CZ20021637A3

CZ20021637A3 - Způsob přípravy konjugované kyseliny linolové z kyseliny linolové prostřednictvím mikroorganismů a tímto získaný výrobek

Info

Publication number: CZ20021637A3
Application number: CZ20021637A
Authority: CZ
Inventors: Simo Laakso; Auli Rainio; Marjata Vahvaselka; Annika Mayra-Makinen; Soile Tynkkynen; Tarja Suomalainen
Original assignee: Valio Ltd
Priority date: 1999-11-19
Filing date: 2000-11-16
Publication date: 2002-11-13
Also published as: AU1709301A; US6960456B1; HUP0204173A3; RU2002116367A; WO2001036653A1; EP1240348A1; BR0015663A; HRP20020427A2; HUP0204173A2; HRP20020427B1; NO20022361D0; CA2390572A1; NZ518902A; KR20020065523A; ZA200203539B; RU2265664C2; FI19992477L; HU224704B1; JP2003514535A; CN1391613A

Description

ZPŮSOB PŘÍPRAVY KONJUGOVANÉ KYSELINY LINOLOVÉ Z KYSELINY LINOLOVÉ PROSTŘEDNICTVÍM MIKROORGANISMŮ A TÍMTO ZÍSKANÝ VÝROBEK

OBLAST TECHNIKY

Vynález popisuje způsob přípravy konjugované kyseliny linolové. Zejména je popisován způsob přípravy konjugované kyseliny linolové, konkrétně jejího cis-9,trans-11 izomeru z kyseliny linolové kvašením.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

CLA je obecně používaný název pro různé izomery konjugované kyseliny linolové, ze kterých pouze dva izomery (cis-9,trans-11 izomer, t.j. hovězí kyseliny, a trans-10,cis-12 izomer) jsou biologicky aktivní. Synteticky vyráběné komerční CLA přípravky obyčejně obsahují všechny různé izomery CLA a pouze 40 % představují cis-9,trans-11 izomery, zatímco mléko obsahuje 80 % cis-9,trans-11 izomeru 18:2.

Mnohé studie uvádějí, že živočišné tuky obsahují mastné kyseliny, které mimo dalších věcí inhibují u testovaných zvířat rakovinu, ovlivňují růstové faktory a mohou ovlivňovat množství tukové tkáně v organismu. Při studování hovězích hamburgerů Michael Pariza objevil, že obsahují mastné kyseliny, a po jejich rozboru bylo zjištěno, že jsou to konjugované linolové kyseliny (CLA). V pokusech na zvířatech bylo zjištěno, že ve skupině, která byla krmena ; výživou obsahující CLA, došlo ke snížení výskytu počtu nádorů prsních žláz, nádorů žaludku a tlustého střeva ve srovnání s kontrolní skupinou (Pariza, M.W., Loretz, L.J., Storkson, J.M. and Holland, N.C., Mutagens and modulátor of mutagenesis in fried ground beef, Cancer Res. ^!(Suppl.), 1983, 43:2444s-2446s and Pariza, M.W. and Hargraves, W.A., A beef-derived mutagenesis modulátor inhibits initiatioň of mouše epidermal tumors by 7,12-dimethylbenzanthracene, Carcinogenesis, 1985, 6:591-593). CLA jsou schopné inhibovat vývoj rakovinných buněk také v tkáňových kulturách lidských buněk. Mechanismus, kterým se to děje, je zatím stále neznámý, ale bylo zjištěno, že CLA působí na různá stadia vývoje rakoviny, na mnoho růstových faktorů a možná také na metabolismus karcinogenních substancí v játrech. Dále se také předpokládá, že CLA pracují jako antioxidant (Ip, C., Chin, S.F., Scimeca,

J.A. and Pariza, M.W., Mammary cancer prevention by conjugated dienoic derivatives of linoleic acid, Cancer Res., 1991, 51:6118-6124), pomocí něhož by sloučenina chránila buněčné membrány od nepříznivého účinku volných radikálů. Byl také studován efekt sloučeniny na snižování cholesterolu a bylo zjištěno, že sloučenina nesnižuje množství lipoproteinu přenášející

V?^ř ···: ·· ·· ···· cholesterol v krvi (HDL), jak činí léčivá snižující cholesterol (Lee, K.N., Kritchevsky, D. and Pariza, M.W., Conjugated linoleic acid and atherosclerosis in rabbits, Atherosclerosis, 1994, 108:19-25). CLA mohou být užitečné pro hubnoucí, neboť bylo zjištěno, že sloučenina’ štěpí tukové tkáně (Park et al., Changes in Body Composition in Mice during Feeding and Withdrawal of Conjugated Linoleic Acid, Lipids, 1999, 34:243-248). .

Naopak, nekonjugovaná kyselina linolová je uváděna jako mající nepříznivé účinky, např. stimulační efekt na rakovinu prsu. Antimikrobiální efekt nekonjugované kyseliny linolové je také všeobecně známý. . . <

CLA mohou být vyráběny chemicky, nebo enzymatickou izomerizací. Přírodní CLA jsou vytvářeny např. v bachoru přežvýkayých zvířat z polynenasycených mastných kyselin jako výsledek biologické aktivity bakterie Butyrivibrio fibrisolvens a jsou odtamtud vylučovány do mléka a do masa, které jsou považovány za nejlepší zdroje CLA.

Bylo zjištěno, že množství CLA dosaženého 'z jídla se značně snížilo během posledního desetiletí. V dietních analýzách je spočítáno,,že v roce 1970 obsahovala průměrná výživa přibližně 0,45 g CLA denně. Jelikož se užívání mléka a mléčných výrobků snižuje, je, průměrná spotřeba v současnosti 0,25 g CLA. Zvýšení přírodních CLA v jídle je vysoce potřebné z hlediska obecného zdraví, neboť podle výzkumu by zdvojnásobení příjmu CLÁ omezilo například riziko rakoviny.

Různé studie uvádějí zvláště mléko ze všeho jídla jako důležitý zdroj CLA. Například, podle finského epidemiologického průzkumu (Knekt et al., ústní prohlášení) užívání mléka snižuje riziko rakoviny prsu. Současně, koncentrace CLA'v tucích mléka se značně liší v období (2,4 až

28,1 mg/g tuku) v závislosti na kvalitě krmení.

Bylo zjištěno, že CLA vytvářejí prospěšné mikroby v zažívacím traktu. Konkrétně, byly studovány bakterie Butyrivibrio fibrisolvens vyskytující se v bachoru a jejich enzym izómeráza. Nicméně, tato bakterie je tak anaerobní, že není možné vyrábět CLA s její; pomocí , v průmyslovém měřítku, neboť dosažení plně anaerobních podmínek vyžadovaných tímto kmenem je složité a neekonomické (US 5 856 149, Pariza ét al.).

i 'M _s

Bylo také zjištěno, že i Propionibacterium ac/ztďprodukuje CLA, ale tento patogenní kmen také produkuje enzym reduktázu, která redukuje produkované CLA dále na další mastné kyseliny (Verhulst et al., System. Appl. Microbiol., 9:12-15 (1987). ;

Je také dobře známo, že některé bakterie produkující kyselinu propionovou jsou schopné přeměnit linoleovou kyselinu na konjugovanou cis-9,trans-11 formu.

Navíc, je všeobecně známo, že přeměna volné linolové kyseliny na CLA je více účinná než přeměna mastné kyseliny ve formě triglyceridu. Nicméně, volná kyselina linolová má inhibiční • · · · · - · · · · .,. ·'· · · • · · · · · · ··· · ··· ·· · · ’ · φ • Φ····· · · · · ··· ··· ··· ····· ·· · ······ účinek na růst bakterií produkující kyselinu propiónovou i V poměrně nízkých koncentracích, což zabraňuje produkci konjugované linoleové kyseliny, a zvláště tak cis-9,trans-11 formy ve velkém měřítku.

US 5 856 149 (Pariza and Yang) popisuje způsob produkce cis-9,trans-11 mastné kyseliny přeměnou nekonjugované nenasycené (dvojné vazby v pozici 9 a 12) mastné kyseliny kmenem

I

Lactobacillus reuterii, nejlépe L. reiterii PYR8. Publikace popisuje izolaci kmenů produkujících CLA, a uvádí, že jen 4 z 45 izolovaných kmenů měly požadovanou linoleát izorherázovou aktivitu a tak byly schopni produkovat CLA z linolové kyseliny. Vědci objevili, že množství produkovaného CLA byl v přímém poměru k množství buněk, a domnívají se, že linoleát izomeráza je shromažďující enzym, který nemá funkční význam v buněčném růstu. Publikace i neuvádí inhibiční efekt kyseliny linolové na bakteriální růst, a dále žádný roztok neřeší tento !

i problém. _f ‘

V článku „Production of conjugated linoleic acid by dairy startér cultures“, J. Appl. Microbiol., I 85 (1998), pp. 95-102, J. Jiang, L. Bjórck and R. Fonden je uvedeno, že bakterie produkující :

ji- . - ' -i kyselinu propionovou jsou schopné přeměnit kyselinu linolovou na CLA. Jiang et al. Studoval j schopnost 19 různých startovacích bakterií přeměnit linolovou kyselinu přidávanou k růstovému \

J d . r médiu na CLA poté, co bylo objeveno, že zrající sýry obsahují vyšší hladiny CLA než jiné

Ij mléčné produkty. Studovali schopnost 7 kmenů lactobacilu, 4 kmeny laktokoku, 2 kmeny = streptokoku a 3 bakterií produkujících propionovou kyselinu produkovat CLA z kyseliny ; linolové v MRS, mléce a Na-laktátovém médiu. Navíc byly studovány různé koncentrace ' kyseliny linolové přidáváním kyseliny linolové do MRS média ve vodném roztoku detergentu : Tween 80. Jen několik málo bakterií produkujících kyselinu propionovou ze studovaných ;

j i.

bakterií byly shledány jako mající schopnost (biologické přeměny, tři ze šesti kmenů, t.j. ; Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichiiP1F a PFF6 a P. freudenreiéhii ssp. ; shermanii PFS vykazovaly aktivitu biologické přeměny. Nejvyšší výtěžek 265 pg/ml z původní ; kyseliny linolové o koncentraci 750 pg/ml byl dosažen s kmenem PFF6. Z produkovaných CLA · bylo 70 až 90 % tvořeno biologicky aktivním cis-9,trans-11 izomerem. Žádný z laktobacilů, laktokoků nebo streptokoků neprodukoval CLA.

Tak, nejlepší bakterie produkující propionovou kyselinu, PFF6 kmen, byly schopné přeměnit pouze 35 % přidané kyseliny linolové na CLA technikou popisovanou Jiang et al. Vědci objevili, že produkce CLA propionovými bakteriemi koreluje pozitivně s jejich tolerancí k volné kyselině : linolové. Tato studie také potvrdila všeobecně známý fakt, že linolová kyselina má antimikrobiální účinky, které inhibují růst bakterií. Publikace uvádí, že účinek antimikrobiálních mastných kyseliny může být omezen použitím povrchově aktivních látek, jako je detergent, např. .

·· 0-0 0·»· 00 ·0 • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 ·

0 0 0 0 0 000 • 00 00 0 0 · ·· ····

Tween 80, nebo proteiny. Tyto studie však nejsou na těchto řádcích uváděny a publikace nepopisuje možné užitečné techniky.

WO 99/29 886, J. Jiang, L. Bjórck and R. Fonden, je částečně založen na výsledcích výzkumu vyplívajících z výše zmíněného článku. Přihláška Se týká použití konkrétních bakterií užitečných v potravinářském využití k produkci CLA in vitro. Navíc k Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii a P. freudenreichii ssp. shermanii, je vhodnou bakterií také Bifidobacterium ' breve. Podle publikace může kvašení probíhat v přítomnosti emulgátoru, jako příklady jsou uvedeny Tween 80 a lecitin. Nicméně, použití emulgátoru není popisováno v příkladech této publikace, a navíc, nejlepší získané výsledky, jsou uvedeny jako stejné ve výše uvedené publikaci: 246,4 pg/ml biologicky aktivního cis-9,trans-11 izomeru získaného z původní kyseliny linolové o koncentraci 750 pg/ml při použití kmene PFF6. Výtěžek tak byl menší než ' 33 %.

Proto tedy je zde stále značná potřeba poskytnutí nových způsobů výroby konjugované kyseliny ; linolové se zdokonalenými výtěžky. Jestliže je zde potřeba využití co největšího možného S množství volné linolové kyseliny jako počátečního materiálu CLA, je základní věcí vyřešit, jak mohou být minimalizovány nebo zamezeny problémy spojované s antimikrobiálními účinky .

i volné linolové kyseliny.

PODSTATA VYNÁLEZU

Cílem navrhovaného vynálezu je poskytnutí nového způsobu produkce konjugované kyseliny linolové s vysokým výtěžkem.

Cílem navrhovaného vynálezu je také poskytnutí nových produktů, které jsou vyráběny způsobem podle navrhovaného vynálezu a které obsahují velká množství CLA.

Navrhovaný vynález je založen na myšlence, že inhibiční efekt volné kyseliny linolové na růst bakterií je omezen přidáváním linolové kyseliny do média ve formě, která značně neinhibuje růst

j.

bakterií, ale je jim během kultivace dosažitelná.

Podle navrhovaného vynálezu bylo zjištěno, že jestliže je linolová kyselina přidávána do reakční směsi jako micelámí směs, má značně nižší inhibiční účinek na růst bakterií, než kyselina linolová v jakékoliv jiné formě. Prostřednictvím přidání vhodných velkých detergentů zůstává kyselina linolová micelámí za kultivačních podmínek. To také omezuje inhibiční efekt kyseliny linolové na růst bakterií. Použití micelámí kyseliny linolové a stabilizace micel během kultivace také umožňuje značně zdokonalený výtěžek CLA.

Použitím micelámí linolové kyseliny jako počátečního materiálu pro kvašení a vybíráním vhodného poměru kyseliny linolové s detergentem je možné dosáhnout více než 90% přeměny •J · · · · · · · · · , ··· ·· «· · ·» ···· . . ί kyseliny linolové na CLA a přes 97 % vytvořeného CLA je uvolňováno do média. Podlé ? navrhovaného vynálezu je způsob vyvíjen tak, aby bylo připraveno velké množství linolové j kyseliny ve formě, která umožňuje bakteriím účinně přeměnit kyselinu linolovou na CLA, J obzvláště na cis-9,trans-11 izomer, bez reakce trpící z inhibičního účinku kyseliny linolové na růst bakterií. í

Vynález také popisuje způsob přípravy CLA z kyseliny linolové pomocí mikroorganismů, ’ přičemž se tento způsob vyznačuje tím, že kyselina linolová používaná jako počáteční materiál je : přidávána do reakční směsi ve formě micel.

Micely obsahují volnou kyselinu linolovou a detergent ve vhodném poměru. i

Vynález dále popisuje produkty vyráběné způsobem podle navrhovaného vynálezu a jejich použití jako takových, nebo ve výrobě praktických jídel a zdraví podporujících látek.

Tvorba micel může být prováděna jednoduchým způsobem smícháním kyseliny linolové s . micely vytvářejícím detergentem ve vhodném poměru za alkalických podmínek. Příprava nevyžaduje zvláštní podmínky ani specielní zařízení. Je to snadné, levné a jednoduché také přo, > provedení ve velkém měřítku.

Volná kyselina linolová je používána pro tvorbu micel podle navrhovaného vynálezů. Volná ' kyselina linolová je komerčně dostupná. . Jinak je také možné připravit volnou kyselinu linolovou ; z rostlinných olejů, např. světlicový olej, kukuřičný olej nebo slunečnicový olej, hydrolýzou volných mastných kyselin při využití zmýdelnění způsoby, které jsou známé (např. Christie, ; W.W., Gas Chromatography and Lipids - a Practical Guide, 2. edition, 1989, The Oily Press, j Ayr, Scotland).

Často je zvažováno ekonomické hledisko, že čistá, volná kyselina linolová je velmi drahá. A í synteticky připravená kyselina linolová není vždy vhodná pro použití v potravinářství kvůli , chemickým zbytkům.

Slunečnicový olej je výhodným zdrojem kyseliný linolové. Obsahuje až 78 % kyseliny linolové j a příprava volných mastných kyselin z tohoto oleje je až stokrát ekonomičtější než komerčně dostupná volná kyselina linolová. .

Z pohledu navrhovaného vynálezu není výběr detergentu kritickým parametrem, například polyoxyethylen sorbitan estery (Tween přípravky, různí výrobci, např. Fluka a Sigma) a PEG 20 sorbitan oleát Kotilen-0/1 VL (Dr. W. Kolb AG) velmi rozšířené v oblasti mikrobiologie, jsou pro tento účel velmi vhodné. Použitelné jsou také další různé detergenty.

ty? ;

Přeměna micelované kyseliny linolové, která byla připravena výše zmíněným způsobem, na , CLA může být účinně provedena kvašením. Při kvašení je možné použít kterékoliv bakterie, které jsou schopné přeměnit linolovou kyselinu na CLA, jako jsou bakterie popisované výše v ' ·· <«···' · · · · ‘ • '· · · · · ♦ ». · · I • » ···'· · · · · · · í • · · · · · · · · ·· · · · · · ······ j i j dosavadním stavu techniky. Nicméně, kvašerií je výhodně prováděno s bakteriemi rozkládajícími * potraviny, zvláště s propionovými bakteriemi. Vhodné kmeny například zahrnují ty z druhu í Propionibacterium freudenreichii a zvláště kmeny patřící do podruhu P. freudenreichii ssp. freudenreichii a P. freudenreichii ssp. shermanií. >

Micelámí kyselina linolová je stabilizována přidáváním povrchově aktivní látky, t.j. dětergent, k ; médiu v množství, které eliminuje účinek média. Výše zmiňované látky, jako jě; Tween a \ Kotilěn, mohou být používány jako povrchově aktivní látky. Výhodná koncentrace povrchově i aktivní látky závisí na množství přidané micelámí linolové kyseliny a na použitém médiu. ; Detergent je obyčejně používán v množství 0,5 až 1,5%, nejlépe jako 1%. Micelovaná kyselina i linolová je tak přidávána do kvasné směsi jako počáteční materiál pro CLA. _t :

Nová technika podle navrhovaného vynálezu dovoluje přidat kyselinu linolovou až do alespoň > 1000 pg/ml média ke kvasné směsi bez toho, že by se značně měnil růst bakterií nebo se snížila účinnost přeměny. Proto je biologická přeměna značně lepší touto technikou, než jinými ;

) známými technikami, t.j. alespoň 80 % kyseliny)linolové se přemění na CLA, a alespoň 75 % ) j, • těchto CLA představuje biologicky nej aktivnější ižomer.

Kvašení· probíhá přesně známým způsobem. Média a podmínky jsou vybírány tak,_; aby byly ) splněny požadavky používaných kmenů, aby bylo dosaženo optimálního výtěžku CLA. Po ;

) zveřejnění navrhovaného vynálezu bude výběr parametrů vhodného kvašení odborníkům v této technice zřejmý. , < Při použití micelované kyseliny linolové je možné produkovat CLA v souvislosti s bakteriálním í růstem vyloučením růst inhibujíeího efektu kyseliny linolové. CLA mohou být také produkovány ; zároveň s buněčnou produkcí určenou pro jiné účely. Jeden zvláštní znak způsobů podle i navrhovaného vynálezu je, že CLA mohou být produkovány po buněčné kultivaci nebo samostatně od toho, při použití nečinných, t.j. nerostoucích, buněk, podle něhož mohou být . CLA produkovány jak ve výživném médiu, tak i ve vyrovnávacím roztoku. Není nutné přidávání , samostatného detergentu do vyrovnávacího roztoku pro stabilizaci micel kyseliny linolové s ; detergentem. Je-li to vyžadováno, mohou být .CLA formy také spojeny tak, aby byly obsaženy i přímo v (potravinovém) výrobku, který má být výroben výrobním procesem používající popisované bakterie. < i

CLA vytvořené kvašením a uvolňované z buněk mohou být izolovány z kvasné směsi základními technikami v tomto oboru, a pokud je to vyžadováno, mohou být pozměněny na vysoce čisté CLA produkty přesně známými způsoby. Nebo mohou .být také kvasná směs ; obsahující CLA a bakteriální buňky použity jako takové, nebo mohou být CLA koncentrovány ; nebo s bakteriálními buňkami usušeny.

·· 4 4 ···· 4 4 - ·· . í

4 * 4 4 4 4 4 · 4 ' · i • · · 4 4 4 4 4 · ’

4 4 4 4 4 * » 4 4 4 • 4 4 4 4 4 4 4 4’ j

4 4 44 44 · 4 4 4 4 4 4 j

Získaný CLA obsahující výrobek může být používán jako takový jako zdraví podporující látka.' Výrobek může být také použit ve výrobě praktických potravin a podobně.

V tomto dokumentu je pojem potrava použit v širokém smyslu, který zahrnuje všechny jedlé | výrobky, které mohou být v pevné, želatinové nebo tekuté formě, a který, zahrnuje jak výrobky f připravené pro spotřebu, tak i výrobky, ke kterým je přidán výrobek podle navrhovaného ? vynálezu v souvislosti se spotřebou, jako přísada nebo jako stálá složka výrobku. Například, | potravu mohou představovat výrobky mléčného průmyslu, maso zpracujícího průmyslu, ; potraviny zpracujícího průmyslu, nápojového průmyslu, pekárenského průmyslu a cukrářského ; průmyslu. Typické výrobky zahrnují mléčné výrobky, jako jogurt, sražené mléko, tvaroh, kysané j mléko, podmáslí a další kvašené mléčné nápoje, nezrající sýry a zrající sýry, náplně svačin apod. . Nápoje, jako jsou syrovátkové nápoje, ovocné nápoje a piva, představují další důležitou skupinu, j

Sublimačně sušené přípravky, jako jsou CLA obsahující kapsle a prášky propionových bakterií, * . · .!· ·,' * a kvašené mléčné výrobky, jejichž obsah CLA je zvýšen aktivitou propionových bakterií, jsou , uváděny jako preferované zpracování; ;

Dále bude vynález popsán podrobněji prostřednictvím příkladů. Tyto příklady jsou záměřeny na zobrazení vynálezu, neomezují žádným způsobem jeho oblast. !

'0 · · 0 ····· · · · ······ ··· · ····· · · 0 ··· ·· «· * ·· ·*··

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1.

Účinek micelizace na bakteriální růst a produkci CLA

Aby byl dokázán účinek způsobu podle navrhovaného vynálezu, byl podstoupen srovnávací test, který studuje růst a produkci CLA propionovými bakteriemi v médiu obsahující volnou kyselinu linolovou, volnou kyselinu linolovou a detergent, a kyselinu linolovou micelovanou podle příkladu 1 a detergent. Jako kontroly byla použita stejná média bez přidávání (pozitivní kontrola

I růstu) a médium, ke kterému byl přidán pouze detergent.

Pro test byly prvně kultivovány kmeny propionové bakterie Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS (PJS), DSM 7067, a P. freudenreichii ssp. freudenreichii 131 (P131) v živném médiu MRS s:

1. bez přidání

2. 600 pg/ml kyseliny linolové

3. přidáním 600 pg/ml kyseliny linolové ze zásobního roztoku obsahujícím 5 mg/ml kyseliny linolové a 1% Tween 80 přípravek ve vodném roztoku (konečný obsah : Tweenu je 0,2%)

4. přidáním 0,9% Kotilenu a 600 pg/ml kyseliny linolové micelované podle příkladu 1

5. přidáním samotného 0,9% Kotilenu (bez kyseliny linolové)

PJS kmen by také kultivován v médiu založeném na syrovátce, které obsahovalo 5% syrovátkový permeát (Valio Oy), 2% kaseinový hydrolyzát (Valio Oy) a 1% kvasinkový extrakt (LabM), bez výše zmiňovaných přísad 1 až 5.

Každý bakteriální kmen byl kultivován v kultivačním médiu dvakrát při teplotě 30 °C po dobu 72 hodin, poté byla každá testovaná směs naočkována 1% čerstvou kulturou. Testované kultury byly sledovány při 30 °C po 4 dny a byla určována buněčná hustota kultury jako zákal při použití Kletí metru. Na konci kultivace (96 hodin) bylo měřeno množství vytvořeného CLA plynovou chromatografií, cis-9,trans-11 izomer zvlášť a další izomery dohromady.

Byl proveden rozbor mastných kyselin s některými obměnami, jak popisuje M. Suutari, K. Liukkonen a AS. Laakso v článku „Temperature adaptation in yeasts: the role of fatty acids“, J. Gen. Microbiol., 136 (1990) 1469-1474. Vzorky média byly odebrány pro rozbory a buňky byly separovány odstřeďováním ( 5000 g, 15 minut). Supernatant byl filtrován na 0,2 μιη filtru a byly odebrány vzorky 0,2 až 0,5 ml. Buněčná hmota byla promyta kohoutkovou vodou. Vzorky , supernatantu a promyté buňky byly sublimačně sušené.

K sublimačně sušeným vzorkům byl přidán 1 ml zmýdelňovacího činidla, které představoval 3,7 , M NaOH roztok v 49% methanolu. Vzorky byly opracovány dusíkem, smíchány a inkubovány ;

• · ·.		4 44 4	4 4	• 4
• · ·	- 4	4 ·	9	4 .	4	4	*
• ' ·	•	• ·	•	• ^ř	4		•
						4
4 ·	4	• 4	4	•	4	4
• 4 4	4 4	4 4	*	• 4		4 4 4	4

v uzavřených zkumavkách při teplotě 100 °C ve vodní lázni po 30 minut a jednou během té doby míchány. Vzorky byly ochlazeny na pokojovou teplotu a k nim byly přidány 4 ml methylačního činidla, které představoval 3,3 M HCl roztok v 48% methanolu. Vzorky byly opracovány ¹dusíkem, smíchány a zkumavky se vzorky byly inkubovány ve vodní lázni při teplotě 80 °C po 10 minut, poté byly schlazeny.'Methyl estery mastných kyselin byly vyjmuty přidáním 1,5 ml : roztoku hexan/methyltercbutyletheru (1:1) ke vzorkům a plynulým třepáním po 10 minut. 1 Spodní vodná fáze byla odstraněna Pasteurovou pipetou. Organická vrstva byla promyta · přidáním 3 ml 0,3 M NaOH roztoku ke vzorkům a plynulým třepáním zkumavek po dobu 5 ? minut. Vzorky byly odstředěny (5000 g, 20 minut) a organická vrstva vzorku byla získaná zpět ^sPasteurovou pipetou. Vzorky byly sušeny síranem sodným a ošetřeny dusíkem.

Methyl estery mastných kyselin byly analyzovány plynovou chromatografií (Hewlett Packard i 5890 series II, Pennsylvania, USA), ke kterému býl připojen plamenový ionizační detektor (FID) ; a automatické vzorkující zařízení (Hewlett Packard 7673A). V rozborech byla používána ‘ kapilární kolona (HP-FFAP, 25 m x 0*2 m x 0,3 pm). Vzorky byly vstříknuty děleným ; vstřikováním (dělený poměr je 1:20; rychlost mytí přepážky je 1 až 2 ml/min.). Sací tlak kolony ; byl 150 kPa a rychlost průtoku nosného plynu (helium) do kolony byl přibližně ί ml/min. ' Rychlost průtoku vytvořeného plynu (vzduch) byl 30 ml/min. a rychlost průtoku vodíku do detektoru byl 40 ml/min. Teplota vstřikování a teplota detektoru byla 250 °C. Teplota trouby byla 70 až 200 °C. Teplota se zvýšila při rychlosti 25 °C za minutu. Výsledky byly zpracovány ( pomocí HP Chemstation software připojeném k plynovému chromatografu.

Mastné kyseliny ve vzorcích byly určovány porovnáváním jejich retenčních dob se známými , standardy mastných kyselin. Přípravek od firmy Sigma byl použit pro určení konjugované ‘ kyseliny linolové, přípravek představoval směs cis- a trans-9,11 a -10,12 izomerů CLA. Jako : interní standard pro určování množství mastných kyselin byl používán 09:0 methyl ester ( mastné kyseliny (methyl ester nonadekanové kyseliny, Sigma). ¹

Výsledky růstu bakterií jsou ukázány v tabulce 1.1.

Tabulka 1.1

Růst kmenů PJS a P131 v MRS médiu obsahujícím kyselinu linolovou (LA)

PJS	Oh	24 h	48 h	72 h	96 h
1) kontrola	2	38	180	325	415
2) LA	78	•84	96	106	110
3) LA + detergent	40	49	68	94	120

' 8 · 4 ..	4 4	• 44 4	• 4	44
«« . .·	5-4	4	•	4	• · '	4. 4 ·
• ·	•	•	•	•	•	• *
i· ·	•	4	•	•	•	• 4
• 4 ·	• »	• ·		*	• ·	··· ·

4) LA (micela) + detergent	11	36	125	252	370
5) detergent	1	35	185	340	430
P131
1) kontrola	8	37	122	270	425
2) LA	80	90	97	107	115
3) LA + detergent	55	60	74	95	114
4) LA (micela) + detergent	1	20	71	160	270
5) detergent	0	22	104	244	410

Z výsledků vyplívá, že kyselina linolová mající koncentraci 600 pg/ml jako taková, nebo přidána ^;skrze zásobní roztok mající 1% Tween ve vodném roztoku, inhibuje růst obou kmenů v porovnání s kontrolou. Použitím odpovídajícího množství micelované kyseliny linolové podle ; navrhovaného vynálezu byl inhibiční efekt kyseliny linolové na růst redukován a kmen rostl ( téměř stejným způsobem jako kontrola. ' > f

Množství CLA vytvořeného PJS a P131 kmeny v médiu založeném na MRS je ukázáno ^!v tabulce 1.2 a odpovídající výsledky PJS kmenu v médiu založeném na syrovátce jsou ukázány ! v tabulce 1.3. ‘ ^; ‘ i

Tabulka 1.2 ' * - ^;

-· 7· » ' ·

Tvorba CLA kmeny PJS a P131 v MRS médiu obsahujícím kyselinu linolovou (LA)

PJS	Celkové CLA pg/ml kultura	CLA (c9,tl 1) pg/ml kultura	CLA výtěžek %	Podíl c9,t 11 izomeru z celkové CLA (%)
1) kontrola	39	¹ -9	-	24
2) LA	195	135	32	69
3) LA + detergent 0,2%	279	227	47	81
4) LA (v micelách) +	680	490	100	73
detergent 0,9%
5) detergent 0,9%	247	64	-	26
P131
1) kontrola	41	11	-	26
2) LA	66	16	11	25
3) LA + detergent 0,2%	78	26	13	34

_i

4) LA (v micelách) +	308	134	51	44
detergent 0,9%			•
5) detergent 0,9%	232	63	.·	27

Tabulka 1.3

Tvorba CLA kmenem PJS v syrovátkovém médiu obsahujícím kyselinu linolovou (LA)

PJS	Celkové CLA pg/ml kultura	CLA (c9,tll) pg/ml kultura	CLA výtěžek %	Podíl ,c9,t 11 izomeru z celkové CLA (%)
kontrola	16	-	-	- '
LA	13	-	-	-
LA + detergent 0,2%	⁵³	13 ‘	2	25
LA (v micelách) +		i
detergent 0,9%	440	420 .	73	96

Z výsledků vyplívá, že micelizace podle navrhovaného vynálezu umožňuje téměř 100% přeměnu kyseliny linolové na CLA, ze kterých přes 75 % tvoří výhodný cis-9,trans-l 1 CLA izomer. : Jestliže je kyselina linolová přidávána jako taková, jen 32 % je přeměněno na CLA, a jestliže je j kyselina linolová přidávána v 1% roztoku detergentu, je na CLA přeměněno jen 47 %. Proto je I značně lepšího výsledku dosaženo s mičelizací podle navrhovaného vynálezu, která vykazuje jak , minimalizaci inhibičního účinku kyseliny linolové na . bakteriální růst, tak i maximální CLA produkci z kyseliny linolové. * , i

PŘÍKLAD 2. * . i

Příprava micel kyseliny linolové ;

Pro přípravu micelámího zásobního roztoku bylo do testovaných zkumavek naváženo 300 mg ; kyseliny linolové (cis-9,trans-12-oktadekadienová kyselina, L-1376, Sigma), bylo přidáno 10 ml _;bezkyslíkaté destilované vody obsahující 0,36 ml sorbitan oleát detergentu (Kotilen 0/1 nebo ' Tween 80) a jemně mícháno. Ke směsi byly přidány uvážlivě kapky 2 N roztoku hydroxidu sodného tak, aby se směs trochu zčeřila (přibližně 0,5 až 0,6 ml). Roztok byl přenesen do 50 ml ; odměmé láhve a láhev byla naplněna po značku bezkyslíkatou destilovanou vodou, pomocí toho i byl získán micelámí zásobní roztok obsahující 6 mg/ml kyseliny linolové. Roztok byl rozdělen

	„ -·'· .. » 4 • .4	4 4. 4 4 4 · 4 4 4 4 4 4 «	44 ' 4 4 ♦ 4
	• 4	4 4 4	4 4
4 ·	• ·	4 · »	4 4

do dvou vhodných dávek, prostřednictvím dusíku byl odstraněn vzduch a dávky byly zamraženy ’ a uchovány. · i

Zásobní roztok micel může být připraven také více koncentrovaný nebo více zředěný, než jak je ^!> popisováno výše. Je nezbytné, aby poměry mezi množstvím volné kyseliny linolové a sorbitan 5 oleát detergentů zůstával stejný jako výše. . i

- · . Ί.

s

PŘÍKLAD 3.

Efekt kyseliny linolové a detergentů na bakteriální růst a produkci CLA

Účinek poměru kyseliny linolové k detergentů byl stanoven kultivací propionových bakterií ^;v růstovém médiu založeném na syrovátce a MRS médiu (LabM) v kultuře 150 ml. Médium založené na syrovátce obsahovalo 2% syrovátku (Valio Oy), 0,5% trypton (LabM) a 1% _;kvasinkový extrakt (LabM). Kyselina linolová byla přidána k médiu jako výše popisovaný ! zásobní roztok ve formě micel tak, aby koncentrace volné kyseliny linolové v médiu byla 600 ; pg/ml. Požadované množství sorbitan oleát detergentů (Kotilen 0/1 nebo Tween 80) bylo přidáno ^:k médiu zvlášť. Bylo upraveno pH média na 6,3; v kulturách byl používán kmen propionových bakterií P. freudenreichii ssp. shermanii JS jako 2% (objem/objem) očkovací látka, který byl ; kultivován v médiu založeném na syrovátce. Kultivace probíhala při teplotě 30 °C. Bakteriální ; růst byl sledován po dobu 96 hodin měřením zákalu média Klett-Summersonovým kolórimetrem ! (filtr ě. 66). CLA a kyselina linolová byly vyhodnocený plynovou chromatografií.

Výsledky jsou ukázány v tabulce 2. Produkce CLA zde a v CLA výsledcích příkladů 3 až 4 : ukazují CLA vytvořené PJS mikrobiálními buňkami, . vypočítané odečítáním množství CLA vytvořeného v médiu z detergentů od celkových CLA koncentracích. Výtěžek CLA je vypočítán následovně: gram vytvořeného CLA/gram původní LA.

·· ·.> ’

- ů

Tabulka 2

Účinek koncentrací detergentů v syrovátkovém médiu a MRS médiu *) na růst PJS a produkci CLA ;

Přidávání detergentů	Klett	Výtěžek CLA
k syrovátkovému médiu	hodnota	(%)
LA (kontrola)	34	< 1
0,9% Kotilen (kontrola)	365’	< 1
LA + 0,2% Kotilen	77	33
LA+ 0,9% Kotilen	306	65
LA + 1,2% Kotilen	309	67

• ΦΦΦΦΦ · · · φ • · · φ φ φφ φ .·· Α· · Φ» ΦΦΦΦ

Přidávání detergentu k MRS médiu	56	51
LA + 0,1% Tween 80
LA + 0,8% Tween 80	301	83

*) MRS médium obsahuje 0,1% Tween 80, následkem 0,1% přidání vzroste konečná ·, koncentrace na přibližně 0,2%.

Kyselina linolová může být přidána ve velkém množství v micelámí formě k růstovému médiu PJS kmene bez toho, že by došlo k úplné inhibici buněčného růstu. Z výsledků v tabulce 2 f vyplívá, že přidávání detergentu dále umožňuje redukovat inhibiční efekt kyseliny linolové. í Jestliže je poměr kyseliny linolové k detergentu »v médiu vhodný, může být množství kyseliny í linolové v médiu zvýšeno tak, že její přeměna na CLA v souvislosti s buněčným růstem je tak i účinná jako v malých koncentracích kyseliny linolové. Tak je dosaženo průmyslové významných j ; množství požadovaného cis-9,trans-l 1 izomeru CLA. V tomto testu byla optimální koncentrace ;

sí . . ♦ _L :· kyseliny linolové 600 pg/ml a obsah detergentu byl 0,9 až 1%, ale mohou být použita;také větší j množství. ’ , PŘÍKLAD 4. Í ί

Produkce CLA kvašením s upravovaným pH _f ¹ ;

Nejúčinnější způsob kultivace propionových bakterií v průmyslovém měřítku je kultivace v kvasném zařízení, kde může být zachováno optimální pH média pro buněčný růst. Výrobní ’ proces konjugované kyseliny linolové prostřednictvím růstu PJS buněk byl vyzkoušen v kvasné i - ^;· ^: i kultuře, jejíž objem roztoku činil 2 litry. Jako růstové médium bylo použito syrovátkové médium podle příkladu 2. Růstové médium obsahovalo micelovanou kyselinu linolovou 400, 600, 1000 , nebo 1400 pg/ml a 0,6, 0,9 nebo 1,5% detergent Kotilen. Během kultivace bylo zachováno pH ! růstového média 6,3 s koncentracemi kyseliny linolové 400, 600 a 1000 pg/ml a 6,5 : s koncentrací kyseliny linolové 1400 pg/ml prostřednictvím automatického přidávání roztoku amonia. Kultivační teplota byla 30 °C a rychlost míchání byla 100 otáček za minutu. Koncentrace životaschopných buněk propionových bakterií byla stanovena v upraveném agaru s mléčnanem sodným a agarové misky byly anaerobně inkubovány při teplotě 30 °C po dobu 5 až 7 dní.

• /··/.	44 *	·· · · ·	4 4
4 · 4	• - · ·	·· i 4	'4 ·
• · 4	• 4	4	4 4
• · ·	• 4	4	4 ·
4 · ··	',· 9	•	4 4

' i

Obrázek 1 ukazuje tvorbu CLA z kyseliny linolové, kdy bylo do média přidáno 400 pg/ml í kyseliny linolové a 0,6% sorbitan oleát detergent. Přeměna kyseliny linolové na CLA jasně í probíhá současně s růstem PJS buněk.

Tabulka 3 porovnává produkci CLA probíhající v kvasném zařízení, kdy obsah kyseliny linolové * v médiu je 400, 600 a 1000 pg/ml, po 94 hodinové kultivaci, a při koncentraci 1400 pg/ml, po j ' í

108 a 132 hodinové kultivaci. ;

í ⁴ j

Tabulka 3

Produkce CLA v kultuře PJS buněk s upraveným pH (

	LA 400 pg/ml deterg. 0,6% 94 hodin	LA 600 pg/ml deterg. 0,9% 94 hodin	j LA 1000 .. pg/ml deterg. 1,5% * 94 hodin	LA 1400 pg/ml deterg. 1,5% 108 hodin	LA 1400 pg/ml • deterg. 1,5% 132 hodin
koncentrace buněk (cfu/ml)	1,3 x 10¹⁰	1,12 x 10¹⁰	j l,4x 10¹⁰	2,4 x 10⁹	1,3 xlO¹⁰
koncentrace CLA (pg/ml)	515	886	v 1270	1490	1650
výtěžek CLA (%)	84	77	í 63 5í.	79	91
podíl mimobuň. CLA (%)	98	99	; ⁹⁸	99	99
podíl eis-9,trans-11 (%)	75	83 '	73	95	94
podíl cis-9,trans-11 (%) *			'1 ’	81	82
spotřeba kyseliny linolové (%)	93	94	1 92	90	92

* obsahuje také CLA pocházející z Kotilenu.

• Λ , ‘ 4 * , ·«. «< - ·-·-·· ' ♦». · > .

·· · ♦ · ' ♦ .· · ♦ ♦ ¹ • 4 · ♦ · · · ♦ · ··'„····· · · · · • · 4 · ♦ · ··· 99 '99 · ♦ ·. ····

PŘÍKLAD 5. , ί

Produkce CLA po fázi buněčného růstu

Schopnost propionových bakterií produkovat CLA po fázi buněčného růstu byla zkoušena : opakováním kvašení z příkladu 3 s tím rozdílem, že kyselina linolová a sorbitan oleát detergent ;

I v micelámím roztoku byly přidány k médiu jen na konci rychlé fáze buněčného růstu PJS buněk, ; po 51 hodinách od začátku kultivace. Koncentrace kyseliny linolové v médiu byla 600 pg/ml a : detergent byl 0,9%. Buněčná koncentrace v okamžiku přidávání byla 1,8 x IO¹⁰ efu/nil. Poté byl buněčný růst zastaven na přibližně tři hodiny a pak vélmi pomalu pokračoval.

Přeměna kyseliny linolové na CLA vyráběná buňkami probíhá velmi rychle: za tři hodiny byl ^;výtěžek CLA 45 % a ža šest hodin byl 58 %. Výhodou tohoto způsobu je kratší celkové trvání : kvašení (přibližně 60 hodin) při porovnání s odpovídající kultivací, kdy jsou kyselina linolová a : detergent přítomny v růstovém médiu od počátku'(přibližně 100 hodin).

' ί

PŘIKLAD 6. f ~

Použití nerostoucích bakteriálních buněk pro produkci CLA v upraveném roztoku i PJS buňky byly kultivovány v růstovém médiu založeném na syrovátce po dobu 3 dnů při teplotě 30 °C, pak byly buňky odstředěny a promývány s 0,1 M roztokem fosfátu sodného (pH 6,0). K ; 50 ml 0,1 M roztoku fosfátu sodného (pH 7,8) byly přidány 2 gramy čerstvé buněčné hmoty tak, aby buněčná koncentrace v roztoku byla 3 x TO¹⁰ cfu/ml. Byla přidána micelovaná kyselina , linolová podle příkladu 1 tak, aby koncentrace kyseliny linolové v upraveném roztoku byla 600 pg/ml. Roztok byl inkubován při teplotě 6 °C nebo 30 °C po dobu 21 hodin. CLA byla hodnocena GC metodou a měřením spektrofotometrem při vlnové délce 235 nm.

Výsledky jsou ukázány v tabulce 4. K tvorbě CLA v upraveném roztoků prostřednictvím ’ nerostoucích PJS buněk docházelo při všech studovaných teplotách, nejúčinnější byla teplota , 30 °C. Produkce CLA ve výživném roztoku vyžaduje přidávání detergentů, aby byla kyselina : linolová zachována v micelámí formě. Výhodná koncentrace detergentů závisí na koncentraci počátečního materiálu v roztoku. Naopak, v upraveném roztoku není vyžadováno přidávání l· samostatného detergentů k reakční směsi, dokonce to může být jasně škodlivé,

Tabulka 4 ’ ,

Výtěžek CLA (gram vytvořeného CLA/gram LA s nerostoucími PJS buňkami ve fosfátovém roztoku, pH 7,8) ·

• . · *..	9'9> .999·	9 9 9 9
• 9 · ·	9 9 ·	9	• 9 9
• · ·	9 · ·	9	9 ·

.9 ·- ·	9 · 9	9	9 9
999·	99 ·		9 9 999 9

	Výtěžek CLA (%)
Reakční doba (h)	6 °C	30 °C
3	3	20
5	5	29 ⁵
21	20	63

PŘÍKLAD 7.

Výroba CLA ze světlicového oleje . a) Zmýdelnění světlicového oleje (

Mastné kyseliny jsou ze světlicového oleje uvolňovány zmýdelněním za přívětivých podmínek s činidlem proti okysličování, pomocí něhož je (zabráněno okysličování kyseliny linolové. Pro í zmýdelnění jsou například používány hydroxid draselný nebo sodný, ethanol, voda a kyselina i

askorbová v následujících poměrech: světlicový'olej 10 g, nasycený vodný roztok KOH 5 ml, ί ethanol 50 ml, voda 10 ml (množství může být také nižší) a kyselina askorbová 1 g. Směs je zpracována dusíkem a uzávěr je těsně uzavřen. Směs je zmýdelněna přes noc magnetickým ; mícháním. Nezmýdelněný podíl je z roztoku výtažen například 30 ml hexanu. Pro zabránění emulgace může být do směsi přidána také voda. Poté je roztok okyselen koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou (pH 2 až 3). Mastné kyseliny jsou z roztoku vytaženy např. dvakrát s ; 40 ml hexanu. Hexan je vypařen v otáčivém ůdpařovači, tuk je přemístěn do láhve mající těšný uzávěr se závitem a je ošetřen dusíkem po několik málo mírnit. Poté je tuková směs připravena a ; je uložena do mrazáku, aby se předešlo stávajícímu okysličení. í

b) Tvorba micel ,

Micely mastných kyselin jsou připraveny podle navrhovaného vynálezu ze směsi volných , mastných kyseliny připravených ze světlicového oleje prostřednictvím Kotilenu, Vody a hydroxidu sodného, například podle následujících poměrů: 700 mg přípravku světlicového oleje, ^:30 ml vody, 0,75 ml Kotilenu, 1,5 ml 2 N roztoku hydroxidu sodného. Před smícháním mohou být Kotilen a voda zahřívány na přibližně 40 °C. Kotilen je smíchán s vodou ošetřenou dusíkem. ; Do směsi je přidán přípravek světlicového oleje a směs je dobře míchána. Nakonec je přidáván ; po kapkách roztok hydroxidu sodného, dokud není směs zčeřena.

c) Produkce CLA » ' j

CLA mohou být produkovány z roztoku tuku pomocí bakterií například následujícím způsobem: , k růstovému médiu, které obsahuje např. 2% syrovátku, 0,5% kasein hydrolysát, 0,5% kvasinkový extrakt a 0,9% Kotilen, je přidáván roztok obsahující kyselinu linolovou a 2% ;

• 4

očkovací látku Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii· JS kultury, která rostla po tri í

X ] dny. CLA výtěžek (%) produkovaný bakteriemi při teplotě 30 °C je zobrazen v tabulce 5. .* ' -i

Tabulka 5 ‘ |

CLA výtěžek v poměru k přidanému množství kyseliny linolové , í

Čas (dny)	původní kyselina linolová pg/ml	CLA (cis-9,trans-11) výtěžek %
3	600	95 ;
4	1500	⁸⁶

PŘÍKLAD 8. f - . · j

Příprava směsi obsahující sušené CLA · i

Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS byla kultivována v syrovátkovém médiu, ik - - ..

které obsahovalo 2% syrovátku (Valio Oy),'- 0,5% kasein hydrolysát (Valio Oy), 0,5% kvasinkový extrakt (Lab M) a 0,2 g micelizované kyseliny linolové jako v příkladu 1. Médium bylo naočkováno 1% čerstvou bakteriální kulturou, pH bylo ponecháno na 6,5 automatickou pH ; upravující jednotkou a teplota byla zachována na 30 °G během kultivace. Po čtyř dnech kultivace , byla buněčná kultura společně s médiem vypařena otáčivým výpamíkem na jednu čtvrtinu , původní kultury a získaný koncentrát byl sublimačně vysušen v Heto sušičce. Výtěžek prášku · byl 23 až 25 g/1000 ml. Výsledný prášek obsahoval 8,056 mg/g CLA (193 mg/24 g prášku), tj. j 96 % původní kyseliny linolové bylo přeměněno na CLA. Z celkové CLA bylo 79 % biologicky ^; nej aktivnějšího izomeru. Výsledky jsou ukázány v tabulce 6. :

^;' j

Tabulka 6

Produkce CLA pomocí PJS do růstového média

	PJS
Celkové množství CLA prášku, mg/g	8,056
cis-9,trans-11 izomer, mg/g	6,373
Kyselina linolová, mg/g	0,609

Claims

1. Způsob přípravy konjugované kyseliny linolové z kyseliny linolové prostřednictvím : mikroorganismů, vyznačující se tím, že kyselina linolová je přidávána do ;

reakční směsi ve formě micek ;

) t

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že micely také obsahují povrchově j aktivní látku. » í

3. Způsob podle nároku 1 nebo 2, vyznačující se tím, že micely jsou vytvořeny reakcí volné kyseliny linolové s povrchově aktivní látkou za zásaditých podmínek.

* . · '

4. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3,( vy ziiačuj í cí se t í m, že micely i obsahují směs kyseliny linolové a polyoxyethylen sórbitan monooleát. |

5. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, ,vy z.n ač uj í c í se tím, že připravuje 1 hlavně cis-9,trans-11 izomer konjugované kyseliny linolové.

6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5,' vyznačující se tím, že přeměna je uskutečněna propionovou bakterií (bakteriemi). i • · i

7. Způsob podle nároku 6, vy zna.čuj í cí; se tím, že propiónová bakterie je kmen patřící do druhu Propionibacterium frěudenreichii, a nejlépe do, jeho. poddruhu : Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii nebo Propionibacterium freudenreichii ; ssp. shermanii. ; í

8. Způsob podle nároku 7, vy zn a č u j í c í- se tím, že průpionová bakterie je : Propionibacterium freudenreichii ssp. freudenreichii 131 nebo Propionibacterium freudenreichii ssp. shermanii JS.

9. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, . v y zn a č u j í c í se t í m, ž e příprava , konjugované kyseliny linolové probíhá současně s bakteriálním růstem.

10. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se tím, že přeměna probíhá v přítomnosti povrchově aktivní látky. .

I

11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že povrhově aktivní látka je j polyoxyethylen sórbitan monooleát, který je používán v koncentraci 0,5 až 1,5%. :

· · · · .4 4 4 .4-4 4 4 ·

Ι· ·4·«

12. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 8, vyzná č u jící se tím, že příprava ;

i konjugované kyseliny linolové probíhá po kultivaci bakterií. j j

i

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že přeměna probíhá s buňkami oddělenými z růstového média bez samostatného přidání povrchově aktivní látky. >

14. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, vyznačující se tím, že příprava konjugované kyseliny linolové probíhá ve spojitosti s přípravou potravinového výrobku.

15. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, v y z načující se tím, že konjugovaná ' !) kyselina linolová je izolována z reakční směsi a může být sušena.

16. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 13, jv y ž n a č U j í c í se tím, že konjugovaná kyselina linolová a bakteriální buňky jsou koncentrovány a mohou být sušeny.

j

17. Způsob podle nároku 16, vyznač u j í c íi s e t í m, ž e linolová kyselina a bakteriální buňky jsou znovu získány, koncentrovány a sublimačně usušeny.

18. Výrobek získaný způsobem podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17.