné baze deferoxaminu B ze směsi vody a organického rozpouštědla rozpustného ve vodě, tvorby deferoxamin mesylátu a krystalizací soli ze směsi vody a anti-rozpouštědla mesylátové soli nebo ze směsi methanolu a anti-rozpouštědla mesylátové soli. Tento proces produkuje deferoxamin B mesylát obsahující méně než 2,5 mol% jiných polyhydroxamátových nečistot a méně než 90 ppm chloridových iontů.

=κ». » - i- «ř í*> K-A.-Wf' <, T. r > Λ- *» - J- Podrobný popis vynálezu

Předkládaný vynález poskytuje způsob přečištění pro produkci vysoce čistého deferoxamin B mesylátu z materiálu obsahujícího deferoxamin B produkovaný mikrobiálně. Způsob přečištění je vhodný pro průmyslové použití a je vysoce ekonomický ve srovnání se jinými známými způsoby přečištění.

Mikrobiální procesy pro produkci deferoxaminu B jsou známé v oboru a jsou popsány např. v US patentu č. 3158552, který je zde uveden jako odkaz. Jak je popsáno v tomto patentu, Streptomyces pilosus se kultivuje v submerzním mediu s nízkým obsahem železa pro stimulaci produkce deferoxaminů, které mikroorganismus používá pro extrakci železa z prostředí. Na konci fermentace je deferoxamin B odstraněn z komplexu s ionty Fe³⁺ v kultivačním mediu pomocí přidání kompetitivního činidla chelatujícího železo, 8-hydroxychinolinu. Medium se potom přefiltruje pro odstranění masy buněk a získá se vodný roztok obsahující deferoxamin B. Při dalším zpracování se hydrochlorid deferoxaminu B, ve směsi s dalšími deferoxaminy, vysráží z vodného roztoku..,.......

Způsob podle předkládaného vynálezu může být použit na materiál získaný z fermentačního media po zpracování, jako je zahuštění nebo extrakce, jak je popsáno v patentu '552, nebo po zpracování popsaném v US patentu č. 5374771. Podobně, odpařený extrakt z fermentačního bujónu obsahující deferoxamin B může být získán v buď vodném, nebo v organickém rozpouštědle a může být použit jak zdroj deferoxaminu B. Výhodně je zdrojem deferoxaminu B vodný roztok s koncentraci deferoxaminu B od přibližně 5 do přibližně 70 g.l^-1, lépe od přibližně 10 do přibližně 30 g.l“¹. Způsob přečištění je dále popsán tak, jak je použit pro přečištění vodného roztoku deferoxaminu B (zde surový roztok deferoxaminu B).

Způsob přečištění podle předkládaného vynálezu obsahuje tři stupně. V prvním stupni jsou nečistoty chemicky nepříbuzné s deferoxaminem B a příbuzné substance s výrazně odlišnou polaritou odstraněny pomocí chromatografie přes adsorpční pryskyřici. Ve druhém stupni je deferoxamin B separován od chloridového iontu a dalších polyhydroxamátů vysrážením deferoxaminu B ve formě volné baze. Ve třetím stupni je deferoxamin B ve formě volné baze suspendován ve směsi rozpouštědel, zpracován kyselinou methansulfonovou pro rozpuštění volné baze a krystalizován ve formě mesylátové soli.

Chromatografická separace nečistot

V prvním stupni podle předkládaného vynálezu jsou separovány sloučeniny, které jsou chemicky odlišné od deferoxaminu B a sloučeniny, které jsou příbuzné, ale mají významně odlišnou-polaritu, pomocí kontaktování materiálu s deferoxaminem B s adsorpční pryskyřicí a odběru deferoxaminu B v roztoku, který je eluentem lože. Výhodnými adsorpčními pryskyřicemi jsou nesubstituované a substituované aromatické pryskyřice, aromaticképryskyřice s hydrofobními skupinami, akrylové a methakrylové pryskyřice. Mezi zejména výhodné pryskyřice patří Diaion® pryskyřice FP, HP, SP a HPGM série (Mitsubishi Chemical Corp.) a Amberlite® pryskyřice XAD série (Rohm and Haas), kdy nejvýhodnější je Diaion® SP 207 a Amberlite® XAD 1180. Deferoxamin B může být eluován z těchto pryskyřic směsí vody a organických rozpouštědel rozpustných ve vodě, jako je methanol, ethanol, acetonitril a tetrahydrofuran.

Výhodné chromatografické postupy využívají pře- a hlavní kolonu obsahující samostatná lože adsorpční pryskyřice. Ve výhodném provedení je surový deferoxamin B nejprve eluován první kolonou, která obsahuje malé množství adsorpční pryskyřice, tj. přibližně 2-6/100 objemu roztoku surového deferoxaminu B. Pre-kolona může být umístěna na horním okraji hlavní kolony a roztok surového deferoxaminu B může být zpracován v pre-koloně bez eluce rozpouštědlem, protože pouze malý podíl deferoxaminu B je absorbován na pre-kolonu. Alternativně může být pre-kolona eluována rozpouštědlem.

Eluens může být směs vody a organického rozpouštědla rozpustného ve vodě, jak je popsáno výše, nebo - pro zlepšení retence deferoxaminu B v hlavní koloně - je eluens sůl ve vodě, jak bylo popsáno výše. Pre-kolona může způsobit malé snížení výtěžku deferoxamin B mesylátu na konci procesu, ale její použití přináší výhodu ve vyšší konečné čistotě a výhodu možnosti regenerace adsorpční pryskyřice v hlavní koloně.

Po zpracování roztoku surového;deferoxaminu B v pre-koloně se roztok výhodně zpracuje anorganickou solí pro zlepšení -adsorpce deferoxaminu B v hlavní .koloně. Chloridové soli a. sulfátové soli jsou výhodné anorganické soli a z nich je nejvýhodnější chlorid amonný a síran amonný. Anorganické soli by měly být přidány v množství od přibližně 2 do přibližně 15 —1 —2

g.l roztoku, lépe přibližně 5-10 g.l roztoku. Roztok surového deferoxaminu B se potom vnese do hlavní kolony obsahující lože absorpční pryskyřice, jejíž objem je přibližně 1/20 objemu roztoku surového deferoxaminu B až přibližně stejný objem, jako je objem roztoku surového deferoxaminu B. Výhodně je objem lože absorpční pryskyřice od přibližně 1/4 do přibližně 3/4 objemu roztoku surového deferoxaminu B. Více koncentrovaný roztok surového deferoxaminu B obvykle vyžaduje méně pryskyřice než více naředěný roztok. Deferoxamin B se adsorbuje na pryskyřici a vodný roztok bez deferoxaminu B se buď nechá odtékat z lože, nebo se vypláchne z lože roztokem anorganické soli. Částečně přečištěný deferoxamin B se potom získá z adsorpční pryskyřice elucí směsí vody a organických rozpouštědel rozpustných ve vodě, jako je methanol, ethanol, acetonitril a tetrahydrofuran, nejlépe acetonitril. Obecně by měl být poměr organického rozpouštědla ve směsi od přibližně 1% do přibližně 70% (obj./obj,), lépe^: od přibližně 1% do přibližně 50% (obj./obj.), v závislosti na pryskyřici. Konkrétně, směs 88:12:3 vody:acetonitrilu:methanolu je velmi dobrou směsí rozpouštědel pro eluci deferoxaminu B z Amberlite® XAD 1180 pryskyřice.

Gradientově eluce může být také výhodně použita pro eluci deferoxaminu B z jakýchkoliv vhodných pryskyřic. Jedna taková obecně použitelná gradientově metoda zahrnuje eluci nejprve vodným -roztokem soli a potom vodou obsahující organické eluční rozpouštědlo. Eluce nejprve vodou, potom směsí voda: acetonitril nebo voda:methanol, a případně'potom eluce směsí voda:ethanol nebo voda:aceton, vede k. dobrým výsledkům.

Zejména výhodnou gradientovou metodou... pro eluci deferoxaminu B z Amberlite® XAD 1180 pryskyřice je eluce nejprve vodným roztokem soli, potom 90:10 směsí vody:acetonitrilu a potom postupným zvyšováním obsahu acetonitrilu na směs 80:20 vody:acetonitrilu.

Když se použije negradientová eluce, tak může být deferoxamin B odebrán z hlavní kolony rozpuštěný ve vodném organickém eluens obsažený v jedné nebo více frakcích odebraných z eluátu. Eluens obsahující deferoxamin B může být volitelně odbarveno, například zpracováním aktivním uhlíkem nebo kationtovou iontoměničovou pryskyřicí, jako je Amberlite®IRC 50, Duolite® C467 a Lewatit®CNP80, za použití způsobů známých v oboru. Když je deferoxamin B odebrán ve třech nebo více frakcích - časně eluované frakci, jedné nebo více středních eluovaných frakcích a pozdní frakci - tak je střední frakce obsahující deferoxamin B obvykle bezbarvá.

Pouze časně eluované a pozdně'eluované frakce mohou být zbarvené. Proto závisí nutnost odbarvení na pořadí frakce.

Když jsou jak časná, tak pozdní frakce smíšeny se střední frakcí, tak je vhodné použít jak aktivovaný uhlík, tak kationtovou iontoměničovou pryskyřici pro odbarvení, protože časná a pozdní frakce odpovídají jinak na odbarvovací metody.

vysrážení volné baze deferoxaminu B

Ve druhém stupni způsobu podle předkládaného vynálezu se volná baze deferoxaminu B vysrází z eluátu z adsorpční pryskyřice. Ačkoli můžp koncentrace deferoxaminu značně záviset na směsi rozpouštědel použité pro eluci deferoxaminu B z pryskyřice, není nutné odpařovat eluens do sucha pro dosažení vhodné koncentrace rozpouštědel.pro vysrážení baze. Odpařování rozpouštědla do sucha je - ve skutečnosti nevýhodné, z důvodu nestability hydroxamátových skupin deferoxaminu B při vysokých? koncentracích v roztoku a při aplikaci tepla. Místo toho může být eluát připraven pro srážení volné baze ve vysokém výběžku následujícím způsobem.

Pokud je koncentrace deferoxaminu B v eluátu nižší než přibližně 50 g.l^-1, tak by měl být eluát odpařen za mírných podmínek na koncentraci deferoxaminu B přibližně 50 g.l^-1 až přibližně 150 g.l^-1, výhodně'přibližně 80 g.l^-1 až přibližně 100 g.l ¹ a nejvýhodněji přibližně 90 g.l^-1. Výhodnými organickými elučními rozpouštědly uvedenými výše jsou rozpouštědla s nižší teplotou varu než je teplota varu vody, a v některých případech azeotropovaná malým množstvím vody, tak, aby se poměr vody ve směsi rozpouštědel zvyšoval při zahušťováni. Zahuštěný eluát se potom naředi acetonitrilem v množství od přibližně 0,5 až přibližně 1,5-násobku objemu zahušťovaného eluátu. Bylo zjištěno, že přidání acetonitrilu v tomto stupni brání srážení deferoxamin B hydrochloridu (nebo síranu, podle typu použité anorganické soli).

Eluát s upravenou koncentrací obsahuj ící--def eroxamin B ve vodě a acetonitrilu (a případně dalším organickém elučním rozpouštědle) se potom upraví na vhodné pH mezi přibližně 8,6 a 10,5, lépe mezi přibližně 9,4 a přibližně J.Q, 0. pH může být upraveno za použití bazické iontoměničové pryskyřice nebo pomocí přidání vodného alkalického roztoku nebo obou způsobů. Mezi vhodné bazické iontoměničové pryskyřice patří Amberlite® pryskyřice IRA série a Diaion® pryskyřice WK série, kde nejvhodnější je Amberlite® IRA 67 v OH formě. Mezi vhodné alkalické roztoky patří roztoky NaOH, KOH, amoniaku nebo aminu, kde nejvhodnějším roztokem je koncentrovaný vodný roztok amoniaku.

V zejména výhodné technice pro úpravu pH..._je nejprve testováno pH. eluátu s upravenou koncentrací. Pokud je pod pH 8,0, tak je pH upraveno na přibližně 8,0 až .9,3 pomocí bazické iontoměničové pryskyřice, jako.je Amberlite IRA 67 v OH-formě. Pryskyřice se potom separuje a přidá se vodný roztok amoniaku, tak, aby pH roztokp s upravenou koncentrací dosáhlo hodnoty přibližně 9,4 až 10,0.

Po úpravě pH se indukuje krystalizace volné baze deferoxaminu B anti-rozpouštědla pro volnou bázi deferoxaminu B, jako je acetonitril, ethanol, methanol nebo aceton. Výhodná anti-rozpouštědla pro volnou bázi deferoxaminu B jsou acetonitril a směsi acetonitril-aceton. Termín anti13 rozpouštědlo', jak je zde použit, označuje kapalinu, ve které je sloučenina špatně rozpustná. Proto se termín antirozpouštědlo týká rozpustnosti určité sloučeniny v kapalině. Předkládaný vynález využívá dvě třídy anti-rozpouštědel: antirozpouštědla pro volnou bázi deferoxaminu B a antirozpouštědla pro deferoxamin B mesylát.

Rychlost přidání anti-rozpouštědla volné-baze deferoxaminu B do eluátu s upraveným pH není zásadní, ale při pomalém přidání existuje tendence k produkci větších krystalů a čistších krystalů volné baze deferoxaminu B. Při průmyslové produkci je praktickou rychlostí adice rychlost přibližně 0,5násobek až přibližně 2-násobek objemu eluátu s upraveným pH za hodinu, protože při nižší rychlosti mohou být získány větší krystaly vyšší čistoty. Celkové množství anti-rozpouštědla přidané do volné baze deferoxaminu B je výhodně přibližně 1,5 až 10-násobek, výhodněji přibližně 2-.....až 8-násobek a nejvýhodněji přibližně 2,5 až 5-násobek objemu eluátu s upraveným pH. Teplota roztoku během krystalizace může být v rozmezí od přibližně -20 °C až přibližně 40 °C, ačkoliv výhodně je teplota udržována mezi přibližně 0 £c a přibližné 20 °c.

Po dokončení krystalizace mohou být-' krystaly volné baze deferoxaminu B izolovány jakýmikoliv běžnými způsoby, jako je filtrace nebo dekantování. Volitelně mohou být krystaly volné baze dále přečištěny rekrystalizací. Směsi acetonitril-voda jsou také dobrými rozpouštědly pro rekrystalizací.

Krystalizace deferoxamin B mesylátu

Ve třetím stupni způsobu podle předkládaného vynálezu se krystalizovaná volná baze suspenduje ve směsi rozpouštědel.

Potom se do suspenze přidá kysplina methansulfonová, která způsobí to, že volná baze deferoxaminu B přejde do roztoku. Po kompletním rozpuštění volné baze deferoxaminu B pokračuje přidávání kyseliny methanesulfonové do té doby, než roztok dosáhne pH přibližně 3 až přibližně 6, -výhodně přibližně 3,54,5. Deferoxamin B mesylát se potom nechá vysrážet.

Vhodné směsi rozpouštědel pro suspendování volné baze deferoxaminu B jsou směsi rozpouštědel pro deferoxamin B mesylát, buď voda nebo methanol, a anti-rozpouštědel pro deferoxamin B mesylát. Mezi anti-rozpouštědla pro .deferoxamin B mesylát patří C1-C7 alifatické alkoholy, aceton, methylformiát, methylacetát, ethylacetát, hexan, toluen, tetrahydrofuran a acetonitril. Polární, rozpouštěcí složka směsi rozpouštědel, tj. methanol nebo voda, se výhodně smísí v poměru přibližně 1:1 až přibližně 1:10 s anti-rozpouštěcí složkou, výhodněji v poměru přibližně 1:5. Výhodnými směsnými rozpouštědly jsou směsi voda-ethanol, voda-acetonitril, methanol-ethanol a methanol-acetonitril, a nejvýhodnější z nich je směs 1:5 voda-ethanol a 1:3 methanol-ethanol. Objem směsného rozpouštědla, který se použije pro suspendování volné baze, je od přibližně 5 do přibližně: 20 1 na kilogram volné baze deferoxaminu B, výhodněji od přibližně 7 do přibližně 15 1 na kilogram. ,

Po vytvoření suspenze se do suspenze přidá kyselina methansulfonová. Množství kyseliny methansulfonové může být přibližně vypočteno podle množství nutného pro získání jednoho ekvivalentu kyseliny k bázi. Alternativně může být množství kyseliny methansulfonové nutné pro získání jednoho ekvivalentu určeno pozorováním množství nerozpuštěné volné baze, které zbývá po přidání kyseliny. Proto by měla být kyselina methansulfonová přidávána pomalu, protože rychlost, kterou > i í i - ‘ > » ί I , i .

! ϊ J ϊ , iii i , > . } 3)1 ) může suspendovaná baze reagovat s kyselinou, je omezena plochou povrchu krystalů. Po rozpuštění veškeré volné baze deferoxaminu B by mělo být sledováno pH roztoku a kyselina methansulfonová by se měla přidávat tak, aby pH roztoku dosáhlo přibližně 3 až přibližně 6, výhodně přibližně 3,5-4,5. Po dosažení požadovaného pH se krystaly deferoxamin B mesylátu nechají vysrážet.

Pro urychleni srážení může být.roztok, ochlazen na přibližně -20 až přibližně 10 °C. Kromě toho může být srážení urychleno přidáním více anti-rozpouštědla deferoxamin B mesylátu do směsi, tj. přidáním C1-C7 alifatického alkoholu, acetonu, methylformiátu, methylacetátu, ethylacetátu, hexanu, toluenu, tetrahydrofuranu nebo acetonitrilu. Po dokončení srážení se deferoxamin B mesylát izoluje běžnými způsoby, jako je filtrace nebo dekantování.

Po popisu výhodných provedení předkládaného vynálezu bude nyní vynález dále ilustrován příklady.

Příklady provedení vynálezu .......

Obecná část 7

HPLC podmínky (reverzní fáze): kolona: Cxe, velikost částic 10 μ, délka 250 mm, průměr 4,6 mm; mobilní fáze: 5,5% THF/voda, 0,13% (NH4)H₂P04 (hmot./obj.), 0,04% natrium-edetát (hmot./obj.) , průtok: 2 ml.min^-1: detekce: UV λ=220 mm.

Příklad 1

Surový deferoxamin B hydrochlorid (7,88 kg) obsahující 5,30 kg deferoxamin B se rozpustí ve vodě (362 1). Vodný roztok se potom zpracuje přes stejný objem Diaion SP 207 adsorpční pryskyřice (Mitsubishi Chemical Corp.) v 10 litrové chromatografické koloně s průtokem 14 l.h^-1. Eluát obsahuje 5,04 kg deferoxaminu. Potom se do eluátu za míšení přidá chlorid amonný v množství 5 g.l^-1 a směs se mísí do rozpuštění chloridu amonného. Roztok se potom vnese do kolony obsahující Amberlite® XAD 1180 adsorpční pryskyřici (132 1) (Rohm & Haas) a zavádí se do lože pomocí vodného roztoku soli. Kolona se eluuje 10% acetonitrilem-vodou a potom 20% acetonitrilem-vodou při průtoku 14 l.h^-1. Eluát se odebírá ve frakcích. Ghlavní frakce obsahuje roztok deferoxaminu-hydrochloridu obsahující 4,53 kg deferoxaminu B. Hlavní frakce se potom odbarví přes aktivovaný uhlík (45 g) a Duolite® C467 (Rohm and Haas) iontoměničovou pryskyřici v H⁺ formě za zisku roztoku deferoxamin-hydrochloridu obsahujícího 4,03 kg deferoxaminu B.

Odbarvený eluát se odpaří na koncentraci deferoxaminu B 90 g.l^-1 Přidá se acetonitril v objemu stejném jako⁷ je objem zahuštěného eluátu a pH se upraví přidáním Amberlite® IRA 67 (Rohm and Haas) v OH^- formě na pH 8,0-9,3. Po úpravě pH iontoměničovou pryskyřicí se pH zvýší na 9,4 až 10,0 pomocí vodného roztoku amoniaku. Volná baze deferoxaminu se potom vysráží přidáním dvou objemů acetonitrilu do roztoku a ochlazením na -5 °C. Krystalizace se dokončí po několika hodinách. Krystaly volné baze deferoxaminu B se izolují filtrací a potom se suspendují v 1:1 směsi acetonitrilu a vody, opět se přefiltrují, promyjí se acetonitrilem a suší se za zisku 3,81 kg volné baze deferoxaminu. HPLC chromatografie ukáže, že volná baze má 97% čistotu. Podle USP chemického testu <221> pro stanovení obsahu chloridů má vysrážená volní baze deferoxaminu B obsah chloridů menší než 60 ppm. USP/NF 24/19, str. 1854-1858 (1999) .

~-. n *·»» 4.-^¼ 4«· »

Volná baze deferoxaminu B se suspenduje v 14:3 směsi ethanolu a vody (42,5 1). Do suspenze se pomalu přidává ředěná kyselina methansulfonová do té doby, než se volná baze rozpustí a roztok dosáhne pH mezi 3,7 a 5. Do roztoku se přidá ethanol pro vysrážení mesylátové soli a získaná suspenze se ochladí na -10 °C a při této teplotě se ponechá několik hodin. Získané krystaly se izolují filtrací, promyjí se ethanolem (50 1) a suší se ve vakuu za zisku 3,4 kg deferoxamin mesylátu. HPLC chromatografie ukáže, že mesylát obsahuje-1,84 % hmot. nečistot. Obsah vlhkosti se určí Karl-Fischerovou analýzou a je 0,2 mol%. USP/NF 24/19, str. 2003-2004 (1999) . Zbarvení je lepší než Y5 při měření podle kriterií Evropského lékopisu pro skóre zbarvení.

Příklad 2

Surový deferoxamin B hydrochlorid (707 g) obsahující 587 g deferoxaminu B se rozpustí ve vodě (10 1). Vodný roztok se zpracuje přes chromatografickou kolonu obsahující Diaion® SP 207 adsorpční pryskyřici (1 1) při průtoku 0,35 l.h^-1. Eluát z kolony obsahuje 562 g deferoxaminu B. Eluát se potom vnesena lože Amberlite XAD 1180 adsorpční pryskyřice (7,2 1) v chromatografické koloně. Lože se eluuje při průtoku 0,7 l.h”¹, nejprve 5,6 1 10 g/1 roztoku chloridu amonného ve vodě a pottím 1:4 směsí methanolu-vody. Deferoxamin B (432 g) se odebere v jedné frakci. Tato frakce se odbarví míšením s aktivním uhlím (40 g) a přefiltruje se. Odbarvený eluát se. odpaří na koncentraci deferoxaminu B 60 g/1.

Potom se přidá stejný objem acetonitrilu. Potom se přidává vodný roztok amoniaku do té doby, než roztok dosáhne pH 9,8. Potom se přidají čtyři objemy acetonitrilu pro vysrážení volné baze deferoxaminu B. Získaná suspenze se ochladí na -4 °C a ponechá se při této teplotě po dobu 24 h, a potom se krystaly izolují filtrací. Izolované krystaly se potom promyjí trojím suspendováním ve směsi 1:1 vodaacetonitril a filtrací. Krystaly se potom suší při 40 °C a atmosférickém tlaku za zisku volné baze deferoxaminu B (341 g) s čistotou 95,2% (hmot./hmot.), jak se určí HPLC a s obsahem chloridů mehším než 60 ppm.

Baze deferoxaminu B se potom suspenduje ve směsi ethanolu (3,1 1) a vody (0,46 1). Pomalu se přidává kyselina methansulfonová, doku se baze deferoxaminu B nerozpustí a roztok nedosáhne pH 3,5. Dalších 30 1 ethanolu se přidá do roztoku pro vysrážení deferoxamin B mesylátu. Získaná suspenze se potom ochladí na teplotu mezi -5°C a 0°C a ponechá se při této teplotě 24 h. Krystaly se izolují filtrací, promyjí se. ethanolem a suší se ve vakuu za zisku deferoxamin B mesylátu (299 g) s čistotou 98 % (hmot./hmot.) podle HPLC analýzy.

Příklad 3

Surový deferoxamin B hydrochlorid (760 g) obsahující 530 g.... deferoxaminu B se rozpustí v 1:1 směsi acetonitrilu-vody (14 1) při 40°C. Získaný roztok se potom přefiltruje a pH se upraví na 9,9 přidáním koncentrovaného vodného roztoku amoniaku. Acetonitril (49 1) se potom přidá pro vysrážení volné baze deferoxaminu B. Získaná suspenze se potom ochladí na 17°C a ponechá se při této teplotě po dobu 4 hodin. Sraženina se izoluje filtrací, promyje se acetonitrilem a suší se za redukovaného tlaku za zisku volné baze deferoxaminu B (403 g). Baze se potom suspenduje ve vodě (20 1) a pomalu se přidává kyselina chlorovodíková do rozpuštění baze a dosažení pH mezi 5,0 a 5,5.

» »vs> Μ» . íř-í v «»«-«»-Η.Ο-·»Λ -*»*-·< M»^ Ί «·

Roztok se vnese na lože Amberlite® XAD 1180 adsorpční pryskyřice (7,2 1) v chromatografické koloně a eluuje se 25% acetonitrilem-vodou. Deferoxamin B (320 g) se získá v jedné frakci. Eluát obsahující deferoxamin B se odbarví pomocí aktivního uhlí (10 g). Po odbarvení se eluát obsahující 305 g deferoxaminu B zahustí na přibližně 110 g/1. Stejný objem acetonitrilu se potom přidá do roztoku. pH roztoku se potom upraví na 8,6 až 9,0 přidáním Amberlite® IRA 67 iontoměničové pryskyřice v OH” formě. Vodný amoniak se potom přidá do roztoku pro vysrážení volné baze deferoxaminu B. Přidávání, pokračuje do té doby, než suspenze dosáhne pH 9,8. Suspenze se potom ochladí na -4 °C a ponechá se při této teplotě po dobu několika hodin. Krystaly se potom izolují filtrací a suspendují se v 1:1 směsi acetonitrilu-vody, znovu se přefiltrují a potom se suší se za redukovaného tlaku. Vysušená volná baze deferoxaminu B se potom rozmělní na prášek před použitím pro přípravu mesylátové soli, jak je popsáno v příkladu 1, v posledním odstavci. Prášková volná baze má 97,8 % (hmot./hmot.) pole HPLC analýzy. Mesylátová sůl získaná za použití tohoto materiálu obsahuje 0,96 % nečistot (hmot./hmot.) podle HPLC analýzy a má obsah chloridů menší než 60 ppm. ;

Příklad 4

Deferoxamin B mesylát se izoluje ze surového deferoxaminu B způsobem podle příkladu 2, s tou výjimkou, že deferoxamin B hydrochlorid se eluuje z lože Amberlite® XAD 1180 adsorpční pryskyřice za použití 15% ethanolu-vody a potom 25% THF-vody. Takto získaný deferoxamin mesylát (238 g) má obsah nečistot 1,73% (hmot./hmot.) podlé HPLC analýzy.

Příklad 5

Surový deferoxamin B hydrochlorid se zpracuje chromatografií postupem podle příkladu 1. Po zahuštění eluátu obsahujícího deferoxamin B na 90 g/1 a odbarvení podle příkladu 1 se odbarvený eluát rozdělí na tři stejné podíly obsahující 40 g deferoxaminu B. Každý podíl se naředí antirozpouštědlem. Jeden podíl se naředí stejným objemem methanolu, další stejným objemem ethanolu a další stejným objemem acetonu. pH každého podílu se potom upraví na. 8,6 až 10,1 vodným roztokem amoniaku, což způsobí to, že se volná baze deferoxaminu B vyloučí z roztoku. Srážení se dokončí přidáním trojnásobku objemu 1:1 směsi acetonitril-antirozpouštědlo do každého podílu, tj. buď acetonitrilumethanolu, acetonitrilu-ethanolu nebo acetonitrilu-acetonu. Suspenze se potom ochladí na -20 až -5°C a volná baze deferoxaminu B se izoluje z každé suspenze filtrací. Krystaly se potom promyjí způsobem popsaným v příkladu 1. Postupem pro transformaci volné baze na mesylát podle příkladu 1 se získá deferoxamin B mesylát v množství od 24 do 28 g z 40 g surového deferoxaminu B. Obsah nečistot v takto získaném deferoxamin B mesylátu byl mezi 1,1 a 1,5% (hmot./hmot.).

Příklad 6

Postupuje se způsobem podle příkladu 2 s tou výjimkou, že surový deferoxamin B obsahuje sulfátový anion a Amberlite XAD 1180 pryskyřice se promyje vodným roztokem síranu amonného místo vodného roztoku chloridu amonného a potom se eluuje 10% acetonitrilem-vodou místo 1:4 směsi methanol-voda. Takto získaný roztok deferoxamin B mesylátu (261 g) má obsah nečistot 1,4% (hmot./hmot.) podle HPLC.

Příklad 7

Suspenze volné baze deferoxaminu B se připraví způsobem podle příkladu 2 a ochladí se popsaným způsobem na 4 °C. 1/10 suspenze obsahující 34,1 g volné baze deferoxaminu B se zahřeje na 36°C a mísí se při zvýšené teplotě po dobu jedné hodiny a potom se přefiltruje za zisku volné baze. Získané krystaly se suší a přemění se na deferoxamin B mesylát způsobem popsaným v příkladu 2. Produkt (27 g) má obsah nečistot 1,4% (hmot./hmot.) podle HPLC analýzy.

Příklad 8

Postupuje se podle příkladu 2, odstavců 1 a 2, s tou výjimkou, že podíl eluátu obsahující 43,2 g deferoxaminu B se neodbarvuje. Volná baze se dvakrát vysráži z tohoto podílu eluátu. Deferoxamin B se nejprve vysráži způsobem popsaným v příkladu 2, odstavci 2. Potom se vysrážená baze deferoxaminu B suspenduje v 1:1 směsi acetonitril-voda v koncentraci 40-50 g/l. Potom se pomalu do suspenze přidává jednomolární kyselina chlorovodíková, doku se deferoxamin B nerozpustí. Volná baze deferoxaminu B se potom znovu vysráži z roztoku způsobem podle příkladu 2, odstavce 2, a potom se transformuje na mesylátovou sůl, jak je popsáno v příkladu 2, odstavci 3, za zisku 27 g. deferoxamin B mesylátu. Barva produktu je neodlišitelná od barvy produktu z příkladu 2. Obsah nečistot je podle HPLC 1,4% (hmot./hmot.).

Příklad 9

Postupem podle příkladu I se surový deferoxamin B zpracuje chromatografií a eluát obsahující deferoxamin B (45,3 g) se odbarví. Odbarvený roztok se zahustí na 90 g/l a zpracuje se přes lože Diaion® SP 207 adsorpční pryskyřice. Vysrážení volné baze a její přeměna na mesylátovou sůl se provede tak, jak je popsáno ve druhém a třetím odstavci příkladu 1, takže se získá

31,5 g mesylátu s pouze 1,46% (hmot./hmot.) obsahem nečistot podle HPLC analýzy.

Příklad 10

Postupuje se podle příkladu 1 s tou výjimkou, že 200 1 acetonitrilu se zamění za 200 1 ethanolu pro indukci sráženi deferoxamin mesylátu. Deferoxamin B mesylát se získá s výtěžkem 94,7%.

Postupem podle příkladu 1, ale se záměnou propanolu, butanolu, amyl alkoholu, hexanolu a heptanolu za ethanol pro indukci srážení deferoxamin B mesylátu, se získá mesylát s výtěžkem v rozmezí od 83,1 do 89,1%.

Záměnou ethylformiátu, ethylaceatátu, butylacetátu, hexanu a THF za ethanol ve způsobu podle příkladu 1 se získá deferoxamin B mesylát s výtěžkem od 88,1 do 93,1 %.

V každé této variantě příkladu 1 je obsah nečistot menší než 2,5% (hmot./hmot.) podle HPLC.

Příklad 11

Deferoxamin mesylát připravený způsobem podle příkladu 1 se rekrystalizuje z methanolu a směsi methanolu a dalších rozpouštědel s výtěžkem od 81,3 do 93,7%. Rekrystalizace se provede rozpuštěním deferoxamin B mesylátu v 8,5 objemech methanolu při teplotě 35°C a potom přidáním jednoho z následujících rozpouštědel při teplotě místnosti: methanolu, · 'βν vκ. ?ι, wiW·!»,'*''*·?'--·.. ,~·-·, > - 1*· «“Ί 'χ ' «··»··* .*-* * - - « > .4 .»“»·» « Jfc ‘rň,· 1»ς ·

J , Λ ’ . ' . ' , ' ethanolu, propanolu, butanolu, ethylformiátu, ethylacetátu, butylacetátu, hexahu, toluenu, THF nebo acetonitrilu. rekrystalizovaný deferoxamin B mesylát má obsah nečistot obvykle 1,2-1,6 % (hmot./hmot), což je nižší než 1,84% (hmot./hmot.) obsah nečistot materiálu před rekrystalizací.

Po popisu vynálezu na jeho výhodných provedeních a po dokreslení vynálezu ve specifických příkladech je odborníkům v oboru jasné, že existují modifikace vynálezu, které také spadají do rozsahu předkládaného vynálezu. Je třeba si uvědomit, že popis a příklady uvedené výše jsou pouze ilustrativní a neomezují rozsah předkládaného vynálezu, který je omezen pouze připojenými nároky.

Claims

1. Způsob pro izolaci deferoxamin B mesylátu z materiálu obsahujícího deferoxamin B produkovaný mikrobiálně vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

a) adsorbování deferoxaminu B na adsorpční pryskyřici kontaktováním výchozího materiálu s adsorpční pryskyřicí;

b) získání eluátu obsahujícího deferoxamin B elucí adsorpční pryskyřice mající na sebe adsorbovaný deferoxamin B směsí vody a organického elučního rozpouštědla rozpustného ve vodě;

c) upravení pH eluátu na hodnotu mezi přibližně 8,6 a

10,5 pomocí bazické iontoměničové pryskyřice nebo alkalického roztoku, nebo obou;

d) krystalizaci volné baze deferoxaminu B z eluátu s upraveným pH pomocí adice anti-rozpouštědla pro volnou bázi deferoxaminu B, volitelně po částečném zahuštění eluátu na koncentraci deferoxaminu B ne vyšší než 150 g/1;

e) suspendování volné baze deferoxaminu B v směsi rozpouštědel tvořené anti-rozpouštědlem deferoxaminu B mesylátu a rozpouštědlem deferoxamin B mesylátu vybraném ze skupiny zahrnující vodu a methanol;

f) rozpuštění volné baze deferoxaminu B ve směsi rozpouštědel pomocí kontaktování suspenze s kyselinou methansulfonovou; a

g) vysrážení deferoxamin B mesylátu.

2. Způsob podle nároku lvyznačující áe tím, že dále obsahuje předběžný stupeň zpracování výchozího materiálu v pre-koloně s adsorpční pryskyřicí.

3. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že dále obsahuje předběžný stupeň přidání anorganické soli k výchozímu materiálu.

4. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že anorganickou solí je chlorid amonný nebo síran amonný.

5. Způsob podle nároku Ivyznačující se tím, že adsorpční pryskyřice je eluována směsí vody a organického rozpouštědla rozpustného ve vodě vybraného ze skupiny zahrnující methanol, ethanol, acetonitril a tetrahydrofuran.

6. Způsob podle nároku 5vyznačující se tím, že organickým rozpouštědlem rozpustným ve vodě je acetonitril.

7. Způsob podle nároku Ivyznačující se tím, že dále zahrnuje mezistupeň odbarvení eluátu před upravením pH eluátu.

8. Způsob podle nároku 1 vyznačující se tím, že dále zahrnuje upravení koncentrace deferoxaminu B v eluátupřed upravením pH eluátu.

9. Způsob podle nároku 8vyznačující se tím, že koncentrace deferoxaminu B v eluátu je upravena na přibližně 50 g/1 až přibližně 150 g/1 odpařením.

10. Způsob podle nároku 9vyznačující se tím, že koncentrace deferoxaminu B je upravena na přibližně 80 g/1 až přibližně 100 g/1.

11. Způsob podle nároku 10 vyznačující se tím, že koncentrace deferoxaminu B je upravena na přibližně 90 g/1.

12. Způsob podle nároku 8vyznačující se tím, že dále zahrnuje přidání acetonitrilu k eluátu po upravení koncentrace a před upravením pH.

13. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že pH eluátu je upraveno na hodnotu mezi přibližně 9,4 a přibližně 10.

14. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že pH eluátu je upraveno přidání alkalického roztoku.

15. Způsob podle nároku 14 vyznačující se tím, že alkalickým roztokem je roztok NaOH, KOH, amoniaku nebo aminu.

16. Způsob podle nároku 15 vyznačuj ící se tím, že alkalickým roztokem je vodný roztok amoniaku.

17. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že pH eluátu je upraveno za..použití bazické iontoměničové pryskyřice.

18. Způsob podle nároku 13 vyznačuj ící se tím, že pH éluátu je upraveno na hodnotu přibližně 9,4 až přibližně 10 přidáváním bazické iontoměničová pryskyřice do eluátu do dosažení pH mezi přibližně 8,0 a přibližně 9,3, separováním bazické iontoměničové pryskyřice a přidáváním vodného roztoku amoniaku do dosažení pH mezi přibližně 9,4 a 10.

19. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že směs rozpouštědel, ve které se suspenduje volná baze děferoxaminu B, obsahuje vodu a anti-rozpouštědlo pro deferoxamin B mesylát vybrané ze skupiny zahrnující C1-C7 alifatické alkoholy, aceton, methylformiát, methylacetát, ethylacetát, hexan, toluen, tetrahydrofuran a acetonitril.

20. Způsob podle nároku 19vyznačující se tím, že anti-rozpouštědlo pro deferoxamin B mesylát je vybrané ze skupiny zahrnující ethanol, aceton a acetonitril.

21. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že směs rozpouštědel, ve které se suspenduje volná baze deferoxaminu B, obsahuje methanol a anti-rozpouštědlo pro deferoxamin B mesylát vybrané ze skupiny zahrnující C1-C7 alifatické alkoholy, aceton, methylformiát, methylacetát, ethylacetát, hexan, toluen, tetrahydrofuran a acetonitril.

22. Způsob podle nároku 21 vyznačující se tím, že anti-rozpouštědlo pro deferoxamin B mesylát je vybrané ze skupiny zahrnující ethanol, aceton a acetonitril.

23. Způsob podle nároku 1 v y;z načující se tím, že srážení deferoxamin B mesylátu je urychleno ochlazením._

24. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že srážení deferoxamin B mesylátu je urychleno přidáním antirozpouštědla deferoxamin B mesylátu vybraného ze skupiny zahrnující C1-C7 alifatických alkoholů, acetonu, methylformiátu, methylacetátu, ethylacetátu, hexanu, toluenu, tetrahydrofuranu a acetonitrilu.

25. Způsob podle nároku lvyznačující se tím, že vyprážený deferoxamin B mesylát má obsah chloridových iontů přibližně 90 ppm nebo méně.

26. Způsob podle nároku Ivyznačuj í že vysrážený deferoxamin B mesylát obsahuje

2,5 mol % jiných polyhydroxamátů vzhledem k