CZ20004016A3

CZ20004016A3 - The human BMP-4 promoter and method for investigating bone-modifying substances using this promoter

Info

Publication number: CZ20004016A3
Application number: CZ20004016A
Authority: CZ
Inventors: Shinji Kawai; Takeyuki Sugiura
Original assignee: Hoechst Marion Roussel Inc
Priority date: 1999-04-22
Filing date: 1999-04-22
Publication date: 2001-05-16

Abstract

Způsob pro výzkum sloučenin s nízkou molekulovou hmotností, které pozitivně nebo negativně regulují expresi lidského BMP-4, který využívá aktivity reporterového genu a regionu 5'- předcházejícího genu, který obsahuje BMP-4 promotor a dále za použití zvířecích buněk, do kterých byl vložen rekombinantní expresní vektor spojený s vhodným reportérovým genem. Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a jejich deriváty získané tímto způsobem mají morfogenetickou aktivitu a inhibiční aktivitu pro kost a chrupavku, které je způsobena prostřednictvím exprese lidského BMP-4, tyto sloučeniny jsou dále užitečné jako profylaktická nebo terapeutická činidla pro onemocnění kostí nebo chrupavekA method for screening for low molecular weight compounds that positively or negatively regulate the expression of human BMP-4, which utilizes the activities of a reporter gene and a 5' upstream region containing the BMP-4 promoter and further using animal cells into which a recombinant expression vector linked to a suitable reporter gene has been introduced. The low molecular weight compounds and their derivatives obtained in this manner have morphogenetic activity and inhibitory activity for bone and cartilage, which is caused by the expression of human BMP-4, these compounds are further useful as prophylactic or therapeutic agents for bone or cartilage diseases

Description

Oblast technikyTechnical area

Předkládaný vynález se týká regionu 5'-předcházejícího DNA lidského kostního morfogenetického proteinu (BMP, dále -4), který obsahuje promotor. Dále se předkládaný vynález týká způsobu pro výzkum sloučenin s nízkou molekulovou hmotností, které pozitivně nebo negativně regulují expresi lidského BMP-4 pomocí zvířecích nebo kvasinkových buněk, do kterých je vložen 5¹-předcházející region DNA obsahující lidský BMP-4 promotor a rekombinantní expresní vektor integrovaný do vhodného reporterového genu, a použití reportérové aktivity jako indikátoru.The present invention relates to a 5'-preceding DNA region of human bone morphogenetic protein (BMP, hereinafter -4) which contains a promoter. Furthermore, the present invention relates to a method for screening for low molecular weight compounds which positively or negatively regulate the expression of human BMP-4 using animal or yeast cells into which a ^5' -preceding DNA region containing a human BMP-4 promoter and a recombinant expression vector integrated into a suitable reporter gene are inserted, and using the reporter activity as an indicator.

Dosavadní stav technikyState of the art

V současnosti je kostní morfogenetická aktivita popisována pro kostní morfogenetický faktor, BMP, který náleží do TGF (transformující růstový faktor) β superrodiny (Science 150: 893-897, 1965; Science 242: 1528-1534, 1988). Známými druhy BMP jsou BMP-1 až BMP-14. Je známo, že BMP-2 až BMP-14 mají kostní morfogenetickou aktivitu. BMP-2 až BMP-14 jsou považovány za účinné pro terapeutickou a preventivní léčbu různých kostních dysfunkcí a onemocnění kostí, nicméně, za přirozených okolností se vyskytují ve velmi malých množstvích. Proto vyžadují velká množství BMP-2 až BMP-14 používaná pro tuto léčbu produkci rekombinantního proteinu. Produkce rekombinantního proteinu je obvykle velmi nákladná ve srovnání s produkcí sloučenin s nízkou molekulovou hmotností. Na druhou stranu, existuje mnoho omezení při jejich použití jako léčiv, která jsou určována jejich fyzikálními vlastnostmi a způsobem • » • · podáním, které jsou dány jejich proteinovým charakterem. Z těchto důvodů jsou organické sloučeniny s malou molekulou, které mají stejnou aktivitu jako uvedené BMP proteiny, velmi slibnými léčivy. Substance získaná za použití způsobu podle předkládaného vynálezu je aktivní v indukci exprese lidského BMP-4, kostního morfogenetického proteinu, a také má stejnou aktivitu jako lidský BMP-4, jehož použití je velmi užitečné. Naopak, existují zprávy (New Engl. J. Med., svazek 335, str. 555-561, 1996), které naznačují, že lidský BMP-4 způsobuje hyperplasii kosti a chrupavky. V tomto případě může inhibice exprese lidského BMP-4 zabránit osteohyperplasii. Předkládaný vynález umožňuje detekci inhibice exprese lidského BMP-4 a poskytuje způsob pro výzkum substancí, které brání takové hyperplasii.Currently, bone morphogenetic activity has been described for bone morphogenetic factor, BMP, which belongs to the TGF (transforming growth factor) β superfamily (Science 150: 893-897, 1965; Science 242: 1528-1534, 1988). Known BMPs are BMP-1 to BMP-14. BMP-2 to BMP-14 are known to have bone morphogenetic activity. BMP-2 to BMP-14 are considered effective for the therapeutic and preventive treatment of various bone dysfunctions and bone diseases, however, they occur in very small amounts under natural circumstances. Therefore, large amounts of BMP-2 to BMP-14 used for this treatment require the production of recombinant protein. The production of recombinant protein is usually very expensive compared to the production of low molecular weight compounds. On the other hand, there are many limitations in their use as drugs, which are determined by their physical properties and the route of administration, which are given by their protein nature. For these reasons, small molecule organic compounds having the same activity as the said BMP proteins are very promising drugs. The substance obtained by using the method of the present invention is active in inducing the expression of human BMP-4, a bone morphogenetic protein, and also has the same activity as human BMP-4, the use of which is very useful. On the contrary, there are reports (New Engl. J. Med., vol. 335, pp. 555-561, 1996) which indicate that human BMP-4 causes hyperplasia of bone and cartilage. In this case, inhibition of the expression of human BMP-4 can prevent osteohyperplasia. The present invention enables the detection of inhibition of the expression of human BMP-4 and provides a method for the investigation of substances which prevent such hyperplasia.

Pro takový způsob výzkumu byl popsán pouze příklad využívající myšího BMP-2 promotoru (WO 97/15308); neexistuje příklad použití lidského BMP-4 promotoru. Region myšího BMP-4 promotoru byl již klonován (Biochem. Biophys. Acta, svazek 1218, str. 221-224, 1994), ale nebyla podrobně popsána sekvence lidského BMP-4 promotoru. Předkládaný vynález poprvé popisuje sekvenci lidského BMP-4 promotoru. Bylo zjištěno, že homologie celé sekvence 5'-předcházejícího regionu DNA mezi lidským a myším BMP-4 (J. Biol. Chem., svazek 270, str. 2836428373, 1995) je 52,2%. Materiály pro způsob výzkumu podle předkládaného vynálezu jsou všechny získány z lidských zdrojů, takže substance získané v takovém výzkumu budou mít klinické využití. Očekává se získání substance schopné přesnější regulace exprese lidského BMP-4, pomocí transfekce dvou promotorů (promotoru-1 a promotoru-2), samostatně nebo simultánně, v rekombinantním expresním vektoru, do hostitelských buněk.For such a research method, only an example using the mouse BMP-2 promoter has been described (WO 97/15308); there is no example using the human BMP-4 promoter. The mouse BMP-4 promoter region has already been cloned (Biochem. Biophys. Acta, vol. 1218, pp. 221-224, 1994), but the sequence of the human BMP-4 promoter has not been described in detail. The present invention describes the sequence of the human BMP-4 promoter for the first time. It has been found that the homology of the entire sequence of the 5'-preceding DNA region between human and mouse BMP-4 (J. Biol. Chem., vol. 270, pp. 2836428373, 1995) is 52.2%. The materials for the research method according to the present invention are all obtained from human sources, so that the substances obtained in such research will have clinical use. It is expected to obtain a substance capable of more precise regulation of human BMP-4 expression by transfecting two promoters (promoter-1 and promoter-2), separately or simultaneously, in a recombinant expression vector, into host cells.

• ·• ·

Podstata vynálezuThe essence of the invention

Předkládaný vynález poskytuje 5'-předcházející region DNA obsahující promotor lidského BMP-4. Pomocí použití 5'předcházejícího regionu genu obsahujícího lidský BMP-4 promotor a zvířecích buněk, do kterých byl vložen rekombinantní expresní vektor, který byl integrován s vhodným reportérovým genem, mohou být zkoumány sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, které pozitivně nebo negativně regulují expresi lidského BMP-4, pomocí reportérové aktivity.The present invention provides a 5'-preceding DNA region containing the human BMP-4 promoter. By using the 5'-preceding region of a gene containing the human BMP-4 promoter and animal cells into which a recombinant expression vector has been inserted that has been integrated with a suitable reporter gene, low molecular weight compounds that positively or negatively regulate the expression of human BMP-4 can be screened by means of reporter activity.

Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností a jejich deriváty mají morfogenetickou aktivitu a inhibiční aktivitu pro kost a chrupavku způsobenou prostřednictvím exprese lidského BMP-4 a jsou užitečné jako preventivní nebo terapeutická činidla pro onemocnění kosti nebo chrupavky, jako léky při metastasách do kostí, nebo jako terapeutická nebo profylaktické činidla při osteohyperplasii.The low molecular weight compounds and their derivatives have morphogenetic activity and inhibitory activity for bone and cartilage caused by expression of human BMP-4 and are useful as preventive or therapeutic agents for bone or cartilage diseases, as drugs for bone metastases, or as therapeutic or prophylactic agents for osteohyperplasia.

Popis obrázků na připojených výkresechDescription of images in the attached drawings

Obr. 1 je exonová-intronová struktura 6,7 kb regionu 5'předcházejícího lidskému BMP-4 genu a mapa míst pro restrikční enzymy.Fig. 1 is an exon-intron structure of the 6.7 kb region 5' upstream of the human BMP-4 gene and a map of restriction enzyme sites.

Obr. 2 je rekombinantní expresní vektor (pMSS116) obsahující promotor 1 5'-předcházejícího regionu lidského BMP-4 genu. Region promotoru 1 (baze č. 1 až 3361 SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí, od 5' konce do Xhol uvedenému na obr. 1) byl insertován do Nhel a Xhol restrikčních míst pGL3-basic vektoru.Fig. 2 is a recombinant expression vector (pMSS116) containing the promoter 1 5'-preceding region of the human BMP-4 gene. The promoter 1 region (bases 1 to 3361 of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, from the 5' end to the XhoI shown in Fig. 1) was inserted into the NheI and XhoI restriction sites of the pGL3-basic vector.

Obr. 3 je rekombinantní expresní vektor (pMSS118) obsahující promotor 2 5¹-předcházejícího regionu lidského BMP-4 genu.Fig. 3 is a recombinant expression vector (pMSS118) containing the promoter 2 5 ¹ -preceding region of the human BMP-4 gene.

Region promotoru 2 (2,3 kb) (baze č. 3361 až 5645 SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí, od Xhol do BglII exonu 2, jak je uvedeno na obr. 1) byl insertován do Xhol a BglII restrikčních míst pGL3-basic vektoru.Promoter region 2 (2.3 kb) (bases 3361 to 5645 of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, from XhoI to BglII of exon 2, as shown in Fig. 1) was inserted into the XhoI and BglII restriction sites of the pGL3-basic vector.

Obr. 4 je rekombinantní expresní vektor (pMSS119) obsahující promotor 1 a promotor 2 5'-předcházejícího regionu lidského BMP-4 genu. Promotor 1 a promotor 2 (baze č. 1 až 5645 SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí, od 5’ konce do BglII místa exonu 2, jak je uvedeno na obr. 1) byly insertovány do Nhel a BglII restrikčních míst pGL3-basic vektoru.Fig. 4 is a recombinant expression vector (pMSS119) containing promoter 1 and promoter 2 of the 5'-preceding region of the human BMP-4 gene. Promoter 1 and promoter 2 (bases 1 to 5645 of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, from the 5' end to the BglII site of exon 2, as shown in Fig. 1) were inserted into the NheI and BglII restriction sites of the pGL3-basic vector.

Obr. 5 ukazuje výsledky měření aktivity lidského BMP-4 promotoru (přechodné exprese).Fig. 5 shows the results of measuring the activity of the human BMP-4 promoter (transient expression).

Předkládaný vynález se týká DNA, jejíž nukleotidová sekvence je representována bázemi 1 až 6774 SEQ ID NO: 1 v Seznamu sekvencí, která kóduje promotorový region lidského kostního morfogenetického proteinu 4, nebo jejího fragmentu. SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí ukazuje sekvenci 5’předcházejícího regionu lidského BMP-4 genu.The present invention relates to a DNA whose nucleotide sequence is represented by bases 1 to 6774 of SEQ ID NO: 1 in the Sequence Listing, which encodes the promoter region of human bone morphogenetic protein 4, or a fragment thereof. SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing shows the sequence of the 5' upstream region of the human BMP-4 gene.

Předkládaný vynález se týká způsobu přípravy DNA podle SEQ ID NO: 1 pomocí následujících kroků:The present invention relates to a method for preparing DNA according to SEQ ID NO: 1 by the following steps:

(1) trávení lidské placentám! genomové DNA restrikčním enzymem EcoRI;(1) digestion of human placental genomic DNA with the restriction enzyme EcoRI;

(2) izolace elektroforesou na agarosovém gelu;(2) isolation by agarose gel electrophoresis;

(3) klonování izolovaného DNA fragmentu tráveného EcoRI do lambda fágového vektoru ÁDASH II zpracovaného stejným enzymem;(3) cloning the isolated EcoRI digested DNA fragment into the lambda phage vector ÁDASH II treated with the same enzyme;

(4) zabalení uvedeného vektoru do fágu;(4) packaging said vector into phage;

(5) vytvoření knihovny genomové DNA pomocí infekce Escherichia coli fágem;(5) creation of a genomic DNA library by phage infection of Escherichia coli;

* ** *

(6) vyšetřování PCR; a (7) subklonování do plasmidového vektoru.(6) PCR investigation; and (7) subcloning into a plasmid vector.

Použitý plasmidový vektor není přesně určen a může být použit jeden z komerčně dostupných vektorů. Výhodným příkladem je pUC18 vektor.The plasmid vector used is not specifically specified and one of the commercially available vectors may be used. A preferred example is the pUC18 vector.

Předkládaný vynález se týká rekombinantního expresního vektor charakterizovaného integrací úplné nebo částečné DNA uvedené v SEQ ID NO: 1 do reporterového genu. Přesněji, rekombinantní expresní vektor je připraven umístěním vhodného regionu z regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP-4 genu, jak je uvedeno v SEQ ID NO: 1, před reporterový gen. Reporterový gen, jako je gen pro luciferasu nebo β-galaktosidasu, ukazuje stav exprese na svém původním produktu. Původní vektor pro rekombinantní expresní vektor není přesně určen a může být použit komerční plasmidový vektor. Výhodným původním vektorem pro použití v předkládaném vynálezu je pGL3. Při použití pGL3 se získá pMSS116 (8,2 kb), pMSS118 (7,1 kb) a pMSS119 (10,5 kb), což jsou rekombinantní expresní vektory obsahující lidský BMP-4i promotor a luciferasový reporterový gen.Předkládaný vynález je označuje jako rekombinantní expresní vektory. Je nutné vkládat rekombinantní expresní vektor do savčích buněk, výhodně lidských osteoblastových buněk, jako jsou SaOS-2 buňky, s liposomy. Zvířecí buňky stabilně transfektované rekombinantními expresními vektory jsou selektovány pomocí markérů resistence.The present invention relates to a recombinant expression vector characterized by the integration of all or part of the DNA set forth in SEQ ID NO: 1 into a reporter gene. More specifically, the recombinant expression vector is prepared by placing an appropriate region from the 5'-preceding region of the human BMP-4 gene as set forth in SEQ ID NO: 1 in front of the reporter gene. The reporter gene, such as the luciferase or β-galactosidase gene, indicates the expression status of its original product. The original vector for the recombinant expression vector is not specifically specified, and a commercial plasmid vector may be used. A preferred original vector for use in the present invention is pGL3. Using pGL3, pMSS116 (8.2 kb), pMSS118 (7.1 kb) and pMSS119 (10.5 kb) are obtained, which are recombinant expression vectors containing the human BMP-4i promoter and the luciferase reporter gene. The present invention refers to them as recombinant expression vectors. It is necessary to introduce the recombinant expression vector into mammalian cells, preferably human osteoblast cells such as SaOS-2 cells, with liposomes. Animal cells stably transfected with the recombinant expression vectors are selected using resistance markers.

Předkládaný vynález se týká způsobu pro výzkum substancí ovlivňujících kosti, při kterém je využito rekombinantního expresního vektor charakterizovaného integrací úplné nebo částečné DNA uvedené v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí do reporterového genu. Dále se týká způsobu pro výzkum substancí • fc ovlivňujících kosti, ve kterém je uvedenou substancí ovlivňující kosti substance indukující osteogenesi nebo substance inhibující osteogenesi. Sloučeniny s nízkou molekulovou hmotností, které indukují nebo inhibují expresi lidského BMP-4, mohou být získány izolací promotoru, který reguluje expresi genu, jeho navázáním s vhodným reportérovým genem a vložením genové struktury do vhodných savčích buněk, za zisku testovacího systému. Substance, které regulují expresi lidského BMP-4 v testovacím systému působí na promotor a zvyšují nebo snižují expresi reporterového genu. Tak umožňuje jednoduché a snadné měření aktivity reporterového genu vyšetřování uvedených substancí.The present invention relates to a method for researching substances affecting bones, in which a recombinant expression vector characterized by the integration of the complete or partial DNA shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing into a reporter gene is used. It further relates to a method for researching substances affecting bones, in which said substance affecting bones is an osteogenesis-inducing substance or an osteogenesis-inhibiting substance. Low molecular weight compounds that induce or inhibit the expression of human BMP-4 can be obtained by isolating a promoter that regulates the expression of the gene, linking it to a suitable reporter gene and introducing the gene structure into suitable mammalian cells, thereby obtaining a test system. Substances that regulate the expression of human BMP-4 in the test system act on the promoter and increase or decrease the expression of the reporter gene. Thus, simple and easy measurement of the activity of the reporter gene allows the investigation of said substances.

Zvířecí buňky transfektované uvedenými vektory mohou být použity pro testování knihovny chemických sloučenin pomocí vysocevýkoného vyhledávání (Nátuře, svazek 384, Suppl., str. 14-16, 1996) a pro testování aktivních substancí z přirozených substancí. Substance zvyšující nebo snižující aktivitu je vybrána pomocí působení této substance na buňky po určitou dobu a potom pomocí měření aktivity reporterového genu. Takto získaná substance může regulovat expresi buď tak, že působí přímo na transkripční faktor, nebo nepřímo na lidský BMP-4 promotor prostřednictvím regulace systému přenosu signálu. Proto jsou tyto sloučeniny účinné jako terapeutická činidla pro onemocnění kostí a chrupavek, nádorové metastasy do kostí nebo osteohyperplasii.Animal cells transfected with the vectors can be used to screen a library of chemical compounds by high-throughput screening (Nature, vol. 384, Suppl., pp. 14-16, 1996) and to screen active substances from natural substances. A substance increasing or decreasing activity is selected by treating the cells with this substance for a certain period of time and then measuring the activity of a reporter gene. The substance thus obtained can regulate expression either by acting directly on the transcription factor or indirectly on the human BMP-4 promoter by regulating the signal transduction system. Therefore, these compounds are effective as therapeutic agents for bone and cartilage diseases, tumor metastasis to bone or osteohyperplasia.

Substance získaná způsobem podle předkládaného vynálezu má morfogenetickou aktivitu na chrupavku či kost a je účinná jako terapeutické nebo profylaktické činidlo v oboru ortopedické chirurgie (při onemocněních jako jsou fraktury, osteoarthritida, jako je kloubní osteoartritida a osteoartritida kyčelního kloubu, arthrosteitis, poškozeníThe substance obtained by the method of the present invention has morphogenetic activity on cartilage or bone and is effective as a therapeutic or prophylactic agent in the field of orthopedic surgery (in diseases such as fractures, osteoarthritis, such as articular osteoarthritis and osteoarthritis of the hip joint, arthrosteitis, damage

ΊΊ

chrupavek, jako je poškození menisku, regenerace kosti a deficit chrupavek způsobený poraněním nebo dissekcí nádoru, kostní rekonstrukce jako je spinální fúze a zvětšení páteřního kanálu, a vrozená onemocnění kostí a chrupavek, jako je dysosteogenesa a achondroplasie), nebo v oboru zubního lékařství (při rekonstrukcích kosti jako je například palatoschisa, rekonstrukce mandibuly a konstrukce reziduálního oblouku) a v oblasti léčby osteoporosy. Dále mohou být substance podle předkládaného vynálezu použity při kostních štěpech v plastické chirurgii. Tyto substance jsou také účinné při terapii v oblasti veterinárního lékařství. Na druhou stranu, předkládaný vynález může poskytnout substance, které inhibují morfogenesi kosti nebo chrupavky. V tomto případě jsou takové substance použity jako činidla pro prevenci nebo terapii hyperplasie kosti nebo chrupavky.cartilage, such as meniscal damage, bone regeneration and cartilage deficiency caused by injury or tumor dissection, bone reconstruction such as spinal fusion and spinal canal enlargement, and congenital bone and cartilage diseases such as dysosteogenesis and achondroplasia), or in the field of dentistry (in bone reconstructions such as cleft palate, mandibular reconstruction and residual arch construction) and in the field of osteoporosis treatment. Furthermore, the substances of the present invention can be used in bone grafts in plastic surgery. These substances are also effective in therapy in the field of veterinary medicine. On the other hand, the present invention can provide substances that inhibit bone or cartilage morphogenesis. In this case, such substances are used as agents for the prevention or therapy of bone or cartilage hyperplasia.

Příklady provedení vynálezuExamples of embodiments of the invention

Předkládaný vynález bude nyní dokreslen v následujících příkladech. Tyto příklady jsou ve všech ohledech pouze ilustrativní a nijak neomezují rozsa předkládaného vynálezu.The present invention will now be further illustrated by the following examples. These examples are in all respects illustrative only and are not intended to limit the scope of the present invention.

Příklad 1: Izolace regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP-4 genuExample 1: Isolation of the 5'-preceding region of the human BMP-4 gene

Lidská placentární genomová DNA (CloneTech) byla trávena různými restrikčními enzymy (BamHI, BglII, EcoRI, HindlII, Pstl, Sací, Sáli, Smál, SPhl a Xbal), byla separována elektroforesou na agarosovém gelu, přenesena na nylonovou membránu a zpracována southernovou hybridizací za standardních podmínek za použití BMP-4 cDNA (Science 242: 1528-1534) jako sondy. Bylo zjištěno, že trávení restrikčním enzymem EcoRI spolu s dalšími restrikčními enzymy vedlo k zisku DNA * · fragmentu velikosti přibližně 7 kb, který obsahoval nejdelši lidský BMP-4 gen. Potom byla lidská placentám! genomová DNA trávena restrikčnim enzymem EcoRI a byla separována elektroforesou na agarosovém gelu pro extrakci DNA fragmentu velikosti přibližně 7 kb z agarosového gelu. Získaný DNA fragment byl klonován do lambda fágového vektoru ÁDASH II (Stratagene Ltd.) tráveného restrikčnim enzymem EcoRI. Vektor byl in vitro zpracován Gigapack III XL extraktem (Stratagene Ltd.), byl použit pro infekci Escherichia coli XLl-Blue MRA (Stratagene Ltd.) za vzniku knihovny genomové DNA. Knihovna byla rozdělena do několika souborů. Každý soubor byl amplifikován skríningem (Nucleic Acids Research 21: 2627-2631, 1993) za použití PCR; přesněji, PCR využívající PCR primery (SEQ ID NO: 2 a SEQ ID NO: 3 Seznamu sekvencí) odpovídající regionu exonu 1 pro selekci požadovaného souboru, za zisku regionu (6,8 kb) 5'-předcházejícího lidskému BMP-4 genu. Potom byl 5'-předcházející 6,8 kb fragment subklonován do pUC18 vektoru (Amersham Pharmacia Biotech.). Vektor byl označen E. coli pKOT 312. E. coli pKOT 312 byl uložen v National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 1-3, Hígashi 1-chome, Tsukuba-shi Ibarakiken 305-8566 Japan, 30.3.1998, pod přírůstkovým číslem FERM P16736 a byl přenesen do International Depository Authority podle Budapešťské smlouvy 17.2.1998 (přírůstkové č. FERM BP6650) .Human placental genomic DNA (CloneTech) was digested with various restriction enzymes (BamHI, BglII, EcoRI, HindIII, PstI, SacI, SalI, Smal, SPhl and XbaI), separated by agarose gel electrophoresis, transferred to a nylon membrane and processed by Southern hybridization under standard conditions using BMP-4 cDNA (Science 242: 1528-1534) as a probe. It was found that digestion with the restriction enzyme EcoRI together with other restriction enzymes resulted in the recovery of a DNA fragment of approximately 7 kb in size, which contained the longest human BMP-4 gene. Then, the human placental genomic DNA was digested with the restriction enzyme EcoRI and separated by agarose gel electrophoresis to extract a DNA fragment of approximately 7 kb in size from the agarose gel. The obtained DNA fragment was cloned into the lambda phage vector ÁDASH II (Stratagene Ltd.) digested with the restriction enzyme EcoRI. The vector was processed in vitro with Gigapack III XL extract (Stratagene Ltd.), was used to infect Escherichia coli XL1-Blue MRA (Stratagene Ltd.) to form a genomic DNA library. The library was divided into several pools. Each pool was amplified by screening (Nucleic Acids Research 21: 2627-2631, 1993) using PCR; more specifically, PCR using PCR primers (SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 of the Sequence Listing) corresponding to the exon 1 region to select the desired pool, obtaining a region (6.8 kb) 5'-preceding the human BMP-4 gene. Then, the 5'-preceding 6.8 kb fragment was subcloned into the pUC18 vector (Amersham Pharmacia Biotech.). The vector was designated E. coli pKOT 312. E. coli pKOT 312 was deposited at the National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry 1-3, Hígashi 1-chome, Tsukuba-shi Ibarakiken 305-8566 Japan, 30.3.1998, under accession number FERM P16736 and was transferred to the International Depository Authority under the Budapest Treaty on 17.2.1998 (accession number FERM BP6650).

Příklad 2: Stanovení DNA sekvence regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP-4 genuExample 2: Determination of the DNA sequence of the 5'-preceding region of the human BMP-4 gene

Sekvence získaného regionu 5'-předcházejícího lidskému BMP4 genu byla stanovena pomocí ALF DNA sekvenátoru (Amersham Pharmacia Biotech), způsobem podle Sanger et al. (Proč. Nati.The sequence of the obtained 5'-preceding region of the human BMP4 gene was determined using an ALF DNA sequencer (Amersham Pharmacia Biotech), according to the method of Sanger et al. (Proc. Nat.

• 4 • ·• 4 • ·

Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977). Takto analyzovaná sekvence je uvedena v SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí.Acad. Sci. USA 74: 5463-5467, 1977). The sequence thus analyzed is set forth in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing.

Příklad 3: Konstrukce rekombinantního expresního vektoru obsahujícího lidský BMP-4 promotor a luciferasový reporterový genExample 3: Construction of a recombinant expression vector containing the human BMP-4 promoter and a luciferase reporter gene

Jak je uvedeno na obr. 4, má lidský BMP-4 dva promotory před exonem 1 (promotor-1) a po exonu 2 (promotor-2), což je podobné jako struktura promotorů v myším BMP-4. Region obsahující promotor-1 (od 5'-konce do Xbal místa, jak je uvedeno na obr. 1) byl insertován do předních míst pro restrikční enzymy, Nhel a Xhol, reporterového genu luciferasového reporterového vektoru pGL3-basic (Pro Mega Ltd.) za použití Xbal restrikčního místa odvozeného z pUC18 vektoru přítomného na 5'-konci, za zisku rekombinantního expresního vektoru pMSS116 (8,2 kb). Tento vektor je uveden na obr. 2. Rekombinantní expresní vektor pMSS118 (7,1 kb) byl získán insercí regionu (od Xhol do BglII v exonu 2, jak je popsáno na obr. 1) obsahujícího promotor-2 do Xhol a BglII restrikčních míst vektoru pGL3-basic. Tento vektor je uveden na obr. 3. Dále byl region (od 5'-konce do BglII v exonu 2, jak je popsáno na obr. 1) obsahujícího jak promotor-1, tak promotor-2, insertován do nhel a BglII restrikčních míst vektoru pGL3-basic za použití Xbal místa odvozeného od pUCl8 vektoru, stejně jako v případě pMSSH6, za zisku rekombinantního expresního vektoru pMSS119 (10,5 kb). Tento vektor je uveden na obr. 4.As shown in Fig. 4, human BMP-4 has two promoters upstream of exon 1 (promoter-1) and downstream of exon 2 (promoter-2), which is similar to the promoter structure in mouse BMP-4. The region containing promoter-1 (from the 5'-end to the XbaI site, as shown in Fig. 1) was inserted into the upstream restriction enzyme sites, NheI and XhoI, of the reporter gene of the luciferase reporter vector pGL3-basic (Pro Mega Ltd.) using the XbaI restriction site derived from the pUC18 vector present at the 5'-end, to obtain the recombinant expression vector pMSS116 (8.2 kb). This vector is shown in Fig. 2. The recombinant expression vector pMSS118 (7.1 kb) was obtained by inserting the region (from XhoI to BglII in exon 2, as described in Fig. 1) containing promoter-2 into the XhoI and BglII restriction sites of the vector pGL3-basic. This vector is shown in Fig. 3. Furthermore, the region (from the 5'-end to BglII in exon 2, as described in Fig. 1) containing both promoter-1 and promoter-2 was inserted into the nheI and BglII restriction sites of the vector pGL3-basic using the XbaI site derived from the pUCl8 vector, as in the case of pMSSH6, to obtain the recombinant expression vector pMSS119 (10.5 kb). This vector is shown in Fig. 4.

Příklad 4: Měření aktivity lidského BMP-4 promotoru (vložení rekombinantního expresního vektoru do lidských buněk a přechodná exprese) .Example 4: Measurement of human BMP-4 promoter activity (insertion of recombinant expression vector into human cells and transient expression).

Pro přechodnou expresi lidského BMP-4 rekombinantního expresního vektoru byly výše uvedené rekombinantní expresní vektory (pMSS116, pMSS118, pMSS119) smíseny s vektorem pRLSV40 (Pro Mega Co.) obsahujícím gen pro luciferasu mořské macešky, který byl použit jako vnitřní kontrola pro měření účinnosti vložení genu při stejném použitém množství. Potom byl s uvedeným DNA roztokem smísen kationtový liposom lipofektamin (Lifetech Oriental Co.) a pro transfekci byla tato směs přidána k lidským osteoosarkomovým buňkám HOS, MG63 a SaOS-2. Aktivita světluškové luiciferasy a luciferasovy z mořské macešky byly měřeny Pikka Gene Duál Křtem (Toyo Ink. Co.). Výsledky jsou uvedeny na obr. 5. Aktivita promotoru byla vyjádřena jako poměr aktivity světluškové luciferasy k aktivitě luciferasy z mořské macešky. Z výsledků je zřejmé, že DNA SEQ ID NO: 1 Seznamu sekvencí má promotorovou aktivitu.For transient expression of human BMP-4 recombinant expression vector, the above recombinant expression vectors (pMSS116, pMSS118, pMSS119) were mixed with the pRLSV40 vector (Pro Mega Co.) containing the firefly luciferase gene, which was used as an internal control to measure the efficiency of gene insertion at the same amount used. Then, the cationic liposome Lipofectamine (Lifetech Oriental Co.) was mixed with the above DNA solution and this mixture was added to human osteosarcoma cells HOS, MG63 and SaOS-2 for transfection. The activities of firefly luciferase and firefly luciferase were measured by Pikka Gene Dual Kit (Toyo Ink. Co.). The results are shown in Fig. 5. The promoter activity was expressed as the ratio of firefly luciferase activity to firefly luciferase activity. From the results, it is clear that the DNA SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing has promoter activity.

Příklad 5: Vložení lidského BMP-4 rekombinantního expresního vektoru do lidských buněk a stabilní expreseExample 5: Insertion of human BMP-4 recombinant expression vector into human cells and stable expression

Pro stabilní expresi lidského BMP-4 rekombinantního expresního vektoru byly výše uvedené vektory smíseny v poměru 10:1 s vektorem pPUR (CloneTech Ltd.) obsahujícím gen pro resistenci na puromycin a dále byly smíseny s kationtovým liposomem lipofektaminem (Lifetech Oriental Co.) pro transfekci lidských osteosarkomových buněk HOS. Buňky, do kterých byl vložen vybraný gen, byly selektovány na kultivačním mediu obsahujícím puromycin (Sigma, Ltd.).For stable expression of human BMP-4 recombinant expression vector, the above vectors were mixed at a ratio of 10:1 with the pPUR vector (CloneTech Ltd.) containing the puromycin resistance gene and further mixed with cationic liposome lipofectamine (Lifetech Oriental Co.) to transfect human osteosarcoma HOS cells. Cells into which the selected gene was inserted were selected on a culture medium containing puromycin (Sigma, Ltd.).

Příklad 6: Vyhledávání aktivních sloučenin s nízkou molekulovou hmotnostíExample 6: Searching for active compounds with low molecular weight

Selektované buňky byly naočkovány do 96-jamkové plotny, byly ošetřeny různými chemickými sloučeninami z knihoven běhemSelected cells were seeded into a 96-well plate, treated with various chemical compounds from the libraries during

1-3 dnů, byly rozpuštěny v cytolytickém činidle (Pro Mega Ltd.) a enzymatická aktivita byla měřena za použití luciferasového testovacího křtu (Pro Mega Ltd.). Tímto způsobem mohly být testovány různé substance indukující nebo inhibující expresi lidského BMP-4.1-3 days, were dissolved in cytolytic reagent (Pro Mega Ltd.) and enzymatic activity was measured using a luciferase assay (Pro Mega Ltd.). In this way, various substances inducing or inhibiting the expression of human BMP-4 could be tested.

Seznam sekvencí <110> Hoechst Marion Roussel, Ltd.Sequence Listing <110> Hoechst Marion Roussel, Ltd.

<120> Lidský BMP-4 promotor a způsob pro výzkum substancí ovlivňujících kosti za použití tohoto promotoru <130> JH98K004 PCT sekvence v angličtině <140><120> Human BMP-4 promoter and method for researching bone-affecting substances using this promoter <130> JH98K004 PCT sequence in English <140>

<141><141>

<150> 10-120173 <151> 1998-04-30 <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 6774 <212> DNA <213> Lidská <220><150> 10-120173 <151> 1998-04-30 <160> 3 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 6774 <212> DNA <213> Human <220>

<221> různé charakteristiky <222> (1)....(6774) <223> 5'předcházející genová sekvence lidského BMP-4 včetně regionů exonu 1 až exonu 3 <400> 1 gaattccttc cgtagcttca ccagacacct aattggccaa gaaggtttga agacctgatg 60 tggttcttaa ttggggatgg ggaattaagg gctactgtat ctataggatt atcttttcac 120 ttgcatagac ctatttggtg tgttcagggc atagtgatac tataattgcc atatttaaca 180 gtttataaag ttcaagccca gcatattctt tgcctgttta atgatgtctt ggtatcagcc 240 ttttaatggt acttatcagc atagaaaatg gaaacaaaat aacttttaaa acagtagctc 300 tcaagcttta gtgtgctcag aatgaccaga gaaccttgtg aaatatacag atttctgggt 360 ccagatctgg ggcaggacca ggaagtctgc atttcatctg cacccccacc ctactctgag 420 • 9<221> various characteristics <222> (1)....(6774) <223> 5'preceding gene sequence of human BMP-4 including regions of exon 1 to exon 3 <400> 1 gaattccttc cgtagcttca ccagacacct aattggccaa gaaggtttga agacctgatg 60 tggttcttaa ttggggatgg ggaattaagg gctactgtat ctataggatt atctttcac 120 ttgcatagac ctatttggtg tgttcagggc atagtgatac tataattgcc atatttaaca 180 gtttataaag ttcaagccca gcatattctt tgcctgttta atgatgtctt ggtatcagcc 240 ttttaatggt actttcagc atagaaaatg gaacaaaat aacttttaaa acagtagctc 300 tcaagcttta gtgtgctcag aatgaccaga gaaccttgtg aaatatacag atttctgggt 360 ccagatctgg ggcaggacca ggaagtctgc atttcatctg cacccccacc ctactctgag 420 • 9

13 13 9 · · · * • 9 · · * • 9 · * • 9 · 9 · · · 9 · · · * • 9 · · * • 9 · * • 9 · 9 · · · * » · · • · · • · · · · · * » · · • · · • · · · · · • · 9 · • · • · 9 · • · gcttatagtc gctttatagtc ctgagaacat ctgagaacat gctttgaaaa gctttgaaaa aggctgtccc aggctgtcccc aagggctcgc aagggctcgc agacaggcta agacaggcta 480 480 ttgaccagct ttgaccagct actctttctt actctttctt gatgttctcc gatgttctcc aggaaaaccc aggaaaaccc aacaaaggaa aacaaaggaa tgcctttcat tgcctttcat 540 540 tgagtagtag tagtagtag cagcatagga cagcatagga gcaatagttg gcaatagttg ctcctgaatt ctcctgaatt atgggtgggt atgggtgggt ttccctcttc ttccctcttc 600 600 atcaatgtgc atcaatgtgc tttaagggta tttaagggta cagtttcatt cagtttcatt tggtctatct tggtctatct accatgttct accatgttct ataaaaacat ataaaaacat 660 660 gaaaattcac gaaaattcac aggtaagttt aggtaagtttt gagatacaga gagatacaga aaataactaa aaaataactaa actgattctt actgattctt ctcacgaact ctcacgaact 720 720 ctgatcacta ctgatcacta ggctgtggtt ggctgtggtt gatttagctc gatttagctc tctaaccaac tctaaccaac aagtaatttg aagtaatttg ttctttggca ttctttggca 780 780 tgagtaaggg tgagtaaggg gggaaaagga ggaaaagga ggagtgggta ggagtgggta aaagcagctg aaagcagctg ataacagatg ataacagatg gcttgcgccc gcttgcgccc 840 840 atctaaaatg atctaaaatg tggggagaga tggggagaga aataaagctg aataaagctg tcccaagaga tcccaagaga actaaagctg actaaagctg agttctctcg agttctctcg 900 900 tcatatatct tcatatatct gaagattcat gaagattcat atcaggggtc atcaggggtc taaacatggt taaacatggt atgtcgggta atgtcgggtta gcttaattgg gcttaattgg 960 960 aaactcctgg aaactcctgg actgtgagtg actgtgagtg tcacagactc tcacagactc atggatgggc atggatggc caatcagtgg caatcagtgg ccactttagt ccactttagt 1020 1020 gtctgggctg gtctgggctg cagcaaaatg cagcaaaatg agacaatagc agacaatagc tgtcattcaa tgtcattcaa aaacctttgg aaaccttttgg aattaaaaaa aaaaaaaaa 1080 1080 accccgaaat accccgaaat gacattggtg gacattggtg ctttaaagta ctttaaagta aaataaagtc aaaataaagtc ctgcctttaa ctgcctttaa gtccagcata gtccagcata 1140 1140 tcactgttgt tcactgttgt ttctgagttt ttctgagtttt aaatattaag aaatattaag aaccacattt aaccacattt cgttaatgat cgttaatgat taaaacaaca taaaacaaca 1200 1200 gtgattgatt gtgattgatt taggggctca tagggggctca gtgagcattt gtgagcattt aatctgtcct aatctgtcct gacttcaggt gacttcaggt accatgctaa accatgctaa 1260 1260 aggagcacaa aggagcacaa tgcctgatgc tgcctgatgc tgcaggagaa tgcaggagaa acattaggta acattaggta actatttaat actattttaat ggagttttaa ggagttttaa 1320 1320 ttttctgtta ttttctgtta ttatttttaa ttatttttt taattaattg taattaattg tgattttgac tgattttgac tatttggaag tatttggaag ctacaggtat ctacaggtat 1380 1380 attttgtcct attttgtcct ccttttgggg ccttttgggg tggtgttatt tggtgttatt gccctgccct gccctgccct gttttaatca gttttaatca gtggttctta gtggttctta 1440 1440 gagaaagtga gagaaagtga actcaggagt actcaggagt gacttaaaat gactaaaaat gaaggaagac gaaggaagac ggactttggc ggactttggc taaaattaca taaaat 1500 1500 attaaataat attaaataat caaatcattt caaatcattt tcaaatataa tcaaatataa agggagcatg agggagcatg cagatgatct cagatgatct ggcccaatcc ggcccaatcc 1560 1560 tttcattctg tttcattctg cagatgagaa cagatgagaa aactgaggct aactgaggct cataggaatg cataggaatg aaaagacttg aaaagacttg cccaaagcca cccaaagcca 1620 1620 tacagcttgt tacagcttgt ttctgttgtt ttctgttgtt tggtgcatta tggtgcatta ggccaaaaga' ggccaaaaga' cctaggccta cctaggccta atagatggaa atagatggaa 1680 1680 aatatggcag aatatggcag gatgtcttgg gatgtcttgg ccttgctctg ccttgctctg acagttgctt acagttgctt ctctgatctc ctctgatctc agatatttcc agattttcc 1740 1740 caccctttgt caccctttgt aaattctgtg aaaattctgtg ttccacacag ttccacacag gaagtagttc gaagtagttc ttgtttttta ttgtttttta aatatcgaag aatatcgaag 1800 1800 gtgtataaac gtgtataaac gtaaagtttt gtaaagttttt tatagatgag tatagatgag ccacccaggg ccacccagggg ccaatatctg ccaatatctg tttaagtaaa tttaagtaaa 1860 1860 gacctaaatg gacctaaatg ctttgcagag ctttgcagag acagtaaagt acagtaaagt gtcatgtctg gtcatgtctg tcccagggaa tcccagggaa agaaatccag agaaatccag 1920 1920 gacaggaaat gacaggaaat gctcagtctt gctcagtctt ccagcactcc ccagcactcc tctggctacc tctggctacc tggagctcag tggagctcag gctatgagcc gctatgagcc 1980 1980 tcaacccctc tcaacccctc cctgaagcat cctgaagcat tagctctgga tagctctgga gcagaggctg gcagaggctg tgatttactt tgatttactt cagagatctg cagagatctg 2040 2040 ggcaagtccc ggcaagtccc tttaacctgg tttaacctgg tagtccttcc tagtccttcc tttccttgtt tttccttgtt tgtaaaacag tgtaaaacag agagatgagg agagatgagg 2100 2100 ctgatagctc ctgatagctc cctcacagct cctcacagct ccatcagagg ccatcagagg cagtgtgtgá cagtgtgtgá aattagttcc aattagttcc tgtttgggaa tgtttgggaa 2160 2160 ggtttaaaag ggtttaaaag ccaccacatt ccaccacatt ccacctccct ccacctccct gctaatatga gctaatatga ttactaaaat t gtttttatat gtt 2220 2220 gaaagggcca gaaagggcca attcctcatc attcctcatc tcccctcttc tcccctcttc ctttaaaaac ctttaaaaac agaccaaggg agaccaaggg gcatcttttc gcatcttttc 2280 2280 ttgtctccct ttgtctccct gtggcctaaa gtggcctaaa aggttactgc aggttactgc ttctgtggtt ttctgtggttt atctccttgg atctccttgg aaagacagag aaagacagag 2340 2340 tgtcaggact tgtcaggact cttaggtaca cttaggtaca ccaaaaatga ccaaaaatga acaaaaaaat aaaaaaaaaat caacaacaac caacaacaac cataacacca cataacacca 2400 2400 acaaaaataa acaaaaaaaataa ctgctgtgtc ctgctgtgtc ggttcttaag ggttcttaag acggcttctg acggcttctg agctagaaac agctagaaac agatttttct agatttttct 2460 2460 aactgtaaaa aactgtaaaa aacgtggccc aacgtggccc cagcctgtct cagcctgtct gcaggccacc gcaggccacc tctgtcttta tctgtcttta ggccttgggg ggccttgggg 2520 2520 ggaggaggga ggaggaggga agtgagctca agtgagctca tttactgggt tttactgggt ctacctcagg ctacctcagg gtcatcacca gtcatcacca aggtgttcta aggtgttcta 2580 2580 caaaacgcac caaaacgcac tttaagaatg tttaagaatg ttttggaagg ttttggaagg aaattcacct aaaattcacct tttaacagcc tttaacagcc caagaggtat caagaggtat 2640 2640 ctctctctgg ctctctctgg cacacagttc cacacagttc tgcacacagc tgcacacagc ctgtttctca ctgtttctca acgtttggaa acgtttggaa atcttttaac atcttttaac 2700 2700

agtttatgga aggccacctt ttaaaccgat ccaacagctc ctttctccat accctgattt 2760 agtttatgga aggccacctt ttaaaccgat ccaacagctc ctttctccat accctgattt 2760 tagaggtgtt tagaggtgtt tcattatctc tcattatctc taattactca taattactca gggtaaatgg gggtaaatgg tgattactca tgattactca gtgttttaat gtgttttaat 2820 2820 catcagtttg catcagtttg ggcagcagtt ggcagcagtt acactaaact acactaaact cagggaagcc cagggaagcc cagactccca cagactccca tgggtatttt tgggtattttt 2880 2880 tggaaggtac tggaaggtac ggcgactagt ggcgactagt cggtgcatgc cggtgcatgc tttctagtac tttctagtac ctccgcacgt ctccgcacgt ggtccccagg ggtccccagg 2940 2940 tgagccccag tgagccccag ccgcttccca ccgcttccca gagctggagg gagctggagg cagcggcgtc cagcggcgtc ccagctccga ccagctccga cggcagctgc cggcagctgc 3000 3000 ggactcggcg ggactcggcg ctgcctgggc ctgcctgggc ttccgggacc ttccgggacc cgggcctgct cgggcctgct aggcgaggtc aggcgaggtc gggcggctgg gggcggctgg 3060 3060 aggggaggat aggggaggat gtgggcgggg gtgggcgggg ctcccatccc ctcccatccc cagaaaggga cagaaagga ggcgagcgag ggcgagcgag ggaggaggga ggaggaggga 3120 3120 aggagggagg agggggagg ggccgccggg ggccgccggg gaagaggagg gaaaggagg aggaaggaaa aggaaaa gaaagaaagc gaaagaaagc gagggaggga gagggaggga 3180 3180 aagaggagga aagaggagga aggaagatgc aggaagatgc gagaaggcag gagaaggcag aggaggaggg aggaggagggg agggagggaa agggagggaa ggagcgcgga ggagcgcgga 3240 3240 gcccggcccg gcccggccccg gaagctaggt gaagctaggt gagtgtggca gagtgtggca tccgagctga tccgagctga gggacgcgag gggacgcgag cctgagacgc cctgagacgc 3300 3300 cgctgctgct cgctgctgct ccggctgagt ccggctgagt atctagcttg atctagcttg tctccccgat tctccccgat gggattcccg gggattccccg tccaagctat tccaagctat 3360 3360 ctcgagcctg ctcgagcctg cagcgccaca cagcgccaca gtccccggcc gtccccggcc ctcgcccagg ctcgcccagg ttcactgcaa ttcactgcaa ccgttcagag ccgttcagag 3420 3420 gtccccagga gtccccagga gctgctgctg gctgctgctg gcgagcccgc gcgagcccgc tactgcaggg tactgcaggg acctatggtg acctatggtg agcaaggcta agcaaggcta 3480 3480 cctggtgagg cctggtgagg ggagacaggc ggagacaggc agagggggtc agagggggtc taggagcctc taggagcctc cttgggggga cttggggggga agaagctggt agaagctggt 3540 3540 cacaggctgt cacaggctgt gaccgaggca gaccgaggca aaaggtggcc aaaggtggcc taattatttt taattattttt ccaatagtgg ccaatagtgg tgctggaggt tgctggaggt 3600 3600 ggggatgctg ggggatgctg gcgctgaaag gcgctgaaag acctttaaat acctttaaat atcggctact atcggctact gccctgccca gccctgccca ggccttctct ggccttctct 3660 3660 gtccagcagt gtccagcagt ccctgggaga ccctgggaga gťctcacctt gťctcacctt tgggaagtgc tgggaagtgc ggggcaggag ggggcaggag agcagaaaca agcagaaaca 3720 3720 agagaagccc agagaagccc ttggtagggg ttggtaggggg ggtcgttggg ggtcgttggg aaaaactgtg aaaaactgtg gggtcttggg gggtcttggg ctgaacgcgt ctgaacgcgt 3780 3780 tgcccacggg tgcccacggg ctggaggttg ctggaggttg cgatccccgg cgatccccgg acggaaagcg acggaaagcg cgggaggagg cgggaggagg aaggagagaa aaggagagaa 3840 3840 ccggctctga ccggctctga ggtccagaga ggtccagaga gagtgagggg gagtgagggg gcagagcgac gcagagcgac ggcgagatgg ggcgagatgg ggagagaaca ggagagaaca 3900 3900 cctagctgga cctagctgga gcaggttctg gcaggttctg cggtagagag cggtagagag cgcagtcctg cgcagtcctg ctggcctctg ctggcctctg gagagtgcgc gagagtgcgc 3960 3960 gccgctccgg gccgctccgg aggctgcgtc aggctgcgtc gaggggagtg gaggggagtg tcacccaatc tcacccaatc tgggccccag tgggccccag ctggcggggc ctggcggggc 4020 4020 gcctgagagc gcctgagagc ttgcgaactg ttgcgaactg cagttgcagg cagttgcagg acgcgccttc acgcgccttc tccacgagct tccacgagct attttcgtcg attttcgtcg 4080 4080 actťgcggaa actťgcggaa cccaaggaac cccaaggaac ctcgcctcta ctcgcctcta tcatttcacg tcatttcacg gtgtagggtc gtgtagggtc cctagagacg cctagagacg 4140 4140 acagccaaga acagccaaga tcccaggggc tcccaggggc tcccaggacg tcccaggacg cttgttcctg cttgttcctg cggtgtcgtg cggtgtcgtg tcctatgggg tcctatgggg 4200 4200 agttcctggc agttcctggc gggacgaaag gggacgaaag gcggacgcgc gcggacgcgc ggctcttcct ggctcttcct ggccctccag ggccctccag gcccggaacc gcccggaacc 4260 4260 gacgggaaag gacgggaaag gttcccgtga gttcccgtga ttcccgagtc ttcccgagtc cctgcaggct cctgcaggct tcttccagcg tcttccagcg ggagttggtc ggagttggtc 4320 4320 cgggggcctt cggggcctt agacgcctcc agacgcctcc aagcactgct aagcactgct ttggaggatg ttggaggatg gtttccaagg gtttccaagg atcgcggttt atcgcggttt 4380 4380 gtgagttgaa gtgagttgaa ggctttgtga ggctttgtga gaggttaaac gaggttaaac ccccaaaaga ccccaaaaga tacatacttg tacatacttg gtaaactgag gtaaactgag 4440 4440 gctacctgta gctacctgta aacacatttc aacacatttc ggcattagga ggcattagga gaagattcga gaagaattcga gtagggaagt gtagggaagt gaaggacaac gaaggacaac 4500 4500 caccccgagt caccccgagt tacattcctt tacattcctt tcccccaata tcccccaata aaaagctctg aaaagctctg gggatgaaag gggatgaaag ttcttttggc ttcttttggc 4560 4560 ttttatcttt t tcgatttaaa tcgatttaaa aatttgagaa aatttgagaa gaaaatgtga gaaaatgtga ctagagatga ctagagatga atcctggtga atcctggtga 4620 4620 átccgaaatt atccgaaatt gaaacacaac gaaacacaac tcccccttcc tccccttcc ccttcctatc ccttcctatc ctctcggttt ctctcggttt tagaaccgcg tagaaccgcg 4680 4680 ctctcccgcc ctctcccgcc ccaggagatt ccaggagatt ccttggggcc ccttggggcc gagggttttc gagggttttc cggggaaccg cggggaaccg ggcgcccgcc ggcgcccgcc 4740 4740 ccttctactg ccttctactg tccctttgcc tccctttgcc ccgcgggcac ccgcgggcac agcttgcctc agcttgcctc cgtctgcttt cgtctgctttt ctctacttct ctctacttct 4800 4800 ggacctctcc ggacctctcc tcggcgggct tcggcggct ttttaaaggg ttttaaaggg cfctctgcgtc cfctctgcgtc tcaaaacaaa tcaaaacaaa acaaaaaaac aaaaaaaaaac 4860 4860 cctttgctct cctttgctct tcccaaccct tcccaaccct ttcgcagccc ttcgcagccc gccccagcgt gccccagcgt ggcgcgggac ggcgcgggac cagcaaaggc cagcaaagcc 4920 4920 gaaagcgccg gaaagcgccg cggctcttgc cggctcttgc cgggcgcgga cgggcgcgga cggtcgcgca cggtcgcgca ggggcgcccg ggggcgcccg cggcctccgc cggcctccgc 4980 4980

• · • · • · • ·• · • · • · • ·

15.15.

acccggacct gaggtgttgg tcgactccgg gcatccacgg tcgggaggga gggctgagct 5040 acccggacct gaggtgttgg tcgactccgg gcatccacgg tcgggaggga gggctgagct 5040 gttcgatcct gttcgatcct ttacttttct tacttttct tcctcaaagt tcctcaagt ctacctgcca ctacctgcca •atgcccctaa •atgcccctaa gaagaaaacc gaaaaaacc 5100 5100 aagtatgtgc aagtatgtgc gtggagagtg gtggagagtg gggcggcagg gggcggcagg caacccgagt caacccgagt tcttgagctc tcttgagctc cggagcgacc cggagcgacc 5160 5160 caaagcagca caaagcagca actgggaaca actgggaaca gcctcaggaa gcctcaggaa agggaggtcg agggaggtcg ggtggagtgg ggtggagtgg gctttggggc gctttggggc 5220 5220 aggagtcatg aggagtcatg gggcccgggc gggcccggc cccggggacg cccggggacg acctggcgct acctggcgct cccggccctg cccggccctg ctgaacgctg ctgaacgctg 5280 5280 agttgcgcct agttgcgcct agtcgggttt agtcgggtttt tcgaagaggc tcgaagaggc ccttgcgcag ccttgcgcag agcgacccac agcgacccac gcgcgcggca gcgcgcggca 5340 5340 gcatcttcga gcatcttcga ttagtcagga ttagtcagga catcccagta catcccagta actgcttgaa actgcttgaa ctgtaggtag ctgtaggtag gtaaaattct gtaaaattct 5400 5400 tgaaggagta tgaaggagta tttgctgcgt tttgctgcgt gcgactctgc gcgactctgc tgctggtgca tgctggtgca acggaggaag acggaggaag ggggtggggg ggggtgggggg 5460 5460 aaggaagtgg aaggaagtgg cgggggaagg cgggggaagg actgtggtgg actgtggtgg tggtttaaaa tggtttaaa aataagggaa aataagggaa gccgaggcga gccgaggcga 5520 5520 gagagacgca gagagacgca gacgcagagg gacgcagagg tcgagcgcag tcgagcgcag gccgaaagct gccgaaagct gttcaccgtt gttcaccgtt ttctcgactc ttctcgactc 5580 5580 cggggaacat cggggaacat ggtgggattt ggtgggattt cctttctgcg cctttctgcg ccgggtcggg ccgggtcgggg agttgtaaaa agttgtaaaa cctcggccac cctcggccac 5640 5640 attaagatct attaagatct gaaaactgtg gaaaactgtg atgcgtcctt atgcgtcctt tctgcagcga tctgcagcga cgcctctttc cgcctctttc tgaatctgcc tgaatctgcc 5700 5700 cggagcttcg cggagcttcg agccccggcg agccccggcg tctgtccctc tctgtccctc agcctggcat agcctggcat ggcttcttcg ggcttcttcg ggggtctgct ggggtctgct 5760 5760 ttgcatgggg ttgcatgggg agaggggcca agaggggcca cgcagcggcg cgcagcggcg gactaggttt gactaggtttt ggggattctc gggggattctc ggtaatggac ggtaatggac 5820 5820 ccggagcaat ccggagcaat gactaacagc gactaacagc cgctccctct cgctccctct cactttccca cactttccca cagcgatcac cagcgatcac cctctaacac cctctaacac 5880 5880 cctccctccc cctccctcc attcccggcc attcccccc ccgcgcgtga ccgcgcgtga caaggtcggc caaggtcggc tgctttcagc tgctttcagc cgggagctag cgggagctag 5940 5940 atcggtggcc atcggtggcc cggctcttcg cggctcttcg gaccttagcg gaccttagcg agcgttcgcc agcgttcgcc aaggggtgac aaggggtgac tggctgtcat tggctgtcat 6000 6000 tgggagcaat tgggagcaat atttggcctt atttggcctt gaggagaccc gaggagaccc tggggaggaa tgggggaa gtggcgggga gtggcggggga gctcgtgttt gctcgtgttt 6060 6060 gcttgtgtgt gcttgtgtgt gtgtgggggg gtgtgggggg gtagtgtgtg gtagtgtgtg taacacgcgc taacacgcgc gtgggcaggg gtgggcaggg tccctctgcg tccctctgcg 6120 6120 ctttcctttt ctttcctttt taagtgcctc taagtgcctc tcggtggtga tcggtggtga ggctttgggc ggctttgggc gggtgagact gggtgagact ttcccgacct ttcccgacct 6180 6180 cgctcccggc cgctcccggc cccacttaag cccacttaag ccgggttcga ccgggttcga gctgggagac gctgggagac gcagtccctt gcagtccctt cagtgcgccc cagtgcgccc 6240 6240 caaatcctct caaatcctct ggcttcaggt ggcttcaggt ggcccggcgc ggcccggcgc gggggcccag ggggggcccag cacgacgcac cacgacgcac cgcgccgaga cgcgccgaga 6300 6300 accgggttct accgggttct ccggtgcgtg ccggtgcgtg cgccagtagc cgccagtagc cctgggagcg cctgggagcg cggcggccgc cggcggccgc ggggcaccgg ggggcaccgg 6360 6360 ccgaggctct ccgaggctct gccgagcgcc gccgagcgcc gccgggagct gccgggagct cctcccggac cctccccggac cgctgaggct cgctgaggct cgggcggcgg cggcggcgg 6420 6420 acgcggaggt acgcggaggt tggcctcgcc tggcctcgcc tggaggggcg tggaggggcg ggcccgcgag ggcccgcgag gggcgggggg ggcggggggg ctgtggagga ctgtggagga 6480 6480 ggggagggcg ggggagggcg cgcaggccct cgcaggccct ttcgccgcct ttcgccgcct gccgcgggag gccgcgggag gggcctcggc gggcctcggc gctcacgtga gctcacgtga 6540 6540 ctccgagggg ctccgagggg ctggaagaaa ctggaagaaa aacagagcct aacagagcct gtctgcggtg gtctgcggtg gagtctcatt gagtctcatt atattcaaat attcaaat 6600 6600 attcctttta attcctttta ggagccattc ggagccattc cgtagtgcca cgtagtgcca tcccgagcaa tcccgagcaa cgcactgctg cgcactgctg cagcttccct cagcttccct 6660 6660 gagcctttcc gagcctttcc agcaagtttg agcaagtttg ttcaagattg ttcaagattg gctgtcaaga gctgtcaaga atcatggact atcatggact gttattatat gttattatat 6720 6720 gccttgtttt gccttgttttt ctgtcagtga ctgtcagtga gtagacacct gtagacacct cttccttccc cttccttcccc cctccccgga cctccccgga attc attc 6774 6774

<210> 2 <211> 30 • · • · · · • * 9 · • · · · *<210> 2 <211> 30 • · • · · · • * 9 · • · · · *

9 9 9 « ♦ · <212> DNA <213> Lidská <220>9 9 9 « ♦ · <212> DNA <213> Human <220>

<221> různé charakteristiky <222> (1) .... (30) <223> Primer (ve směru kódující sekvence) pro klonování 5’předcházející genové sekvence lidského BMP-4 odpovídající regionu exonu 1 <400> 2 ggcagaggag gagggaggga gggaaggagc <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Lidská <220><221> various characteristics <222> (1) .... (30) <223> Primer (in the direction of the coding sequence) for cloning the 5’ upstream human BMP-4 gene sequence corresponding to the exon 1 region <400> 2 ggcagaggag gagggagga gggaaggagc <210> 3 <211> 30 <212> DNA <213> Human <220>

<221> různé charakteristiky <222> komplement((1)....(30)) <223> Reversní primer pro klonování 5'předcházející genové sekvence lidského BMP-4 odpovídající regionu exonu 1 <400> 3 gggacctctg aacggttgca gtgaacctgg · fl/ y>do- 76<221> various characteristics <222> complement((1)....(30)) <223> Reverse primer for cloning 5' upstream human BMP-4 gene sequence corresponding to exon 1 region <400> 3 gggacctctg aacggttgca gtgaacctgg · fl/ y>do- 76

Claims

Patent claims

(1) digestion of human placental genomic DNA with the restriction enzyme EcoRI;

DNA having a nucleotide sequence consisting of bases No. 1 to 1;

6774 of SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing that encodes the human bone morphogenetic protein 4 promoter region, or fragment thereof.

(2) agarose gel electrophoresis;

2. A method of preparing the DNA of SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing comprising the steps of:

3. A recombinant expression vector comprising integrated, in the reporter gene, all or part of the DNA shown in SEQ ID NO: 1 of the Sequence Listing.

(3) cloning the isolated EcoRI digested DNA fragment into the λDASH II lambda phage vector treated with the same enzyme;

4. A method for researching bone-modifying substances using the recombinant expression vector of claim 3.

(4) packaging said vector into phage;

5. The method for researching bone-modifying substances according to claim 4, wherein the bone-modifying substance is an osteogenesis-inducing substance.

(5) creating a genomic DNA library by infection of Escherichia coli with phage;

(6) PCR screening; and (7) cloning into a plasmid vector.

6. The method for researching bone-modifying substances according to claim 4, wherein the bone-modifying substance is an osteogenesis inhibiting substance.