CZ20011134A3

CZ20011134A3 - Stabilní koncentrované insulinové přípravky pro plicní podávání

Info

Publication number: CZ20011134A3
Application number: CZ20011134A
Authority: CZ
Inventors: Svend Havelund
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1998-10-16
Filing date: 1999-10-15
Publication date: 2001-08-15
Also published as: EP1121144B1; TWI223597B; ES2228728T3; HUP0104111A3; DK1121144T3; EP1172114B1; IL142011A0; AU6188999A; BR9914585A; EP1172114A2; ATE218364T1; JP4212240B2; KR20010075631A; PL347210A1; AU758146B2; JP2002527487A; NO20011842D0; PL197504B1; HUP0104111A2; CN1323219A

Description

Stabilní koncentrované insulinové přípravky pro plicní podávání

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká koncentrovaných vodných insulinových přípravků s vysokou fyzikální a chemickou stabilitou, vhodných pro plicní podávání.

Dosavadní stav techniky

Diabetes je obecný termín pro poruchy u lidí s nadměrným vylučováním moči jako u diabetes mellitus a diabetes insipidus. Diabetes mellitus je metabolická porucha, při které se více či méně zcela ztrácí schopnost využívat glukosu. Diabetem trpí 2 % lidské populace.

Od zavedení insulinu ve 20. letech 20. století probíhá nepřetržitý pokrok ve zlepšení léčby diabetes mellitus. Pro zabránění dosažení extrémních glykemických hladin praktikují často diabetičtí pacienti mnohonásobnou injekční terapii, při které se insulin podává s každým jídlem.

V roztoku je způsob samosdružování insulinu komplexní funkcí koncentrace proteinu, iontů kovů, pH, iontové síly a složení roztoku. Pro v současnosti používané přípravky obsahující U100 insulin, zinečnaté ionty, isotonické činidlo a fenolickou konzervační látku, se uvažují následující rovnovážné stavy:

6 In *->	3 In₂
3 In₂ +	2 Zn²⁺ θ	In₆ (T₆)
τ₆ θ	T3R3 *->	Ré

Známé způsoby degradace insulinu zahrnují a) vznik fíbrily; b) deamidaci na A18, A21 a B3; c) dimerizaci transamidací nebo vytvořením Schiffovy báze; d) disulfidové výměnné reakce.

Podle Brange (Stability of Insulin, Kluwer Academie Press, 1994) probíhá každá z těchto degradačních reakcí mnohem rychleji v monomemím stavu než ve stavu hexamemím. Proto je nejúčinnějším způsobem stabilizace insulinových přípravků posunutí výše uvedené rovnováhy co možná nejvíce doprava. Kromě tohoto obecného účinku působení hmoty je reaktivita vybraných φ

φ

φφ φφ φφ • · φ · φφ φφφφ φ φ φ φφφ φφ * φ φφ φ φ φ φ φ φ zbytků dále modifikována v závislosti na jejich přímém zapojení do konformační změny T —> R. Reaktivita B3Asn je mnohem nižší ve stavu R (kde zbytek zaujímá α-helix) než ve stavu T. Interkonverze mezi konformacemi Τβ, T₃R₃ a Re dvou insulinových hexamerů obsahujících zinek je modulována ligandem vážícím se na T₃R₃ a Ré formy. Anionty jako je chloridový anion, mají afinitu ke čtvrté koordinační poloze iontů kovů u T₃R₃ a Ré, zatímco konzervační činidla jako je fenol se váží na hydrofobní kapsy uložené blízko povrchu T₃R₃ a Ré forem (Derewenda, Nátuře 338, 594, 1989; a Brzovic, Biochemistry 33, 130557, 1994). S použitím Co²⁺ insulinu bylo ukázáno, že kombinovaný efekt navázaného aniontu a fenolu je obzvláště účinný pro stabilizaci R₆ stavu. (Brader, Trends Biochem. Sci. 30, 6636, 1991; a Bloom, J. Mol. Biol. 245, 324, 1995). Dále se ukázalo, že jak pro Zn²⁺, tak pro Co²⁺ insulin je v indukování stavu R u insulinového hexamerů fenol mnohem účinnější než m-kresol (Wollmer, Biol. Chem. Hoppe-Seyler 368, 903, 1987; a Choi, Biochemistry 32, 11638, 1993). Vysokoafínitními fenolickými deriváty indukujícími stav R jsou 7-hydroxyindol (Dodson, Phil. Trans. R. Soc. Lond. A 345, 153, 1993), resorcinol a 2,6- a 2,7-dihydroxynaftalen (Bloom, J. Mol. Biol. 245, 324, 1995). Fyzikální denaturace insulinu je známa jako fíbrilace. Ve fíbrilárním stavu leží natažené peptidové řetězce paralelně nebo antiparalelně navzájem spojené vodíkovými můstky, v takzvané β-struktuře nebo β-struktuře skládaného listu. Fibrily obvykle představují stav proteinu s nejnižší energií, a pouze drsné podmínky, jako je silná báze, mohou umožnit regeneraci z tohoto stavu do stavu přirozeného se správně složeným proteinem. Faktory, které podporují rychlost tvorby fíbril, jsou vzrůstající teplota, vzrůstající plocha povrchu mezi kapalnou a vzdušnou fází a pro insulin bez zinku, vzrůstající koncentrace. Pro hexamemí insulin obsahující zinek rychlost tvorby fíbril se vzrůstající koncentrací klesá. Má se za to, že tvorba fíbril probíhá přes monomerizaci insulinu. Fibrily insulinu mají vzhled gelů nebo precipitátů.

Deriváty insulinu seříznuté na C-terminu řetězce B, např. des-pentapeptid(B26-B30)insulin a des-oktapeptid(B23-B30)insulin, jsou mnohem náchylnější k tvorbě fíbril než lidský insulin. Analogy insulinu, které se snadno disociují z hexamemí jednotky na formu monomemí, např. AspB28 lidský insulin a LysB28ProB29 lidský insulin, jsou také mnohem náchylnější k tvorbě fíbril než lidský insulin. Přirozený stav insulinu se stabilizuje vyvoláním podmínek ·· ·· ···*·« ·· ·«·· * · · ··· • ·· · » · · ·♦ · · • «··*«· · · * · · ♦ 9 ♦ · * 9 9 9

9 9 9 9 9 999 99 9 stabilizujících hexamerní jednotku, tzn. v přítomnosti zinečnatých iontů (2-4 Zn²⁺/hexamer), fenolu (0,1-0,5 % w/v) a chloridu sodného (5-150 mM).

Přídavek činidel redukujících povrchovou tenzi a rozhraní vzduch-kapalina redukuje sklon k tvorbě fíbril. Polyethylenglykol, polypropylenglykol a jejich kopolymery s průměrnou molekulovou hmotností 1800 našly tak použití jako stabilizátory v koncentrovaných roztocích insulinu pro infuzní pumpy (Grau, 1982, Neue Insuline, Eds. Petersen, Schluter & Kerp, Freiburger Graphische Betriebe, str. 411-419; a Thurow, 1981, patent DE2952119A1). Úplný přehled fyzikální stability insulinu podává Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academie Publisher, str. 18-23. Většina chemických degradačních reakcí insulinu v přípravcích je způsobena reakcemi na karboxamidové funkci asparaginových zbytků, obzvláště zbytků B3 a A21. Hydrolýza amidových skupin vede k desamidoderivátům a transamidace za účasti aminoskupiny z jiné molekuly vede ke kovalentně vázaným dimerům a, po podobných následných reakcích, k trimerům a vyšším polymerům.

V kyselém roztoku je nejreaktivnější AsnA21, což vede kAspA21 insulinu (Sundby, J. Biol. Chem. 237, 3406, 1962). V surovém insulinu hovězího nebo prasečího původu, získaném kyselou extrakcí ethanolem, byly nejpočetnější isolované dimery AspA21-GlyAl a AspA21-PheBl (Helbig 1976, Insulindimere aus der B-Komponente von Insulinpraparationen, Thesis at the Rheinisch-Westfalischen Technischen Hochschule, Aachen).

V neutrálním roztoku, což je výhodné provedení insulinových přípravků pro injekční terapii, je nejvnímavějším zbytkem AsnB3. Produkty degradace zahrnují AspB3 insulin, AspB3GlnB4-isopeptidinsulin a dimery a vyšší polymery, kde AspB3 poskytuje karbonylovou skupinu a spolu s aminoskupinou jiné molekuly tvoří peptidovou vazbu. Úplný přehled chemické stability insulinu podává Brange 1994, Stability of Insulin, Kluwer Academie Publisher, str. 23-36. Co se týká fyzikální stability, podmínky stabilizující hexamerní jednotku, tzn. přítomnost zinečnatých iontů (2-4 Zn²⁺/hexamer), fenolu (0,1-0,5 % w/v) a chloridu sodného (5-150 mM), snižují rychlost tvorby produktů degradace během skladování při neutrálním pH.

Další typ polymerační reakce se pozoruje v případě, kdy jsou podmínky stabilizující hexamerní jednotku opomenuty. Při absenci zinku, fenolu a chloridu sodného a při teplotě 50 °C jsou převažujícími vzniklými produkty disulfidicky vázané dimery a polymery s vysokou • · • Φ 4« ··»· 444 » r · ··· « ·· · • · 4 4 < * ·♦ ·· V

4 · * 44 • · · »4444 • 4 · 4 ··· «4»44 molekulovou hmotností. Mechanismem jejich vzniku je disulfidová výměnná reakce jako výsledek β-eliminace disulfídů (Brems, Protein Engineering 5, 519, 1992).

Rozpustnost insulinu je funkcí pH, koncentrace iontů kovů, iontové síly, fenolických látek, složení roztoku (polyoly, ethanol a další rozpouštědla), čistoty a druhu (hovězí, prasečí, lidský, jiné analogy). Přehled podává Brange, Galenics of Insulin, Springer-Verlag 1987, str. 18 a 46.

Rozpustnost insulinu při hodnotách pH blízkých isoelektrickému pH, tzn. v rozmezí pH 4,0 až 7,0, je nízká. Při kyselém pH byly připraveny vysoce koncentrované (5 000 U/ml, 30mM) roztoky prasečího insulinu (Galloway, Diabetes Care 4, 366, 1981), ale insulin v přípravku je vysoce nestabilní kvůli deamidaci na AsnA21. Při neutrálním pH jsou připravitelné vysoce koncentrované roztoky insulinu bez zinku, ale tyto roztoky jsou nestabilní kvůli velké rychlosti polymerace a deamidace na AsnB3. Pro roztoky prasečího insulinu se zinkem obsahující fenol při neutrálním pH se uvádí, že jsou fyzikálně stabilní při koncentraci 1 000 U/ml při pokojové teplotě, ale stávají se přesycenými při teplotě snížené na 4 °C (Brange a Havelund, Artifícial Systems for Insulin Delivery, Brunetti et al., Eds., Raven Press 1983).

Pro zmírnění obtíží při injekcích insulinu se velká pozornost věnuje alternativním způsobům podávání (souhrnný přehled podává Brange a Langkjaer, Protein Delivery, Physical Systems, Sanders a Hendren, Eds., Plenům Press 1997). Plicní podávání se zdá být ze všech způsobů nejslibnějším (Service, Science 277, 1199, 1997). Insulin je možné podávat aerosolizovaný ve formě suchého prášku nebo jako rozprášené kapičky z insulinového roztoku. Účinnost je možné zvýšit cvičeným dýcháním (Gonda, US Patent 5 743 250) a přídavkem činidla podporujícího absorpci (Baekstroem, US Patent 5 747 445) nebo inhibitorů proteasy (Okumura, Int. J. Pharm. 88, 63, 1992).

Biodostupnost rozprášeného koncentrovaného insulinového roztoku (500 U/ml) se ve srovnání s podkožní injekcí ukázala být 20 až 25% (Elliot, Aust. Paediatr. J. 23, 293, 1987). Při použití 30 až 50 μΐ insulinového roztoku na nadýchnutí je nutné, aby byl insulinový roztok 5 až 20 krát koncentrovanější než je obvyklá koncentrace 0,6 mM. Při použití obalu na jednu dávku, např. bublinkového balení (Gonda, US Patent 5 743 250), je odstraněn požadavek na konzervační látku. Většina insulinových přípravků se konzervuje toxickým, sliznice dráždícím a nepříjemně páchnoucím fenolem a m-kresolem. Vynechání fenolů však působí problémy se ·· ·♦ ·» ···* φφ · • · · φ · · · ΦΦΦΦ • φ φ · φ φ φφφ φφφ • φ φφφ φ φ φ · · φ φ · • · φφφ ΦΦΦΦ φφ φφ ··«·· φφ φφφ stabilitou. Kromě bakteriostatického působení fenoly působí ve spojení s ionty zinku také jako fyzikálně chemické stabilizátory insulinu. Proto je výhodné, aby insulinové přípravky pro inhalaci byly připraveny s minimální koncentrací fenolu, nebo aby byl fenol nahrazen přijatelnější náhradou.

Podstata vynálezu

Definice

Zde používaný termín analog lidského insulinu (a podobné výrazy) znamená lidský insulin, ve kterém jedna nebo více aminokyselin byla vynechána a/nebo nahrazena jinými aminokyselinami, včetně nekódujících aminokyselin, nebo lidský insulin, který obsahuje další aminokyseliny, tzn. více než 51 aminokyselin.

Zde používaný termín derivát lidského insulinu (a podobné výrazy) znamená lidský insulin nebo jeho analog, ve kterém je na jednu nebo více aminokyselin navázán nejméně jeden organický substituent.

Zde používaný termín fenolická molekula znamená fenol nebo jeho libovolný derivát, jako je m-kresol nebo chlorkresol.

Stručný popis vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí koncentrovaných insulinových přípravků pro plicní podávání s přijatelnou fyzikální a chemickou stabilitou.

Tohoto předmětu se překvapivě dosahuje poskytnutím insulinového přípravku, ve kterém je koncentrace chloridu udržována nižší než 50 mM, a ve kterém je koncentrace dalších aniontů, jako fosfátu, minimální.

Předkládaný vynález se tedy týká vodného insulinového přípravku obsahujícího 3 až

20mM lidský insulin nebo jeho analog nebo derivát, méně než 50mM chlorid, méně než ÍOmM další anionty jiné než jsou chloridové nebo acetátové, 2 až 5 Zn²⁺ iontů připadajících na šest molekul insulinu a méně než 3 fenolické molekuly připadající na šest molekul insulinu.

Výhodná provedení ·· · • 9 99 • 9 ·· ·· ···· • · · · ·9 9 • · 9 · · · ··· · ·9 • · ··· · · · 9 9 9 99 • · ······· • 9 99 99 *·9 ·· 999

Insulinový přípravek podle předkládaného vynálezu obsahuje výhodně 3 až 15mM, výhodněji 4 až 15mM, ještě výhodněji 5 až 15mM, ještě výhodněji 6 až 15mM lidský insulin nebo jeho analog nebo derivát.

V daných výhodných provedeních přípravek podle vynálezu obsahuje 3mM, 6mM, 9mM, 12mM nebo 15mM lidský insulin nebo jeho analog nebo derivát.

Pokud se má insulinový přípravek podle vynálezu podávat z obalů na více dávek, je žádoucí konzervační působení, a přípravek proto výhodně obsahuje až 50mM fenolické molekuly. Překvapivě je však dostatečná stabilita získána při použití relativně nízké koncentrace fenolických molekul, jako je 3 až 12 fenolických molekul připadajících na šest molekul insulinu, výhodně 3 až 9 fenolických molekul připadajících na šest molekul insulinu. Nízká koncentrace fenolických molekul je použitelná v případě, že není potřebné žádné nebo pouze malé konzervační působení, jako například u obalů na jednu dávku. Další výhodou použití malého množství fenolických molekul je zvýšené pohodlí pro pacienta.

K zajištění optimální stability obsahuje insulinový přípravek podle vynálezu výhodně méně než 40mM, výhodněji méně než 30mM chlorid, ještě výhodněji 5 až 20mM chlorid.

V určitém provedení může insulin obsahovat malé množství fosfátového pufru, výhodně až do 5mM fosfátu.

Insulinové přípravky podle vynálezu, které obsahují 2 až 4 Zn²⁺ ionty, výhodně 2,2 až 3,2 Zn²⁺ ionty připadající na šest molekul insulinu, jsou velmi stabilní.

Vhodné jsou také insulinové přípravky podle vynálezu, které obsahují 3 až 5 Zn²⁺ iontů, výhodně 3,5 až 5 Zn²⁺ iontů připadajících na šest molekul insulinu.

K insulinovému přípravku podle vynálezu je překvapivě možné přidávat relativně vysoké koncentrace zwitteriontů jako je glycylglycin a glycin, aniž by se snížila rozpustnost insulinu. Glycylglycin působí jako pufr při neutrálním pH a svým mírným chelatačním působením na zinek dále zvyšuje rychlost rozpouštění insulinu se zinkem při neutrálním až bazickém pH. Glycylglycin také působí jako zachycovač reakcí na aminu během skladování. Ve výhodném provedení tedy insulinový přípravek podle vynálezu dále obsahuje 5 až 150mM zwitteriontový amin, výhodně glycylglycin nebo glycin.

·· ·· ·· ··· · ·· ···· ··· · · • · · · · · ··· · · • ······ · · · · ·

Ve výhodném provedení insulinový přípravek podle vynálezu dále obsahuje 5 až 50mM trishydroxymethylaminomethan, který působí jako pufr při neutrálním pH a jako zachycovač sloučenin reagujících s aminem.

V jiném výhodném provedení insulinový přípravek podle vynálezu obsahuje jako kationty sodné ionty. Sodný ion má nízký efekt vysolování.

V jiném výhodném provedení insulinový přípravek podle vynálezu obsahuje jako kationty ionty draselné nebo směs draselných a sodných iontů. Ionty draselné v koncentraci vyšší než je jejich 4 až 5mM koncentrace v plasmě zvyšují transport insulinu plícemi.

V jiném výhodném provedení se ionty draselné v koncentraci vyšší než 4 až 5mM používají ve spojení s mírným bronchodilatantem jako je menthol.

V jiném výhodném provedení insulinový přípravek podle vynálezu obsahuje 0,001 až 1 hmot.% neiontového surfaktantu, výhodně tween 20 nebo Polox 188. Neiontový detergent se přidává pro stabilizaci insulinu proti fíbrilaci během skladování a rozprašování.

V jiném výhodném provedení insulinový přípravek podle vynálezu pro další zvýšení biodostupnosti insulinu obsahuje 1 až lOmM aniontový surfaktant, výhodně taurocholát sodný.

Ve výhodném provedení je používaným insulinem lidský insulin.

V jiném výhodném provedení je používaným insulinem analog lidského insulinu, kde v poloze B28 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v poloze B29 je Lys nebo Pro; nebo des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30) lidský insulin.

Výhodné analogy lidského insulinu jsou ty, kde v poloze B28 je Asp nebo Lys a v poloze DO o D7Q doq

B29 je Lys nebo Pro, výhodně Asp lidský insulin nebo Lys Pro lidský insulin.

V jiném výhodném provedení je insulin vybírán ze skupiny rozpustných insulinových derivátů s dlouhotrvajícím účinkem jako jsou deriváty lidského insulinu s jedním nebo více lipofilními substituenty, výhodně acylované insuliny.

Insulinový derivát v tomto provedení je výhodně vybírán ze skupiny obsahující B29-N^£-myristoyl-des(B30) lidský insulin, B29-N^£-palmitoyl-des(B30) lidský insulin, B29-N^£-myristoyl lidský insulin, B29-N^£-palmitoyl lidský insulin, B28-N^£-myristoyl Lys^B28Pro^B29 lidský insulin, B28-N^ř:-palmitoyl Lys^B28Pro^B29 lidský insulin, B30-N^£-myristoyl Thr^B29Lys^B3° lidský insulin, B30-N^£-palmitoylThr^B29Lys^B3° lidský insulin, B29-N^f-(N-palmitoyl^y-glutamyl)-des(B30) lidský insulin, B29-N^£-(N-lithocholyl-y• · · ·

φ φ φ φ · · ♦

ΦΦΦ· · · ··· φ ······ · ·· φ φ φφφ φ φφ φφ ·· ·Φ·

-glutamyl)-des(B30) lidský insulin, B29-N®-(ro-karboxyheptadekanoyl)-des(B30) lidský insulin a B29-N^E-(ro-karboxyheptadekanoyl) lidský insulin.

Nej výhodnějším insulinovým derivátem je B29-N^E-myristoyl-des(B30) lidský insulin nebo B29-N⁶-(N-lithocholyl-y-glutamyl)-des(B30) lidský insulin.

Výše uvedené rozpustné insulinové deriváty s dlouhotrvajícím působením vážou albumin a byly navrženy pro konstantní basální dodávání insulinu (Markussen, Diabetologia 39, 281,

1996). Podkožní podávání jednou nebo dvakrát denně zajišťuje požadované basální dodávání insulinu, zatímco pro plicní podávání jsou doporučeny inhalace několikrát denně, výhodně ve spojení s jídlem.

Insulinové deriváty mají prodloužený náběh působení a mohou tak kompenzovat velmi rychlý nárůst insulinu v plasmě běžně spojovaný s plicním podáváním. Při pečlivém výběru typu insulinu předkládaný vynález umožňuje upravení časového rozvržení k získání žádaného insulinového profilu.

V určitém provedení předkládaného vynálezu obsahuje insulinový přípravek analog insulinu nebo lidský insulin stejně jako derivát insulinu.

Fenolické molekuly v insulinovém přípravku jsou výhodně vybírány ze skupiny obsahující fenol, m-kresol, chlorkresol, thymol nebo jejich směs.

Insulinový přípravek podle předkládaného vynálezu má výhodně hodnotu pH v rozmezí 7 až 8,5, výhodněji 7,4 až 7,9.

Následující příklady ilustrují předkládaný vynález, nejsou však příklady limitujícími.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Rozpuštěním 337 mg lidského insulinu zbaveného zinku ve 1237 μΐ vody a přídavkem

263 μΐ O,1M ZnCl₂ a 637 μΐ vody před úpravou pH 38 μΐ 0,2M NaOH a konečným doplněním vody na 2,5 ml, se připravilo 2,5 ml 21mM zásobního roztoku insulinu, specifický objem insulinu se počítal 0,7 μΙ/mg. Poté se připravil 15mM preparát přídavkem 350 μΐ 0,16M m-kresolu, 175 • · • · • · · · • · • · · · · · · ···· ···· ····· · · · • ······ · · · · · · ·· ··· · · · · ·· · · · · ··· · ♦ · · · μΐ 0,32Μ fenolu a soli nebo detergentu o koncentraci uvedené v Tabulce 1, naředil se médiem na 12, 9, 6, 3 a 0,6M a uchovával při 5 °C.

Příklad 2

Insulin obsahující zinek se dispergoval ve vodě (1:10) v ledové lázni, přidal se ekvivalent glycylglycinu (7/15) a hydroxid sodný (3,1 ekvivalent) a směs se pomalu míchala přes noc při 5 °C. Poté se přidal 0,1 ekvivalent chloridu zinečnatého a detergent, pH se upravilo 0,8 ekvivalenty chlorovodíkové kyseliny na hodnotu 7,5 a objem se upravil před přídavkem fenolu a vody a 15mM preparát se nakonec ředil médiem obsahujícím chlorid sodný, glycylglycin a detergent za vzniku 12mM, 9mM, 6mM a 3mM lidského insulinu (viz Tabulka 2 a 3).

Výsledky jsou shrnuty v Tabulce 1 až 3.

Údaje v Tabulce 1 ukazují, že i malé množství fosfátu (např. 5mM) snižuje stabilitu insulinu a náhrada chloridu sodného trihydroxymethylaminomethanhydrochloridem také snižuje rozpustnost insulinu. Oproti solím zvyšují zwitterionty glycylglycinu a glycinu rozpustnost insulinu; bylo možno přidávat nečekaně vysoké koncentrace zwitteriontů glycylglycinu a glycinu aniž by se zhoršil stabilizační efekt na insulin. Glycylglycin působí jako pufr při neutrálním pH a svým mírným chelatačním působením na zinek dále zvyšuje rychlost rozpouštění insulinu se zinkem při neutrálním až bazickém pH. Glycylglycin také působí jako zachycovač reakcí na aminu během skladování. Přídavek neiontových detergentů tween 20 a poloxamer 188 až do množství 1 hmot.% a 3mM aniontového detergentu taurocholátu sodného nesnížil stabilitu při skladování při 5 °C.

Tabulka 2 ukazuje vyhodnocení působení fenolické látky přidané ekvimolámě k insulinu. Tři fenolické molekuly zvyšují fyzikální stabilitu 6 až 15mM nebo více insulinu při nízké teplotě a při zvýšené teplotě 2 až 3x redukují tvorbu polymerů (při nízké koncentraci chloridu). V jiné sadě pokusů (viz Tabulka 3) se relativní množství fenolu a m-kresolu lišilo od 0 do 2 na insulin při rostoucí chemické stabilitě.

• · • ·

Příklad 3

B29-N⁶-(N-lithocholyl-y-glutamyl)-des(B30) lidský insulin (441 mg, 143 nmol/mg) se suspendoval v 5 ml vody při 0 °C a přidalo se 220 μΐ IN NaOH. Po rozpuštění analogu insulinu se přidalo 295 μΐ O,1M ZnCl₂ a roztok se míchal až do rozpuštění přechodně vzniklého precipitátu. Postupně se přidalo 315 μΐ 0,32mM fenolu a 98 μΐ 0,5M glycylglycinu a 70 μΐ 1% Tween 20, naměřila se hodnota pH 7,60. Nakonec se přidalo 693 μΐ vody a roztok se protlačil přes sterilní jednotku 0,22 pm Millex®-GV filtru za vzniku 7 ml 9mM B29-N⁶-(N-lithocholyl-y-glutamyl)-des(B30) lidského insulinu. Roztok zůstal po 3 měsíce při 5 °C stabilní.

Tabulka 1

Stabilita roztoků lidského insulinu při obvyklých koncentracích fenolu/kresolu (používaných v obalech na více dávek) je funkcí koncetrace soli, iontového náboje a koncentrace detergentu.

Excipient 0,5 Zn²⁺/insulin 16mM fenol a kresol pH 7,5 a přidáno (mM):	Fyzikální stabilita roztoku při 5 °C Maximální koncentrace bez precipitace po dobu 4 měsíců. Testovaly se roztoky 0,6, 3, 6, 9,12, respektive 15mM insulinu.
referentní (normální rozpuštění*)	3 až 6
referentní (nízká iontová síla)	12
NaCl 10	15
NaCl 20	12
NaCl 40	6
NaCl 60	<3

• ·

Excipient 0,5 Zn²⁺/insulin 16mM fenol a kresol pH 7,5 a přidáno (mM):	Fyzikální stabilita roztoku při 5 °C Maximální koncentrace bez precipitace po dobu 4 měsíců. Testovaly se roztoky 0,6, 3, 6, 9,12, respektive 15mM insulinu.
NaH₂PO₄5
+ NaCI 20	6
+ NaCI 25	6
+ NaCI 37,5	6
+ NaCl 50	6
glycylglycin 7	15
glycylglycin 12	15
glycylglycin 24	15
glycylglycin 48	15
glycylglycin 72	15
glycylglycin 96	15
glycylglycin 120	15
glycin 10	15
glycin 20	15
glycin 40	15
glycin 60	15
glycin 80	15
glycin 100	15
trishydroxymethylaminomethan**) 7	12
tris 12	9
tris 24	9

• · • · • · · · • · • · • · • · • ·

Excipient 0,5 Zn²⁺/insulin 16mM fenol a kresol pH 7,5 a přidáno (mM):	Fyzikální stabilita roztoku při 5 °C Maximální koncentrace bez precipitace po dobu 4 měsíců. Testovaly se roztoky 0,6, 3, 6, 9, 12, respektive 15mM insulinu.
tris 48	3
tween 20 0,05%	15
tween 20 0,2%	15
tween 20 1%	15
tween 20 5%	<3
Polox 188 0,2%	12
Polox 188 1%	12
taurocholát sodný 3	12
taurocholát sodný 15	9

přídavek Ιμΐ IN chlorovodíkové kyseliny na mg insulinu odpovídající 6 ekvivalentům chloridu ⁾ neutralizováno kyselinou chlorovodíkovou • · • · 4 · • ·

Tabulka 2

Stabilita lidského insulinu při ekvimolámích koncentracích fenolických konzervačních látek.

Excipient 0,5 Zn²⁺/insulin, NaCl 15mM, glycylglycin 7mM, tween 20 0,01%, pH 7,5 a ekvimolární:

Fyzikální stabilita roztoku při 5 Chemická stabilita při °C 37 °C Maximální stabilní koncentrace % polymeru / týden bez precipitace po dobu 3 měsí- 3 a 15mM insulin ců pro 3, 6,9, 12,15mM insulin.

kresol	15	0,55	0,56
fenol	15	0,37	0,39
chlorkresol	15	0,51	0,40
thymol	9	0,85	1,25
referentní	6	0,94	1,49

(bez fenolických látek) • · · · • ·

Tabulka 3

Stabilita lidského insulinu při různých koncentracích fenolických konzervačních látek.

Excipient 0,5 Zn²⁺/insulin, NaCI 15mM, glycylglycin 7mM, tween 20 0,01%, pH 7,5 a	Ekvivalent fenolické sloučeniny na molekulu insulinu	Chemická stabilita při 37 °C % polymeru / týden 3 a 9mM insulin
referentní	0	0,99	1,43
fenol	0,33	0,69	0,96
fenol	0,67	0,52	0,55
fenol	1	0,46	0,38
fenol	2 a 1,33	0,27	0,26
chlorkresol	0,33	0,66	0,93
chlorkresol	0,67	0,48	0,58
chlorkresol	1	0,30	0,30
chlorkresol	2 a 1,33	0,13	0,18

Průmyslová využitelnost

Předkládané koncentrované vodné insulinové přípravky jsou vhodné pro plicní podávání, pro pacienta pohodlnější a mají vysokou chemickou a fyzikální stabilitu. Pro tyto prostředky jsou charakteristické vysoké koncentrace insulinu, relativně nízké koncentrace fenolických molekul a nízká koncentrace aniontů.

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Vodný insulinový přípravek vyznačující se t í m, že obsahuje 3 až 20mM lidský insulin nebo jeho analog nebo derivát, méně než 50mM chlorid, méně než lOmM anionty jiné než jsou anionty chloridové nebo acetátové, 2 až 5 Zn²⁺ iontů připadajících na šest molekul insulinu a nejméně 3 fenolické molekuly připadající na šest molekul insulinu.
2. Insulinový přípravek podle nároku 1 v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje 3 až 15mM lidský insulin nebo jeho analog nebo derivát, výhodně 3mM, 6mM, 9mM, 12mM nebo 15mM lidský insulin nebo jeho analog nebo derivát.
3. Insulinový přípravek podle nároku 2 vy zn a č u j í c í se t í m, že obsahuje 4 až 15mM, výhodně 5 až 15mM, výhodněji 6 až 15mM lidský insulin nebo jeho analog nebo derivát.
4. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 3 v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje až 50mM fenolické molekuly, výhodně 3 až 12 fenolických molekul připadajících na šest molekul insulinu, výhodněji 3 až 9 fenolických molekul připadajících na šest molekul insulinu.
5. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4 v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje méně než 40mM, výhodně méně než 30mM chlorid, výhodněji 5 až 20mM chlorid.
6. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5 v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje až 5mM fosfát.
7. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků lažóvyznačující se t í m, že obsahuje 2 až 4 Zn²⁺ ionty, výhodně 2,2 až 3,2 Zn²⁺ ionty připadající na šest molekul insulinu.

• · • ·
8. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 7 v y z n a č u j í c í se t í m, že dále obsahuje 5 až 150mM zwitteriontový amin, výhodně glycylglycin nebo glycin.
9. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 8 v y z n a č u j í c í se t í m, že dále obsahuje 5 až 50mM trishydroxymethylaminomethan.
10. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 9 v y z n a č u j í c í se t í m, že jako kationty obsahuje sodné ionty, draselné ionty nebo jejich směs.
11. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků lažlOvyznačující se t í m, že dále obsahuje 0,001 až 1 hmot.% neiontového surfaktantu, výhodně tween 20 nebo Polox 188.
12. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 11 v y z n a č u j í c í se t í m, že dále obsahuje 1 až lOmM aniontový surfaktant, výhodně taurocholát sodný.
13. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků laž 12 vyznačující se t í m, že obsahuje lidský insulin.
14. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 13 v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje analog lidského insulinu, kde v poloze B28 je Asp, Lys, Leu, Val nebo Ala a v poloze B29 je Lys nebo Pro; nebo des(B28-B30), des(B27) nebo des(B30) lidský insulin.
15. Insulinový přípravek podle nároku 14 vy zn a č u j í c í se t í m, že obsahuje analog lidského insulinu, kde v poloze B28 je Asp nebo Lys a v poloze B29 je Lys nebo Pro, výhodně Asp^B28 lidský insulin nebo Lys^B28Pro^B29 lidský insulin.

9 9 9 9 9

9 9

9 9 9 9 •9

9·

99 99 «9

9 0
16. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 12 v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje derivát lidského insulinu mající jeden nebo více lipofilních substituentů, výhodně acylovaný insulin.
17. Insulinový přípravek podle nároku 16 v y z n a č u j í c í se t í m, že insulinový derivát je vybírán ze skupiny obsahující B29-N^e-myristoyl-des(B30) lidský insulin, B29-N⁶-palmitoyl-des(B30) lidský insulin, B29-N^E-myristoyl lidský insulin, B29-N^E-palmitoyl lidský insulin, B28-N^E-myristoyl Lys^B28Pro^B29 lidský insulin, B28-N^E-palmitoyl Lys^B28Pro^B29 lidský insulin, B30-N^E-myristoyl Thr^B29Lys^B30 lidský insulin, B30-N^E-palmitoyl Thr^B29Lys^B30 lidský insulin, B29-N^£-(N-palmitoyl-y-glutamyl)-des(B30) lidský insulin, B29-N^E-(N-lithocholyl-y-glutamyl)-des(B30) lidský insulin, B29-N^E-(ro-karboxyheptadekanoyl)-des(B30) lidský insulin a B29-N^E-(co-karboxyheptadekanoyl) lidský insulin.
18. Insulinový přípravek podle nároku 17 v y z n a č u j í c í se t í m, že insulinový derivát je B29-N^E-myristoyl-des(B30) lidský insulin nebo B29-N^E-(N-lithocholyl-y-glutamyl)-des(B30) lidský insulin.
19. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 18 v y z n a č u j í c í se t í m, že obsahuje analog insulinu nebo lidský insulin stejně jako derivát insulinu.
20. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 19 v y z n a č u j í c í se t í m, že fenolické molekuly jsou vybírány ze skupiny obsahující fenol, m-kresol, chlorkresol, thymol nebo jejich libovolnou směs.
21. Insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 20 v y z n a č u j í c í se t í m, že hodnota pH je v rozmezí 7 až 8,5, výhodně 7,4 až 7,9.
22. Způsob léčby diabetů typu I nebo typu II v y zn a č uj í c í se t í m, že se pacientovi s potřebou takové léčby podává insulinový přípravek podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 21.
23. Způsob léčby diabetů typu I nebo typu II podle nároku 22 v y z n a č u j í c í se tím, že se insulin podává ve spojení s jídly.