CZ200137A3

CZ200137A3 - Antigenic peptides derived from telomerase

Info

Publication number: CZ200137A3
Application number: CZ200137A
Authority: CZ
Inventors: Gustav Gaudernack; Jon Amund Eriksen; Mona Moller; Marianne Klemp Gjertsen; Ingvil Seterdal; Stein Seboe-Larsen
Original assignee: Norsk Hydro As
Priority date: 1998-07-08
Filing date: 1999-06-30
Publication date: 2001-06-13
Also published as: CN1313773A; US7794723B2; PL203815B1; AR077576A2; WO2000002581A1; EP2316476A3; HUP0104889A3; DE69910580D1; EP1362597B2; JP5491315B2; DE69910580T3; DK1362597T3; EP2258383A2; EP1093381A1; EP1093381B1; DE69910580T2; HK1039068B; CZ303215B6; DK1093381T3; ATE247484T1

Description

Oblast techniky

Vynález se týká proteinů nebo peptidů, které vyvolávají imunitní odpověď zprostředkovanou T buňkami, vakcín proti rakovinným onemocněním a kompozic pro léčbu rakovinných onemocnění, které obsahují tyto proteiny nebo peptidové fragmenty. Vynález se také týká farmaceutických kompozic obsahujících proteiny nebo peptidy a způsobu generování T lymfocytů schopných rozeznávat a ničit tumorové buňky u savců.

Dosavadní stav techniky

Rakovinné onemocnění se vyvíjí v několika krocích a zahrnuje určité případy mutace. Tyto mutace ústí v pozměněnou expresi nebo funkci genů spadajících do dvou kategorií: onkogeny a tumor supresorové geny. Onkogeny se odvozují původně od proto-onkogenů bodovou mutací nebo translokací, a tím ústí v transformovaný stav buňky, která nese mutaci. Všechny onkogeny kódují a projevují se přes proteiny. Proto-onkogeny jsou normální geny buňky, které mají potenciál stát se onkogenem. Ve většině případů se ukazuje, že proto-onkogeny jsou komponenty signálních transdukčních cest. Onkogeny působí dominujícím způsobem. Tumor supresorové geny na druhou stranu působí recesivní mírou, například přes ztrátu funkce, a přispívají konkogenezi pokud obě alely kódující funkční protein jsou pozměněny tak, že produkují nefunkční genový produkt.

Současné působení kombinace pozměněných onkogenů a tumor supresorových genů ústí v buněčnou transformaci a vývoj maligního fenotypu. Tyto buňky mají nicméně sklon ke stárnutí a mají omezenou životnost. Ve většině případů rakovinných onemocnění imortalizace tumorových buněk vyžaduje vyřazení enzymových komplexů nazvaných telomerázy. U somatických buněk není katalytická podjednotka tohoto enzymu normálně exprimována. Další události, jako je působení proteinů kódovaných tumorovými viry nebo demetylace spících promotorových míst, mohou ústit v expresi funkčního telomerázového komplexu v tumorových buňkách.

V oblasti lidské imunologie rakovinných onemocnění je v posledních dvou desetiletích vidět intenzívní snaha charakterizovat pravé antigeny specifické pro

4 4 · · · · · · · 4 4· • · · « · · · · 44 · • · · 4 4 4 4 4· • · 9 9 · · 9 9 9 9* • 4 · 4 · ♦ 4 9 94

4 4 4 4 44 4 4 44 444 rakovinné onemocnění. Snahy jsou věnovány zvláště analýze protilátek vůči lidským tumorovým antigenům. Dosavadní znalosti naznačují, že tyto protilátky by mohly být použity pro diagnostiku a terapeutické účely, například ve spojení s protirakovinnými látkami. Nicméně protilátky se mohou pouze vázat na tumorové antigeny, které jsou vystaveny na povrchu tumorových buněk. Z tohoto hlediska snahy o léčbu rakovinných onemocnění založenou na imunitním systému těla byly méně úspěšné, než se očekávalo.

Základní rys imunitního systému je takový, že může rozeznat vlastní od nevlastního a normálně nereaguje vůči vlastním molekulám. Bylo ukázáno, že rejekce tkání nebo orgánů přenesených z jiných individuí je způsobena imunitní odpovědí vůči cizím antigenům na povrchu přenesených buněk. Imunitní odpověď je obecně tvořena humorální odpovědí zprostředkovanou protilátkami a buněčnou odpovědí. Protilátky jsou produkovány a sekretovány B lymfocyty a obvykle rozpoznávají volné antigeny v nativní konformaci. Mohou potenciálně rozpoznat téměř jakékoliv místo na povrchu antigenu. Na rozdíl od protilátek, T buňky, které zprostředkovávají buněčnou část imunitní odpovědi, rozpoznávají antigeny pouze v kontextu MHC molekul (molekuly hlavního histokompabilitního systému) a to pouze po vhodném zpracování antigenu. Toto zpracování antigenu obvykle zahrnuje proteolytickou fragmentaci proteinu, která ústí v peptidy, jenž se mohou vázat do žlábku MHC molekul. To umožňuje T buňkám také rozpoznávat peptidy odvozené od intracelulámích antigenů.

T buňky umí rozeznat pozměněné peptidy odvozené od jakýchkoliv v tumorové buňce v kontextu MHC molekul na povrchu tumorových buněk. T buňky mohou být následovně aktivovány za účelem inaktivace tumorových buněk obsahujících pozměněný peptid. U experimentálních modelů zahrnujících myší tumory bylo ukázáno, že bodové mutace v intracelulámích konstitučních proteinech (“šelf’ proteinech) mohou zvýšit množství antigenů pro rejekci tumoru, které se skládají z peptidů lišících se v jedné aminokyselině od normálních peptidů. T buňky rozeznávající peptidy v kontextu MHC molekul na povrchu tumorových buněk jsou schopné usmrtit tumorové buňky a tak odvrhnout tumor z hostitele (Boon et al., 1989, Cell 58, 293-303).

MHC molekuly u člověka jsou běžně uváděny jako HLA molekuly (human leucocyte associated antigen). Existují dvě základní třídy HLA molekul, třída I a třída II. HLA molekuly I třídy jsou kódovány sublokusy HLA A, B a C a primárně aktivují CD8+ cytotoxické T buňky. HLA molekuly II třídy na druhou stranu aktivují primárně CD4+ T • · · · · ♦ buňky a jsou kódovány sublokusy DR, DP a DQ. Každé individuum normálně vykazuje šest různých HLA molekul I třídy, obvykle dvě alely z každé ze tří podskupin A, B a C, ačkoliv v některých případech je počet různých HLA molekul I třídy redukován díky dvounásobnému výskytu stejné HLA alely.

HLA genové produkty jsou vysoce polymorfní. Různá individua exprimují různé HLA molekuly, které se liší od těch nalezených v jiných individuích. To vysvětluje obtížnost nalezení HLA sourodých orgánových donorů u transplantací. Význam genetické variace HLA molekul v imunologii je odražen v její roli jako imunoresponzivních genů. Díky jejich kapacitě vázat peptidy, přítomnost nebo absence některých HLA molekul určuje kapacitu individua odpovídat na specifické peptidové epitopy. Ve svém důsledku HLA molekuly určují rezistenci nebo citlivost vůči nemoci.

T buňky mohou inhibovat vznik a růst rakovinného onemocnění několika mechanismy. Cytotoxické buňky, jak HLA molekuly I třídy rozeznávající CD8+ tak HLA molekuly II třídy rozeznávající CD4+, mohou přímo usmrtit tumorovou buňku prezentující vhodný tumorový antigen. Obvykle jsou potřebné CD4+ pomocné T buňky pro cytotoxickou odpověď CD8+ T buněk, ale pokud je peptidový antigen prezentován vhodnou antigen předkládající buňkou (APC), cytotoxické CD8+ buňky mohou být aktivovány přímo, to ústí v rychlou, silnou účinnější odpověď.

Zatímco peptidy, které jsou prezentovány HLA molekulami II třídy, mají proměnlivou délku (12 až 25 aminokyselin), peptidy představované HLA molekulami I třídy musí mít obvykle devět aminokyselinových zbytků, aby byly kompatibilní s vazebným žlábkem HLA molekul I třídy. Delší peptid se nemusí navázat, pokud nemůže být zpracován APC nebo cílovou buňkou, jako je rakovinná buňka, před interakcí se žlábkem HLA molekul I třídy. Byl zaznamenán pouze omezený počet odchylek od tohoto požadavku devíti aminokyselin a v těchto případech byla délka předkládaného peptidu buď osm nebo deset aminokyselinových zbytků.

Shrnutí týkající způsobu vazby peptidů na MHC molekuly může být nalezeno v práci Hans-Georg Rammensee, Thomas Friede a Stefan Stevanovic, (1995, Immunogenetics, 41, 178-228) a v práci Barinaga (1992, Science 257, 880-881). Male a kol. (1987, Advanced Immunology, J.B. Lippincott Company, Philadelphia) nabízí více ucelenější vysvětlení technického pozadí vynálezu.

V našem vynálezu International Application PCT/N092/00032 (publikováno jako WO92/14756) jsme popsali syntetické peptidy a fragmenty onkogenních proteinů, které « · 4 · ·· 9 9 · 99 9

9 9 9 9 9 · 9 99

9 9 9 9 · ·9

9 9 9 9 ♦ · · ·9 mají bodovou mutaci nebo translokaci ve srovnání s jejich proto-onkogeny nebo proteiny tumor supresorových genů. Tyto peptidy odpovídají, kompletně překrývají nebo jsou fragmenty zpracovaných onkogenních proteinových fragmentů nebo tumor supresorových genových fragmentů, které jsou prezentovány rakovinnými buňkami nebo jinými antigen předkládajícími buňkami, a jsou přítomny ve formě komplexu HLA-peptidy alespoň jednou alelou v každém individuu. U těchto peptidů bylo také ukázáno, že indukují specifickou T buněčnou odpověď vůči aktuálnímu onkogennímu proteinovému fragmentu produkovanému po zpracování buňkou a představovanému HLA molekulám. Zvláště jsme popsali peptidy odvozené od p21-ras proteinu, který obsahoval bodové mutace v určitých aminokyselinových pozicích, zvláště v pozicích 12, 13 a 61. Bylo ukázáno, že tyto peptidy jsou účinné při regulaci růstu rakovinných buněk in vitro. Navíc bylo ukázáno, že peptidy vyvolávají CD4+ T buněčnou imunitní odpověď vůči rakovinným buňkám, které obsahují mutovaný p21-ras onkogenní protein, při podávání takových peptidů ve vakcínách nebo při postupu terapie rakoviny. Později jsme také ukázali, že tyto peptidy také vyvolávají CD8+ T buněčnou odpověď vůči rakovinným buňkám které obsahují mutovaný p21-ras onkogenní protein, při podávání takových peptidů zmíněném výše (viz M.K. Gjertsen a kol., Int. J cancer, 1997, kap. 72, s. 784).

Nicméně peptidy popsané výše mohou být použity pouze u omezeného množství rakovinných onemocnění, jmenovitě u těch onemocnění, kde byl nalezen onkogen s bodovou mutací nebo translokaci v proto-onkogenu nebo tumor supresorovém genu. Je zde proto silná potřeba protirakovinné léčby nebo vakcíny, která by mohla být účinná vůči širšímu okruhu rakovinných onemocnění.

Obecně jsou tumory velice heterogenní s ohledem na odchylky nalezené v tumorových buňkách. To vyvolává myšlenku, že jak potenciální terapeutický účinek tak preventivní účinek rakovinných vakcín vzroste s počtem cílů, vůči kterým je vakcína schopna vyvolat T buněčnou imunitní odpověď. Vakcína s více cíly by také snižovala riziko tvorby nových tumorů léčbou vznikajících variant primárního tumoru.

Pro svoji předpokládanou roli v prevenci buněčného stárnutí byl v poslední době středem zájmu enzym telomeráza. Telomeráza je RNA-dependentní DNA polymeráza, která syntetizuje telomemí DNA repetice podle RNA templátu, který tvoří podjednotku telomerázového holoenzymu. DNA repetice syntetizované tímto enzymem jsou zainkorporovány do telomer, což jsou specializované struktury DNA-protein, které se • · · * · · · · · · · · • · · · · · · · · « 9 9 9 9 » · ·

9 9 9 9 9 9 9 9 · vyskytují na koncích lineárních DNA molekul, které tvoří každý chromozóm. Telomeráza byla poprvé identifikována u ciliate Tetrahymena (Greider and Blackburn, 1985, Cell 43, 405-413). Sekvence katalytické podjednotky lidské telomerázy byla nedávno identifikována v práci Meyerson a kol. (1990, Cell 1197 , 785-795) a v práci Nakamura a kol. (1997, Science 277, 955-959), byly pojmenovány gen hEST2 a hTRT respektive. Navíc byly identifikovány tři další proteiny, které jsou spojené s telomerázovou aktivitou: p80 a p95 u Tetrahymena (Collins et al, 1995, Cell 81, 677686) a TP1/TLP1, což jsou savčí homology proteinu p80 u Tetrahymena (Harrington a kol., 1997, Science, 275, 973-977; Nakayama a kol., 1997, Cell 88, 875-884).

Telomeráza není obvykle exprimována ve většině normálních buněk v organismu. Většina buněk somatického původu u člověka nevykazuje detegovatelnou telomerázovou aktivitu, telomerázová aktivita je za to detegována u zárodečných buněk a některých kategorií kmenových buněk, které jsou ve fázi aktivního buněčného dělení (Harley et al., 1994, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 59, 307-315; Kim a kol., 1994, Science 266, 2011-2015; Broccolia kol., 1995, PNAS USA 92, 9082-9086; Counter a kol., 1995, Blood 85, 2315-2320; Hiyama a kol., 1995, J. Immunol. 155, 3711-3715). Telomery u většiny typů lidských somatických buněk se zkracují se vzrůstajícím věkem organismu, což je v souladu s nepřítomností telomerázové aktivity u těchto buněk. Kultivované lidské buňky také vykazují zkracování telomer. Zkracování telomer také pokračuje u kultivovaných lidských buněk, které byly transformovány, dokud telomery nedosáhnou kritické délky. V tomto okamžiku, který se nazývá kritický bod, je pozorována významná kariotická nestabilita a buněčná smrt.

Nesmrtelné buňky, které získaly schopnost růst v kultuře neomezenou dobu, se v populaci v kritickém bodě objevují s malou frekvencí. Tyto nesmrtelné buňky vykazují vysoké hladiny telomerázové aktivity a stabilní telomery. Telomerázová aktivita je také snadno detekovatelná ve velké většině lidských tumorových vzorků analyzovaných za čerstva (Kim a kol., 1994, Science 266, 2011-2015), včetně karcinomů ovarií (Counter et al., 1994, PNAS USA 91, 2900-2904). Výstižné revue na toto téma je práce Shay and Bachetti (1997, Eur. J. Cancer 33, 787-791). Aktivace telomerázy tak může překročit bariéru kontinuálního buněčného dělení vymezenou délkou telomer. Buňky, které překonají normální mechanismus stárnutí toho mohou docílit stabilizací délky telomer, pravděpodobně díky aktivitě telomerázy.

· · · · · ··· · · »··· · · · · · «····« · * • · · · · · » · · ·

U virů prokázaných při vzniku lidských rakovinných onemocnění, například

Epstain Barr virus (EBV, u B buněčných malignit a karcinomů nosohltanu) a lidský

Papilloma virus (HPV 16 a 18, u karcinomů cervixu), je dlouho známá schopnost učinit lidské buňky nesmrtelnými. Nedávno bylo demonstrováno, že indukce telomerázové aktivity je klíčový prvek v tomto procesu. (Klingelhutz et al, 1996, Nátuře, 380, 79-82).

Telomeráza je proto potenciální cíl rakovinové terapie. Byly tak nabídnuty inhibitory telomeráz jako nová třída protirakovinových léků (shrnuto v pracích Sharma a kol., 1997, Ann Oncol 8(11), 1063-1074; Axelrod, 1996, Nátuře Med 2(2), 158-159; Huminiecki, 1996, Acta Biochim Pol, 43(3), 531-538). Předpokládá se, že identifikace lidské katalytické podjednotky telomerázy, může zajistit biochemickou reagencii pro identifikaci takových léků (Meyerson et al, 1990, Cell 1197, 785-795). Telomerázy jsou také předpokládané jako markéry pro diagnózu prognózy rakoviny (Soria and Rixe, 1997, Bull Cancer 84(10), 963-970; Dahse et al, 1997, Clin Chem 43(5), 708-714).

Podstata vynálezu

Nicméně pokud je známo, nikdo ještě v minulosti neuvažoval, že telomerázy mohou sloužit jako užitečný cíl pro terapii zprostředkovanou T buňkami nebo, že telomerázové peptidy nebo proteiny mohou být použity při léčbě nebo prevenci rakoviny.

V souladu s druhým aspektem vynálezu je zde zamýšleno použití nukleové kyseliny ve způsobu léčby nebo prevence rakoviny, a to nukleové kyseliny, která je schopná kódovat telomerázový protein nebo peptidy jak je popsáno v prvním aspektu vynálezu.

V souladu se třetím aspektem vynálezu předkládáme farmaceutickou kompozici obsahující alespoň jeden telomerázový protein nebo peptid nebo nukleovou kyselinu jak je popsáno v prvním nebo druhém aspektu vynálezu a farmaceuticky přijatelný nosič nebo ředidlo.

V souladu se čtvrtým aspektem vynálezu předkládáme způsob přípravy farmaceutické kompozice, která je popsána ve třetím aspektu vynálezu, způsob zahrnující smísení alespoň jednoho telomerázového proteinu nebo peptidu nebo nukleové kyseliny jak je uvedeno v druhém aspektu vynálezu s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Dále je zde v souladu s pátým aspektem vynálezu uvedena farmaceutická kompozice obsahující kombinaci alespoň jednoho telomerázového proteinu nebo peptidu podle prvního aspektu vynálezu a alespoň jednoho peptidu schopného indukovat T buněčnou imunitní odpověď vůči onkogennímu nebo mutovanému tumor supresorovému proteinu nebo peptidu, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Také v souladu se šestým aspektem vynálezu předkládáme způsob zahrnující smísení alespoň jednoho telomerázového proteinu nebo peptidu podle prvního aspektu vynálezu s alespoň jedním peptidem schopným indukovat T buněčnou imunitní odpověď vůči onkogennímu nebo mutovanému tumor supresorovému proteinu nebo peptidu a farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla.

V souladu se sedmým aspektem vynálezu předkládáme použití telomerázových proteinů nebo peptidů, nebo nukleové kyseliny schopné kódovat telomerázový protein nebo peptid při přípravě léků pro léčbu a prevenci rakoviny.

V osmém aspektu vynálezu je předkládán způsob generace T lymfocytů schopných rozpoznat a zničit tumorovou buňku u savců, který zahrnuje odebrání vzorku T lymfocytů ze savce a kultivace T lymfocytů v přítomnosti telomerázových proteinů nebo peptidů v množství dostatečném pro generování T lymfocytů specifických vůči telomerázový protein nebo peptid.

Vynález je podrobněji popsán pouze způsobem příkladů s odkazem na doprovodné obrázky, ve kterých:

Obr. 1 ukazuje sekvence aminokyselin konzervovaných motivů u lidské katalytické podjednotky telomerázy, která byla identifikována v práci Meyerson a kol. (1997, Cell 90, 785-795) a v práci Nakamura a kol. (1997 Science 277, 955-959). Jsou ukázány motivy T, 1, 2, 3 (A podle Nakamury), 4 (B' podle Nakamury) 5 (C podle Nakamury), 6 (D podle Nakamury) a E. peptidy mohou být syntetizovány s odpovídajícími sekvencemi nebo se sekvencemi zahrnujícími jakýkoliv z regionů označený závorkami. Označení A2, A1, A3 a B7 označuje peptidy, které jsou pravděpodobně přítomny v molekulách HLA-A2, HLA-A1, HLA-A3 a HLA-B7.

Je předkložen telomerázový protein nebo peptid pro použití ve způsobu léčby nebo prevence rakoviny. Ve výhodném provedení způsob podle vynálezu obsahuje generaci T buněčné odpovědí vůči telomeráze. Způsob může zahrnovat podávání savcům, s výhodou člověku, který trpí nebo pravděpodobně trpí rakovinou, terapeuticky

·· ·· ·· ···♦ • · · · ♦ ·* • · · · ♦· · * · · · ·* • O · < · ·· · · · Μ ♦ ·♦ · účinné množství telomerázového proteinu nebo peptidů tak, že je indukována T buněčná imunitní odpověď vůči telomeráze u savců.

T buňky specifické vůči telomeráze mohou být použity k zasažení buněk, které exprimují telomerázu. Jelikož většina buněk v organismu neexprimuje telomerázu, budou tak neovlivněny. Nicméně tumorové buňky, které exprimují telomerázu budou napadeny a zničeny. Jelikož telomerázová aktivita byla detekována u většiny karcinomů je předpoklad, že tento materiál a způsoby najdou široké použití.

Rakovinná onemocnění, která jsou vhodná pro léčbu zahrnují (výčet není kompletní) rakovinu prsu, prostaty, pankreatu, karcinom kolorekta, plic, maligní melanom, leukémie, lymfomy, rakovinu ovarií, cervixu a karcinomy žlučového traktu.

Zde použitý termín telomeráza znamená ribonukleoproteinový enzym, který vykazuje telomery prodlužující aktivitu. Telomerázový protein, jak je zde použit, znamená jakoukoliv proteinovou komponentu telomerázy, včetně jakékoli podjednotky, která má katalytickou aktivitu.

S výhodou je telomerázový protein savčí telomerázový protein a výhodněji lidský telomerázový protein. Lidský telomerázový protein je s výhodou katalytická podjednotka telomerázy identifikovaná jako hTRT v práci Nakamura a kol. (1997, Science 277, 955-959) a hEST2 v práci Meyerson a kol. (1990, Cell 1197 , 785-795), jejichž cDNA sekvence jsou uloženy v GenBank pod čísly AF015950 a AFO18167.

Termín telomerázový peptid, jak je použit zde, znamená peptid, který má sekvenci aminokyselin odpovídající sekvenci přítomné v sekvenci telomerázového proteinu. Telomerázové peptidy mají s výhodou 8 až 25 aminokyselin. Výhodněji telomerázové peptidy obsahují mezi 9 a 25 aminokyselinami. Například telomerázové peptidy obsahují 9, 12, 13, 16 nebo 21 aminokyselin.

Telomerázové proteiny nebo peptidy jsou vybrány tak, že jsou schopné generování T buněčné odpovědi přímo vůči telomerázovému proteinu (nebo vůči telomerázovému proteinu od kterého je telomerázový peptid odvozen). Ve výhodných provedeních je T buněčná indukovaná odpověď cytotoxická T buněčná odpověď. Cytotoxická T buněčná odpověď může být zprostředkována CD4+ T buňkami nebo může být zprostředkována CD8+ T buňkami. V jakémkoliv případě musí být peptid schopný vytvořit a být prezentován jako komplex s MHC proteiny I nebo II třídy na povrchu tumorové buňky nebo antigen prezentující buňky po předchozím procesu zpracování antigenu, pokud je to nezbytné.

• · ·· · · ·· · · · · • · · · 9 9 9 9 · ·

Telomerázový peptid může obsahovat jeden nebo více aminokyselinových zbytků z aminokyselinového motivu nezbytného pro biologickou funkci telomerázového proteinu; jinými slovy se může překrývat alespoň částečné s takovým aminokyselinovým motivem. Příklady takových aminokyselinových motivů jsou motivy 1 až 6 v rámci sekvence lidské telomerázové katalytické podjednotky hEST2, jak byla identifikována v práci Meyerson a kol. (1990, Cell 1197, 785-795), jinými slovy to jsou motivy:

LLRSFFYVTE

SRLRFIPK,

LRPIVNMDYWG,

PELYFVKVDVTGAYDTI,

KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCY,

LLLRLVDDFLLVT a

GCWNLRKTW nebo jakýkoliv z motivů T, 1, 2, A, B’, C, D nebo E, které byly identifikovány v práci Nakamura a kol. (1997, Science 277, 955-959) v hTRT sekvenci, jmenovitě motivy:

WLMSVYWELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLK, EVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDG, LRPIVNMDYWGARTFRREKRAERLTSRV, PPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVIASIIKP, KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGI,

LLRLVDDFLLVTPHLTH, AKTFLRTLVRGVPEYGCWNLRKTW a HGLFPWCGLLL.

Vhodné peptidy, které mohou být využity ve způsobech a kompozicích zde popsaných, jsou uvedeny v tabulce 1 stejně jako v přiloženém listu sekvencí.

Další vhodné peptidy odvozené z jakéhokoliv úseku v telomerázové sekvenci, které mohou být využity ve způsobech a kompozicích zde popsaných, jsou uvedeny v tabulce 2.

Jsou zahrnuty také proteiny a peptidy, které obsahují aminokyselinové sekvence odpovídající aminokyselinovým sekvencím přítomným v aminokyselinových sekvencích savčích homologů s telomerázou druhu Tetrahymena asociovaných proteinů p80 a • · »·· · ··· * · • · · · · · · ·· · *··· ·· ·· ·· ·· ··· p95. Například p80 homology TP1 a TLP1 (Harrington a kol, 1997, Science, 275, 973977; Nakayama a kol., 1997, Cell 88, 875-884).

Větší peptidové fragmenty nesoucí malé množství aminokyselinových substitucí nejen na N-terminálním konci, ale i na C-terminálním konci jsou zahrnuty také, jak se předpokládá, tyto peptidy mohou zvyšovat množství T buněčných klonů, které mají vhodnou specificitu.

Zde popsané peptidy jsou zvláště vhodné pro použití do vakcíny schopné bezpečně zvýšit nejen CD4+, ale také CD8+ T buněčnou odpověď:

a) peptidy jsou synteticky produkovány a tak nemohou obsahovat transformované rakovinné geny nebo další místa nebo materiály, které by mohly mít škodlivý vliv,

b) peptidy samotné mohou být použity pro indukci buněčné imunitní odpovědi

c) peptidy mohou být cílem pro zvláště T buněčný typ imunitní odpovědi bez vedlejších účinků dalších neočekávaných odpovědí.

Telomerázové peptidy nebo proteiny zde popsané mohou být podávány v množství v rozsahu jednoho mikrogramu (1 pg) až jednoho gramu (1 g) průměrnému lidskému pacientu, který je vakcinován. Je výhodné, pokud jsou použity menší dávky v rozmezí jednoho mikrogramu (1 pg) až jednoho miligramu (1 mg) na každou dávku.

Ve výhodném provedení je telomerázový peptid nebo protein pacientovi dodáván ve formě farmaceutické kompozice. Telomerázový protein nebo peptid může být podáván jako směs proteinů nebo směs proteinů a peptidů nebo jako směs peptidů. Farmaceutická kompozice může navíc obsahovat obvyklá aditiva, rozpouštědla, stabilizátory nebo podobné látky známé v oblasti.

Farmaceutická kompozice může obsahovat jeden nebo více telomerázových proteinů nebo peptidů. Proteiny nebo peptidy obsažené ve směsi mohou být jakékoliv z následujících:

a) směs peptidů, které mají různé sekvence, například, odpovídají různým částem sekvence telomerázového proteinu;

b) směs peptidů, které mají překrývající se sekvence, ale schopné se vázat k různým HLA alelám;

c) směs obou předcházejících směsí (a) a (b);

d) směs některých směsí (a);

e) směs některých směsí (b);

* ft ft ft ft* · · · · ··· · ft · · · • ft ··· · · · · ft

f) směs některých směsí (a) a některých směsí (b);

V každém případě může být také použita směs proteinů a peptidů odpovídajících různým telomerázovým proteinům, například telomerázová katalytická podjednotka a homology Tetrahymena p80 nebo p95.

Jinak mohou být telomerázové peptidy ve směsi vzájemně kovalentně spojeny za vzniku větších polypeptidů nebo dokonce cyklických polypeptidů. Farmaceutická kompozice může být tvořena smísením telomerázového proteinu(ů) nebo peptidu(ů) s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

Farmaceutické kompozice mohou také zahrnovat alespoň jeden peptid, který je schopný indukovat T buněčnou imunitní odpověď vůči onkogennímu nebo mutovanému tumor supresorovému proteinu nebo peptidu. Jinak telomerázové proteiny nebo peptidy mohou být podávány jak simultánně tak v libovolném pořadí těchto peptidů. Příklady onkogenních proteinů jsou p21-ras proteiny H-ras, K-ras a N-ras, abl, gip, gsp, ret a trk. Výhodně jej onkogenní protein nebo peptid p21 -ras protein nebo peptid, například p21ras peptidy popsané v našem vynálezu International Application PCT/N092/00032 (publikační číslo WO92/14756). Tumor supresorové proteiny zahrnují p53 a Rb (retinoblastom). Takové farmaceutické kompozice mohou být vytvořeny smísením telomerázového proteinu(ů) nebo peptidu(ů) s mutovaným tumor supresorovým nebo onkogenním proteinem nebo peptidem, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo rozpouštědlem.

Termín mutantní v použití zde znamená přirozenou sekvenci, která obsahuje jednu nebo více s následujících změn: bodová mutace (tranzice nebo transverze), delece, inzerce, duplikace translokace nebo inverze. Výraz farmaceutická kompozice neznamená pouze kompozici použitelnou pro léčbu pacienta s rakovinou, ale znamená také kompozici použitelnou ve spojení s prevencí, jako například kompozice vakcín.

Telomerázové peptidy nebo proteiny jsou podávány lidskému individuu, které potřebuje tento druh léčby nebo prevence. Podávání může být provedeno jednou nebo vícekrát jak je vhodné pro nastolení a/nebo udržení požadované T buněčné imunitní odpovědi. Peptidy mohou být podávány společně, jak dohromady tak odděleně, se sloučeninami jako jsou cytokiny a/nebo růstové faktory, například interleukin-2 (IL-2), interleukin-12 (IL-12), růstový faktor GM-CSF nebo podobné v závislosti na síle imunitní odpovědi jak je v oblasti známé. Telomerázové proteiny nebo peptidy mohou být použity jako vakcína nebo terapeutická kompozice buď samotné nebo v kombinaci • · ·· ♦·«· ··· ···· ♦ · · · ·· ♦ ··· · · · · ·* • · ··· · · * · ·· • ·♦ ♦··· ··· ···· ·· ·· ♦· ·· ··· s dalšími materiály. Například peptid nebo peptidy mohou být dodávané ve formě lipopeptidového konjugátu, o kterém je známo, že indukuje vysoce afinitní cytotoxickou T buněčnou odpověď (Dereš, 1989, Nátuře 342).

Peptidy nebo proteiny uvedené výše jako možné složky farmaceutických kompozic mohou být ve formě nukleových kyselin kódujících zejména peptid nebo protein. Tak se mohou farmaceutické kompozice skládat z peptidů a/nebo proteinu samotného nebo v kombinaci s nukleovou kyselinou, nebo mohou být složeny ze směsí nukleových kyselin.

Telomerázové peptidy nebo proteiny mohou být podávány individuu ve formě DNA vakcín. DNA kódující telomerázový peptid nebo protein může být ve formě klonované plazmidové DNA nebo syntetického oligonukleotidů. DNA může být podávány společně s cytokiny jako je IL-2 a/nebo další společně stimulující molekuly. Cytokiny a/nebo společně stimulující stimulační molekuly mohou být samy podávány ve formě plazmidu nebo oligonukleotidové DNA.

Bylo ukázáno, že odpověď na DNA vakcíny je vyšší v přítomnosti imunostimulačních DNA sekvencí (ISS). Ty mohou mít podobu hexamerních motivů obsahujících metylovaný CpG podle vzorce: 5'-purin-purin-CG-pyrimidin-pyrimidin-3'. Naše DNA vakcíny mohou obsahovat tyto nebo jiné imunostimulační sekvence (ISS) v DNA kódující telomerázový peptid nebo protein, v DNA kódující cytokiny nebo další společně stimulující molekuly nebo v obou typech DNA. Shrnutí výhod DNA vakcinace je v práci Tighe a kol. (1998, Immunology Today, 19(2), 89-97).

Je popsán způsob léčby pacienta postiženého rakovinou, způsob zahrnující navození T buněčné imunitní odpovědi během stimulace in vitro nebo ex vivo pomocí telomerázového proteinu nebo peptidů. Telomerázový protein nebo peptid může být také použit ve způsobu vakcinace pacienta za účelem získání rezistence vůči rakovině. Vhodné metody pro vakcinací zahrnují navození T buněčné imunitní odpovědi během stimulace in vitro nebo ex vivo pomocí telomerázového proteinu nebo peptidů. Také popisujeme způsob léčby nebo prevence rakoviny, který zahrnuje podávání savci trpícímu nebo pravděpodobně trpícímu rakovinou terapeuticky účinné množství telomerázového proteinu nebo peptidů tak, že se u savce indukuje T buněčná imunitní odpověď vůči telomeráze.

Peptidy zde popsané mohou být produkovány konvečními metodami například různými metodami peptidové syntézy známými v oblasti. Také to mohou být fragmenty • · *· · · • · • · • · ·

telomerázových proteinů vznikající štěpením, například použitím bromkyanu a následné purifikaci. Může být použito také enzymatické štěpení. Telomerázové proteiny nebo peptidy mohou být také ve formě rekombinantně exprimovaných proteinů nebo peptidů.

Nukleové kyseliny kódující telomerázové peptidy mohou být vytvořeny syntézou oligonukleotidů. Ta může být provedena jakoukoliv z různých metod dostupných v oblasti. Nukleové kyseliny kódující telomerázové proteiny mohou být klonovány zgenomové nebo cDNA knihovny za použití konvenčního skreeningu knihovny. Nukleotidová sonda (proba) může odpovídat jakékoliv části sekvence známého telomerázového genu. Nukleová kyselina může být také získána pomocí PCR (Polymerase Chain Reaction). Nukleová kyselina je s výhodou DNA a může být případně vklonována do vektoru. Subklony mohou být generovány použitím vhodných restrikčních enzymů. Klonovaná nebo subklonovaná DNA může být namnožena ve vhodném hostiteli, například bakteriálního původu. Hostitel může být také eukaryotický organismus, jako jsou kvasinky nebo bakulovirus. Telomerázový protein nebo peptid může být získán expresí ve vhodném hostiteli. V tomto případě je DNA vklonována do expresního vektoru. Je dostupné množství komerčních expresních kitů. Metody jsou popsány v knize Maniatis a kol. (1991, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press) a knize Harlow and Lané (1988, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press), které mohou být použity k těmto účelům.

Příklady provedení vynálezu

Peptidy byly syntetizovány pomocí peptidové syntézy na pevné fázi v kontinuálním toku. Byly použity aminokyseliny N-a-Fmoc s vhodnou ochranou vedlejších řetězců. Fmoc aminokyseliny byly aktivovány pro vytvoření vazby vytvořením pentafluorfenylesterů nebo použitím buď TBTU nebo diisopropylkarbodiimidové aktivace před reakcí. Pro selektivní odstranění Fmoc po každé vazbě byl použit 20% piperidin v DMF. Odštěpení řetězce od pryskyřice a odstranění skupin chránících vedlejší řetězce bylo provedeno pomocí 95% TFA s vhodnými čistícími látkami. Peptidy byly purifikovány a analyzovány pomocí vysokotlaké chromatografie (HPLC) na reverzní fázi. Peptidy byly identifikovány pomocí hmotnostní spektrometrie s elektrospreyem (Finnigan mat SSQ710).

• 4 •4 444444 444

4 4 4 4 4 44444

444 4 444 44

44 4444 444 «444 4« 44 44 44·#«

Aby byla vakcína vůči rakovině a způsob specifické rakovinné terapie založený na T buněčné imunitní odpovědi účinný, musely být splněny tři podmínky:

a) peptid má alespoň délku 8 aminokyselin, je to fragment telomerázového proteinu a

b) peptid je schopný indukovat buď ve své plné délce, nebo po zpracování buňkami předkládajícími antigen T buněčnou imunitní odpověď.

Následující experimentální metody mohou být použity ke zjištění, jestli jsou tyto tri podmínky u daného peptidu splněny. Zaprvé by mělo být určeno, jestli daný peptid zvyšuje T buněčnou imunitní odpověď in vitro. Je také potřeba zjistit, zda syntetický peptid odpovídá nebo je schopen po zpracování vytvořit peptidový fragment, který odpovídá peptidovému fragmentu, který se vyskytuje v rakovinných buňkách obsahujících telomerázu nebo v buňkách předkládajících antigen, které zpracovaly přirozeně se vyskytující telomerázu. Měla by být také stanovena specificita T buněk indukovaných in vivo pomocí vakcinace telomerázovými peptidy.

Je nezbytné stanovit jestli tumorové buněčné linie exprimující telomerázu mohou být zabity T buněčnými klony získanými z periferní krve karcinomatických pacientů po vakcinací telomerázovým peptidem. T buněčné klony jsou získány klonováním T buněčných blastů (T-cell blasts) přítomných mezi monukleárními buňkami periferní krve (PBMC) odebranými karcinomatickému pacientu po vakcinací telomerázovým peptidem. Protokol vakcinace peptidem zahrnuje několik in vivo injekcí peptidů zavedených intrakutánné společně s GM-CSF nebo jiným běžně používaným adjuvans. Klonování T buněk je provedeno vysetím odpovídajících T buněčných blastů v množství 5 blastů na jednu jamku v Terasakiho destičkách. V každé jamce bylo obsaženo 2x10⁴autologních ozářených (30 Gy) PBMC buněk jako zdrojových buněk. Buňky byly inkubovány s kandidátním telomerázovým peptidem v koncentraci 25 mM a s 5 U/ml rekombinantního interleukinu-2 (rlL-2) (Amersham, Aylesbury, UK) v celkovém objemu 20 ml. Po devíti dnech byly T buněčné klony přeneseny na 96-jamkové destičky s jamkami s plochým dnem (Costar, Cambridge, MA) společně s 1 mg/ml fytohemagglutinin (PHA, Wellcome, Dartford, UK), 5 U/ml rlL-2 a s alogeními ozářenými (30 Gy) PBMC buňkami (2 x 10⁵) na jamku jako zdrojovými buňkami. Rostoucí klony byly dále expandovány do 24-jamkových destiček společné s PHA / rlL2 a s 1 x 10® alogeních ozářených (30 Gy) PBMC buněk jak zdrojových buněk a testovány na peptidovou specificitu po 4 až 7 dnech.

• · ······ · · · · · • · · · · · · · · 4 ···· ·· ·· ·· ·· ···

T buněčné klony byly selektovány pro další charakterizaci. Fenotyp buněčného povrchu T buněčného klonu je určen zjištěním, jestli je T buněčný klon CD4+ nebo CD8+. T buněčný klon je inkubován s autologními tumorovými buňkami vystavenými různým poměrům efektorová buňka ku cílová buňka za účelem stanovení jestli proběhla lyže tumorových buněk. Lyže naznačuje, že T buňky vykazují reaktivitu přímo vůči od tumoru odvozenému antigenu, například telomerázovému proteinu.

Za účelem ověření, jestli rozpoznávaný antigen je asociován s telomerázovým proteinem, a identifikace HLA molekul I a II třídy, které předkládají předpokládaný telomerázový peptid T buněčnému klonu, byly jako cílové buňky v cytotoxických testech použity různé tumorové buněčné linie exprimující telomerázový peptid a zároveň nesoucí jednu nebo více HLA molekul I nebo II třídy pacienta. Cílové buňky byly značeny ⁵¹Cr nebo ³H-thymidinem (9,25 χ 10⁴ Bq/ml) přes noc, jednou promyty a vysety v množství 5000 buněk na jamku v 96-jamkových destičkách. T buňky byly přidány v různých poměrech efektorová buňka ku cílová buňka a destičky byly inkubovány po dobu 4 hodiny při teplotě 37 °C a sklizeny, poté vyhodnoceny na kapalinovém scintilačním čítači (Packard Topcount). Jako cílové buňky mohou být použity například buňky buněčné linie karcinomu močového měchýře T24 (12Val⁺, HLA-A1⁺, B35⁺), melanomové buněčné linie FMEX (12Val⁺, HLA-A2⁺, B35⁺) a buněčné linie karcinomu střeva SW 480 (12Val⁺, HLA-A2⁺, B8⁺) nebo jakékoliv další tumorová buněčné linie pozitivní na telomerázu. Jako kontroly mohou být použity vhodné buněčné linie, které neexprimují telomerázový protein, ty nebudou lyžovány. Lyže zvláště buněčných linií naznačuje, že T buněčný testovaný klon rozpoznává endogenně zpracovaný telomerázový epitop v kontextu HLA molekul I nebo II podtypu exprimovaný danou buněčnou linií.

Vymezení T buněčných klonů s HLA molekulami I nebo II třídy může být dosaženo experimenty s blokováním. Mohou být použity monoklonální protilátky vůči HLA antigenům I třídy, například pankreatická monoklonální protilátka vůči HLA antigenům I třídy W6/32 nebo vůči antigenům II třídy, například monoklonální protilátky vůči HLA antigenům II třídy DR, DQ a DO (B8/11, SPV-L3 a B7/21). Aktivita T buněčného klonu vůči autologním tumorovým buněčným liniím je vyhodnocena pomocí monoklonálních protilátek vůči HLA molekulám I a II třídy v konečné koncentraci 10 mg/ml. Stanovení jsou provedena podle postupu uvedeného výše ve třech paralelních stanoveních v 9616

-jamkových destičkách a cílové buňky jsou preinkubovány 30 minut při teplotě 37°C před přidáním T buněk.

Přesná specificita T buněčného klonu může být stanovena pomocí experimentů s pulsem peptidu. Z důvodu identifikace telomerázového peptidu, který je aktuálně rozpoznáván T buněčným klonem, byl testován panel nonamemích peptidů. Autologní fibroblasty značené ⁵¹Cr nebo ³H-thymidinem a promyté slabou kyselinou byly vysety v množství 2500 buněk na jamku v 96-jamkové destičce a vystaveny pulzu peptidů o koncentraci 1 mM společně s b2-mikroglobulinem (2,5 mg/ml) v inkubátoru s teplotou 37 °C a 5% CO₂ před tím, než byly přidány T buňky. Stanovení byla prováděna ve třech paralelních provedeních v 96-jamkových destičkách a inkubace probíhala 4 hodiny s poměrem efektorová buňka ku cílová buňka 5:1. Kontroly mohou zahrnovat T buněčné klony kultivované samostatně, s APC v nepřítomnosti peptidů nebo s irelevantním s melanomem asociovaným peptidem, MART-1/Melan-A peptidem.

Ke stanovení přesné specificity T buněčných klonů může být použit také alternativní protokol. V tomto alternativním protokolu jsou jako antigen předkládající buňky využity buňky linie T2 Tap deficientní. Tato buněčná linie exprimuje pouze malé množství HLA-A2 antigenu, ale zvýšené hladiny HLA antigenů I třídy na buněčném povrchu mohou být indukovány přídavkem b2-mikroglobulinu. ³H značené cílové buňky jsou inkubovány s různými testovanými a kontrolními peptidy v koncentraci 1 mM společně s b2-mikroglobulinem (2,5 mg/ml) po dobu jedné hodiny při 37 °C. Po pulzu peptidů před tím, než se přidají T buňky, jsou cílové buňky intenzívně promyty a vysety v množství 2500 buněk na jamku v 96-jamkové destičce. Destičky jsou před sklizením inkubovány 4 hodiny při 37 °C v atmosféře 5% CO₂. Kontroly obsahují T buněčné klony kultivované samostatně nebo s cílovými buňkami v nepřítomnosti peptidů. Stanovení byla prováděna ve třech paralelních provedeních v 96-jamkových destičkách s poměrem efektorová buňka ku cílová buňka 20:1.

Citlivost T buněčných klonů vůči zvláštním peptidům označeným výše může být také stanovena pomocí experimentů dávka-odpovéď. Jako cílové buňky mohou být použity fibroblasty senzitivované peptidy. Cílové buňky jsou vystaveny pulzu daného peptidu, jak je popsáno výše pro stanovení přesné specificity s tou výjimkou, že peptidy jsou před přídavkem T buněk přidány v různých koncentracích. Kontroly mohou zahrnovat cílové buňky samotné a cílové buňky vystavené pulzu irelevantního s melanomem asociovaného peptidu Melan-A/MART-1.

·· ·* ·· MM ·· φ φ φ · · « · φφφ ······ φ φ φ φ φ • ·« · φ φ φ φφ φ φφφ φφ φφ φφ φφ φφφ

Popis obrázků

Obr. 1

Obr.1 popisuje indukci cytotoxických T lymfocytů (CTL‘s) reaktivních vůči telomeráze (hTERT) u transgenních myší HLA-A2 (A2/K^b) imunizovaných telomerázovými peptidy se sekvenčním číslem 9 a 10. Jako kontrola byl použit standardní peptid chřipky (58-66) tvořící komplex s HLA-A2. Myším ve třech skupinách po pěti byly dvakrát týdně dávány subkutánní injekce, které obsahovaly 10⁷ ozářených syngenních buněk sleziny, které byly předtím vystaveny pulzu peptidů (100 pg/ml). Týden po druhé injekci byly myši usmrceny a byly vypreparovány jejich sleziny. Buňky sleziny byly zpracovány standardními postupy a buňky z imunizovaných zvířat byly restimulovány in vitro po dobu 5 dní společnou kultivací s ozářenými autologními buňkami sleziny vystavenými pulzu peptidů (10 pg/ml), které sloužily jako antigen předkládající buňky, před tím, než byly testovány na cytotoxicitu vůči cílovým buňkám exprimujícím hTERT (Jurkat), které byly transfektovány HLA-A2 (A2/K^b), testu s uvolňováním ⁵¹Cr.

Sloupce vlevo na obrázku 1 ukazují zabití HLA-A2 transfektovaných Jurkat buněk vystavených pulzu kontrolního peptidů (chřipka 58-66) T buňkami, které byly získány po imunizaci myší peptidem se sekvencí číslo 9, v různých poměrech efektorová buňka ku cílová buňka. U všech poměrů efektorová buňka ku cílová buňka byla pozorována specifická cytotoxicita vyšší než pozadí. Sloupce ve středu ukazují podobná data s T buňkami, které byly získány po imunizaci myší peptidem se sekvencí číslo 10. Významné zabíjení buněk Jurkat bylo pozorováno pouze tehdy, pokud jako efektorové buňky byly vybrány buňky sleziny od myší, které byly vystaveny pulzu telomerázového peptidů na rozdíl od toho, pokud jako efektorové buňky byly vybrány buňky sleziny od myší vystavených pulzu chřipkového peptidů. Zabití buněk Jurkat pouze na úrovni pozadí bylo pozorováno, když byly cílové buňky vystaveny pulzu irelevantního peptidů (peptid melanokortikoidního receptorů 1, MC1R244), jak je vidět ze sloupců v pravé části obr.1. Tyto výsledky ukazují, že peptidy se sekvenčním číslem 9 a 10 jsou imunogenní in vivo a imunizace může vyvolat imunitní odpověď u teplokrevných živočichů, které vykazují běžné lidské MHC molekuly HLA-A2. Tato zjištění také naznačují, že peptidy s číslem sekvence 9 a 10 mohou být použity jako vakcína vůči •4 *··· rakovině u lidí nesoucích HLA-A2 nebo jiné HLA molekuly I. třídy schopné vázat tyto peptidy. Navíc tyto výsledky ukazují, že hTERT exprimované leukemickou T buněčnou linií Jurkat mohou být zpracovány proteolytickým aparátem buněčné linie za vzniku peptidových fragmentů, které jsou identické nebo podobné peptidům s číslem sekvence 9 a 10. Tato pozorování společně pak naznačují, že imunitní odpověď získaná po vakcinací karcinomatických pacientů nebo pacientů s rizikem vzniku rakoviny těmito peptidy může ústit v účinné zabití tumorových buněk exprimujících hTERT podjednotku telomerázy.

Obr. 1 znázorňuje cytotoxicitu efektorových buněk získaných z myší imunizovaných jak naznačeno na obrázku vůči HLA-A2 transfektovaným buňkám Jurkat. Cílové buňky byly označeny ⁵¹Cr (0,1 μ0ϊ/100 μΙ buněčné suspenze) po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C, dvakrát promyty a vystaveny pulzu peptidu (1 μρ/ηηΙ) po dobu jedné hodiny při teplotě 37 °C před promytím. Dva tisíce označených, cílových buněk vystavených pulzu peptidu bylo vyseto na jamku v 96-jamkové mikrotitrační destičce s v-tvarem dna jamky, a do jamky byly přidány efektorové buňky (2,5x10⁴ až 2x10⁵). Kultura byla inkubována 4 hodiny při 37 °C, poté byl odebrán supernatant a ten testován v gama čítači.

Výsledky vobr.1 jsou vyjádřeny jako specifická cytotoxicita vypočítaná podle následujícího vztahu:

(cpm experimentálně uvolněné - cpm spontánně uvolněné)/ (cpm celkové - cpm spontánně uvolněné) x 100

Obr. 2

Obr. 2 ukazuje výsledky in vitro stimulace periferních krevních T buněk od pacienta (TT) s karcinomem střeva peptidy odvozenými od telomerázy (hTERT) s čísly sekvencí 2, 3, 4 a 7. Kultivace in vitro byla provedena následujícím způsobem: Tři sady 10⁵ mononukleárních buněk bylo inkubováno 6 dnů v médiu X-VIVO 10 doplněném 15% lidským sérem inaktivovaným teplem ve vlhkém inkubátoru s 5% CO2· Peptidy byly přítomny ve všech kulturách v konečné koncentraci 30 μ9/πιΙ média. Kultury bez peptidů sloužily jako kontrola. Proliferativní odpověď vyšší než pozadí byla pozorována u T buněk pokud byly stimulovány peptidem se sekvencí číslo

4. Tyto výsledky ukazují, že krev karcinomatického pacienta obsahuje cirkulující T buňky specifické pro peptidy odvozené od telomerázy (hTERT). Tyto výsledky ukazují,

«· v »	·· • «	• 9 8 *	•	* ·	• • ·
• s • t*·	ó i • 9	* > · » · ♦ ·	• • ·	* · · • · ·*	• «

že enzymatická podjednotka telomerázy (hTERT) je u muže imunogenní a může spontánně zvýšit specifickou T buněčnou odpověď vůči telomeráze, pokud je nadměrně exprimována tumorem rostoucím v pacientovi. Navíc, jedna část specifické odpovědi u tohoto pacienta je zaměřena přímo proti peptidu s číslem sekvence 4, která je zde uvedena. Tento nález naznačuje, že peptid se sekvencí č. 4 může být také použit jako vakcína vůči rakovině u člověka. Obr. znázorňuje výsledky konvenčního T buněčného proliferativního testu, kde periferní krevní mononukleárové buňky (10⁵) byly kultivovány s peptidy, jak je ukázáno, 7 dní ve třech sadách před sklizením. K měření proliferativní kapacity kultur byl přidán před sklizením ke kultuře přes noc ³H-thymidin (3,7x10⁴ Bq / jamku). Hodnoty jsou udány jako průměr četností za minutu (cpm) tří paralelních sad.

Obr. 3 a 4

Obr. 3 a 4 ukazují reaktivitu lymfocytů infiltrovaných do tumoru (TILs) získaných od pacienta s pokročilým karcinomem pankreatu. T buňky byly získány z biopsie tumoru a byly úspěšně kultivovány in vitro za vzniku T buněčné linie. T buněčná linie byla CD3+, CD4+ a CD8- a proliferovala specificky v odpovědi na přítomnost telomerázových peptidů. Výsledky v obr.3 ukazují T buňky, které rozpoznávají peptidy se sekvencí číslo 2 a 3, ve srovnání s kontrolami, které obsahovaly samotné médium. Výsledky v obr. 3 ukazují T buňky, které rozpoznávají peptid se sekvencí číslo 2. TILs buňky byly expandovány společnou kultivací s rekombinantím interleukinem 2 (rlL-2) a testovány po 14 pomocí standardního proliferačního testu s použitými peptidy se sekvencemi číslo 2, 3, 4 a 7.

Tabulka 1

LMSVYWEL ELLRSFFYV YWELLRSF WELLRSFF SVYWELLR VELLRSFFY YVTETTFQK RLFFYRKSV SIGIRQHLK RPALLTSRL ALLTSRLRF LLTSRLRFI RPIVNMDYV LRPIVNMDY YWGARTFR WGARTFRR GARTFRREK ARTFRREKP PPELYFVKV ELYFVKVDV FVKVDVTGA IPQDRLTEV DRLTEVIAS RLTEVIASI IPQGSILSTL ILSTLLCSL LLRLVDDFL RLVDDFLLV VPEYGCWN VPEYGCWNL TLVRGVPEY FLRTLVRGV GVPEYGCW WNLRKTW GLFPWCGLL

FLHWLMSVYWELLRSFFYVTE EARPALLTSRLRFIPK DGLRPIVNMDYWGAR GVPEYGCWNLRKWNF

Tabulka 2

YAETKHFLY ISDTASLCY DTDPRRLVQ AQDPPPELY LTDLQPYMR QSDYSSYAR

ILAKFLHWL ELLRSFFYV LLARCALFV WLCHQAFLL RLVDDFLLV RLFFYRKSV LQLPFHQQV RLGPQGWRL SLQELTWKM NVLAFGFAL VLLKTHCPL FLLVTPHLT TLTDLQPYM RLTEVIASI FLDLQVNSL SLNEASSGL ILSTLLCSL LLGASVLGL VLAFGFALL LQPYMRQFV LMSVYWEL RLPQRYWQM RQHSSPWQV YLPNTVTDA NMRRKLFGV RLTSRVKAL LLQAYRFHA LLDTRTLEV YMRQFVAHL LLTSRLRFI CLVCVPWDA LLSSLRPSL FMCHHAVRI LQVNSLQTV LVAQCLVCV CLKELVARV FLRNTKKFI ALPSDFKTI VLVHLLARC VQSDYSSYA SVWSKLQSI KLPGTTLTA QLSRKLPGT ELYFVKVDV GLLLDTRTL WMPGTPRRL SLTGARRLV WIEQSSSL LPSEAVQWL QAYRFHACV GLFDVFLRF KLFGVLRLK RLREEILAK • · • ·

Tabulka 2 (pokračování)

TLVRGVPEY GLPAPGARR GLFPWCGLL KLTRHRVTY VLPLATFVR ELVARVLQR DPRRLVQLL FVRACLRRL SVREAGVPL AGRNMRRKL LARCALFVL RPAEEATSL LPSDFKTIL LPSEAVQWL LPGTTLTAL RPSFLLSSL LPNTVTDAL RPALLTSRL RCRAVRSLL MPRAPRCRA GIRRDGLLL VLRLKCHSL YMRQFVAHL SLRTAQTQL QMRPLFLEL LLRLVDDFL FVQMPAHGL HASGPRRRL WIEQSSSL RVISDTASL CVPAAEHRL RVKALFSVL NVLAFGFAL LVARVLQRL FAGIRRDGL HAQCPYGVL RAQDPPPEL AYRFHACVL HAKLSLQEL GAKGAAGPL TASLCYSIL APRCRAVRS GARRLVETI AQCPYGVLL HAKTFLRTL EATSLEGAL KAKNAGMSL AQTQLSRKL AGIRRDGLL VLRLKCHSL ILKAKNAGM DPRRLVQLL GAKGAAGPL FAGIRRDGL GARRRGGSA HAKTFLRTL HAKLSLQEL

4

4444 44

Tabulka 2 (pokračování)

LARCALFVL EHRLREEIL NMRRKLFGV CAREKPQGS LTRHRVTYV RRFLRNTKK RRDGLLLRL RREKRAERL RRLVETIFL LRFMCHHAV RRYAWQKA KRAERLTSR RRKLFGVLR RRRGGSASR RRLPRLPQR RRLGPQGWR LRGSGAWGL HREARPALL VRRYAWQK ARTSIRASL HRVTYVPLL LRSHYREVL MRPLFLELL HRAWRTFVL MRRKLFGVL LRLVDDFLL LRRVGDDVL YRKSVWSKL QRLCERGAK FRALVAQCL SRKLPGTTL LRRLVPPGL RRSPGVGCV RRVGDDVLV VRGCAWLRR VRSLLRSHY ARTFRREKR SRSLPLPKR IRASLTFNR LREEILAKF IRRDGLLLR QRGDPAAFR LRPIVNMDY ARRLVETIF ARPALLTSR LRPSLTGAR LRLKCHSLF FRREKRAER ARGGPPEAF CRAVRSLLR GRTRGPSDR RRRLGCERA LRELSEAEV ARCALFVLV RPAEEATSL DPRRLVQLL RPSFLLSSL LPSEAVQWL

Tabulka 2 (pokračování)

RPALLTSRL LPSDFKTIL RPPPAAPSF LPRLPQRYW LPNTVTDAL LPGTTLTAL LAKFLHWLM KAKNAGMSL GSRHNERRF KALFSVLNY SPLRDAWI RAQDPPPEL MPAHGLFPW AEVRQHREA REAGVPLGL EEATSLEGA LEAAANPAL QETSPLRDA REVLPLATF KEQLRPSFL REKPQGSVA LEVQSDYSS REARPALLT EEDTDPRRL REEILAKFL CERGAKNVL DDVLVHLLA GDMENKLFA YERARRPGL

Seznam sekvencí

Obecné pro všechny sekvence.

Typ sekvence: Peptid

Sekvenční jednotka: Aminokyselina

Topologie: Lineární

SEKVENCE Č.: 1

DÉLKA SEKVENCE: 22 aminokyselin

FLHWLMSVYVVELLRSFFYVTE 15 10 1520

SEKVENCE Č.: 2

DÉLKA SEKVENCE: 16 aminokyselin

EARPALLTSRLRFIPK

5 10 '15

SEKVENCE Č. : 3

DÉLKA SEKVENCE: 16 aminokyselin

DGLRPIVNMDYVVGAR

1015

SEKVENCE Č.: 4

DÉLKA SEKVENCE: 18 aminokyselin

GVPEYGCVVNLRKTVVNF 15 1015

SEKVENCE Č.: 5

DÉLKA SEKVENCE: 23 aminokyselin

KFLHWLMSVYVVELLRSFFYVTE

10 1520

SEKVENCE Č.: 6

DÉLKA SEKVENCE: 17 aminokyselin

KFLHWLMSVYVVELLRS

SEKVENCE Č.: 7

DÉLKA SEKVENCE:

LMSVYVVE

SEKVENCE Č.: 9

DÉLKA SEKVENCE:

ILAKFLHW

SEKVENCE Č.: 10

DÉLKA SEKVENCE: ELLRSFFY 15

SEKVENCE Č.: 11

DÉLKA SEKVENCE: LMSVYVVE 15

SEKVENCE Č.: 12

DÉLKA SEKVENCE: TSRLRFIP 15

SEKVENCE Č.: 13

DÉLKA SEKVENCE:

LTSRLRFI 15

SEKVENCE Č.: 14

DÉLKA SEKVENCE:

LLTSRLRF aminokyselin

LLRSFFYVTE

15 aminokyselin

L aminokyselin

V aminokyselin

L aminokyselin

K aminokyselin

P aminokyselin

I

·· ·· ♦·♦» ·· • · · · > · · · · · • · < · t · * · • 9 · > · · ··· · • · · · * *- · ·» ♦ ·«· ·· ·· ·· ·« «

SEKVENCE Č. : 15 DÉLKA SEKVENCE: ALLTSRLR

SEKVENCE Č.: 16

DÉLKA SEKVENCE: PALLTSRL 15

SEKVENCE Č.: 17

DÉLKA SEKVENCE: RPALLTSR 15

SEKVENCE Č.: 18

DÉLKA SEKVENCE: ARPALLTS 15

SEKVENCE Č.: 19

DÉLKA SEKVENCE:

P A L L T aminokyselin

F aminokyselin

R aminokyselin

L aminokyselin

R aminokyselin

Claims

1. Telomerázový protein nebo peptid pro použití ve způsobu léčby nebo prevence rakoviny.

2. Telomerázový protein nebo peptid podle nároku 1 pro použití jak je zde specifikováno, telomerázový protein nebo peptid je schopný generovat T buněčnou odpověď přímo vůči telomerázovému proteinu.

3. Telomerázový protein nebo peptid podle nároku 1 nebo 2 pro použití jak je zde specifikováno, kde způsob zahrnuje podávání savcům trpícím nebo pravděpodobně trpícím rakovinou terapeuticky účinné množství telomerázového proteinu nebo peptidů tak, že je u savců indukovaná T buněčná imunitní odpověď vůči telomeráze.

4. Telomerázový protein nebo peptid podle nároku 2 nebo 3 pro použití jak je zde specifikováno, kde indukovaná T buněčná odpověď je cytotoxická T buněčná odpověď.

5. Telomerázový protein nebo peptid podle kteréhokoliv předcházejícího nároku pro použití jak je zde specifikováno, kde telomerázový protein nebo peptid je lidský telomerázový protein nebo peptid.

6. Telomerázový peptid podle kteréhokoliv předcházejícího nároku pro použití jak je zde specifikováno, kde telomerázový peptid má délku mezi 8 a 25 aminokyselinami.

7. Telomerázový peptid podle nároku 6 pro použití jak je zde specifikováno, kde peptid má délku 9, 12, 13, 16 nebo 21 aminokyselin.

8. Telomerázový peptid podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 pro použití jak je zde specifikováno, kde peptid má délku alespoň 9 aminokyselin.

9. Telomerázový peptid podle kteréhokoliv předcházejícího nároku pro použití jak je zde specifikováno, kde telomerázový peptid má aminokyselinovou sekvenci, která se částečně nebo úplně překrývá se sekvencí vybranou ze všech následujících sekvencí:

LLRSFFYVTE, SRLRFIPK, LRPIVNMDYWG, PELYFVKVDVTGAYDTI, KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCY, LLLRLVDDFLLVT, GCWNLRKTW, WLMSVYWELLRSFFYVTETTFQKNRLFFYRKSVWSKLQSIGIRQHLK,

Μ ‘.·Ί i·; i. ·; i i Ί ···· ·· ·· ·· ·· ···

EVRQHREARPALLTSRLRFIPKPDG, RPIVNMDYWGARTFRREKRAERLTSRV,

PPPELYFVKVDVTGAYDTIPQDRLTEVlASIIKP,

KSYVQCQGIPQGSILSTLLCSLCYGDMENKLFAGI, LLRLVDDFLLVTPHLTH,

AKTFLRTLVRGVPEYGCWNLRKTW a HGLFPWCGLLL.

10. Telomerázový peptid podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro použití jak je zde specifikováno, kde telomerázový peptid má aminokyselinovou sekvenci: LMSVYWEL, ELLRSFFYV, YWELLRSF, WELLRSFF, SVYWELLR, VELLRSFFY, YVTETTFQK, RLFFYRKSV, SIGIRQHLK, RPALLTSRL, ALLTSRLRF, LLTSRLRFI, RPIVNMDYV, LRPIVNMDY, YWGARTFR, WGARTFRR, GARTFRREK, ARTFRREKP, PPELYFVKV, ELYFVKVDV, FVKVDVTGA, IPQDRLTEV, DRLTEVIAS, RLTEVIASI, IPQGSILSTL, ILSTLLCSL, LLRLVDDFL, RLVDDFLLV, VPEYGCWN, VPEYGCWNL, TLVRGVPEY, FLRTLVRGV, GVPEYGCW, WNLRKTW nebo GLFPWCGLL.

11. Telomerázový peptid podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro použití jak je zde specifikováno, kde telomerázový peptid má aminokyselinovou sekvenci: FLHWLMSVYWELLRSFFYVTE, EARPALLTSRLRFIPK, DGLRPIVNMDYWGAR nebo GVPEYGCWNLRKWNF, to je sekvence číslo 1,2,3 nebo 4 dle pořadí.

12. Telomerázový peptid podle kteréhokoliv z předcházejících nároků pro použití jak je zde specifikováno, kde telomerázový peptid má aminokyselinovou sekvenci: YAETKHFLY, ISDTASLCY, DTDPRRLVQ, AQDPPPELY, LTDLQPYMR, QSDYSSYAR, ILAKFLHWL, ELLRSFFYV, LLARCALFV, WLCHQAFLL, RLVDDFLLV, RLFFYRKSV, LQLPFHQQV, RLGPQGWRL, SLQELTWKM, NVLAFGFAL, VLLKTHCPL, FLLVTPHLT, TLTDLQPYM, RLTEVIASI, FLDLQVNSL, SLNEASSGL, ILSTLLCSL, LLGASVLGL, VLAFGFALL, LQPYMRQFV, LMSVYWEL, RLPQRYWQM, RQHSSPWQV, YLPNTVTDA, NMRRKLFGV, RLTSRVKAL, LLQAYRFHA, LLDTRTLEV, YMRQFVAHL, LLTSRLRFI, CLVCVPWDA, LLSSLRPSL, FMCHHAVRI, LQVNSLQTV, LVAQCLVCV, CLKELVARV, FLRNTKKFI, ALPSDFKTI, VLVHLLARC, VQSDYSSYA, SVWSKLQSI, KLPGTTLTA, QLSRKLPGT, ELYFVKVDV, GLLLDTRTL, WMPGTPRRL, SLTGARRLV, WIEQSSSL, LPSEAVQWL, QAYRFHACV, GLFDVFLRF, KLFGVLRLK, RLREEILAK, TLVRGVPEY, GLPAPGARR, GLFPWCGLL, KLTRHRVTY, VLPLATFVR, ELVARVLQR, DPRRLVQLL, FVRACLRRL, SVREAGVPL, AGRNMRRKL, LARCALFVL, RPAEEATSL, fc········· ···· ·· ·· ·· ·· ···

LPSDFKTIL, LPSEAVQWL, LPGTTLTAL, RPSFLLSSL, LPNTVTDAL, RPALLTSRL, RCRAVRSLL, MPRAPRCRA, GIRRDGLLL, VLRLKCHSL, YMRQFVAHL, SLRTAQTQL, QMRPLFLEL, LLRLVDDFL, FVQMPAHGL, HASGPRRRL, WIEQSSSL, RVISDTASL, CVPAAEHRL, RVKALFSVL, NVLAFGFAL, LVARVLQRL, FAGIRRDGL, HAQCPYGVL, RAQDPPPEL, AYRFHACVL, HAKLSLQEL, GAKGAAGPL, TASLCYSIL, APRCRAVRS, GARRLVETI, AQCPYGVLL, HAKTFLRTL, EATSLEGAL, KAKNAGMSL, AQTQLSRKL, AGIRRDGLL, VLRLKCHSL, ILKAKNAGM, DPRRLVQLL, GAKGAAGPL, FAGIRRDGL, GARRRGGSA, HAKTFLRTL, HAKLSLQEL, LARCALFVL, EHRLREEIL, NMRRKLFGV, CAREKPQGS, LTRHRVTYV, RRFLRNTKK, RRDGLLLRL, RREKRAERL, RRLVETIFL, LRFMCHHAV, RRYAWQKA, KRAERLTSR, RRKLFGVLR, RRRGGSASR, RRLPRLPQR, RRLGPQGWR, LRGSGAWGL, HREARPALL, VRRYAWQK, ARTSIRASL, HRVTYVPLL, LRSHYREVL, MRPLFLELL, HRAWRTFVL, MRRKLFGVL, LRLVDDFLL, LRRVGDDVL, YRKSVWSKL, QRLCERGAK, FRALVAQCL, SRKLPGTTL, LRRLVPPGL, RRSPGVGCV, RRVGDDVLV, VRGCAWLRR, VRSLLRSHY, ARTFRREKR, SRSLPLPKR, IRASLTFNR, LREEILAKF, IRRDGLLLR, QRGDPAAFR, LRPIVNMDY, ARRLVETIF, ARPALLTSR, LRPSLTGAR, LRLKCHSLF, FRREKRAER, ARGGPPEAF, CRAVRSLLR, GRTRGPSDR, RRRLGCERA, LRELSEAEV, ARCALFVLV, RPAEEATSL, DPRRLVQLL, RPSFLLSSL, LPSEAVQWL, RPALLTSRL, LPSDFKTIL, RPPPAAPSF, LPRLPQRYW, LPNTVTDAL, LPGTTLTAL, LAKFLHWLM, KAKNAGMSL, GSRHNERRF, KALFSVLNY, SPLRDAWI, RAQDPPPEL, MPAHGLFPW, AEVRQHREA, REAGVPLGL, EEATSLEGA, LEAAANPAL, QETSPLRDA, REVLPLATF, KEQLRPSFL, REKPQGSVA, LEVQSDYSS, REARPALLT, EEDTDPRRL, REEILAKFL, CERGAKNVL, DDVLVHLLA, GDMENKLFA nebo YERARRPGL.

13. Nukleová kyselina pro použití ve způsobu léčby nebo prevence rakoviny, nukleová kyselina je schopna kódovat telomerázový protein nebo peptid podle kteréhokoliv z předcházejících nároků.

14. Farmaceutická kompozice obsahující alespoň jeden telomerázový protein nebo peptid podle jakéhokoliv z nároků 1 až 12, nebo alespoň jednu nukleovou kyselinu podle nároku 13, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

15. Farmaceutická kompozice obsahující kombinaci alespoň jednoho telomerázového proteinu nebo peptidu podle nároků 1 až 12 a alespoň jednoho peptidu schopného indukovat T buněčnou imunitní odpověď vůči onkogennímu nebo mutovanému tumor supresorovému proteinu nebo peptidu, společně farmaceuticky přijatelným nosičem nebo rozpouštědlem.

16. Farmaceutická kompozice podle nároku 14 nebo 15 pro použití při léčbě nebo prevenci jakéhokoliv z následujících karcinomů: karcinom prsu, karcinom prostaty, maligní melanom, leukemie, lymfomy, karcinom ovarií, karcinom děložního čípku a karcinomy žlučových cest.

17. Způsob přípravy farmaceutické kompozice podle nároku 14, kde způsob obsahuje smísení alespoň jednoho telomerázového proteinu nebo peptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 nebo alespoň jedné nukleové kyseliny podle nároku 13, s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo ředidlem.

18. Způsob přípravy farmaceutické kompozice podle nároku 15, kde způsob obsahuje smísení alespoň jednoho telomerázového proteinu nebo peptidu podle kteréhokoliv z nároků 1 až 12 s alespoň jedním peptidem schopným indukovat T buněčnou odpověď vůči onkogennímu nebo mutovanému tumor supresorovému proteinu nebo peptidu, a farmaceuticky přijatelného nosiče nebo ředidla.

19. Farmaceutická kompozice podle nároku 15 nebo způsob výroby farmaceutické kompozice podle nároku 18, kde onkogenní protein nebo peptid je mutovaný p21-ras protein nebo peptid.

20. Farmaceutická kompozice podle nároku 15 nebo způsob výroby farmaceutické kompozice podle nároku 18, kde tumor supresorový protein nebo peptid je retinoblastom nebo p53 protein nebo peptid.

21. Použití telomerázového proteinu nebo peptidu nebo nukleové kyseliny schopné kódovat telomerázový protein nebo peptid při přípravě léku pro léčbu nebo prevenci rakoviny.

22. Způsob generování T lymfocytů schopných rozeznat a zničit tumorové buňky u savců, kde způsob obsahuje odebrání vzorku T lymfocytů ze savce, kultivaci vzorku T lymfocytů v přítomnosti telomerázového proteinu nebo peptidu v množství dostatečném pro generování telomerázových T lymfocytů.

23. Telomerázový protein nebo peptid pro použití ve způsobu léčby nebo prevence rakoviny zejména zde popsaného s odkazy na obrázky a na nich ukázaném.

•4 • c ····

24. Použití při přípravě léků pro léčbu nebo prevenci rakoviny telomerázového proteinu nebo peptidu nebo nukleové kyseliny schopné kódovat telomerázový protein nebo peptid zejména zde popsané s odkazy na obrázky a na nich ukázané.

25. Nukleová kyselina schopná kódovat telomerázový protein nebo peptid pro použití ve způsobu léčby nebo prevence rakoviny zejména zde popsaná s odkazy na obrázky a na nich ukázaná.

26. Farmaceutická kompozice nebo způsob přípravy takové farmaceutické kompozice obsahující alespoň jeden telomerázový protein nebo peptid zejména zde popsaná s odkazy na obrázky a na nich ukázaná.

27. Způsob generování telomerázových T lymfocytů v podstatě zde popsaný.