CZ20013264A3

CZ20013264A3 - Lactobacillus strains

Info

Publication number: CZ20013264A3
Application number: CZ20013264A
Authority: CZ
Inventors: Jean-Richard Neeser; Roberto Reniero; Alain Servin
Original assignee: Société des Produits Nestlé S. A.
Priority date: 1999-03-11
Filing date: 2000-03-02
Publication date: 2002-01-16
Also published as: IL145079A; CO5241327A1; HUP0200205A2; ZA200107290B; IL145079A0; ZA200107293B; HUP0200205A3; NZ513806A; NO20014299D0; US6835376B1; EP1162986A1; BR0008911A; AR022912A1; WO2000053200A1; RO121701B1; RU2247569C2; CA2364435A1; PE20001557A1; AU779414B2; RU2243779C2

Abstract

The present invention pertains to novel microorganisms of the genus Lactobacillus, that are useful in preventing diarrhea brought about by pathogenic bacteria. In particular, the present invention relates to the use of said microorganisms for the preparation of an ingestable support and to a composition containing the same. <IMAGE>

Description

Vynález se týká nových, mikroorganismů rodu Lactobacillus, které jsou užitečné při prevenci průjmu, zprostředkovaného pravděpodobně patogenními bakteriemi. Zejména se předkládaný vynález týká užiti uvedených mikroorganismů pro přípravu poživatelného nosiče a prostředku obsahujícího tento nosič.The invention relates to novel microorganisms of the genus Lactobacillus, which are useful in preventing diarrhea, possibly mediated by pathogenic bacteria. In particular, the present invention relates to the use of said microorganisms for the preparation of an edible carrier and a composition comprising the carrier.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Organismy, které jako hlavní metabolickou složku produkují kyselinu mléčnou, jsou dlouho známy. Tyto bakterie se mohou nacházet v mléce nebo v továrnách, které zpracovávají mléko, zejména v živých nebo odumřelých rostlinách, ale také ve střevě lidí a zvířat. Tyto mikroorganismy, shrnuté pod výrazem „bakterie kyseliny mléčné, představují dosti nehomogenní skupinu a zahrnují, například, rody Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus apod..Organisms that produce lactic acid as a major metabolic component have long been known. These bacteria can be found in milk or in milk processing factories, especially in live or dead plants, but also in the intestines of humans and animals. These microorganisms, summarized under the term "lactic acid bacteria", represent a rather inhomogeneous group and include, for example, the genera Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus, Bifidobacterium, Pediococcus and the like.

Bakterie kyseliny mléčné byly využity jako fermentační činidla ke konzervaci potravy při nízkém pH a k působení fermentačních prostředků, vytvořených během jejich fermentační činnosti, k inhibici růstu ničících bakterií. Nakonec byly bakterie kyseliny mléčné užity pro přípravu různých druhů potravin jako je sýr, jogurt a další fermentované mléčné produkty.Lactic acid bacteria have been used as fermentation agents to preserve food at low pH and to act as fermentation agents formed during their fermentation activity to inhibit the growth of destroying bacteria. Finally, lactic acid bacteria have been used to prepare various types of food such as cheese, yogurt and other fermented dairy products.

Docela nedávno získaly bakterie kyseliny mléčné velký díl pozornosti, kdy bylo zjištěno, že některé kmeny mají po požití cenné vlastnosti pro člověka a zvířata. Zejména určité kmeny rodu Lactobacillus nebo Bifidobacterium vykazovaly schopnost kolonizovat střevní sliznici a pomáhat při udržování dobrého stavu člověka a zvířete.Recently, lactic acid bacteria have received much attention, with some strains found to have valuable properties for humans and animals when ingested. In particular, certain strains of the genus Lactobacillus or Bifidobacterium have shown the ability to colonize the intestinal mucosa and assist in maintaining good human and animal health.

S ohledem k tomu, EP 0 768 375 popisuje specifické kmeny Bifidobacteria, které jsou schopné implantace do střevní flóry a mohou ulpívat na střevních buňkách. Tyto Bifidobacteria jsou označována jako pomáhající při imunomodulaci tím, že jsou schopná kompetitivního vyloučení adhese patogenní bakterie k střevním buňkám, tedy pomáhají v udržování zdraví j ednotlivce.Accordingly, EP 0 768 375 describes specific strains of Bifidobacteria which are capable of being implanted in the intestinal flora and which can adhere to intestinal cells. These Bifidobacteria are said to aid immunomodulation by being able to competitively eliminate the adhesion of pathogenic bacteria to the intestinal cells, thus helping to maintain the health of the individual.

Během posledních několika let byl výzkum na potenciální užití probiotických životaschopné také soustředěn činidel.Over the past few years, research into the potential use of probiotic viable has also been concentrated reagents.

mikrobiální bakteriímicrobial bacteria

Probiotika přípravky, kyseliny j sou které napomáhají mikroflóry ve střevě.Probiotics preparations are acids that help microflora in the intestine.

mléčné jako považována za zdraví jednotlivceDairy as considered the health of the individual

Mikrobiální udržováním probiotické přirozené přípravky mohou být v případě jejich účinných mikrobů a pokud způsoby běžně akceptovány jako jejich účinku jsou známy. Probiotika jsou míněny k připojení k střevní sliznici, kolonizaci střevního traktu a rovněž k předcházení připojení škodlivých mikroorganismů na střevní trakt. Rozhodující nezbytný předpoklad jejich účinku je v tom, že mohou dosahovat střevní sliznice ve vhodné a životaschopné formě a nejsou rozrušeny v horních částech trávicího traktu, zvláště účinkem nízkého pH, které převládá v žaludku.By microbial maintenance, probiotic natural preparations may be in the case of their effective microbes and if the methods commonly accepted as their effect are known. Probiotics are intended to attach to the intestinal mucosa, colonize the intestinal tract, and also prevent the attachment of harmful microorganisms to the intestinal tract. A crucial prerequisite for their effect is that they can reach the intestinal mucosa in a suitable and viable form and are not disrupted in the upper parts of the gastrointestinal tract, in particular due to the low pH prevailing in the stomach.

V tomto ohledu, WO 97/00078 popisuje určitý kmen, který se nazývá Lactobacillus GG (ATCC 53103), jako probiotikum. Tento mikroorganismus je zejména obsažen ve způsobu prevence nebo léčení hypersenzitivních reakcí navozených potravou, kdy je podáván příjemci spolu s potravou, která podléhá hydrolýze působením pepsinu a/nebo trypsinu. Vybraný kmen Lactobacillus je popisován jako vykazující adhesivní a kolonizační schopnosti a mající systém enzymů proteáz, tak že bílkovinná látka obsažená v podávané potravě je dále hydrolyzována prostřednictvím proteáz, které jsou produkované určitým kmenem Lactobacilla. Tento způsob, který je popisovaný v tétoIn this regard, WO 97/00078 describes a particular strain called Lactobacillus GG (ATCC 53103) as a probiotic. In particular, the microorganism is comprised in a method of preventing or treating hypersensitivity reactions induced by food when administered to a recipient together with a food that is subject to hydrolysis by pepsin and / or trypsin. The selected Lactobacillus strain is described as exhibiting adhesive and colonizing capabilities and having a protease enzyme system, such that the proteinaceous substance contained in the diet is further hydrolyzed by proteases produced by a particular Lactobacilla strain. This method, which is described in this

přihlášce, bude mít eventuelně za následek vzestup bílkovinné látky střeva, která nevykazuje podstatné množství alergenní látky.the application will eventually result in an increase in the intestinal protein substance that does not exhibit a substantial amount of the allergenic substance.

Dále, v EP 0 bakterií kyseliny Heliobacter pylori, v přípravě nosiče, spojený s účinkemFurther, in EP 0 of the bacterium Heliobacter pylori, in the preparation of a carrier, associated with an effect

577 903, mléčné, je připraveno užití které mají schopnost uznanou příčinou vývoje takových náhrady který je který je určeného pro léčbu nebo profylaxi577 903, dairy, is ready to use which have the ability to acknowledge the development of such substitutes which is which is intended for treatment or prophylaxis

Heliobacter pylori.Heliobacter pylori.

vředu, vředu,ulcer, ulcer,

Na základě znalosti cenných vlastností určitých kmenů bakterií bakterií zdravotní kyseliny mléčné, kyseliny mléčné, které jsou stav člověka a/nebo zvířete.Based on the knowledge of the valuable properties of certain strains of bacterial bacteria, lactic acid, lactic acid, which is a human and / or animal condition.

jsou v oboru požadovány další které jsou prospěšné pro kmeny dobrýothers are required in the art which are beneficial to good strains

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Otázkou předkládaného vynálezu je tedy poskytnout další bakteriální kmeny, které vykazují nové vlastnosti, které jsou prospěšné pro člověka a/nebo zvířata.It is therefore an object of the present invention to provide additional bacterial strains that exhibit novel properties that are beneficial to humans and / or animals.

Výše uvedená otázka byla vyřešena novými mikroorganismy, jmenovitě bakteriemi kyseliny mléčné, příslušející k rodu Lactobacillus, které mají schopnost předcházet kolonizaci střeva patogenními bakteriemi, které způsobují průjem.The above question has been solved by new microorganisms, namely lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus, which have the ability to prevent colon colonization by pathogenic bacteria that cause diarrhea.

Podle výhodného provedení, je kmen Lactiobacillu schopný adhese ke střevní sliznici savců a může růst za přítomnosti více jak 4% žlučových solí.According to a preferred embodiment, the Lactiobacillus strain is capable of adhering to the intestinal mucosa of mammals and can grow in the presence of more than 4% bile salts.

Avšak, podle jiného výhodného provedení, je bakterie kyseliny mléčné vybrána ze skupiny, která sestává z Lactobacillus rhamnosus nebo Lactobacillus paracasei, výhodně Lactobacillus paracasei a výhodněji Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116.However, according to another preferred embodiment, the lactic acid bacterium is selected from the group consisting of Lactobacillus rhamnosus or Lactobacillus paracasei, preferably Lactobacillus paracasei, and more preferably Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116.

Mikroorganismy, podle vynálezu, vykazuji mimo jiné následující vlastnosti: jsou gram positivní, negativní na katalázu, negativní na tvorbu NH₃ formy argininu a negativní na produkci C0₂, produkují L(+) kyselinu mléčnou, jsou schopné růstu za přítomnosti žlučových solí v koncentraci vyšší než 0,4% a mohou podstatně předcházet kolonizaci střevních buněk bakteriemi přivozujícími průjem, jako je patogenní E. coli, například enteropatogenní E. coli (EPEC) nebo salmonella, například salmonella typhimurium.The microorganisms according to the invention exhibit, inter alia, the following properties: they are gram positive, catalase negative, NH ₃ form arginine negative and CO ₂ production negative, produce L (+) lactic acid, are capable of growing in the presence of bile salts at a concentration higher than 0.4% and may substantially prevent colonization of intestinal cells by diarrhea-inducing bacteria such as pathogenic E. coli, for example enteropathogenic E. coli (EPEC) or salmonella, for example salmonella typhimurium.

Nové mikroorganismy mohou být užity pro přípravu různých poživatelných nosičů, jako je mléko, jogurt, tvaroh, fermentovaná mléka, fermentované produkty na basi mléka, fermentované produkty na basi obilovin, prášková mléka, výživa pro kojence a v nosiči mohou být obsaženy v množství od kolem 10⁵ cfu/g až kolem 10¹¹ cfu/g. Pro účel předkládaného vynálezu bude zkratka cfu označovat „jednotku tvořící kolonie, která je definována jako množství bakteriálních buněk, jak ukazují mikrobiální počty na agarových plotnách.The novel microorganisms can be used to prepare various edible carriers such as milk, yoghurt, curd, fermented milk, fermented milk-based products, fermented cereal-based products, powdered milk, infant formulas, and may be present in the carrier in amounts ranging from about 10 ⁵ cfu / g to about 10 ¹¹ cfu / g. For the purpose of the present invention, the abbreviation cfu will refer to "colony forming unit, which is defined as the number of bacterial cells as shown by microbial counts on agar plates.

Předkládaný vynález také poskytuje potravinový nebo farmaceutický prostředek, který obsahuje nejméně jeden z kmenů Lactobacilla, majícího výše uvedené vlastnosti a/nebo který obsahuje kulturu supernatantu, ve které rostou mikroorganismy nebo jejich frakce.The present invention also provides a food or pharmaceutical composition comprising at least one of the Lactobacilla strains having the above characteristics and / or comprising a culture of the supernatant in which the microorganisms or fractions thereof are grown.

Pro přípravu potravinového prostředku, podle vynálezu, je začleněn ve vhodném nosiči nejméně jeden z kmenů Lactobacilla, podle vynálezu, v množství od kolem 10⁵ cfu/g až kolem 10¹¹cfu/g, výhodně od kolem 10⁶ cfu/g až kolem 1O¹⁰ cfu/g, výhodněji od kolem 10⁷ cfu/g až kolem 10⁹ cfu/g.For preparing a food composition according to the invention is incorporated in a suitable carrier, at least one of the Lactobacillus strains according to the invention in an amount from about 10 ⁵ cfu / g to about 10 ¹¹ cfu / g, preferably from about 10 ⁶ cfu / g to about 1O ¹⁰ cfu / g, more preferably from about 10 ⁷ cfu / g to about 10 ⁹ cfu / g.

V případě farmaceutického prostředku může být produkt připraven ve formě tablet, kapalných bakteriálních suspensí, sušených orálních doplňků, vlhkých orálních doplňků, suchých ·In the case of a pharmaceutical composition, the product may be prepared in the form of tablets, liquid bacterial suspensions, dried oral supplements, wet oral supplements, dry

potravinových přípravků pro podáváni sondou a vlhkých potravinových přípravků pro podávání sondou s obsahem množství kmenů Lactobacilla v rozmezí vyšším než kolem 10¹² cfu/g, výhodně od kolem 10⁷ cfu/g až kolem 10^u cfu/g, výhodněji od kolem 10⁷ cfu/g až kolem 1O¹⁰ cfu/g.gavage and wet gavage food compositions containing a plurality of Lactobacilla strains in a range of greater than about 10 ¹² cfu / g, preferably from about 10 ⁷ cfu / g to about 10 ^u cfu / g, more preferably from about 10 ⁷ cfu / g to about 10 ¹⁰ cfu / g.

Činnost nových mikroorganismů ve střevě jednotlivce je přirozeně závislá na dávce. Čím více nových mikroorganismů je začleněno prostřednictvím požití výše uvedeného potravinového nebo farmaceutického prostředku, tím vyšší je ochranná a/nebo léčebná účinnost mikroorganismů. Jelikož nové mikroorganismy nejsou škodlivé lidem a zvířatům a mohou být eventuelně izolovány ze stolic dětí, může být jejich vysoké množství začleněno tak, že podstatně velká část střeva jednotlivce bude kolonizována novými mikroorganismy.The activity of new microorganisms in an individual's intestine is naturally dose-dependent. The more new microorganisms are incorporated through ingestion of the above food or pharmaceutical composition, the higher the protective and / or therapeutic efficacy of the microorganisms. Since the new microorganisms are not harmful to humans and animals and may eventually be isolated from the stools of children, a high amount thereof may be incorporated so that a substantial part of the individual's intestine is colonized by the new microorganisms.

Avšak, podle jiného výhodného provedení, může být pro přípravu jednoho z výše uvedených poživatelných nosičů použit supernatant kultury kmene Lactobacilla, podle vynálezu. Supernatant může být užit jako takový nebo může být sušen za podmínek, které neničí metabolické sloučeniny produkované mikroorganismy do kapalného prostředí, jako je například lyofílizace, a může být začleněn v nosiči. Za účelem snížit na minimum množství neznámých sloučenin v supernatantu, budou kmeny Lactobacilla výhodně růst v definovaném prostředí, prostředku, který je znám a neovlivní negativně hostitele, ve kterém je začleněn. Dále odborníci budou na základě svých obecných znalostí, popřípadě zbavovat supernatant nežádoucích produktů, například prostřednictvím chromatografie.However, according to another preferred embodiment, a culture supernatant of the Lactobacilla strain of the invention may be used to prepare one of the above-mentioned edible carriers. The supernatant may be used as such or may be dried under conditions that do not destroy the metabolic compounds produced by the microorganisms into a liquid medium, such as lyophilization, and may be incorporated in a carrier. In order to minimize the amount of unknown compounds in the supernatant, the Lactobacilla strains will preferably grow in a defined environment, a composition that is known and will not adversely affect the host in which it is incorporated. Further, those skilled in the art will, based on their general knowledge, optionally dispose of the supernatant of undesirable products, for example by chromatography.

Během rozsáhlých studií, vedoucích k předkládanému vynálezu, zkoumali vynálezci stolice dětí a izolovali z nich různé bakteriální kmeny. Tyto kmeny byly následně zkoumány pro jejich schopnost předcházet kolonizaci epiteliálních buněk bakteriemi, které jsou známou příčinou průjmu.During extensive studies leading to the present invention, the inventors examined the stool of children and isolated various bacterial strains therefrom. These strains were subsequently examined for their ability to prevent colonization of epithelial cells by bacteria that are a known cause of diarrhea.

······ · ·· 4······· · ·· 4 ·

9 9 · 4 · · · 4 49 9 4 5

4 4 *44 44 é ···· ··*·· ·· ·· ····· ·· ·4 4 * 44 44 é ···· ·· * ·· ·· ·· ····· ·· ·

Některé bakteriální rody, zahrnující Lactobacillus, Lactococcus a Streptococcus, byly sledovány pro jejich schopnosti zamezovat průjmu. Tyto zkoušky inhibiční schopnosti byly provedeny hlavně s patogenní E. coli a salmonellou typhimurium jako representativními pro patogenní mikroorganismy, které způsobují průjem u jednotlivce.Some bacterial genera, including Lactobacillus, Lactococcus and Streptococcus, have been studied for their ability to prevent diarrhea. These inhibition tests were mainly performed with pathogenic E. coli and salmonella typhimurium as representative of the pathogenic microorganisms that cause diarrhea in the individual.

Ve vhodném prostředí byly pěstovány různé bakterie kyseliny mléčné, v takovém jako je MRS, Hugo-Jago nebo M17 při teplotách od kolem 30° do 40°C, které odpovídají jejich optimální růstové teplotě. Po dosažení stacionárního růstu byly bakterie shromážděny centrifugací a znovu rozptýleny ve fysiologickém roztoku NaCl. Mezi jednotlivými zkouškami byly bakteriální buňky skladovány zmrazené(-20°C).Various lactic acid bacteria, such as MRS, Hugo-Jago or M17, were grown in a suitable environment at temperatures from about 30 ° C to 40 ° C that correspond to their optimal growth temperature. After stationary growth, the bacteria were collected by centrifugation and resuspended in physiological NaCl solution. Between individual assays, bacterial cells were stored frozen (-20 ° C).

Pro stanovení antibakteriálních vlastností byly vybrány následující přístupy.The following approaches have been selected to determine antibacterial properties.

Podle jednoho zápisu, byly pěstované kmeny Lactobacilla, podle vynálezu,zkoušeny pro svoji schopnost zamezovat adhesi patogenních bakterií, způsobujících průjem, ke střevním buňkám nebo zamezovat jejich invasi do střevních buněk. Nakonec, byly střevní buňky přivedeny do styku s patogenními bakteriemi a pěstovanými kmeny Lactobacilla, podle vynálezu, a byla stanovena rychlost adhese nebo invase.According to one notation, cultured Lactobacilla strains of the invention were tested for their ability to prevent adhesion of pathogenic bacteria causing diarrhea to intestinal cells or to prevent their invasion into intestinal cells. Finally, intestinal cells were contacted with pathogenic bacteria and cultured Lactobacilla strains, according to the invention, and the rate of adhesion or invasion was determined.

Podle druhého zápisu, byl supernatant buněčné kultury kmenů Lactobacilla, podle vynálezu, přidán spolu s patogenními mikroorganismy ke střevním buňkám a byla stanovena rychlost adhese nebo invase.According to the second notation, the cell culture supernatant of the Lactobacilla strains of the invention was added together with pathogenic microorganisms to the intestinal cells and the rate of adhesion or invasion was determined.

Může být zřejmé, že pěstované Lactobacilly a supernatant se prokázaly extrémně účinné při prevenci obojího, adhese a invase do střevních buněk, což prokazuje, že metabolické sloučeniny, produkované novými mikroorganismy, jsou nejspíše odpovědné za činnost proti průjmu.It can be seen that cultured Lactobacilli and supernatant have proven extremely effective in preventing both adhesion and invasion of intestinal cells, demonstrating that metabolic compounds produced by new microorganisms are likely to be responsible for counteracting diarrhea.

Dále se k výše uvedenému objevu ukazuje, že kmeny, podle vynálezu, kupodivu vykazují antialergenní vlastnosti, kdy uvedené kmeny mají dopad na syntézu různých imunologických mediátorů.Further to the above discovery, it appears that the strains of the invention surprisingly exhibit antiallergenic properties, wherein said strains have an impact on the synthesis of various immunological mediators.

Je obecně uznáváno, že humorální imunitní odpovědi a alergické reakce jsou zprostředkovány CD4⁺ T buňkami, které nesou fenotyp typu 2(Th2). Th2 buňky jsou charakterizovány tvorbou vysokých hladin interleukinu 4 (IL-4) a cytokinu, požadovaného pro sekreci IgE, který je hlavní skupinou protilátek, začleněnou v alergických reakcích.It is generally accepted that humoral immune responses and allergic reactions are mediated by CD4 ⁺ T cells that carry the type 2 (Th2) phenotype. Th2 cells are characterized by the formation of high levels of interleukin 4 (IL-4) and the cytokine required for the secretion of IgE, which is the major group of antibodies involved in allergic reactions.

Diferenciace Th2 buněk je poškozována IFN-γ, příslušným cytokinem, který je produkovaný vzájemně se vylučující Thl podskupinou CD4⁺T buněk. Uvedené Thl buňky jsou na druhé straně silně indukované interleukinem 12 (IL-12). Naproti tomu IL-10, další cytokin, má silně rušivý dopad na proliferaci Thl buněk a tudíž se uvažuje, že má úlohu v imunosupresivních reakcích.Th2 cell differentiation is impaired by IFN-γ, an appropriate cytokine that is produced by the mutually secreting Th1 subset of CD4 ⁺ T cells. Said Th1 cells, on the other hand, are strongly induced by interleukin 12 (IL-12). In contrast, IL-10, another cytokine, has a highly disruptive impact on Th1 cell proliferation and is therefore thought to play a role in immunosuppressive reactions.

Shrnuto, oba IL-12 a IL-10 mají silné modulační účinky na vývoj CD4⁺ T buněk ovlivněním vývoje podskupiny Thl. IL-12 je klíčový regulační cytokin pro indukci diferenciace Thl a tedy inhibuje tvorbu Th2 odpovědí. Hlavním způsobem inhibice Th2 buněk je tudíž spatřován ve stimulaci syntézy IL-12 pomocnými buňkami.In summary, both IL-12 and IL-10 have potent modulatory effects on CD4 ⁺ T cell development by affecting the development of the Th1 subset. IL-12 is a key regulatory cytokine for inducing Th1 differentiation and thus inhibits the production of Th2 responses. Thus, a major method of inhibiting Th2 cells is seen to stimulate IL-12 synthesis by helper cells.

Je dobře známo, že některé složky gram negativních bakterií, jako je LPS, navozují vysoké hladiny IL-12 v adherentních buňkách, jako jsou makrofágy a dendritické buňky. Shodně se ukazuje, že gram negativní bakterie mohou silně ovlivnit diferenciaci CD4⁺ T buněk směrem k Thl fenotypu.It is well known that some components of gram-negative bacteria, such as LPS, induce high levels of IL-12 in adherent cells such as macrophages and dendritic cells. It is consistently shown that gram negative bacteria can strongly affect the differentiation of CD4 ⁺ T cells towards the Th1 phenotype.

Mikroorganismy STU, jako například kmeny Lactobacilla, podle vynálezu, byly zkoušeny pro potenciální úlohu v indukci cytokinů, zahrnutých v regulaci diferenciace CD4⁺ T buněk. Zejména byl studován účinek STU na fenotyp CD4⁺ T buněk, podstupujících diferenciaci Th2.STU microorganisms, such as Lactobacilla strains, of the invention have been tested for a potential role in the induction of cytokines involved in the regulation of CD4 ⁺ T cell differentiation. In particular, the effect of STU on the phenotype of CD4 ⁺ T cells undergoing Th2 differentiation was studied.

V tomto ohledu byla schopnost STU indukovat syntézu mRNA, která kóduje tyto dva regulační cytokiny v myších adhrerentních buňkách získaných z kostní dřeně, srovnána se 4 dalšími kmeny Lactobacilla a s kontrolní gram negativní bakterií (E. coli K12). Po 6ti hodinové inkubaci buněk s různými ředěními v rozmezí od 10⁷ až 10⁹ cfu/ml byla mRNA měřena semikvantitativní RT-PCR.In this regard, the ability of STU to induce mRNA synthesis that encodes these two regulatory cytokines in mouse bone marrow derived adhrerent cells was compared with 4 other Lactobacilla strains and a control gram negative bacterium (E. coli K12). After a 6 hour incubation of cells with different dilutions ranging from 10 ⁷ to 10 ⁹ cfu / ml, mRNA was measured by semi-quantitative RT-PCR.

Ačkoliv všechny kmeny Lactobacilla mohou indukovat transkripci IL-12 mRNA do určitého stupně, ST 11 se může ukazovat jako nejsilnější vyvolavatel, vzhledem k tomu, že může být detekován silný PCR signál dokonce při nejnižší bakteriální dávce. Ve skutečnosti byla schopnost ST11 indukovat transkripci IL-12 mRNA tak silná jako u E.coli. Indukce IL-10 mRNA byla obecně slabší než pro IL-12 mRNA, protože signál mohl být detekován pouze při vyšších bakteriálních dávkách. Nicméně, STU byl nejsilnějším vyvolavatelem IL-10 mRNA, jak srovnáno s jinými Lactobacilly a kontrolní E.coli.Although all Lactobacilla strains can induce the transcription of IL-12 mRNA to some degree, ST11 may prove to be the strongest inducer, since a strong PCR signal can be detected even at the lowest bacterial dose. In fact, the ability of ST11 to induce transcription of IL-12 mRNA was as potent as that of E. coli. Induction of IL-10 mRNA was generally weaker than for IL-12 mRNA, since the signal could only be detected at higher bacterial doses. However, STU was the most potent inducer of IL-10 mRNA, as compared to other Lactobacilli and control E. coli.

STU se tedy zdá být schopný indukce imunoregulačních cyrtokinů, zahrnutých v diferenciaci CD4⁺ T buněk. Jeho silná schopnost indukovat IL-12 z něho dělá kandidáta inhibice Th2 odpovědí a jeho měřitelná indukce IL-10 může předcházet zánětlivým odpovědím.Thus, STU appears to be capable of inducing immunoregulatory cyrtokines involved in CD4 ⁺ T cell differentiation. Its potent ability to induce IL-12 makes it a candidate for inhibiting Th2 responses, and its measurable induction of IL-10 can prevent inflammatory responses.

Dále bylo k výše uvedenému objevu určeno, který STU měl inhibiční účinek na CD4⁺ T buňky, podléhající Th2 diferenciaci a který měl positivní účinek na funkce Thl. Byl užit dobře založený systém pro diferenciaci buněk v kultuře, kde prekursorFurther, to the above discovery, it was determined which STU had an inhibitory effect on Th2 differentiated CD4 ⁺ T cells and which had a positive effect on Th1 functions. A well based system for cell differentiation in a precursor culture was used

CD4⁺ T buněk byl polyklonálně aktivován a modulován, až došlo k diferenciaci Thl nebo Th2, v závislosti na typu společného stimulu v živném prostředí.Thl/Th2 diferenciace byla indukována během 7 denní primární kultury, poté byly buňky opět stimulovány po 2 dny v sekundární kultuře, obsahující samotné prostředí a přídavek specifického fenotypu (Thl nebo Th2) byl stanoven měřením typů cytokinů, produkovaných v supematantu (iFN-γ versus IL-4).CD4 ⁺ T cells were polyclonal activated and modulated until differentiation of Th1 or Th2 occurred, depending on the type of common stimulus in the culture medium. Th1 / Th2 differentiation was induced during the 7 day primary culture, after which the cells were stimulated again for 2 days in the secondary culture containing media alone and addition of a specific phenotype (Th1 or Th2) was determined by measuring the types of cytokines produced in the supernatant (iFN-γ versus IL-4).

Je obecně známo, že prekursor CD4⁺ T buněk z myší BALB/c dosud především rozlišoval predominantní Th2 fenotyp ((vysoké IL-4, nízké IFN-γ V supernatantech dvoutýdenní kultury) po aktivaci za neutrálních podmínek (samotné prostředí v týdenní kultuře) . Tento fenotyp mohl být kompletně navrácen do původního stavu k původnímu Thl (vysoké IFN-γ, nízké IL-4) při přidání blokujících monoklonárních protilátek k IL-4 v týdenní kultuře.It is generally known that the CD4 ⁺ T cell precursor from BALB / c mice has so far mainly discriminated the predominant Th2 phenotype ((high IL-4, low IFN-γ in two week culture supernatants) after activation under neutral conditions (weekly culture alone). This phenotype could be completely restored to the original Th1 (high IFN-γ, low IL-4) by adding blocking monoclonal antibodies to IL-4 in weekly culture.

Ke zkoumání potenciální úlohy STU na inhibici Th2, byly v týdenní kultuře aktivovány čištěné prekursory CD4⁺ T buněk z BALB/c myší za přítomnosti adherentních buněk z kostní dřeně jako pomocných buněk. Tyto buňky byly společně pěstovány buď v samotném prostředí nebo za přítomnosti lmg/ml LPS nebo 10⁸cfu/ml STU nebo 10⁸ cfu/ml jiného Lactobacilla. Po čase byly buňky promyty a CD4⁺ T buňky byly opět jednou čištěny a znovu stimulovány ve dvoutýdenní kultuře v samotném prostředí.To investigate the potential role of STU for Th2 inhibition, purified weekly culture of purified CD4 ⁺ T cell precursors from BALB / c mice were activated in the presence of adherent bone marrow cells as helper cells. These cells were co-cultured either in the medium alone or in the presence of 1mg / ml LPS or 10 ⁸ cfu / ml STU or 10 ⁸ cfu / ml other Lactobacilla. Over time, cells were washed and CD4 ⁺ T cells were again purified and re-stimulated in two-week culture in medium alone.

Cytokiny, produkované diferencovanými CD4⁺ T buňkami, byly měřeny po dvou dnech. Jak očekáváno, buňky, které byly diferencované za přítomnosti samotného prostředí, se ukázaly dominantní fenotypu Th2. Přidání STU do týdenní kultury silně ovlivňovalo výsledek Th2 diferenciace, jak to vyplývá z 8násobného snížení produkce IL-4. Tato inhibice byla podobnou veličinou jako ta, která byla pozorována v kulturách, získaných z buněk, které byly diferencovány za přítomnosti LPS. NaprotiCytokines produced by differentiated CD4 ⁺ T cells were measured after two days. As expected, cells that were differentiated in the presence of medium alone showed a dominant Th2 phenotype. The addition of STU to the weekly culture strongly influenced the result of Th2 differentiation, as evidenced by a 8-fold reduction in IL-4 production. This inhibition was similar to that observed in cultures obtained from cells that were differentiated in the presence of LPS. Opposite

• «4» • «3» 99 99 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • • 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 • • 4 4 4» 4 » 44 44 4 4

4*4 *

4 4 4 4 t · · ♦ «4« 44 4 4 4 t · · ♦ «4« 4

4 4 4 tomu, další kmen Lactobacilla měl neměřitelný dopad na hladiny il-4. Je zajímavé, že hladiny iFN-γ nebyly zvýšeny při přidání STU do týdenní kultury.In addition, another Lactobacilla strain had an immeasurable impact on il-4 levels. Interestingly, iFN-γ levels were not increased when STU was added to the weekly culture.

CD4⁺ T buňkami, zvyšuje produkciCD4 ⁺ T cells increase production

IL-10 sIL-10 p

Shrnuto, STU specificky snižuje produkci IL-4 které podléhají diferenciaci Th2, ale nevýznamně sekreci iFN-γ. Tato skutečnost, že ST11 nezvyšuje může být vztažena k jeho schopnosti indukovat dopadIn summary, STU specifically reduces IL-4 production that is subject to Th2 differentiation but insignificantly iFN-γ secretion. This fact that ST11 does not increase may be related to its ability to induce impact

IFN-y, důsledkem, že to může mít nízký zánětlivý navzdory j eho činnosti proti Th2.IFN-γ, due to the fact that it may have low inflammatory despite its activity against Th2.

NásledněThen

Lactobacilla, se může zdát, že STU je které mají profil proti Th2, j eden který je kmenů dělá výbornými kandidáty pro jejich užití s protialergickou a probiotickou činností.Lactobacilla, it may seem that STU is having a profile against Th2, one which is strains makes excellent candidates for their use with antiallergic and probiotic activity.

jako bakteriílike bacteria

Přehled obrázků na výkresechBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Obr. 1 znázorňuje schéma, ilustrující pokusu na buněčné kultuře, ve které pěstované buňky zkoušce pro inhibici adhese patogenní k epiteliálním buňkám.Giant. 1 is a diagram illustrating a cell culture experiment in which cultured cells are assayed to inhibit adhesion pathogenic to epithelial cells.

výsledkyresults

STU jsou užity ve bakterie E.coliSTUs are used in E. coli

Obr. 2 znázorňuje schéma, ilustrující výsledky pokusu na buněčné kultuře, ve které supernatant kultury STU je užit ve zkoušce pro inhibici adhese patogenní bakterie E.coli k epiteliálním buňkám.Giant. 2 is a diagram illustrating the results of a cell culture experiment in which a culture supernatant of STU is used in an assay to inhibit the adhesion of a pathogenic E. coli bacterium to epithelial cells.

Obr. 3 znázorňuje schéma, ilustrující výsledky pokusu na buněčné kultuře, ve které pěstované buňky ST11 jsou užity ve zkoušce pro inhibici invase salmonelly typhimurium k epiteliálním buňkám.Giant. 3 is a diagram illustrating the results of a cell culture experiment in which cultured ST11 cells are used in an assay to inhibit salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.

Obr. 4 znázorňuje schéma, ilustrující výsledky pokusu na buněčné kultuře, ve které supernatant kultury STU je užit veGiant. 4 is a diagram illustrating the results of a cell culture experiment in which a culture supernatant of STU is used in a cell culture

zkoušce pro inhibici invase salmonelly typhimurium k epiteliálním buňkám.assay for inhibiting salmonella typhimurium invasion of epithelial cells.

Obr. 5 znázorňuje acidifikaci kmene L.casei CNCM 1-2116 (označované STU) v různém růstovém prostředí.Giant. 5 shows the acidification of the L.casei CNCM 1-2116 strain (referred to as STU) in various growth media.

Obr. 6 znázorňuje rychlost přežiti kmene L.casei STU při 10°C, měřenou během 30ti dnů.Giant. 6 shows the survival rate of the L.casei STU strain at 10 ° C, measured over 30 days.

Obr. 7 znázorňuje složení mRNA pro IL-12 a IL-10 v myších adherentních buňkách, získaných z kostní dřeně, po inkubaci buněk s různými ředěními STU.Giant. 7 shows the composition of IL-12 and IL-10 mRNA in bone marrow-derived adherent cells after incubation of cells with various dilutions of STU.

Obr. 8 znázorňuje výsledek diferenciace Th2 jako důsledek snížení produkce IL-4.Giant. 8 depicts the result of Th2 differentiation as a result of a decrease in IL-4 production.

Vynález bude nyní popsán následujícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahzu vynálezu.The invention will now be described by the following examples, which are not intended to limit the scope of the invention.

Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Prostředí a roztoky:Environment and solutions:

MRS(Difco)MRS (Difco)

Hugo-Jago(trypton 30g/l (Difco), extrakt z kvasinek 10 g/1 (Difco), laktóza 5 g/1 (Difco), KH₂PO₄ 6 g/1, hovězí extrakt 2 g/1 (Difco) , agar 2 g /1 (Difco))Hugo-Jago (tryptone 30g / l (Difco), yeast extract 10 g / l (Difco), lactose 5 g / l (Difco), KH ₂ PO ₄ 6 g / l, beef extract 2 g / 1 (Difco) , agar 2 g / l (Difco))

M17 (Difco)M17 (Difco)

DMEM (Eagle prostředí v Dulbeccově modifikaci)DMEM (Eagle environment in Dulbecco's modification)

CFA ( podle Ghosh a spol Journal of Clinical microbiology, 1993 31 2163-6)CFA (according to Ghosh et al. Journal of Clinical Microbiology, 1993 31 2163-6)

Míiller Hinton agar (Oxoid) ······ · · · ·· • · · · · · · · ·4 • · · · · · ·· • · · · · · · · ·· y Λ ········· <2 ·· ·· ··· ·· ·· «Miller Hinton agar (Oxoid) 4 4 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 ······ <2 ·· ·· ··· ·· ·· «

LB (Luria Bertami, Maniatis, A Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor, 1992)LB (Luria Bertami, Maniatis, Laboratory Handbook, Cold Spring Harbor, 1992)

Antibiotika byla získána ze SigmaAntibiotics were obtained from Sigma

C¹⁴ acetát (53,4 ci/mmol, Amersham International PLC)C ¹⁴ acetate (53.4 ci / mmol, Amersham International PLC)

PBS (NaCl 8 g/1, KC1 0.2 g/1, Na₂HPO₄ 1.15 g/1, KH₂PO₄ 0.2 g/DPBS (NaCl 8 g / l, KCl 0.2 g / l, Na ₂ HPO ₄ 1.15 g / l, KH ₂ PO ₄ 0.2 g / D

Roztok Trypsin-EDTA (Seromed)Trypsin-EDTA solution (Seromed)

FCS fetálni telecí sérum (Gibco)FCS fetal calf serum (Gibco)

E.coli DAEC 1845 byla získána z( Washington University, Seattle) a E.coli JPN15 byla získána z (Center for Vaccine Development of the University of Maryland, USA). Kmen salmonella typhimurium SL 1344 byl získán z (Department of microbiology, Standford University, CA, USA) .E. coli DAEC 1845 was obtained from (Washington University, Seattle) and E. coli JPN15 was obtained from (Center for Vaccine Development of the University of Maryland, USA). The salmonella typhimurium strain SL 1344 was obtained from (Department of Microbiology, Standford University, CA).

Příklad 1Example 1

Isolace bakterií kyseliny mléčné ze stolice dětíIsolation of lactic acid bacteria from stool

Z plen 16ti zdravých dětí ve stáří 15 až 27 dní, byly sebrány čerstvé stolice. 1 g čerstvé stolice byl umístěn za anaerobních podmínek pro transport do laboratoře a během dvou hodin proběhly mikrobiální analýzy zkoumaných vzorků různými ředěními v Ringerově roztoku a očkováním na selektivní živné půdy. K izolaci bakterie kyseliny mléčné byl užit MRS agar plus antibiotika ( phosphomycin 80 pg/ml, sulfamethoxazol 93 pg/nfl, trirnethoprim 5 pg/ml), které byly inkubovány po dobu 48 hodin při 37C. Kolonie byly náhodně vybrány a čištěny. Fysiologické a genetické charakteristiky byl provedeny na izolátech.Fresh stools were collected from the diapers of 16 healthy children aged 15 to 27 days. 1 g of fresh stool was placed under anaerobic conditions for transport to the laboratory, and microbial analyzes of the samples under investigation were performed in various dilutions in Ringer's solution and inoculated on selective broths within two hours. MRS agar plus antibiotics (phosphomycin 80 pg / ml, sulfamethoxazole 93 pg / ml, trirnethoprim 5 pg / ml) were used to isolate lactic acid bacteria and incubated for 48 hours at 37C. Colonies were randomly selected and purified. Physiological and genetic characteristics were performed on isolates.

• · · ·• · · ·

Příklad 2Example 2

Kultivace buněk Caco-2Caco-2 cell culture

Pro inhibiční zkoušky byla buněčná linie Caco-2. Tato buněčná jako střevní model užita linie vlastnosti pro střevní buňky, polarizace, exprese střevních strukturálních polypeptidů apod..For inhibition assays, the cell line was Caco-2. This cell as an intestinal model used a line of properties for intestinal cells, polarization, expression of intestinal structural polypeptides and the like.

takové enzymů, představuje význačné jako je například produkce určitýchof such enzymes represents prominent such as the production of certain

Buňky byl pěstovány na jmenovitě na miskách z plastické a množení, na odmaštěných a sterilizovaných skleněných mm (Corning) pro zkoušky pro inhibiční zkoušky.Cells were grown on plastic and propagation dishes, on degreased and sterilized glass mm (Corning) for inhibition assays.

se šesti vyhloubeními 22 x 22 na plotnách s 24 vyhloubeními třech hmoty 25 různých cm² (Corning) podložkách, pro růst plotnách adhese a bylo živné prostředí (DMEM)with six wells 22 x 22 on plates with 24 wells of three masses 25 different cm ² (Corning) pads, for growth plates adhesion and was a nutrient medium (DMEM)

Po druhém dni pěstování živné prostředí doplněno s 100 pg/ml amphoterinu a 20% po dobu 30ti minut. Pěstování v ovzduší, které obsahovalo 90% vzduchu a měněno. Před užitím bylo pěni ci Ί i nu/streptomyci nu, inaktivovánými provedeno přiAfter the second day of culture, the medium was supplemented with 100 µg / ml amphoterin and 20% for 30 minutes. Growing in the air, which contained 90% air and varied. Before ingestion, the foaming / streptomycin foams inactivated were carried out at the time of inactivation

Buňky vyhloubeníCells depleted

7.2.7.2.

10% CO₂.10% CO ₂ .

ze stěn při pH buněčné denněfrom the walls at pH cell daily

U/mlU / ml

FCS, přiFCS, at

37°CDeň: 32 ° C

56°C bylo děleny každých šest dní. Buňky byly působením PBS s 0.25%56 ° C was divided every six days. Cells were treated with PBS with 0.25%

Pro neutralizační účinek byly sebrány trypsinu a trypsinu byl objem FCS, otáčkách za mM EDTA získané suspenzi přidán odpovídající centrifugována (10 minut při 1000 usazenina byla opět umístěna do kultury. Do nové lahve bylo přemístěno kolem 3.5 x 10⁵ buněk, kultivovány až do vzniku splývající monovrstvy.For neutralizing effect, trypsin was collected and trypsin was added to the FCS volume, revolutions per mM EDTA of the suspension obtained, appropriately centrifuged (10 minutes at 1000 pellet was placed in culture again. About 3.5 x 10 ⁵ cells were transferred to a new flask, cultured until confluent monolayers.

směs byla minutu) a kultivační které byly • « · ·mixture was a minute) and cultivation which were • «· ·

Přiklad 3Example 3

Kultivace bakteriíCultivation of bacteria

STU :STU:

Bakteriální kmen E.coli byl skladován při teplotě -20°C v MRS prostředí, které obsahovalo 15% glycerolu. Kmen rostl za anaerobních podmínek v MRS a dvakrát byl během 24 hodin přenesen před užitím inhibičních zkoušek do nového prostředí. Pro zkoušku byla užita koncentrace 2xl0⁹ cfu/ml.The E.coli bacterial strain was stored at -20 ° C in an MRS medium containing 15% glycerol. The strain was grown under anaerobic conditions in MRS and was transferred to the new medium twice within 24 hours before using inhibition assays. A concentration of 2x10 ⁹ cfu / ml was used for the assay.

Supernatant byl shromážděn centrifugací při 20.000 otáčkách za minutu po dobu jedné hodiny a následně byl získaný supernatant zkoumán na přítomnost bakterií.The supernatant was collected by centrifugation at 20,000 rpm for one hour, and then the supernatant obtained was examined for the presence of bacteria.

E.coli:E.coli:

Byly užity dva kmeny E.coli DAEC C 1845 (Enteroinvasivní E.coli) a E-coli JPN 15 (EPEC; enteropatogenní E.coli).Two strains of E.coli DAEC C 1845 (enteroinvasive E.coli) and E-coli JPN 15 (EPEC; enteropathogenic E.coli) were used.

První pasáž po rozmražení byla provedena na CFA-Muller Hinton agaru, který je vhodný pro působení exprese adhesivních složek bakterií.The first passage after thawing was performed on CFA-Muller Hinton agar, which is suitable for the expression of bacterial adhesive components.

Bakteriální buňky byl před každou zkouškou inkubovány při 37 °C a přemístěny do nového prostředí, což bylo provedeno dvakrát po 24 hodinách. Jelikož JPN15 obsahuje geny pro ampicilin, bylo uvedené antibiotikum užito pro selekci během růstu.Bacterial cells were incubated at 37 ° C and transferred to a new medium twice each 24 hours before each assay. Since JPN15 contains genes for ampicillin, the antibiotic was used for selection during growth.

Salmonella:Salmonella:

Pro zkoušky byl použit kmen SL 1344 salmonelly typhimurium, který rostl před použitím v LB prostředí.Salmonella typhimurium strain SL 1344, which grew prior to use in an LB medium, was used for the assay.

Příklad 4Example 4

Inhibiční zkouška pro E.coliInhibition test for E. coli

Patogenní bakteriální kmeny byly po druhém přenosu do nového prostředí označeny radioizotopy za použití C¹⁴-acetátu při 10 pCi/ml V LB prostředí. Inkubace kmenů v tomto prostředí proběhla během 18ti hodin při teplotě 37°C.Pathogenic bacterial strains were labeled with radioisotopes using C ¹⁴ -acetate at 10 pCi / ml in an LB medium after a second transfer to a new medium. Incubation of the strains in this medium was performed for 18 hours at 37 ° C.

Bakteriální suspenze byla následně podrobena centrifugaci (1041 g, 15 minut), tak že se eliminoval supernatant se zbývajícím C¹⁴-acetátem. Usazenina byla rozptýlena a promyta v PBS a buňky byly rozptýleny v 1% sterilní manose v koncentraci kolem 10⁸ buněk/ml. Manosa je známá k inhibici nespecifické adhese.The bacterial suspension was then centrifuged (1041 g, 15 minutes) to eliminate the supernatant with the remaining C ¹⁴ -acetate. The pellet was dispersed and washed in PBS and the cells were dispersed in 1% sterile mannose at a concentration of about 10 ⁸ cells / ml. Mannose is known to inhibit non-specific adhesion.

Rozdílné bakteriální kmeny (E.coli) byly přivedeny do styku s monovrstvou buněk Caco-2 (37°C, 10% CO₂, 90% vzduchu) po dobu 3 hodin. Byly provedeny ty samé zkoušky za použití supernatantu (získaného centrifugaci při 20.000 otáčkách za minutu po dobu 40ti minut).Different bacterial strains (E. coli) were contacted with a Caco-2 cell monolayer (37 ° C, 10% CO ₂ , 90% air) for 3 hours. The same tests were performed using the supernatant (obtained by centrifugation at 20,000 rpm for 40 minutes).

Kontrolní patogenní bakterie byly přivedeny do styku s Caco- monovrstvou bez současného přidání ST11 nebo kultury supernatantu.Control pathogenic bacteria were contacted with the Caco monolayer without addition of ST11 or culture supernatant.

Prostředí bylo po 3 hodinové inkubaci změněno a monovrstva byla třikrát promyta v PBS. Každé promytí zahrnovalo 20x míchání roztoku PBS tak jako hlavně eliminaci veškeré nespecifické adhese. Buňky byly poté rozrušeny přidáním 1 ml uhličitanu sodného a inkubovány po dobu 40ti minut při 37°C. Pevný podíl (250 μΐ) byl po homogenizaci zředěn v 5 ml scintilační kapaliny (Hionic-fluor Packard) a spočítán (Packard 2000) . Procento adhese patogenních buněk k buňkám Caco-2 byloThe medium was changed after a 3 hour incubation and the monolayer was washed three times in PBS. Each wash involved 20x mixing the PBS solution as well as mainly eliminating any non-specific adhesion. The cells were then disrupted by the addition of 1 ml sodium carbonate and incubated for 40 minutes at 37 ° C. After homogenization, the solids (250 μ v) were diluted in 5 ml of scintillation fluid (Hionic-Fluor Packard) and counted (Packard 2000). The percentage of adhesion of pathogenic cells to Caco-2 cells was

spočítáno proti kontrole, která byla nastavena na 100% (adhese nebo pro příklad 5 invase).calculated against a control that was set to 100% (adhesion or invasion for example 5).

Přiklad 5Example 5

Inhibični zkouška pro salmonelluInhibition test for salmonella

Salmonelly jsou bakterie, které napadají epiteliální buňky a množí se tam. Pro určení inhibični činnosti ST11 kmenu salmonella typhimurium, byl inkubován SL 1344 v prostředí s obsahem C¹⁴-acetátu, jak popsáno výše, a byl podroben zkoušce popsané v příkladu 4.Salmonella are bacteria that attack epithelial cells and multiply there. To determine the inhibitory activity of the ST11 salmonella typhimurium strain, SL 1344 was incubated in a C ¹⁴ -acetate medium as described above and subjected to the assay described in Example 4.

Buňky Caco-2 byly po inkubaci promyty PBS k eliminaci všech neadherentních buněk. Následně bylo přidáno prostředí, které obsahovalo gentamycin (20 pg/ml) a inkubace trvala 1 hodinu při 37°C. Gentamycin je antibiotiku nepronikající střevními buňkami, tak že všechny extracellulární mikroorganismy byly usmrceny, kdežto salmonella, která již pronikla střevními buňkami, bude přežívat. Po promytí buněk dvakrát v PBS, byly buňky rozrušeny přidáním sterilní destilované vody a byla měřena radioaktivita, jak popsáno v příkladu 4.Caco-2 cells were washed after incubation with PBS to eliminate any non-adherent cells. Subsequently, medium containing gentamycin (20 µg / ml) was added and incubation continued for 1 hour at 37 ° C. Gentamycin is an antibiotic not penetrating intestinal cells, so that all extracellular microorganisms have been killed, while salmonella, which has already penetrated intestinal cells, will survive. After washing the cells twice in PBS, the cells were disrupted by adding sterile distilled water and the radioactivity was measured as described in Example 4.

Výsledky pokusů 4 a 5 jsou znázorněny na obr. 1 až 4. Může se zdát, že pěstované buňky STU a kultura supernatantu byly extrémně účinné v prevenci adhese a invase patogenními mikroorganismy, které způsobují průjem, do střevních buněk.The results of Experiments 4 and 5 are shown in Figures 1-4. Cultured STU cells and culture supernatant may appear to be extremely effective in preventing adhesion and invasion of pathogenic microorganisms that cause diarrhea into intestinal cells.

Přiklad 6Example 6

Vlastnosti STUSTU properties

STU byl podroben inkubaci v napodobené žaludeční šťávě. Napodobená žaludeční šťáva byla připravena suspendováním pepsinu (3g/l) ve sterilním izotonickém roztoku chloriduThe STU was incubated in simulated gastric juice. Mock gastric juice was prepared by suspending pepsin (3g / L) in sterile isotonic chloride solution.

sodného (0.5% hmotnostních) a úpravou pH na 2.0, respektive na 3.0 koncentrovanou HC1. STU rostl v různých množstvích ve výše uvedeném prostředí a byla určována resistence mikroorganismů.sodium (0.5% by weight) and adjusting the pH to 2.0 and 3.0 with concentrated HCl, respectively. STU grew in various amounts in the above medium and the resistance of microorganisms was determined.

Výsledky jsou shrnuty v tabulce I níže.The results are summarized in Table I below.

Tabulka ITable I

pH pH Cfu/ml v čase 0 Cfu / ml at time 0 Cfu v čase 1 minuta Cfu in time 1 minute Cfu v čase 15 minut Cfu in time Fifteen minutes Cfu v čase 30 minut Cfu in time 30 minutes Cfu v čase 60 minut Cfu in time 60 minutes 2.0 2.0 2. Οχ 10⁹ Οχ 10 ⁹ 1.8 x 10⁹ 1.8 x 10 ⁹ 1.2 x 10⁹ 1.2 x 10 ⁹ 3.7 x 10⁸ 3.7 x 10 ⁸ 7.0 x 10³ 7.0 x 10 ³ 3.0 3.0 2.Οχ 10⁹ 2.Οχ 10 ⁹ 1.9 x 10⁹ 1.9 x 10 ⁹ 1.7 x 10⁹ 1.7 x 10 ⁹ 1.7 x 10⁹ 1.7 x 10 ⁹ 8.4 x 10® 8.4 x 10®

STU měl následující vlastnosti, jak určeno podle způsobů popsaných pro druhy bakterií kyseliny mléčné (Vydavatel, B.J.B. Wood a W.H.Holzapřel, Blackie A&P) .The STU had the following properties as determined by the methods described for lactic acid bacteria (Publisher, B.J.B. Wood and W. H. Holzapřel, Blackie A&P).

-gram pozitivní-gram positive

-negativní na katalázunon-catalase negative

-negativní na tvorbu NH₃ formy argininunegative for formation of NH ₃ form of arginine

-negativní na tvorbu CO₂ -negative for CO ₂ formation

-negativní na produkci L(+) kyseliny mléčné-negative of L (+) lactic acid production

-rostou v přítomnosti koncentraci vyšší než 0,4% žlučových solí při jejichthey grow in the presence of a concentration of greater than 0.4% of bile salts at their concentration

Příklad 7Example 7

Růst ST11 za různých podmínekST11 growth under different conditions

STU byl inkubován při 37°C v prostředí na basi rajčat (4% rajčatový prášek rehydratovaný v destilované vodě) doplněném sacharózou (0, 0.5, 1 nebo 2%) nebo peptonem sóji (0.5%) nebo glukózou (0.5%) pro různá časová období. Výsledky jsou znázorněny na obr. 5.STU was incubated at 37 ° C in tomato-based environment (4% tomato powder rehydrated in distilled water) supplemented with sucrose (0, 0.5, 1 or 2%) or soy peptone (0.5%) or glucose (0.5%) for various time periods. period. The results are shown in Figure 5.

ST11 byl dále přidán k prostředí,které sestávalo z rýžové mouky (3%), pšeničné mouky (2%) a sacharózy (3%), v množství 2.5% a bylo inkubováno při 37 °C až bylo dosaženo pH 4.4. Po zchlazení byl produkt zabalen s přidáním vitaminu C nebo bez přidání vitaminu C a skladován při 10°C.ST11 was further added to the medium consisting of rice flour (3%), wheat flour (2%) and sucrose (3%) at 2.5% and incubated at 37 ° C until pH 4.4 was reached. After cooling, the product was packaged with or without vitamin C and stored at 10 ° C.

Obr. 5 znázorňuje údaje přežití STU při 10°C v obilné tekutině, zabalené v různých materiálech z plastické hmoty (HDPE High density polyethylene, PS polystyrene).Giant. 5 shows STU survival data at 10 ° C in a cereal fluid packaged in various HDPE High density polyethylene (PS polystyrene) materials.

Přiklad 8Example 8

Indukce syntézy IL-12 a IL 10 mRNA myších adherentnich buněk prostřednictvím STUInduction of IL-12 and IL10 mRNA synthesis of mouse adherent cells by STU

Buňky kostní dřeně byly izolovány z feiíiuru a tibie 8 týdnů starých specifických myších C57BL/6 patogenů prostých a byly inkubovány v koncentraci 2xl0⁶ buněk/ml v RPMI prostředí (Gibco), které obsahovalo 10% fetálního hovězího séra, lmM LGlataminu, 12mM Hepes, 0.05 mM 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu (všechna činidla z Gibco) po dobu 12ti hodin při 37°C v 5% CO₂ ovzduší. Neadherentní buňky byly vyloučeny třemi postupnými promytími teplým živným prostředím a zbývající adherentní buňky byly sebrány a inkubovány v koncentraci 10⁶ buněk /ml po dobu 6ti hodin v optimálním čase pro syntézu cytokinu mRNA myších adherentnichBone marrow cells were isolated from phiuria and tibia of 8 week old specific C57BL / 6 pathogen-free mice and incubated at a concentration of 2x10 ⁶ cells / ml in RPMI medium (Gibco) containing 10% fetal bovine serum, 1mM LGlatamine, 12mM Hepes, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U / ml penicillin and 100 µg / ml streptomycin (all Gibco reagents) for 12 hours at 37 ° C in 5% CO ₂ air. Non-adherent cells were secreted by three sequential washes with warm culture medium and the remaining adherent cells were collected and incubated at 10 ⁶ cells / ml for 6 hours at the optimal time for cytokine mRNA synthesis of adherent mice.

J9 ···«·· e ·· ··· • · · · · · · ·v·· ··· «4««·« • · ·· · · « « « · · • · · · · · ···· • · ·· ··· ·· ·· ·♦ · buněk v odpovědi na LPS. Byly přidány bakterie v různých koncentracích v rozmezí od 10⁹ až 10⁷ cfu/ml. Bakterie byly pěstovány a skladovány jak udáno výše.J9 · e e v v 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 «4 4 4 4 4 4 Cells in response to LPS. Bacteria were added at various concentrations ranging from 10 ⁹ to 10 ⁷ cfu / ml. The bacteria were grown and stored as above.

Nakonec 6ti hodinového kultivačního období byly buňky izolovány centrifugací a rozrušeny užitím reakčního balíčku TRIzol (GibcoBRL, Kat. č. 15596-018) podle výrobních instrukcí. Úplná RNA byla izolována precipitací izopropanolu a byla reversně transkribována do cDNA po dobu 90ti minut při 42°C za použití 200 U reversní trankriptázy (Superscript II, BRL) v reakčním objemu s obsahem 200 mM Tris pH 8.3, 25 mM KC1, 1 pg/ml oligo d(T)₁₅ (Boehringer Mannheim), l· mM DTT (Boehringer Manheim) , 4 mM každé dNTP (Boehringer Mannheim) a 4 0 U/mlFinally, for a 6 hour culture period, cells were harvested by centrifugation and disrupted using the TRIzol reaction package (GibcoBRL, Cat. No. 15596-018) according to the manufacturing instructions. Total RNA was isolated by isopropanol precipitation and was reverse transcribed into cDNA for 90 minutes at 42 ° C using 200 U reverse transcriptase (Superscript II, BRL) in a reaction volume containing 200 mM Tris pH 8.3, 25 mM KCl, 1 µg / ml ml oligo d (T) ₁₅ (Boehringer Mannheim), 1 mM DTT (Boehringer Manheim), 4 mM each dNTP (Boehringer Mannheim) and 40 U / ml

Rnasin (Promega) . Byly užity PCR priméry a podmínky, jak již bylo popsáno (Kopf a spol., Journal of experimental Medicine 1. září 1996; 184(3):1127-36). Množství cDNA bylo normalizováno ve vzorcích užitím primérů specifických pro geny (β-2mikroglobulin). Produkty PCR byly odděleny na 2% agarovém gelu a pásy byly analyzovány pod UV zářením.Rnasin (Promega). PCR primers and conditions were used as described (Kopf et al., Journal of Experimental Medicine September 1, 1996; 184 (3): 1127-36). The amount of cDNA was normalized in the samples using gene-specific primers (β-2-microglobulin). The PCR products were separated on a 2% agar gel and the bands were analyzed under UV radiation.

Jak znázorněno na obr. 7, ST11 vykazuje nejsilnější indukci IL-12 a IL-10 mRNA, která byla srovnatelná s hladinami, pozorovanými u pozitivní kontroly (E.coli). Rozdíly jsou nejlépe zřejmé při nejnižších bakteriálních koncentracích (10⁷cfu/ml).As shown in Fig. 7, ST11 shows the strongest induction of IL-12 and IL-10 mRNA, which was comparable to the levels observed in the positive control (E.coli). Differences are best evident at the lowest bacterial concentrations (10 ⁷ cfu / ml).

Příklad 9Example 9

Suprese syntézy IL-4 prostřednictvím STUSuppression of IL-4 synthesis by STU

CD4⁺ T buňky ze sleziny specifických myších BALB/c patogenů prostých byly čištěny užitím balíčku MiniMACS (Miltenyi Biotec, Kat. č. 492-01). CD4⁺ T buňky byly pěstovány při koncentraci 2xl0⁵ buněk/ml v RPMI prostředí, které obsahovalo 10% fetálního hovězího séra, 1 mM L-glutaminu, 12 mM ···· ♦ · • · « ·♦ • ·*··»· • 9 9 9 9 9 9CD4 ⁺ T cells from spleen-specific mouse BALB / c pathogens free were purified using the MiniMACS package (Miltenyi Biotec, Cat. No. 492-01). CD4 ⁺ T cells were grown at a concentration of 2x10 ⁵ cells / ml in RPMI medium containing 10% fetal bovine serum, 1 mM L-glutamine, 12 mM. · 9 9 9 9 9 9

99 999 ·9 9 9 99999,999 · 9,999,999

Hepes, 0.05 mM 2-merkaptoetanolu, 100 U/ml penicilinu a 100 pg/ml streptomycinu a buňky byly aktivovány během jednoho týdne protilátkami vázanými příčnými vazbami k plotnám z CD3 (klon 2C11) a CD28 (klon 37.51, obojí protilátky z Pharmingen). Během tohoto týdenního pěstování, byly buňky společně pěstovány s adherentními buňkami kostní dřeně (izolovanými jak popsáno výše) jako pomocnými buňkami a s 10⁸ cfu/ml ST11 nebo 10⁸cfu/ml Lal nebo 1 mg/ml LPS nebo samotným prostředím. Po této době byly buňky promyty a CD4⁺ T buňky byly jednou čištěny užitím MiniMACS balíčku a opět stimulovány ve dvoutýdenní kultuře, která obsahovala samotné prostředí. Cytokiny, produkované diferencovanými CD4⁺ T buňkami, byly měřeny po dvou dnech v supernatantech použitím sendvičové ELISA ( balíčky z Endogen a Pharmigen).Hepes, 0.05 mM 2-mercaptoethanol, 100 U / ml penicillin and 100 µg / ml streptomycin, and the cells were activated within one week by antibody-bound cross-links to plates from CD3 (clone 2C11) and CD28 (clone 37.51, both Pharmingen antibodies). During this weekly cultivation, cells were co-cultured with adherent bone marrow cells (isolated as described above) as helper cells and with 10 ⁸ cfu / ml ST11 or 10 ⁸ cfu / ml Lal or 1 mg / ml LPS or medium alone. After this time, cells were washed and CD4 ⁺ T cells were once purified using the MiniMACS package and re-stimulated in a two-week culture that contained medium alone. Cytokines produced by differentiated CD4 ⁺ T cells were measured after two days in supernatants using a sandwich ELISA (Endogen and Pharmigen packages).

Výsledky jsou znázorněny na obr. 5. Buňky, diferencované za přítomnosti samotného prostředí, ukazují dominantní Th2 fenotyp, který je charakterizovaný vysokými hladinami IL-4. Přidání ST11 k týdenním kulturám silně modulovalo výsledek diferenciace Th2, jak vyplývá z osminásobného snížení produkce IL-4. Tato inhibice byla podobné velikosti jak bylo pozorováno v kulturách, získaných z buněk diferencovaných v přítomnosti LPS.Naproti tomu, jiný kmen Lactobacilla měl neměřitelný dopad na hladiny IL-4. Zajímavé je, že hladiny IFN-γ nebyly po přidání STU v týdenních kulturách zvýšeny.The results are shown in Fig. 5. Cells differentiated in the presence of medium alone show a dominant Th2 phenotype characterized by high levels of IL-4. Addition of ST11 to weekly cultures strongly modulated the result of Th2 differentiation, as evidenced by an eightfold reduction in IL-4 production. This inhibition was similar in magnitude to that observed in cultures obtained from cells differentiated in the presence of LPS. In contrast, another Lactobacilla strain had an immeasurable impact on IL-4 levels. Interestingly, IFN-γ levels were not increased in weekly cultures after addition of STU.

Jak může být zřejmé, z výše uvedených kmenů, podle vynálezu, mohou být dobře připraveny potravinové a/nebo farmaceutické nosiče, které přinášejí výhodu cenných vlastností mikroorganismů.As can be seen, food and / or pharmaceutical carriers can be well prepared from the aforementioned strains of the invention, which bring the advantage of the valuable properties of microorganisms.

Příklad 10Example 10

Kmen ST11 byl v klinické zkoušce zkoumán ve společnosti z okolí Guatemala City na svoji schopnost způsobit přenos akutního průjmu v období dešťů, což bylo zkoušeno většinou na dětech v této oblasti. Celkem bylo ve studii zahrnuto 203 dětí ve věku od 35 měsíců do 70ti měsíců, které přijaly cílovou dávku 1O¹⁰ životaschopných organismů (STU) nebo žádnou dávku (placebo) během 29ti denního příjmového období. Děti, vybrané pro obojí vzorek a respektive placebo, měly typické nedostatky v hmotnosti vzhledem k věku a výšce vzhledem k věku, které jsou charakteristické pro podvýživu.In a clinical trial, the ST11 strain has been studied in a community around Guatemala City for its ability to transmit acute diarrhea during the rainy season, which has been tested mostly on children in this area. A total of 203 children aged 35 months to 70 months who received a target dose of ¹⁰ viable organisms (STU) or no dose (placebo) during the 29-day income period were included in the study. The children selected for both the sample and the placebo, respectively, had typical deficiencies in weight relative to age and height relative to age that are characteristic of malnutrition.

Před započetím příjmového pokusu u předškolních dětí bylo bezpečné provedení založeno na studiích in vitro a in vivo. In vitro studie vykazovaly typickou resistenci pro antibiotika podobnou typu u jiných lactobacillů užitých pro potravinové účely a žádný potenciál pro tvorbu biogenních aminů, pro degradaci hlenu a pro dekonjugaci žlučových solí. V kontrolní klinické studii s placebem, která zahrnovala 42 dospělých dobrovolníků, byl STU dobře tolerován a nevyvolával žádné nežádoucí účinky. Mezi potenciálními projevy byly monitorovány plynatost, množství stolic za den a konzistence stolice. Hladiny proteinů akutní fáze nenasvědčovaly žádné potenciální zánětlivé reakci.Prior to initiation of the intake experiment in preschool children, safe performance was based on in vitro and in vivo studies. In vitro studies showed typical resistance to antibiotics of a similar type in other lactobacilli used for food and no potential for biogenic amine formation, mucus degradation and bile salt deconjugation. In a placebo control clinical study involving 42 adult volunteers, STU was well tolerated and did not cause any adverse effects. Flatulence, stool volume per day and stool consistency were monitored among potential manifestations. Acute phase protein levels did not indicate any potential inflammatory response.

Vzorky a placeba byly zabaleny do sáčků v (Nestlé Product Technology Center manufacturing facility v Konolfingen, Švýcarsko) a odeslány zmrazené do Guatemaly. Každý lOg sáček obsahoval nosné prostředí s čokoládovým aroma a buď 0.2 g STU (1O¹⁰ cfu) nebo v případě placeba 0.2 g mléčného prášku. Nosné prostředí s čokoládovým aroma sestávalo z kakaového prášku, cukru, sojového lecitinu, vanilinu a skořice. Sáčky byly skladovány při 4° až 6°C až do dvou hodin před použitím. Před použitím byly sáčky rozpuštěny ve 100 ml vody, poskytnutou Nestlé. Tato voda byla prostá jakékoliv bakteriální kontaminace.The samples and placebo were packed in bags at the Nestlé Product Technology Center manufacturing facility in Konolfingen, Switzerland and shipped frozen to Guatemala. Each 10g bag contained a chocolate flavor carrier and either 0.2 g STU (10 ¹⁰ cfu) or 0.2 g milk powder for placebo. The chocolate flavor carrier consisted of cocoa powder, sugar, soya lecithin, vanillin and cinnamon. The bags were stored at 4 ° to 6 ° C until two hours before use. Before use, the bags were dissolved in 100 ml of water provided by Nestle. This water was free of any bacterial contamination.

*444*4 · · * · · « • 4 · 4 4 · * 4 « · « •4« «44 · » 4 · · · · «4« 4 4 •444 4*4 44 4* 444 * 4 · · 4 · 4 · 4 4 · 4 · 4 · 4 · 4 · 4 · 4 · 4 4 • 444 4 * 4 44 4

44 444 * · 44 *4444 444

Podle přiloženého zápisu byl průjem definován jako výskyt tři nebo více tekutých nebo neformovaných stolic během 24 hodinového období. Průjmová episoda byla definována jako událost, při které došlo k evidenci průjmu (tři průjmovité stolice během 24 hodin). Její celkové trváni v hodinách bylo vypočítáno z okamžiku první ze tří označených stolic do objeveni se první formované stolice nebo do období 24 hodin bez defekace. Pro dítě, které mělo „novou episodu, uplynulo od konce předchozího období 48 hodin. Jestliže ne, pak to bylo hodnoceno jako pokračování té samé episody a pro hodnocení byla užita celková doba trvání. Jeden z případů bylo dítě, které zakusilo jednu nebo více dokumentovaných episod průjmu během 29 denního sledovaného období. Intenzita průjmových episod byla založena na celkovém množství řídkých stolic. Složky vážnosti episody zahrnují přítomnost krve, hlenu nebo hnisu ve stolicích, společně se symptomy horečky a zvracení. Jako vážnou klasifikovala episodu také intenzita sedmi stolic během 24 hodin nebo potřeba zásahu zdravotnických odborníků na klinikách, ve zdravotnických střediscích nebo nemocnicích.According to the appended report, diarrhea was defined as the occurrence of three or more liquid or unformed stools during a 24-hour period. A diarrhea episode was defined as an event in which diarrhea was recorded (three diarrhea stools within 24 hours). Its total duration in hours was calculated from the time of the first of the three designated stools to the appearance of the first formed stool or to a 24-hour period without defecation. For a child with a “new episode, 48 hours have passed since the end of the previous period. If not, then it was judged to be a continuation of the same episode, and the duration was used for the assessment. One case was a child who experienced one or more documented episodes of diarrhea during the 29 day follow-up period. The intensity of the diarrhea episodes was based on the total number of thin stools. The components of the severity of the episode include the presence of blood, mucus, or pus in the stools, along with symptoms of fever and vomiting. Seven bowel movements within 24 hours or the need for intervention by health professionals at clinics, health centers or hospitals have also classified the episode as serious.

Pokud byly průjmová episoda diagnostikována ze sledovaného systému, byl sebrán vzorek průjmovité stolice pro mikroskopické vyšetření a pěstování k identifikaci potenciálního etiologického patogena pro danou episodu. Vzorek byl diagnostikován na antigen rotaviru, giardie a E. histolytica, v jednom případě na dysenterii, a na bakteriální patogeny, zahrnující Shigellu, Salmonellu, Aeromonas, Plesiomonas, shigelloides, E.coli a možná V. cholerae.If the diarrhea episode was diagnosed from the observed system, a sample of diarrhea stool was collected for microscopic examination and cultivation to identify a potential etiological pathogen for the episode. The sample was diagnosed for rotavirus, giardia and E. histolytica antigen, in one case dysenteria, and for bacterial pathogens including Shigella, Salmonella, Aeromonas, Plesiomonas, shigelloides, E. coli and possibly V. cholerae.

Během období zkoumání byly vzorky sebrány ke zkoušce schopnosti mikroorganismů, obsažených během období podávání. Ukazuje se, že mikroorganismy zůstali životaschopné v sáčcích během celé studie, tak že také na konci studie byly sáčky schopné dodat 1O¹⁰ životaschopnýchDuring the investigation period, samples were collected to test the ability of microorganisms contained during the administration period. It turns out that microorganisms remained viable in the bags throughout the study, so that at the end of the study, the bags were also able to deliver ¹⁰ viable.

• 9• 9

9 mikroorganismů na rekonstituci s vodou.9 microorganisms for reconstitution with water.

Studie ukázaly, že vzorky, obsahující probiotické mikroorganismy, mohou snižovat výskyt průjmu na rozdíl od kontrolní skupiny (placebo), asi o 30%. Avšak, také kontrolní skupina již ukazovala snížené množství výskytu průjmu oproti běžné populaci, která nepřijala ani vzorek ani placebo. Tento novější objev může být zčásti objasňován na základě dětí, které přijímaly doplňkovou hodnotnou výživu a vodu prostou kontaminace. Nicméně, poněvadž studie byla provedena v terénu, může být snadno odvozeno, že STU může spolehlivě snižovat výskyt průjmu in vivo.Studies have shown that samples containing probiotic microorganisms can reduce the incidence of diarrhea by about 30% compared to the control group (placebo). However, the control group also showed a reduced amount of diarrhea compared to the general population that received neither the sample nor the placebo. This more recent discovery may be partly explained by children who have received valuable, nutritional supplementary and contamination-free water. However, since the study was conducted in the field, it can easily be deduced that STU can reliably reduce the incidence of diarrhea in vivo.

Zastupuje:Represented by:

Claims

PATENT CLAIMS

A Lactobacillus strain from the group of lactic acid bacteria belonging to the genus Lactobacillus, characterized in that it has the ability to prevent colon colonization by pathogenic bacteria that cause diarrhea.

2.

The Lactobacilla strain according to claim 1, characterized in that it is capable of adhering to the intestinal mucosa of the host.

3. Strain Lactobacilla, according to any of the foregoing claims; y z n and watching s e t i that it is capable growth in the presence more than 0.4% bile salts • 4. Strain Lactobacilla, according to any

of the preceding claims, characterized in that it is selected from the group consisting of Lactobacillus rhamnosus or Lactobacillus paracasei.

5. The Lactobacilla strain of claim 4, confess- Lactobacillus paracasei. is that it is 6. Lactobacillus paracasei, according to Claim 5 marked to you m that it is Lactobacillus paracasei CNCM 1-2116 (NCC 2461).

9 • 9 • 9 ♦ · • · » • 9 * 9 99 9 • 9 • « • • • 9 ♦ 9 9 9 * · * • 9 9 99 99 9 * 9 ♦ ·

Use of a Lactobacillus strain according to any one of the preceding claims for the preparation of an edible carrier.

Use according to claim 7, wherein the strain

Lactobacillus is present in the carrier in an amount of from about 10 ⁵ cfu / g to about 10 ¹² cfu / g carrier.

Use of the culture supernatant of the strain

Lactobacillus according to any one of claims 1 to 6, for the preparation of an edible carrier.

Use according to any one of claims 7 or 9, wherein the carrier is a food composition selected from milk, yogurt, cottage cheese, cheese, fermented milk, fermented milk-based products, ice creams, fermented cereal-based products, powdered milk, infant formulas. .

Use according to any one of claims 7 to 10, wherein the carrier is used for the treatment and / or prophylaxis of diarrhea-related disorders.

A food or pharmaceutical composition comprising at least one Lactobacilla strain according to any one of claims 1 to 6, or a supernatant or a culture thereof.

Food or pharmaceutical composition according to claim 12, characterized in that it is selected from milk, yogurt, cottage cheese, cheese, fermented milk, fermented milk-based products, ice cream, fermented cereal-based products, powdered milk, baby nutrition, tablets, liquid bacterial suspensions, 4 4 4 4 · 4 4 4 · 4 4 4 4 »» » * Dried oral supplements, wet oral supplements, dry gavage or wet gavage.