CZ200194A3

CZ200194A3 - Quinoline derivatives

Info

Publication number: CZ200194A3
Application number: CZ200194A
Authority: CZ
Inventors: Anders Bjoerk; Stig Joensson; Tomas Fex; Gunnar Hedlund
Original assignee: Active Biotech Ab
Priority date: 1998-07-15
Filing date: 1999-07-14
Publication date: 2001-05-16
Also published as: EE200100010A; BR9912109B1; ZA200007593B; ES2205854T3; UA64791C2; HK1035715A1; EP1095021A1; OA11906A; IL140346A0; ATE250036T1; IS2208B; NO20010211D0; RU2213733C2; BR9912109A; CN1309641A; HUP0103224A2; CA2336968C; CA2336968A1; WO2000003991A1; TR200100087T2

Description

Oblast vynálezu

Předložený vynález se týká nových substituovaných derivátů chinolin-3karboxamidu, způsobů jejich přípravy, přípravků tyto deriváty obsahující a způsobu jejich využívání při klinické léčbě onemocnění pocházejících z autoimunity jako je roztroušená skleróza, diabetes melitus závislý na podávání inzulínu, systémový lupus erythematosus, revmatická artritida, zánětlivá střevní onemocnění a psoriaza a dále onemocnění, kde hraje hlavní úlohu patologický zánět jako u astmatu, atherosklerozy, mrtvice a Alzheimerovy choroby. Předložený vynález se zvláště týká nových derivátů chinolinu vhodných k léčbě například roztroušené sklerózy a jejích projevů.

Dosavadní stav vynálezu

Autoimunní onemocnění, např. roztroušená skleróza (MS), diabetes melitus závislý na podávání inzulínu (IDDM), systémová lupus erythematosus (SLE), revmatická artritida (RA), zánětlivé onemocnění střev (IBD) a psoriaza představují napadení lidského imunitního systému, které může být systémového původu nebo jiného původu namířeného proti jednotlivým tělesným orgánům. Objevují se jako onemocnění, při kterých imunitní systém vytváří poruchy a namísto zprostředkování ochranných funkcí se chová jako agresor (1).

MS je nejobecnějším získaným neurologickým onemocněním mladých dospělých lidí v západní Evropě a Severní Americe. Ta představuje proti jiným neurologickým onemocněním této skupiny větší handicap a finanční ztráty a to jak na ztrátě výdělku, tak na lékařské péči. Ve Spojených Státech je přibližně 250000 případů MS.

- 2 Přesto, že příčina MS je neznámá, pokrok ve výzkumu při zobrazování mozku, v imunologii a v molekulární biologii zlepšil porozumění této chorobě. K léčbě MS se běžně používá několik terapií, avšak žádná z nich jednotlivě neprokázala dramatickou účinnost léčby. Běžný způsob léčby MS spadá do tří kategorií: léčby akutního podráždění, tlumení postupující choroby a terapie specifických symptomů.

MS ovlivňuje centrální nervový systém a aktivuje demyelinační pochod, tj. ztrácí se myelinová ochrana a chrání se axony. Myelin vytváří izolační látku umožňující rychlé vedení nervových impulzů. Při demyelinaci se tato vlastnost evidentně ztrácí. I když nerozumíme patogenním mechanizmům odpovědným za MS, některé cesty ukazují, že demyelinace má imunopatologický základ. Patogenní léze a plaky jsou charakterizovány infiltrací imunologicky aktivních buněk jako jsou makrofágy a aktivované T-buňky (2).

V US patentech č. 4,547,511 a č. 4,738,971 a v EP 59,698 jsou nárokovány některé deriváty N-aryl-1,2-dihydro-4-substituovaného 1-alkyl-2-oxochinolin-3karboxamidu jako prostředku ke zlepšení bunéčné imunity. Sloučenina

Rochinimex [Roquinimex] známá jako rochinimex [Roquinimex] (Měrek Index, 12. vyd., č. 8418; Linomide®, LS2616, N-fenyl-N-methyl-1,2-dihydro-4-hydroxy-1 -methyl-2-oxochinolin-3karboxamid) náleží do této řady sloučenin. Rochinimex byl uváděn jako látka s mnohočetnými imunomodulačními účinky bez doprovodné obecné imunosuprese (3-12).

• ♦

- 3 V US patentu č. 5,580,882 jsou nárokovány deriváty chinolin-3-karboxamidu, jako vhodné pro léčbu stavů spojených s MS. Přednost se dává zvláště sloučenině rochinimex. V US patentu č. 5,594,005 jsou nárokovány deriváty chinolin-3karboxamidu jako látky vhodné k léčbě diabetů typu I. Přednost se dává zvláště sloučenině rochinimex.

WO 95/24195 jsou nárokovány deriváty chinolin-3-karboxamidu, jako látky vhodné pro léčbu střevních zánětlivých onemocnění. Přednost se dává zvláště sloučenině rochinimex nebo jejím solím. Ve WO 95/24196 jsou nárokovány deriváty chinolin-3-karboxamidu, které jsou vhodné pro léčbu psoriazy. Přednost se dává zvláště sloučenině rochinimex nebo jejím solím.

Při klinických zkouškách porovnávajících rochinimex s placebo bylo uváděno, že rochinimex je slibný při léčbě stavů spojených s MS (13, 14). S rochinimexem jsou spojeny ovšem i některé vážné nevýhody. Bylo například zjištěno, že rochinimex je u krys teratogenní a u lidí působí vedlejší účinky v závislosti na velikosti dávky, např. syndrom podobný chřipce, což brání plnému využití klinického potenciálu této sloučeniny.

Ve WO 92/18483 nárokované deriváty chinolinu substituované v poloze 6 skupinou R_AS(O)_n (Ra = nižší alkyl nebo aryl; n = 0 - 2) se navíc uvádí, že tyto látky mají imunomodulační, protizánětlivý a protinádorový účinek.

Substitucí, tj. typem a charakteristikou, uvádí výše uvedené a zmiňované sloučeniny mimo rozsah předloženého vynálezu.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu jsou strukturně nové sloučeniny chinolinu, které jsou svým farmakologickým profilem s vysokým účinkem na pokusné modely a nízkou úrovní vedlejších účinků vhodné pro léčbu onemocnění pocházejících z autoimunity a patologických zánětů. Příklady takových onemocnění jsou roztroušená skleróza, diabetes melitus závislá na inzulínu, systémová lupus erythematosus, revmatická artritida, zánětlivé onemocnění střev a psoriaza a dále ·· * ··

9··· ·· 94 9··

9999 ·· 4 94 · 9 999 9 9 99 ·

9999 ·· 4 *4 «9 9* 944 9 9 9

- 4 taková onemocnění, kde hraje hlavní úlohu zánět, jako je například astma, atheroskleróza, mrtvice a Alzheimerova choroba. Předložený vynález se týká zvláště nových derivátů chinolinu vhodných pro léčbu například roztroušené sklerózy a jejích projevů.

Termínem „léčba“ tak, jak je zde používán, se míní profylaxe a rovněž tak poskytování pomoci proti symptomům onemocnění.

Překvapivě bylo zjištěno, že nové sloučeniny obecného vzorce (I)

kde

R se vybírá z methylu, ethylu, n-propylu, iso-propylu, n-butylu a allylu;

R’ se vybírá z methylu, methoxylu, fluoru, chloru, bromu, trifluormethylu a OCH_xF_y; kde x = 0 až 2, y = 1 až 3 s výjimkou, kdy x + y = 3;

R” se vybírá z vodíku, fluoru a chloru s výjimkou, že R” se vybírá z fluoru a chloru, pouze pokud R’ se vybírá z fluoru a chloru;

R₄ se vybírá z vodíku a farmaceuticky přijatelných anorganických kationtů jako je například sodík, draslík a vápník a organických kationtů jako je například monoethanolamin, diethanolamin, dimethylaminoethanol, morfolin a podobných;

R₅ se vybírá z ethylu, n-propylu, iso-propylu, methoxylu, ethoxylu, chloru, bromu, trifluormethylu a OCH_xF_y a OCH₂CH_xF_y;

kde x = 0 až 2, y = 1 až 3 s výjimkou, kdy x + y = 3;

*· ·« · ·♦ « · · <·«· · · · ♦ ·♦ · 0 ♦ Φ ·

- 5 Reje vodík; nebo

R₅ a R₆ jsou společně methylendioxylem;

jsou neočekávaně účinné a specifické při léčbě jedinců postižených autoimunními nebo zánětlivými onemocněními.

Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou existovat v různých tautomerních formách a všechny tyto tautomerní formy pokud existují sem též náležejí.

U řešení, kterým se podle vynálezu dává přednost se R₄ vybírá z vodíku měno sodíku,

R₅ se vybírá z ethylu, methoxylu, chloru a trifluormethylu,

R₅ a R₆ jsou společně methylendioxyl,

R se vybírá z methylu a ethylu,

R' se vybírá z methoxylu, fluoru, chloru a trifluormethylu pokud je R” vodík a

R” se vybírá z meta’- a para-fluoru, pokud je R’ orthofluor.

Mezi sloučeniny obecného vzorce (I) , kterým se podle předloženého vynálezu dává přednost patří:

N-ethyl-N-(3-fluorfenyl-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3karboxamid,

N-ethyl-N-(4-methoxyfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-

3-karboxamid,

N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-(2,5-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2oxoch i nol i n-3-karboxam id,

N-ethyl-N-(3-methoxyfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-ethyl-1-methyl-2-oxochinolin-

3-karboxamid, • · · * · · · · ♦ · · • · ·· · · · • · · · Φ · · · * ♦ 9 ♦ · « · · • · «· ·· «·· φ · · · • · · • · · • · · »* ·♦

- 6 N-methyl-N-(2-fluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1 -methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxoch i no I i n-3-karboxam i d,

N-methyl-N-(2,5-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxoch i no I i n-3-karboxam id,

N-methyl-N-(4-chlorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-(4-trifluormethylfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydrOxy-5,6-methylendioxy-1-methyl-

2-oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-(4-methoxyfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-trifluormethyl-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid.

Pro mnohá lidská spontánní autoimunní onemocnění existují pokusné modely u kterých tato onemocnění nastávají spontánně a to například u určitých chovů laboratorních zvířat nebo mohou být vyvolána u těchto laboratorních zvířat imunizací specifickým antigenem nebo antigeny z cílového orgánu.

Pokusná autoimunní encefalomyelitis (EAE) jako model autoimunních zánětlivých onemocnění centrálního nervového systému (CNS) byla široce využívaným modelem pro lidské onemocnění roztroušenou sklerózou.

Autoimunitu na kolagen typu II lze pokusně vyvolat u jistých chovů myší nebo krys a ta může vést k vývoji polyartritidy. Kolagenem vyvolaná artritida má několik společných obecných rysů s lidským onemocněním revmatickou arthritidou.

Charakteristikou astmatu u lidí je zvýšená reaktivita dýchacích cest na široký obor chemických a fyzikálních stimulů. Nyní se již vcelku uznává, že produkty uvolňované ze zanícených buněk, např. aktivované eosinofily ohrožují integritu epithelu a budí silnou bronchiální odezvu. Model zápalu plic u myší způsobeného

- 7 ovoalbuminem (OA) je převážen dočasně regulovaným přívodem lymfocytů a eosinofilů do bronchiálního lumenu (cév).

Bylo zjištěno, že rochinimex vyvolává syndrom bolestivosti beaglů (BPS) (15, 16) u různých plemen loveckých psů. Onemocnění vykazuje klinické a laboratorní projevy ospravedlňující použití BPS jako modelu syndromu podobného chřipce u lidí vyvolaného rochinimexem.

Sloučeniny obecného vzorce (I) byly testovány na inhibici pokusné akutní autoimunní encefalomyelitis (aEAE) u myší. Pro řízení léčby byl použit rochinimex a vykázal více než 50 % inhibici při >5 mg.kg'¹. Překvapivé a neočekávané výsledky byly získány při zavedení odpovídající substituce do chinolinového kruhu v poloze 5. V porovnání s rochinimexem se účinnost sloučeniny substituované 5chlorsubstituentem zvýšila 100 krát. Odpovídající substituce do polohy 6, 7 a 8 měla za důsledek vznik méně aktivních sloučenin. Účinku substituce v poloze 5 lze nejlépe porozumět na fyzikálně chemickém základě. Aktivita EAE z pohledu inhibice EAE byla obecně v následujícím sestupném pořádku podle polohy substituentu: 5 > 6 » 7 = 8. Při porovnání účinků sloučenin substituovaných v poloze 5 a 6 se ukazuje, že mezi oběma existuje významný statistický rozdíl na každé normální úrovni (p< 0,001), a účinek substituce v poloze 5 je největší. Vlastní aromatická substituce 3-karboxamidového fragmentu do chinolinového fragmentu sloučeniny obecného vzorce (I) značně omezila nebo i odstranila vedlejší účinky rochinimexu, tj. teratogenní účinky a BPS. Fyzikálně chemické vlastnosti substituentu v poloze 5 v chinolinovém fragmentu a ortho- metaa/nebo zvláště para- substituent ve 3- karboxamidovém fragmentu mají při porovnání s rochinimexem hlavní důležitost pro zlepšení poměru rizika a výhod. Rovněž tak záměna methylové skupiny na karboxamidovém dusíku vyšší alkylovou skupinou značně zmenší vedlejší účinky. Sloučenina obecného vzorce (I) byla tedy překvapivě zjištěna jako sloučenina jak chemicky, tak farmakologicky odlišná od léčiv navrhovaných k léčbě MS a jejích projevů.

Všechna řešení vynálezu jak jsou uvedena v nárocích jsou zde ve specifikaci uvedena.

Následující příklady jsou zamýšleny k objasnění vynálezu, aniž by nějak omezovaly jeho rozsah.

Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou být připravovány způsoby známými z literatury a podle následujících metod:

Způsob A:

II III I

Sloučeniny obecného vzorce (I) lze připravovat známými způsoby, například způsobem znázorněným výše, reakcí esterových derivátů karboxylových kyselin chinolinu s anilinem ve vhodném rozpouštědle jako je toluen, xylen a podobných. Obecné způsoby přípravy esterových derivátů karboxylových kyselin chinolinu obecného vzorce (II) jsou popsány dále. N-alkylované aniliny obecného vzorce (III) jsou komerčně dostupné nebo známé z literatury, např. v Johnstone, et al., J. Chem. Soc., 2223 - 2224, 1969. Sloučeniny náležející do oblasti obecného vzorce (III) lze připravit způsoby, které jsou obecně analogické s postupy popsanými v literatuře.

Způsob B:

III

IV

- 9 ·· «« ·· · ·· φ • *· φ φ φ φ · φ··· • · ·Φ φ · · ·φ φ ······* φ φ ♦ φ· φ φ « φ · · · φ ·· ·· ·· Φ· φφ>· ·····

Sloučeniny obecného vzorce (I) mohou být také připravovány reakcí karboxylové kyseliny chinolinu obecného vzorce (IV) s anilinem obecného vzorce (III). Lze použít různá kopulační činidla známá v oboru, např. karbodiimidy známé z US patentu č. 4,547,511. Jeden z vhodných způsobů využívá thionylchlorid v přítomnosti triethylaminu a vhodného rozpouštědla jako je dichlormethan. Tohoto způsobu lze použít v případech, kdy přímá vazba mezi esterem a anilinem neprobíhá, například pokud anilin obsahuje substituenty odebírají elektrony. Karboxylové kyselina chinolinu obecného vzorce (IV) může být získána z * odpovídajících esterů obecného vzorce (II) kyselou hydrolýzou podle popisu uvedeného níže.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Ethylester kyseliny 1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1 -methyl-2-oxochinolin-3karboxylové

K roztoku 2,6-difluorbenzonitrilu (42 g, 0,30 mol) ve 150 ml bezvodého methanolu byl pomalu při 30 °C přidáván methoxid sodný (17,9 g, 0,33 mol). Po zahřívání pod refluxem po dobu 1 hodiny byl přidán 40 % vodný roztok methylaminu (133 ml, 1,2 mol) a výsledný roztok refluxován po dobu 4 dní. Při ochlazení se vyloučil bílý pevný 2-methoxy-6-(methylamino)benzonitril, který byl oddělen filtrací. Precipitát byl rozpuštěn ve vodném roztoku ethylenglykolu (500 ml) a hydroxidu draselného (14 g). Roztok byl přes noc refluxován při teplotě 150 °C, ochlazen na laboratorní teplotu a pH nastaveno koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 4. Vytvořená kyselina anthranilová byla oddělena filtrací, promyta vodou (50 ml) a ve vakuu vysušena. Kyselina 6-methoxy-N-methylanthranilová (32 g, 0,18 mol) a bikarbonát sodný (^8 g, 0,45 mol) byly suspendovány v 1,4-dioxanu (500 ml). Potom byl pomalu za chlazení v ledové lázni přidáván fosgen (25 ml, 0,45 mol). Směs byla zahřívána při 40 °C po dobu 1 hodiny, ochlazena na 15 °C a přidáno 150 ml vody. Vytvořený anhydrid isatoový byl oddělen filtrací. Po pečlivém vysušení byl 5-methoxy-N-,ethylisatoový anhydrid (20,7 g, 0,10 mol) za ·· ·< · ·· *·«· *··· «·· «««« 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 9 99 9 9 ·

- 10 laboratorní teploty přidán k roztoku diethylmalonátu sodného (31 g, 0,17 mol) ve 250 ml bezvodého Ν,Ν-dimethylformamidu. Roztok byl po dobu 3 hodin zahříván na 100 °C, ochlazen na laboratorní teplotu, přidáno 250 ml vody a pH nastaveno koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou na hodnotu 4. Sraženina byla oddělena filtrací, ve vakuu vysušena a získána sloučenina uvedená v nadpisu jako čistě bílé krystalky (22 g) s výtěžkem 48 %.

1H NMR (CDCI₃) δ 1,43 (t, 3H), 3,62 (s, 3H), 3,96 (s, 3H), 4,45 (q, 2H), 6,70 (d, 1H), 6,92 (d, 1H), 7,55 (t, 1H), 13,5 (s, 1H).

Příklad 2

Ethylester kyseliny 1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3karboxylové

Fosgen (51 g, 0,52 mol) rozpuštěný ve 150 ml dioxanu byl po částech přidáván do mechanicky míchané kaše kyseliny 2-amino-6-chlor-benzoové (30 g, 0,175 mol) a bikarbonátu sodného (44 g, 0,52 mol) ve 300 ml dioxanu. Nastala prudká reakce s vývinem plynu; tato reakční směs byla ochlazena a udržována na teplotě pod 50 °C. Pak se v míchání při 50 °C pokračovalo ještě 1 hodinu. Reakční směs byla ochlazena na 15 °C, výsledná sraženina oddělena, promyta vodou a usušena za vzniku isatoového anhydridu. Anhydrid (5 g, 0,025 mol) byl rozpuštěn v 50 ml Ν,Ν-dimethylacetamidu a ochlazeno na 0 °C. Ke směsi byl pomalu po částech přidáván hydrid sodíku (75 %) (0,94 g, 0,028 mol), potom methyljodid (1,89 ml, 0,030 mol) takovou rychlostí, aby se teplota udržela pod 5 °C. Reakční směs byla míchána za laboratorní teploty po dobu 5 hodin. Přebytečný methyljodid byl za vakua odstraněn. Potom byl přidán společně hydrid sodíku (0,94 g, 0,028 mol) a diethylmalonát (4,5 g, 0,028 mol). Směs byla zahřívína na 85 °C po dobu 5 hodin. Po ochlazení na laboratorní teplotu bylo přidáno 50 ml methanolu a 50 ml 1 M kyseliny chlorovodíkové a následně 250 ml vody. Vytvořila se emulze, která stáním po dobu 72 hodin v chladničce vykrystalizovala. Krystalická hmota byla oddělena filtrací, promyra vodou, směsí voda/methanol (1 : 1), heptanem a vysušena k získání sloučeniny uvedené v nadpise (6,3 g) s výtěžkem 74 %.

- 11 « ·*

1H NMR (CDCI₃) δ 1,46 (3H, t), 3,63 (3H, s), 4,49 (2H, q), 7,23 (1H, d), 7,27 (1H,

d), 7,49 (1H,t), 15,0 (1H,s).

Příklad 3

Ethylester kyseliny 1,2-dihydro-4-hydroxy-5-trifluormethyl-1-methyl-2-oxochinolin-

3-karboxylové

2-fluor-6-(trifluormethyl)benzonitril (10 g, 0,053 mol) byl v autoklávu zahříván po dobu 2 dní při 40 °C ve 200 ml bezvodého methylaminu. Nadbytečnému methylaminu bylo umožněno odpařit se a výsledná tuhá šedá látka byla rozpuštěna ve 200 ml methylenchloridu společně s 4-aminopyridinem (0,1 g, 0,001 mol)) a triethylaminem (3,3 ml, 0,026 mol). K tomuto ochlazenému roztoku byl pomalu přidáván ethylmalonylchlorid (8,8 g, 0,060 mol). Roztok byl míchám po dobu 4 hodin a potom zpracován k získání nažloutlého sirupu. Sirup byl rozpuštěn ve 100 ml bezvodého ethanolu a přidán methoxid sodný (5,4 g, 0,10 mol). Po 1 hodině se rozpouštědlo odstranilo a na zbytek působeno methylenchloridem a vodou. Vytvořený chinolinový derivát byl pečlivě vysušen a potom suspendován ve 250 ml vychlazeného bezvodého tetrahydrofuranu. Potom byl pomalu přidáván hydrid sodíku (4 g, 0,125 mol) a potom methyljodid (10 ml, 0,15 mol). Směs byla pod refluxem zahřívána po dobu 6 hodin, ochlazena vodou a působeno na ni diethyletherem. Rozpouštědla byla odstraněna a zbytek (17,3 g) rozpuštěn ve směsi ethanolu (50 ml) a koncentrované kyseliny chlorovodíkové (10 ml). Roztok byl přes noc zahříván na 45 °C, ochlazen a sraženina oddělena za získání 8 g sloučeniny uvedené v nadpisu š výtěžkem 48 %.

1H NMR (CDCI₃) δ 1,46 (3H, t), 3,68 (3H, s), 4,50 (2H, q), 7,58 (1H, m), 7,71 (2H, m), 15,0 (1H, s).

Zcela stejným způsobem byla získána následující sloučenina z odpovídajících výchozích látek:

ethylester kyseliny 1,2-dihydro-4-hydroxy-5-trifluormethoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxylové.

- 12 Příklad 4

Ethylester kyseliny 1,2-dihydro-4-hydroxy-1-methyl-2-oxo-5,6methylendioxychinolin-3-karboxylové

Di-terc-butyl dikarbonát (36 g, 0,17 mol) byl po částech přidáván k roztoku 3,4(methylendioxy)-anilinu (20,6 g, 0,15 mol) v bezvodém tetrahydrofuranu (150 ml). Roztok byl po dobu 2 hodin zahříván pod refluxem, potom ve vakuu zkoncentrován za získání černého pevného zbytku. Zbytek byl rozpuštěn v bezvodém tetrahydrofuranu (600 ml) a ochlazen na -40 °C. Po kapkách byl přidáván hexanový roztok 1,3 M sek-butyllithia (265 ml, 0,35 mol).

Po míchání roztoku po dobu 0,5 hodiny při -40 °C byl přidán suchý led v roubíkách (cca 40 g). Směs byla ponechána ohřát na 0 °C a přidána voda (cca 700 ml). Vodný roztok byl kyselinou chlorovodíkovou okyselen na pH 3 a extrahován etherem. Extrakty byly vysušeny a zkoncentrovány za získání kyseliny

5,6-methylendioxyanthranilové chráněné N-tBoc jako pevný zbytek (45 g). Tato kyselina byla přidávána do ledem chlazené suspenze hydridu sodíku (80 % v oleji, 9,0 g, 0,30 mol) v N,N-dimethylformamidu (200 ml). Směs byla míchána po dobu 0,5 hodiny a přidán methyljodid (22 ml, 0,35 mol). Směs byla přes noc míchána za laboratorní teploty, potom ochlazena vodou (600 ml) a třikrát extrahována etherem. Organická vrstva byla promyta nasycenou solankou, ve vakuu vysušena a zkoncentrována za získání temně hnědé olejovité látky. Olej byl rozpuštěn v methanolu (400 ml) a přidána koncentrovaná kyselina chlorovodíková (80 ml). Roztok byl přes noc míchán za laboratorní teploty, zneutralizován 5 M hydroxidem sodným a třikrát extrahován etherem. Spojené extrakty byly filtrovány kolonou s SiO₂ a eluát ve vakuu zkoncentrován za získání methylovaného anthranilového esteru (20 g). Ester byl rozpuštěn v dichlormethanu (400 ml) a ochlazen v ledové lázni. Byl přidán ethylmalonylchlorid (21 g, 0,14 mol) a potom po 30 minutách triethylamin (22 ml, 0,16 mol). Po míchání po dobu 1 hodiny při laboratorní teplotě byla zakalená směs promyta 0,5 M kyselinou chlorovodíkovou a potom bikarbonátem. Organická fáze byla ve vakuu pečlivě vysušena a zkoncentrována. Zbytek byl potom rozpuštěn v suchém ethanolu (200 ml) a přidán methoxid sodný (17 g, 0,32 mol). Směs byla míchána po dobu 1 hodiny a přidána

- 13 ·· ·· 9· · ·· • · · · · · 4· *· • · ·· · ♦ · ·· • ♦ · ··· · · ··· • · · · · 3 · «· ·* ·< ·· ····· voda (300 ml). Roztok byl potom promyt ethylacetátem a vodný roztok dále okyselen koncentrovanou kyselinou chlorovodíkovou. Sraženina byla oddělena filtrací a ve vakuu vysušena za získání sloučeniny uvedené v nadpisu jako šedé krystaly (17 g, celkový výtěžek 41 %).

1H NMR (CDCI₃) δ 1,45 (3H, t), 3,58 (3H, s), 4,48 (2H, q), 6,17 (2H, s), 6,71 (1H,

d), 7,14 (1H, d).

Příklad 5

5-ethylisatoový anhydrid

Směs chloralhydrátu (59,3 g, 0,36 mol), vody (700 ml) a síranu sodného (85,8 g, 0,60 mol) byla zahřívána na 50 °C. Při dosažení teploty 50 °C byla postupně přidána směs 3-ethylanilinu (40,8 g, 0,33 mol), vody (700 ml) a koncentrované kyseliny chlorovodíkové (33,6 ml) a směs hydroxylaminhydrochloridu (74,8 g, 1,04 mol) a vody (330 ml). Výsledná směs byla během 30 minut zahřáta na 80 °C a při této teplotě udržována dalších 10 minut před tím, než byla v ledové lázni ochlazena. Výsledná sraženina bylá odfiltrována, promyta vodou a ve vakuu vysušena nad P₂O₅ za vzniku isonitrosoacetanilidu (36,6 g) s výtěžkem 58 %. Isonitrosoacetanilid (10,0 g, 0,05 mol) byl po částech přidáván ke směsi vody (9 ml) a koncentrované kyseliny sírové (60 ml) předem ohřáté na 50 °C a teplota udržována mezi 50 - 55 °C. Po ukončeném přidávání byla směs zahřáta na 80 °C a při této teplotě chována po dobu 10 minut. Potom byla reakční směs ochlazena v ledové lázni a nalita na 10 až 12 násobný objem reakční směsi na drcený led. Potom byla směs ponechána stát po dobu přibližně jedné hodiny. Vodní suspenze byla extrahována dichlormethanem, který byl vysušen a odpařena za vzniku směsi dvou analogů 4-ethyl a 6-ethylisatinu v poměru přibližně 0,68 : 1 (7,6 g) s výtěžkem 84 %.

Směs dvou isomerů byla rozpuštěna ve vodném hydroxidu sodném a roztok byl zfiltrován přes celit a potom okyselen na pH 4. Analog substituovaný v poloze 4 byl za tohoto pH extrahován do dichlormethanu, který byl vysušen a odpařen za vzniku čistého 4-ethylisatinu (3,1 g) s výtěžkem 34 %.

4-ethylisatin (3,1 g, 0,018 mol) byl přidán ke směsi koncentrované kyseliny sírové (45 μΙ) v kyselině octové (14 ml). Suspenze byla ohřátá na 30 °C, byl přidán 35 % peroxid vodíku (2,2 ml) a po tomto přídavku se teplota zvýšila na 65 °C. Po zahřívání po dobu 3 hodin byla směs ochlazena a sraženina odfiltrována, promyta vodou, vysušena a získána sloučenina uvedená v nadpisu (1,7 g) s výtěžkem 48 %.

1H NMR (DMSO-d₆) δ 1,12 (3H, t), 3,02 (2H, q), 6,98 (1H, d), 7,05 (1H, d), 7,58 (1H, t), 11,6 (1H, pás).

Příklad 6

Kyselina 1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1 -methyl-2-oxo-chinolin-3-karboxylová

Za chlazení bylo přidáváno 10 ml koncentrované kyseliny chlorovodíkové ke 30 ml acetanhydridu. K tomuto roztoku byl přidán ethylester kyseliny 1,2-dihydro-4hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2-oxo-chinolin-3“karboxylové (10,5 g, 38 mmol) a tato směs zahřívána po dobu 14 hodin při 80 °C. Směs byla ochlazena na laboratorní teplotu a krystalický produkt odfiltrován, promyt vychlazeným methanolem, usušen a získána sloučenina uvedená v nadpisu (7,2 g) s výtěžkem 77 %.

1H NMR (CDCI₃) δ 3,73 (3H, s), 4,02 (3H, s), 6,82 (1H, d), 7,02 (1H, d), 7,62 (1H,t).

Příklad 7 N-methyl-N-fenyl-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2-oxochinolin-3karboxamid (nezahrnuto v nárocích) (Způsob A)

N-methylanilin (2,7 g, 0,025 mol) byl rozpuštěn v 80 ml toluenu a oddestilováno přibližně 30 ml rozpouštědla k získání suchého roztoku. K tomuto vřícímu roztoku byl přidán ethylester kyseliny 1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxylové (2,7 g, 0,01 mol). Ethanol vytvořený během reakce byl oddestilováván společně s trochou toluenu po dobu 4 hodin. Reakční směs byla ···· ···· · • · ·· · · · · • · ♦ ··· · · · _t ···· · · · · ·· ·· *· ···

- 15 ochlazena na laboratorní teplotu. Sraženina byla oddělena, promyta studeným toluenem a hexanem a vysušena k získání sloučeniny označené v nadpise (2,8 g) s výtěžkem 83 %.

1H NMR (CDCh) δ 3,49 (3H, s), 3,50 (3H, s), 4,03 (3H, s), 6,66 (1H, d), 6,86 (1H,

d), 7,08-7,48 (6H, m).

13C NMR (CDCh) δ 29,7 (CH₃), 36,8 (CH₃), 56,8 (CH₃), 103,3 (CH), 104,2 (C),

108.4 (CH), 110,2 (C), 126,2 (CH), 127,2 (CH), 128,6 (CH), 131,4 (CH), 141,2 (C), 143,6 (C), 157,0 (C), 157,4 (C), 160,3 (C), 165,1 (C).

ESI MS/MS [M+H]⁺ 339, fragment 232.

Zcela stejným způsobem byly získány následující sloučeniny z odpovídajících výchozích látek:

N-methyl-N-fenyl-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3karboxamid (v nárocích nezahrnuto).

1H NMR (CDCI₃) δ 3,38 (3H, s), 3,52 (3H, s), 7,08 - 7,34 (7H, m), 7,43 (1H, t).

13C NMR (CDCI₃) δ 29,9 (CH₃), 38,5 (CH₃), 104,7 (C), 112,8 (C), 113,3 (CH),

125.5 (CH), 125,6 (CH), 126,8 (CH), 128,7 (CH), 131,8 (CH), 132,9 (C), 142,6 (C), 143,9 (C), 158,0 (C), 166,1 (C), 169,3 (C).

ESI MS/MS [M+H]⁺ 343, fragmenty 236 a 108.

N-ethyl-N-(3-methoxyfenyl-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-ethyl-1-methyl-2-oxochinolin-

3-karboxamid,

N-methyl-N-(4-chlorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3karboxamid,

1H NMR (CDCh) δ 3,38 (3H, s), 3,45 (3H, s), 7,12 - 7,28 (6H, m), 7,45 (1H, t).

·· ·· ·· · ·· * · · · ···· ·· • · · · · · · · · ······· · « · · • · · · ·· · 9 9 • · ·♦ ·· 999 9 ·

- 16 13C NMR (CDCIg) δ 30,0 (CH₃), 38,4 (CH₃), 104,5 (C), 112,6 (C), 113,4 (CH),

125,6 (CH), 127,0 (CH), 128,9 (CH), 131,9 (CH), 132,4 (C), 132,8 (CH), 142,5 (C). 142,6 (C), 158,0 (C), 166,0 (C), 169,2 (C).

ESI MS/MS [M+Hf 377, fragmenty 236 a 142.

3-karboxamid,

1H NMR (CDCI₃) δ 1,18 (3H, t), 3,33 (3H, s), 3,74 (3H, s), 3,90 (2H, q, široký pás), 6,73 (2H, d), 7,05 - 7,15 (3H, m), 7,22 (1H, d), 7,39 (1H, t).

13C NMR (CDCI₃) δ 12,4 (CH₃), 31,1 (CH₃), 45,6 (CH₂), 55,4 (CH₃), 109,5 (C),

111,5 (C), 114,2 (CH), 115,2 (CH), 126,2 (CH), 127,9 (CH), 130,4 (C), 132,2 (CH), 133,1 (C), 141,7 (C). 159,2 (C), 159,3 (C), 160,1 (C), 166,7 (C).

ESI MS/MS [M+Hf 387, fragmenty 236 a 152.

N-methyl-N-(4-methoxyfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1--methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

1H NMR (CDCI3) δ 3,37 (3H, široký pás), 3,43 (3H, s), 3,75 (3H, s), 6,75 (2H, široký pás), 7,14 (3H, široký pás), 7,22 (1H, d), 7,40 (1H, t).

13C NMR (CDCI₃) δ 30,0 (CH₃), 38,5 (CH₃), 55,4 (CH₃), 105,4 (C), 112,8 (C),

113,4 (CH), 113,9 (CH), 125,5 (CH), 127,0 (CH), 131,7 (CH), 132,7 (C), 136,8 (C), 142,6(C). 158,1 (C), 158,3 (C), 164,9 (C), 169,1 (C).

ESI MS/MS [M+Hf 373, fragmenty 236 a 138.

N-ethyl-N-(3-fluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3karboxamid,

1H NMR (CDCI3) δ 1,20 (3H, t), 3,33 (3H, s), 3,95 (2H, q), 6,84 - 6,98 (3H, m),

7,11 - 7,20 (2H, m), 7,23 (1H, d), 7,42 (1H, t).

« ·

- 17 13C NMR (CDCI3) δ 12,9 (CH₃), 29,9 (CH₃), 45,8 (CH₂), 104,7 (C), 112,7 (C),

113,4 (CH), 113,8 + 114,0 (CH), 113,9 + 114,1 (CH), 122,3 + 122,4 (CH), 125,6 (CH), 129,5 + 129,6 (CH), 131,9 (CH), 132,8 (CH), 142,7 (C). 143,7 + 143,8 (C), 158,0 (C), 161,4 + 163,4 (C), 165,9 (C), 168,8 (C); některé píky jsou pro F-vazbu multiplety.

ESI MS/MS [M+H]⁺ 375, fragmenty 236 a 140.

N-rnethyl-N-(2-fluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

1H NMR (CDCI₃) δ 3,47 (3H, s), 3,53 (3H, s), 4,03 (3H, s), 6,68 (1H, d), 6,88 6,96 (2H, m), 7,02 - 7,07 (1H, m), 7,12 - 7,17 (1H, m), 7,42 - 7,49 (2H, m).

13C NMR (CDCIg) δ 30,7 (CH₃), 36,8 (CH₃), 57,1 (CH₃), 104,3 (C), 104,4 (C),

107,2 (CH), 109,2 (C), 116,4 + 116,6 (CH), 124,3 + 124,3 (CH), 128,7 (CH), 129,9 + 130,0 (C), 129,9 + 130,0 (CH), 132,9 (CH), 141,1 (C). 157,4 (C), 157,4 (C), 156,8 + 158,8 (C), 160,3 (C), 167,0 (C).

ESI MS/MS [M+H]⁺ 357, fragment 232.

N-methyl-N-(3-chlorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

1H NMR (CDCb) δ 3,40 (3H, s), 3,50 (3H, s), 4,02 (3H, s), 6,67 (1H, d, široký pás), 6,90 (1H, d, široký pás), 7,1 (2H, široký pás), 7,28 (1H, široký pás), 7,38 (1H, široký pás), 7,43 (1H, t, široký pás).

13C NMR (CDCI₃) δ 29,8 (CH₃), 36,8 (CH₃), 57,0 (CH₃), 103,5 (CH), 104,3 (C),

108,6 (CH), 109,9 (C), 124,7 (CH), 126,5 (CH), 127,5 (CH), 129,7 (CH), 131,7 (CH), 133,9 (C). 141,4 (C), 144,8 (C), 157,2 (C), 157,7 (C), 160,3 (C), 165,0 (C). ESI MS/MS [M+H]⁺ 373, fragment 232.

N-ethyl-N-(3-fluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2-oxochinolin-

3-karboxamid,

1H NMR (CDCIs) δ 1,22 (3H, t), 3,50 (3H, s), 3,92 (2H, široký pás), 4,02 (3H, s), 6,66 (1H, d), 6,81 - 6,92 (2H, m), 7,08 - 7,19 (3H, m), 7,41 (1H, t).

13C NMR (CDCI₃) δ 13,1 (CH₃), 29,8 (CH₃), 43,9 (CH₂), 56,9 (CH₃), 103,4 (CH),

104.3 (C), 108,6 (CH), 110,4 (C), 114,5 + 114,7 (CH), 123,4 (CH), 129,6 + 129,7 (CH), 131,6 (CH), 141,4 (C), 143,5 (C), 157,2 (C), 157,4 (C), 160,3 (C), 161,4 +

163.3 (C), 164,4 (C).; některé píky jsou pro F-vazbu multiplety

ESI MS/MS [M+Hf 371, fragment 232.

1H NMR (CDCh) δ 3,46 (3H, s), 3,52 (3H, s), 4,05 (3H, s), 6,69 (1H, d), 6,92 (1H, d), 7,10-7,38 (4H, dd), 7,45 (1H, t).

13C NMR (CDCI3) δ 29,8 (CH₃), 36,8 (CH₃), 56,8 (CH₃), 103,4 (CH), 104,2 (C),

108,6 (CH), 110,0 (C), 127,6 (CH), 128,9 (CH), 131,6.(CH), 132,8 (C). 141,3 (C),

142,2 (C), 157,1 (C), 157,5 (C), 160,3 (C), 165,0 (C).

ESI MS/MS [M+H]⁺ 373, fragment 232.

N-ethyl-N-(2-fluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-trifluormethyl-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-(4-chlorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-trifluormethyl-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid, '

1H NMR (CDCI₃) δ 3,40 (3H, s), 3,48 (3H, s), 7,08 - 7,25 (4H, m), 7,48 (1H, d), 7,65 (1H, t), 7,69 (1H, t).

13C NMR (CDCI3) δ 30,1 (CH₃), 38,7 (CH₃), 103,8 (C), 112,7 (C), 113,4 (C), 118,7 (CH), 121,9 + 121,9 + 122,0 + 122,0 (CH), 120,3 + 122,4 + 124,6 + 126,8 (C), 127,0 (CH), 127,8 + 128,0 + 128,3 + 128,5 (C), 128,9 (CH), 131,6 (CH), 132,4 • · ·φ · · · φφ • φφφ φφφφ φ • ΦΦΦ φφ · ·

- 19 (0,142,3 (C), 142,6 (C), 157,7 (C), 166,3 (C), 169,9 (C); některé píky jsou pro Fvazbu multiplety.

ESI MS/MS [M+H]⁺411, fragmenty 270 a 142.

N-methyl-N-(4-methoxyfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-trifluormethyl-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-(4-chlorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-trifluormethoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-(4-methoxyfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-trifluormethoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-fenyl-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-6-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid (v nárocích neuveden)

1H NMR (CDCI₃) δ 3,38 (3H, s, široký pás), 3,52 (3H, s), 3,96 (3H, s), 7,14 - 7,23 (2H, m), 7,23-7,30 (5H, m).

13C NMR (CDCb) δ 29,7 (CH₃), 38,3 (CH₃), 57,2 (CH₃), 113,6 (CH), 113,7 (C),

116.8 (CH), 120,3 (C), 125,8 (CH), 126,9 (CH), 128,7 (CH), 136,5 (C), 143,9 (C),

150.9 (C), 158,0 (C), 165 (C), 168,9 (C).

ESI MS/MS [M+H]⁺ 373, fragmenty 266 a 108.

N-methyl-N-(4-chlorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5,6-methylendioxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid.

Příklad 8

N-methyl-N-(4-trifluormethylfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid (Způsob B)

K ledovému roztoku kyseliny 1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxylové (8 g, 0,032 mol), triethylaminu (15,5 ml, 0,11 mol) a 4trifluormethyl-N-methylanilinu (6,1 g, 0,035 mol) ve 150 ml methylenchloridu byl během 0,5 hodiny po kapkách přidáván roztok thionylchloridu (3,0 ml, 0,042 mol) v 10 ml methylenchloridu. V míchání se pokračovalo při 4 °C po dobu 4 hodin.

- 20 Roztok byl zředěn 10 ml methylenchloridu, promyt studenou 1 M kyselinou sírovou a extrahován 1 M hydroxidem sodným. Hodnota pH vodné fáze byla nastavena na 8 - 8,5, vyčiřeno filtrací a potom okyseleno roztokem kyseliny chlorovodíkové na pH 4. Stáním se vytvořila krystalická sraženina, která byla odfiltrována, promyta vodou, vysušena a získána sloučenina uvedená v nadpisu (8,5 g) s výtěžkem 65 %.

1H NMR (CDCIg) δ 3,48 (3H, s), 3,54 (3H, s), 4,06 (3H, s), 6,70 (1H, d), 6,94 (1H, d), 7,46 (1H, t), 7,50 (4H, široký pás).

13C NMR (CDCI₃) δ 29,8 (CH₃), 36,9 (CH₃), 56,9 (CH₃), 103,5 (CH), 104,2 (C),

108.7 (CH), 109,5 (C), 117,3 + 121,7 + 126,0 + 130,3 (C), 125,8 + 125,9 + 125,9 + 126,0 (CH), 126,3 (CH), 127,9 + 128,4 + 128,9 + 129,4 (C), 131,8 (CH), 141,4 (C), 146,7 (C), 157,2 (C), 158,0 (C), 160,3 (C), 165,0 (C); některé píky jsou pro Fvazbu multiplety.

ESI MS/MS [M+H]⁺ 407, fragment 232.

Stejným způsobem byly získány následující sloučeniny z odpovídajících výchozích látek:

N-ethyl-N-(4-trifluormethylfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

1H NMR (CDCI₃) δ 1,22 (3H, t), 3,28 (3H, s), 3,99 (2H, q), 7,13 (1H, d), 7,23 7,32 (3H, m), 7,40-7,51 (3H, m).

13C NMR (CDCI₃) δ 13,0 (CH₃), 29,8 (CH₃), 45,8 (CH₂), 104,0 (C), 112,7 (C),

113,5 (CH), 120,6 + 122,8 + 124,9 + 127,1 (C), 125,7 (CH), 125,7 + 125,7 +

125.8 + 125,8 (CH), 126,7 (CH), 128,3 + 128,6 + 128,8 + 129,1 (C), 132,1 (CH), 133,0 (C), 142,8 (C), 145,6 (C), 157,9 (C), 166,8 (C), 169,1 (C); některé píky jsou pro F-vazbu multiplety.

ESI MS/MS [M+H]⁺ 425, fragmenty 236 a 190.

N-ethyl-N-(4-trifluormethylfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid, ···· · · · · · • · · · · · · · · ·« ·

- 21 1H NMR (CDCI3) δ 1,22 (3H, t), 3,51 (3H, s), 3,93 (2H, q), 4,02 (3H, s), 6,67 (1H,

d), 6,91 (1H, d), 7,43 (1H, t), 7,46 - 7,52 (4H, m).

13C NMR (CDCI3) δ 13,2 (CH₃), 29,8 (CH₃), 44,1 (CH₂), 56,9 (CH₃), 103,5 (CH),

104.3 (C), 108,7 (CH), 110,0 (C), 120,7 + 122,9 + 125,0 + 127,2 (C), 125,9 +

125.9 (CH), 127,7 (CH), 128,9 + 129,2 + 129,4 + 129,7 (C), 131,8 (CH), 141,5 (C), 145,3 (C), 157,2 (C), 157,8 (C), 160,3 (C), 164,4 (C); některé píky jsou pro Fvazbu multiplety.

ESI MS/MS [M+H]⁺ 421, fragmenty 232 a 206.

N-methyl-N-(4-trifluormethoxyfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

1H NMR (CDCI3) δ 3,33 (3H, s), 3,45 (3H, s), 6,62 (1H, široký pás), 6,83 (1H, široký pás), 6,98 - 7,17 (2H, m široký pás), 7,20 (1H, d), 7,37 (1H, t široký pás).

13C NMR (CDCI3) δ 29,9 (CH₃), 37,3 (CH₃), 103,3 (C), 104,7 + 104,9 + 105,1 (CH), 110,5 + 110,7 (CH), 112,7 (C), 113,3 (CH), 125,7 (CH), 126,7 (CH), 128,1 (C), 128,6 (CH), 132,1 (CH), 133,3 (C), 142,8 (C), 157,8 (C), 156,9 + 157,0 +

158.9 + 159,0 (C), 160,6 + 160,6 (C), 167,4 (C), 170,4 (C); některé píky jsou pro F-vazbu multiplety.

ESI MS/MS [M+Hf 379, fragmenty 236 a 144.

N-methyl-N-(2,5-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2 oxochinolin-3-karboxamid,

N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

1H NMR (CDCI3) δ 3,40 (3H, s), 3,51 (3H, s), 4,02 (3H, s), 6,60 - 6,63 (1H, m), 6,63 (1H, d), 6,73 - 6,79 (1H, m), 6,90 (1H, d), 7,38 - 7,46 (2H, m).

13C NMR (CDCIs) δ 29,9 (CH₃), 36,0 (CH₃), 56,9 (CH₃), 103,5 (CH), 104,2 (C),

104.4 + 104,6 + 104,6 + 104,8 (CH), 108,6 (CH), 109,2 (C), 110,8 + 110,9 + 111,0 + 111,0 (CH), 127,3 + 127,3 + 127,4 + 127,4 (C), 130,0 + 130,1 (CH), 131,8 (CH),

141.4 (C), 157,2 (C), 157,3 + 157,4 + 159,3 + 159,4 (C), 158,5 (C), 160,3 (C),

160.7 + 160,8 + 162,6 + 162,7 (C), 165,5 (C); některé píky jsou pro F-vazbu multiplety.

ESI MS/MS [M+Hf 375, fragment 232.

N-methyl-N-(2,5-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2oxochinolin-3-karboxamid,

1H NMR (CDCIa) δ 3,48 (3H, s), 3,64 (3H, s), 4,10 (3H, s), 6,60 - 7,30 (5H, m), 7,63 (1H, i).

13C NMR (CDCI3) δ 31,0 (CH₃), 37,2 (CH₃), 57,2 (CH₃), 104,4 (C), 105,0 (CH),

105.7 (C), 109,5 (CH), 115,2 + 115,6 (CH), 116,8 + 116,9 (CH), 117,2 + 117,3 +

117.5 117,7 (CH), 129,8 + 130,0 + 130,0 + 130,2 (C), 133,9 (CH), 141,0 (C),

151,9 + 155,8 (C), 157,6 (C), 155,8 + 159,6 (C), 161,4 (C), 161,7 (C), 167,6 (C); hlavní forma; některé píky jsou pro F-vazbu multiplety.

ESI MS/MS [M+H]⁺ 375, fragment 232.

N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5,6-methylendioxy-1-methyl-

2-oxochinolin-3-karboxamid.

Farmakologické metody

Akutní pokusná autoimunní encefalomyelitis (aEAE)

V pokusech byly použity samice myší SJL/N ve stáří 8 týdnů. Homogenát míchy myší (MSCH) byl získán ze samic myší C57B1/6 ve stáří od 8 do 12 týdnů. Tkáň byla homogenizována na ledu a zředěna studeným PBS. Nekompletní Freund obsahující 1 mg.ml'¹ M. tuberculosis hominis H37Ra byl zemulgován se stejným objemem MSCH a získána konečná koncentrace 10 mg.ml'¹ MSCH. Objem inokula 0,1 ml byl vstříknut intradermálně do kořene ocasu. Pertusový toxin byl injikován i.p. v 0. a 3. dni po imunizaci. Dávkování bylo prováděno per os denně od 3. do 12. dne po imunizaci nebo ve 3. až 7. dni a 10. až 12. dni. Kontrolní zvířata obdržela fyziologický roztok. Zvířata - osm ve skupině pro příslušnou dávku - byla klasifikována poměrem na klinické příznaky paralytického

- 23 onemocnění škálou od 0 do 5 takto: 0 - normální; 1 - ochablý ocas; 2 - paréza zadní části; 3 - paralýza zadní části a ochabnutí předních nohou; 4 - bilaterální ochablost a paralýza přední části; 5 - smrt. Klinická klasifikace byla sledována v

7. dni a od 9. dne až do konce pokusu ve 14. dni denně. Účinek podávání byl počítán jako procento inhibice klinického klasifikačního poměru v porovnání s kontrolními pokusy s fyziologickým roztokem.

Kolagenem způsobená arthritida

Pro pokusy byly použity samci myší DBA/1 ve stáří od 8 do 10 týdnů. Ve dni 0 byly myši imunizovány intradermálně do kořene ocasu kolagenem bovinního typu II (100 pg na myš) ve Freundově kompletním adjuvantu. Podávání bylo prováděno per os denně ve dnech 3 až 7, 10 až 14, 17 až 21, 24 až 28 a 31 až 35. Patnáct dní po imunizaci byly myši prohlédnuty na známky artritidy. Zvířata byla sledována třikrát za týden. Každý druhý nebo třetí den byly jednotlivé nožky arthritických zvířat klasifikovány podle škály 0 - 4 (0 = bez artritidy, 1 = artritida v jednom z interfalangeálním, metatarsofalangeálním nebo interkarpálním kloubu, 2 = dva artritické klouby, 3 = tři artritické klouby, 4 = jako u 3 s vážnějším zarudnutím a opuchnutím nožek). Klasifikace pro každý otok byla přidávána až do získání maximálně dosažitelného klasifikačního poměru 16 u každé myši.

Zápal plic vyvolaný ovoalbuminem

V pokusech byly použity samice myší C57B1/6 ve stáří mezi 10 až 14 týdny, 10 myší v každé skupině. Myši byly senzitizovány ovoalbuminem (OA) v hydroxidu hlinitém o objemu 0,2 ml na jedno i.p. injikování. Zkouška byla prováděna ve dni 0 až 16. Kontrolní myši obdrženy fyziologický roztok. Čtrnáct dní po senzitizací OA byly myši vystaveny po dobu 20 minut aerosolu o koncentraci 1,5 % hmotn./obj. OA v solance vytvořeným rozprašovačem. Na kontrolní myši s vehikulem bylo působeno solnou mlhou. Sedmdesátdvě hodiny po aplikaci OA/vehikulum dostaly myši anestezi a byl proveden bronchoalveolární výplach nakapáním dvakrát 0,5 ml ledové solanky pufrované fosfátem (PBS) do plic. Byl stanoven celkový počet buněk a diferenciál byl založen na identifikaci eosinofilů,

- 24 monocytů/alveolárních makrofágů, lymfocytů a neutrofilů. Infiltrace eosinofilů do plicní tkáně byla hodnocena histochemickými metodami na zmrazených řezech plic za použití diaminobenzidintetrahydrochloridu (DAB).

Teratogenní účinky na krysy

Sloučeniny byly podávány samicím krys subkutálně během 8. až 14. dne březosti. Krysy byly 20. den po oplodnění otevřeny císařským řezem a pitvány. Plod byl zkoumán na vnější a vnitřní abnormality.

Syndrom bolestivosti beaglů (BPS)

Sloučeniny byly podávány psům plemene beagl intravenosně. Dávky byly podávány po pět po sobě jdoucích dní. Psi byly hodnoceni na klinické a laboratorní příznaky syndromu bolestivosti, např. na horečku, zvýšený poměr sedimentace erythrocytů (ESR), alkalický fosfát (AP), indukci akutní proteinové fáze a vasculitis.

Mezi sloučeninami, kterým se dávala přednost jsou: N-methyl-N-(4trifluormethylfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2-oxochinolin-3karboxamid a N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid zde nazývané sloučeniny A a B. N-methyl-Nfenyl-1,2-dihydro-4-hydroxy-6-chlor-1 -methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid a rochinimex jsou referenční sloučeniny zde označované jako C a D.

Inhibice aEAE

Dávka mg.kg'¹, p.o.	% inhibice aEAE
Sloučenina A (vynález)	Sloučenina B (vynález)	Sloučenina C	Rochinimex D
0,2	66	59	92	35
1	86	96	100	40
5	99	100		69

- 25 Teratogenicita u krys

Dávka mg.kg'¹, p.o.	% malformovaných plodů
Sloučenina A (vynález)	Sloučenina B (vynález)	Sloučenina C	Rochinimex D
6	4	0	37	nezkoušeno
10	nezkoušeno	nezkoušeno	nezkoušeno	9
30	2			30

Účinná množství sloučeniny obecného vzorce (I) se podávají potřebnému pacientovi vyžadujícímu takovou léčbu nejlépe obvyklými cestami podávání a v takové formě farmaceutického přípravku, která obsahuje účinné množství aktivní složky a vhodný farmaceuticky přijatelný nosič. Takové přípravky mohou být v různé formě, např. v roztocích, suspenzích, emulzích, tabletách, tobolkách a prášcích připravených pro orální podávání, jako aerosoly k inhalaci, ve sterilních roztocích pro parenterální podávání, čípcích pro rektální zavádění nebo vhodných přípravcích působících zevně. Konvenční postupy pro výběr a způsob přípravy vhodného farmaceutického přípravku je popsán například v „Pharmaceuticals The Science of Dosage Form Design“, M.B. Aulton, Churchill Livingstone, 1988.

Pro použití pro léčbu MS se předpokládají vhodné denní dávky od 0,0005 mg.kg'¹do přibližně 10 mg.kg'¹ tělesné hmotnosti, zvláště mezi 0,005 mg.kg'¹ a přibližně 1 mg.kg'¹ tělesné hmotnosti, v závislosti na specifických podmínkách léčby, věku a hmotnosti určitého pacienta a specifické odezvě pacienta na medikaci. Přesné jednotlivé dávky, rovněž tak jako denní dávky se musejí stanovit podle standardních principů a pokynů lékaře.

·· · · ·♦ · «· ♦ · ♦ · ♦ * ♦· 9 99

9 99 9 9 999

9 9 9 9 9 9 9 99 • · · * * · 99 9 9 9 999

- 26 Ke zlepšení stability nebo snadnosti podávání léčiva se předpokládají různá aditiva. Farmaceutický přípravek může také obsahovat další jiné přídavné terapeuticky vhodné látky než je sloučenina obecného vzorce (I).

Průmyslová využitelnost

Sloučeniny podle vynálezu lze využít ve farmaceutickém průmyslu a v medicíně k léčbě nemocí pocházejících od autoimunity a patologických zánětů.

- 27 Literatura

1. Talal, N.: Autoimmune diseases. In: Roitt, I.M. a Delves, P.J. (eds.) Encyclopedia of Immunology, s. 195-198. Academie Press, 1992.

2. Prineas, J.W.: The neuropathology of multiple sclerosis. In: Koetsier, J.C. (ed.) Handbook of Clinical Neurology, s. 213-257. Elsevier Science Publ., Amsterdam, 1985.

3. Tarkowski, A., Gunnarsson, K., Nilsson, L.-A., Lindholm, L. a Stalhandske, T.: Successful treatment of autoimmunity in MLR/1 mice with LS2616, a new immunomodulator. Arthritis Rheum., 29, (11), 1405 - 1409, 1986.

4. Larsson, E.-L., Joki, A.-L a Stalhandske, T.: Mechanism of action of the new immunomodulator LS2616 on T-cell responses. Int. J. Immunopharmacol., 9, (4), 425-31, 1987.

5. Wanders, A., Larsson, E., Gerdin, B. a Tufveson, G.: Abolition of the effect of eyelosporine on rat cardiac allograft rejection by the new immunomodulator LS2616 (Linomide). Transplantation, 47, (2), 216 -217, 1989.

6. Kalland, T.: Regulation of natural killer progenitors: studies with a novel immunomodulator with distinct effects at the precursor level. J. Immunol., 144, (11), 4472-4476, 1990.

7. Gonzalo, J.A., González-García, A., Kalland, T., Hedlund, G., Martinez, C. a Kroemer, G.: Linomide, a novel immunomodulator that prevents death in four models of septic shock. Eur. J. Immunol., 23, 2372 - 2374, 1993.

8. Karussis, D.M., Lehmann, D., Slavín, S., et al.: Treatment of chronic-relapsing experimental autoimmune encephalomyelitis with the synthetic immunomodulator Linomide (quinoline-3-carboxamide). Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 90, 6400-6404, 1993.

9. Gonzalo, J.A., González-Garcia, A., Kalland, T., et al.: Limonide inhibits programmed cell death of peripheral T celíš in vivo. Eur. J. Immunol., 24, 48 52, 1994.

10. Gross, D.J., Sidi, H., Weiss, L., Kalland, T., Rosenmann, E. a Slavín, S.: Prevention of diabetes mellitus in non-obese diabetic mice by Limonide, a novel immunomodulating drug. Diabetologia, 37, 1195 - 1201, 1994.

• 9

11. Karussis, D.M., Lehmann, D., Brenner, T., et al.,: Immunomodulation of experimental autoimmune myasthenia gravis with Linomide. J. Neuroimmunol., 55, (2), 187- 193, 1994.

12. Bai, X.F., Shi, F.D., Zhu, J., Xiao, B.G., Hedlund, G. a Link, H.: Linomideinduced suppression of experimental autoimmune neuritis is associated with down-regulated macrophage functions. J. Neuroimmunol., 76, 177 -184, 1997.

13. Karussis, D.M., Meiner, Z., Lehmann, D., et al.: Treatment of secondary progressive multiple sclerosis with the immunomodulator Linomide. Neurology, 47, 341 -346, 1996.

14. Andersen, O., Lycke, J., Tollesson, P.O., et al.: Linomide reduces the rate of active lessions in relapsing-remitting multiple sclerosis. Neurology, 47, 895 900, 1996.

15. Kelly, D.F., Grimsell, C.S.G. a Kenyon, C.J.: Polyarteritis in the dog: A čase report. Vet Record, 92, 363 - 366, 1973.

16. Harcourt, R.A.: Polyarterities in a colony of beagles. Vet Report, 102, 519 522, 1978.

0 0	00	0 0 0	00 0
• 0	• 0	• 0 00	« 0 00
f 0	• t	• 0 0	0 0 0

0 0	0 «	• 0 0	0 0 0
• 0	0 0	00 000 -	0· 000

2001-

Claims

Patentové nároky:

1. Sloučeniny obecného vzorce (I) (I) kde

R se vybírá z methylu, ethylu, n-propylu, iso-propylu, n-butylu a allylu;

R' se vybírá z methylu, methoxylu, fluoru, chloru, bromu, trifluormethylu a OCH_xF_y;

kde x = 0 až 2, y = 1 až 3 s výjimkou, kdy x + y = 3;

R” se vybírá z vodíku, fluoru a chloru s výjimkou, že R” se vybírá z fluoru a chloru, pouze pokud R' se vybírá z fluoru a chloru;

R₄ se vybírá z vodíku a farmaceuticky přijatelných anorganických a organických kationtů;

R₅ se vybírá z ethylu, n-propylu, iso-propylu, methoxylu, ethoxylu, chloru, bromu, trifluormethylu a OCH_xF_y a OCH₂CH_xF_y;

kde x = 0 až 2, y = 1 až 3 s výjimkou, kdy x + y = 3;

Reje vodík; nebo

R₅ a Re jsou společně methylendioxylem;

a kterýkoliv jejich tautomer.
2. Sloučeniny podle nároku 1 vyznačující se tím, že farmaceuticky vhodné anorganické kationty se odvozují od sodíku, draslíku a vápníku a organické • · · · · · · · · · · • · ·· · · · · · • ·· · · · · · · · · • · · · ·· · · e • · ♦· ·· · · · · · φ kationty jsou odvozeny od monoethanolaminu, diethanolaminu, dimethylaminoethanolu, morfolinu a podobných.
3. Sloučeniny podle nároku 1 a 2 vyznačující se tím, že R_s se vybírá z ethylu, methoxylu, chloru a trifluormethylu.
4. Sloučeniny podle nároku 1 a 2 vyznačující se tím, že pro R₅ a R₆ je společný methylendioxyl.
5. Sloučeniny podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že R se vybírá z methylu a ethylu.
6. Sloučeniny podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že R' se vybírá z methoxylu fluoru, chloru, trufluormethylu pokud je R” vodík.
7. Sloučeniny podle kteréhokoliv z předchozích nároků vyznačující se tím, že R se vybírá z meta’- a parafluoru za předpokladu, že R' je orthofluor.
8. Sloučenina podle nároků 1 a 2, kterou je N-ethyl-N-(3-fluorfenyl)-1,2-dihydro-4- hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
9. Sloučenina podle nároků 1 a 2, kterou je N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2- dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
10. Sloučenina podle nároků 1 a 2, kterou je N-methyl-N-(2,5-difluorfenyl)-1,2- dihydro-4-hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
11. Sloučenina podle nároků 1 a 2, kterou je N-ethyl-N-(3-methoxyfenyl)-1,2- dihydro-4-hydroxy-5-ethyl-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.

·· ·Φ ♦ · » φφ • 9 · 9 · · ·· φφφ • · φφ φφφ φ φ • 9 · φφφ φ φ φφ φ • · 9 · 99 φ φφ • · 9Φ ΦΦ ·φφ φφ φ
12. Sloučenina podle nároků 1 a 2, kterou je N-methyl-N-(2,5-difluorfenyl)-1,2dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
13. Sloučenina podle nároku 1 a 2, kterou je N-methyl-N-(4-trifluormethylfenyl)-

1,2-dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
14. Sloučenina podle nároků 1 a 2, kterou je N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2dihydro-4-hydroxy-5,6-methylendioxy-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
15. Sloučeniny podle kteréhokoliv z předchozích nároků používané jako terapeutikum.
16. Farmaceutické přípravky obsahující jako účinnou složku sloučeninu obecného vzorce (I) společně s farmaceutickým nosičem.
17. Farmaceutické přípravky podle nároku 16 obsahující další farmakologicky účinné látky.
18. Farmaceutické přípravky podle nároků 16 a 17 používané jako terapeutikum v denních dávkách účinné složky od 0,0005 mg.kg'¹ do přibližně 10 mg.kg'¹tělesné hmotnosti, zvláště pak od 0,005 mg.kg'¹ do přibližně 1 mg.kg'¹ tělesné hmotnosti.
19. Postup výroby sloučeniny obecného vzorce (I), kde R, R’, R”, R₄, Rs a R₆ jsou substituenty definované výše, vyznačující se tím, že se na anilin obecného vzorce (III) (A) působí esterovými deriváty kyseliny chinolinkarboxylové obecného vzorce (II) ve vhodném rozpouštědle jako je toluen, xylen nebo podobné, nebo (B) působí kyselinou chinolinkarboxylovou obecného vzorce (IV) za použití vhodných kopulačních činidel, přednostně karbodiimidu nebo thionylchloridu v přítomnosti triethylaminu a vhodného rozpouštědla jako je dichlormethan.
20. Použití sloučeniny obecného vzorce (I),

L.

(I) • · • ·

- 33 kde

R se vybírá z methylu, ethylu, n-propylu, iso-propylu, n-butylu a allylu;

R’ se vybírá z methylu, methoxylu, fluoru, chloru, bromu, trifluormethylu a

OCH_xF_y;

kde x = 0 až 2, y = 1 až 3 s výjimkou, kdy x + y = 3;

R” se vybírá z vodíku, fluoru a chloru s výjimkou, že R” se vybírá z fluoru a chloru, pouze pokud se R’ vybírá z fluoru a chloru;

R₄ se vybírá z vodíku a farmaceuticky přijatelných anorganických a organických kationtů;

R₅ se vybírá z ethylu, n-propylu, iso-propylu, methoxylu, ethoxylu, chloru, bromu, trifluormethylu a OCH_xF_y a OCH₂CH_xF_y;

kde x = 0 až 2, y = 1 až 3 s výjimkou, kdy x + y = 3;

R₆ je vodík; nebo

R₅ a R₆ jsou společně methylendioxylem;

a kteréhokoliv jejího tautomeru, k léčbě patologických zánětů a autoiminuty postihujících savce.
21. Použití podle nároku 20 vyznačující se tím, že farmaceuticky vhodné anorganické kationty se Odvozují od sodíku, draslíku a vápníku a organické kationty jsou odvozeny od monoethanolaminu, diethanolaminu, dimethylaminoethanolu, morfolinu a podobných.
22. Použití podle nároku 20 a 21 vyznačující se tím, že R₅ se vybírá z ethylu, methoxylu, chloru a trifluormethylu.

• · ·· ♦· · ·« • · · · 9 9 ·♦ 9 9 9

9 9 99 9 9 9 9 9
23. Použití podle nároku 20 a 21 vyznačující se tím, že pro R₅ a R₆ je společný methylendioxyl.
24. Použití podle nároku 20 a 21 vyznačující se tím, že R se vybírá z methylu a ethylu.
25. Použití podle nároku 20 a 21 vyznačující se tím, že R’ se vybírá z methoxylu fluoru, chloru, trufluormethylu pokud je R” vodík.
26. Použití podle nároku 20 a 21 vyznačující se tím, že R” se vybírá z meta’- a parafluoru za předpokladu, že R’ je orthofluor.
27. Použití podle nároku 20 a 21 pro N-ethyl-N-(3-fluorfenyl)-1,2-dihydro-4hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
28. Použití podle nároku 20 a 21 pro N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
29. Použití podle nároku 20 a 21 pro N-methyl-N-(2,5-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4hydroxy-5-chlor-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
30. Použití podle nároku 20 a 21 pro N-ethyl-N-(3-methoxyfenyl)-1,2-dihydro-4hydroxy-5-ethyl-1 -methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
31. Použití podle nároku 20 a 21 pro N-methyl-N-(2,5-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
32. Použití podle nároku 20 a 21 pro N-methyl-N-(4-trifluormethylfenyl)-1,2dihydro-4-hydroxy-5-methoxy-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
33. Použití podle nároku 20 a 21 pro N-methyl-N-(2,4-difluorfenyl)-1,2-dihydro-4hydroxy-5,6-methylendioxy-1-methyl-2-oxochinolin-3-karboxamid.
34. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 až 33 k léčbě roztroušené sklerózy (MS) savců.
35. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 až 33 k léčbě diabetes mellitus závislém na podávání inzilinu (IDDM) u savců.
36. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 až 33 k léčbě systémové lupus erythematosus (SLE) savců.
37. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 až 33 k léčbě revmatické arthritidy (RA) savců.
38. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 až 33 k léčbě zánětlivých onemocnění střev. (IBD) savců.
39. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 až 33 k léčbě psoriazy savců.
40. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 až 33 k léčbě zánětlivých respiračních onemocnění jako je astma u savců.
41. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 až 33 k léčbě atherosklerozy savců.
42. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 až 33 k léčbě mrtvice u savců.
43. Použití podle kteréhokoliv z nároků 20 - 33 k léčbě Alzheimerovy choroby savců