CZ205496A3 - Pharmaceutical preparation for treating cancer, process of its preparation and the use of il-10 for preparing medicament for antagonizing cyctotoxicity blockade caused by il-2 endogenic il-4 - Google Patents
Pharmaceutical preparation for treating cancer, process of its preparation and the use of il-10 for preparing medicament for antagonizing cyctotoxicity blockade caused by il-2 endogenic il-4 Download PDFInfo
- Publication number
- CZ205496A3 CZ205496A3 CZ962054A CZ205496A CZ205496A3 CZ 205496 A3 CZ205496 A3 CZ 205496A3 CZ 962054 A CZ962054 A CZ 962054A CZ 205496 A CZ205496 A CZ 205496A CZ 205496 A3 CZ205496 A3 CZ 205496A3
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- cells
- human
- activity
- pbmcs
- ifn
- Prior art date
Links
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 37
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 20
- 239000003814 drug Substances 0.000 title claims abstract description 9
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 title claims abstract description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title 1
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 claims abstract description 155
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 claims abstract description 155
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 claims abstract description 85
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 claims abstract description 84
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 claims abstract description 61
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 23
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 39
- 210000003810 lymphokine-activated killer cell Anatomy 0.000 claims description 19
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 6
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 claims description 6
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 claims description 5
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 143
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 79
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 46
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 25
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 25
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 22
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 22
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 21
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 17
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 16
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 10
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101001033233 Homo sapiens Interleukin-10 Proteins 0.000 description 8
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 8
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 8
- 102000052620 human IL10 Human genes 0.000 description 8
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 8
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 7
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 7
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 6
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 6
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 5
- 230000004044 response Effects 0.000 description 5
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 5
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 4
- 208000035269 cancer or benign tumor Diseases 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 4
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 4
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 4
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 4
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 4
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 4
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 3
- 101001002657 Homo sapiens Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- 101001002709 Homo sapiens Interleukin-4 Proteins 0.000 description 3
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 239000013065 commercial product Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 102000055229 human IL4 Human genes 0.000 description 3
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 210000003000 inclusion body Anatomy 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- 210000001616 monocyte Anatomy 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 3
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- 101150067964 BcRF1 gene Proteins 0.000 description 2
- CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N Carbon dioxide Chemical compound O=C=O CURLTUGMZLYLDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000008485 antagonism Effects 0.000 description 2
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 description 2
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 238000002513 implantation Methods 0.000 description 2
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000011403 purification operation Methods 0.000 description 2
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 2
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 2
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 2
- MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N (3s)-4-[[(2s)-1-[[(2s)-1-[[(1s)-1-carboxy-2-hydroxyethyl]amino]-4-methyl-1-oxopentan-2-yl]amino]-5-(diaminomethylideneamino)-1-oxopentan-2-yl]amino]-3-[[2-[[(2s)-2,6-diaminohexanoyl]amino]acetyl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CCCCN MZOFCQQQCNRIBI-VMXHOPILSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000011691 Burkitt lymphomas Diseases 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053717 Fibrous histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000746373 Homo sapiens Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Proteins 0.000 description 1
- 101000960969 Homo sapiens Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 1
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- 229940122803 Vinca alkaloid Drugs 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 229940045985 antineoplastic platinum compound Drugs 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 229910002092 carbon dioxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001569 carbon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000011260 co-administration Methods 0.000 description 1
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 230000002380 cytological effect Effects 0.000 description 1
- 238000011266 cytolytic assay Methods 0.000 description 1
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000263 cytotoxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000001066 destructive effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 210000002767 hepatic artery Anatomy 0.000 description 1
- 201000000284 histiocytoma Diseases 0.000 description 1
- 102000055228 human IL5 Human genes 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 230000008629 immune suppression Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 230000001024 immunotherapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000016507 interphase Effects 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000031942 natural killer cell mediated cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004493 neutrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 231100000404 nontoxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 239000000346 nonvolatile oil Substances 0.000 description 1
- 238000007899 nucleic acid hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 235000021110 pickles Nutrition 0.000 description 1
- 150000003058 platinum compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000002908 protein secreting cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005909 tumor killing Effects 0.000 description 1
- 210000005167 vascular cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Farmaceutický prostředek k léčení rakoviny obsahující PBMC aktivované IL-10 a farmaceuticky vhodný nosič, způsob jeho výroby a použití IL-10 k výrobě léčiv k antagonizaci blokády cytotoxiciny vyvolané IL-2 endogenním IL-4.A pharmaceutical composition for the treatment of cancer containing IL-10 activated PBMCs and pharmaceutically a suitable carrier, a method of making the same; use of IL-10 for the manufacture of a medicament for antagonizing endogenous IL-2-induced cytotoxicin blockade IL-4.
Description
Oblast technikyTechnical field
Vynález se týká farmaceutického prostředku k léčení rakoviny, způsobu jeho výroby a použití IL-10 k výrobě léčiv k antagonizaci blokády cytotoxiciny vyvolané IL-2 endogenním IL-4.The present invention relates to a pharmaceutical composition for the treatment of cancer, to a method for its manufacture, and to the use of IL-10 in the manufacture of a medicament for antagonizing IL-2 induced blockade of endogenous IL-4.
Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION
Imunologické přístupy k léčení rakoviny jsou založeny na poznatku, že rakovinové buňky poněkud zmařily obranu organismu proti jinde se vyskytujícím nebo cizím buňkám a molekulám, a že tato obrana může být léčebně povzbuzována k zabíjení rakovinových buněk nebo zabraňování jejich růstu, například jak o tom pojednává Klein [Immunology, Wi1ley-Interscience, New York, str, 623 až 648, 1982]. Nové poznatky, že imunitní efektory mohou přímo nebo nepřímo mařit růst nádorů, vedl k obnovenému zájmu o tento přístup k léčení rakoviny [Heberman, Concepts Immunopath. 1=96 (1985), (přírodní zabijácké buňky zabraňují růstu nádorů); Rosenberg ^a kol. Ann.Rev.Immunol. 4:681 (1988) (použití zabijáckých buněk aktivovaných IL-2 k léčení rakoviny); Ralf a kol., J.Exp.Med. 167=712 (1988) (ničivá činnost makrofágů vůči nádorům podporovaná lymfokiny) Tepper a kol., Cell 57=503 (1989) (IL-4 má ničivý účinek na nádory); M.Cohen, Lymphokines and Tumor Immunity“ -lymfokiny a imunita vůči nádorům), str. 237 až 253, S. Cohenem vydané publikaci Lymphokines and the Immune Response lymfokiny a imunitní odezva (CRC Press, Boča Raton, (1990)1.Immunological approaches to cancer treatment are based on the recognition that cancer cells have somehow thwarted the body's defense against other or foreign cells and molecules, and that this defense can be therapeutically encouraged to kill cancer cells or prevent their growth, for example, as discussed in Klein. [Immunology, Willey-Interscience, New York, pp. 623-648, 1982]. Recent findings that immune effectors can directly or indirectly thwart tumor growth have led to a renewed interest in this approach to cancer treatment [Heberman, Concepts Immunopath. 1 = 96 (1985), (natural killer cells prevent tumor growth); Rosenberg et al. Ann.Rev.Immunol. 4 : 681 (1988) (use of IL-2 activated killer cells to treat cancer); Ralf et al., J.Exp.Med. 167 = 712 (1988) (lymphokine-assisted tumor macrophage killing) Tepper et al., Cell 57 = 503 (1989) (IL-4 has a tumor killing effect); M. Cohen, Lymphokines and Tumor Immunity (Lymphokines and the Immune Response), pp. 237-253, published by Lymphokines and the Immune Response Lymphokines and the Immune Response (CRC Press, Boca Raton, (1990) 1).
Schopnost imunitní odezvy vůči novotvarům je řízena rozmani2 tými typy buněk a zahrnuje působení T-buněk a cytokinů odvozených od monocytů. Jedním z imunologických přístupů, který se ukázal jako klinicky slibný, byla tak zvaná “adoptivní imunoterapie používající zabijáckých buněk aktivovaných IL-2 [Rosenberg, Sci. Am., str. 62 až 69 (květen 1990)]. Ačkoli se IL-2 samotný nebo v kombinaci s několika tradičními chemoterapeutickými činidly jeví jako účinný k léčení určitých zhoubností (například karcinomu ledvinových buněk), vedly některé nešťastné vedlejší toxické účinky jako propouštění cévního řečiště a otoky spojené s podáváním účinných dávek IL-2 k názoru, že rizika by mohla převážit užitečnost [Cotran a kol.,J.Immunol. 139:1882 (1987); Edwards a kol. Cancer Res. 52:3425 (1992)].The ability of the immune response to neoplasms is controlled by a variety of cell types and involves the action of T-cells and monocyte-derived cytokines. One immunological approach that has been shown to be clinically promising was the so-called adoptive immunotherapy using IL-2 activated killer cells [Rosenberg, Sci. Am., Pp. 62-69 (May 1990)]. Although IL-2, alone or in combination with several traditional chemotherapeutic agents, appears to be effective in the treatment of certain malignancies (such as renal cell carcinoma), some unfortunate toxic side effects such as vascular leakage and swelling associated with the administration of effective doses of IL-2 that the risks could outweigh the usefulness [Cotran et al., J. Immunol. 139: 1882 (1987); Edwards et al. Cancer Res. 52: 3425 (1992)].
L idské -endothel iální buňky cév jsou obzvlášť citlivé na toxicitu IL-2, jak je zřejmé ze zvýšené propustnosti cév (to je syndrom cévní netěsnosti) a otoků. Jeden z činitelů přispívajících k této patologii může být zesílen ulpíváním T-buněk a neutrofilních leukocytů, aktivovaných IL-2, na jednovrstvové cévní výstelce, jak bylo dříve pozorováno in vitro [Edwards a kol.; Damle a kol. 138:1779 (1987)].Human vascular vascular cells are particularly sensitive to the toxicity of IL-2 as evidenced by increased vascular permeability (i.e., vascular leak syndrome) and swelling. One of the factors contributing to this pathology may be enhanced by the adherence of IL-2 activated T-cells and neutrophil leukocytes to monolayer vascular linings as previously observed in vitro [Edwards et al .; Damle et al. 138: 1779 (1987)].
Alternativním přístupem k imunologickému léčení novotvarových chorob je adoptivní přenos imunních buněk. Adoptivní imunoterapie je definována jako přenášení do jedince s nádorem aktivních imunologických reagencií, jako jsou buňky s protinádorovým působením, které mohou zprostředkovat buď přímo nebo nepřímo protinádorové účinky. Adoptivní imunoterapie představuje atraktivní přístup k léčení novotvarových chorob. Je třeba poznamenat, že jelikož jsou do jedince přenášeny aktivní imunologické reagencie, není potřebná imunitní schopnost jedince. Tudíž potlačení imunity, které obecně souvisí s nádorovým stavem nepředstavuje hlavní problém při této terapeutické alternativě. Jelikož není potřebná imunitní schopnost jedince, a ve skutečnosti může být blahodárná k účinkům adoptivního přenosu imunních buněk, může být adoptivní imunologie snadno kombinována s ostatními terapiemi, jako je che3 raoterapie nebo ozařování.An alternative approach to immunological treatment of neoplastic diseases is adoptive transfer of immune cells. Adoptive immunotherapy is defined as the delivery to a subject with a tumor of active immunological reagents, such as cells with antitumor activity, which can mediate either directly or indirectly antitumor effects. Adoptive immunotherapy represents an attractive approach to the treatment of neoplasm diseases. It should be noted that since active immunological reagents are transferred to an individual, the individual's immune ability is not required. Thus, immune suppression that is generally associated with a tumor condition is not a major problem in this therapeutic alternative. Since the individual's immune ability is not needed, and in fact may be beneficial to the effects of adoptive immune cell transfer, adoptive immunology can be readily combined with other therapies such as chemotherapy or radiation.
Pacienti, prodělávající chemoterapii nebo ozařování, mají sklon mít nižší imunitu a budou mít obecně vyčerpanou dodávku efektorových jednojaderných buněk periferní krve (PBMC), jež jsou k disposici k aktivování. U takových pacientů by terapie vykazující účinnost při nízkém poměru efektorových buněk k buňkám cílovým byla tudíž obzvlášť výhodná.Patients undergoing chemotherapy or radiation tend to have lower immunity and will generally have a depleted supply of peripheral blood effector mononuclear cells (PBMCs) available for activation. Thus, in such patients, therapy showing efficacy at a low ratio of effector cells to target cells would be particularly advantageous.
Schopnost imunitní odezvy vůči novotvarům je řízena rozmanitými typy buněk a zahrnuje působení T-buněk a cytokinů odvozených od monocytů. Adoptivní imunoterapie používající rekombinantních lidských cytokinů vyvinula podávání jednojaderných buněk periferní krve (PBMC) stimulovaných mimotělně [Phillips a kol., Clin. Oncol. 5 :19 3 á“: ( 1987 X; J?errusia, Curr . Opin . Immunol. 3 : 49 :( 1991) ] následované podáváním IL-2 [Rosenberg a kol. J. Immunol. 138: 1779 (1985)]. Mimotělní zpracování PBMC vytváří zabijácké buňky aktivované lymfokiny (lymphokine-acti vated killer LAK) a aktivované přírodní zabijácké buňky (natural killer NK) mající cytolytické účinky na různé nádorové buňky.The ability of the immune response to neoplasms is controlled by a variety of cell types and involves the action of T-cells and monocyte-derived cytokines. Adoptive immunotherapy using recombinant human cytokines has developed administration of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) stimulated extracorporeally [Phillips et al., Clin. Oncol. 5: 19 3 α ': (1987 X; J errusia, Curr. Opin. Immunol. 3: 49 :( 1991)] followed by administration of IL-2 [Rosenberg et al. J. Immunol. 138: 1779 (1985)] The extracorporeal processing of PBMCs produces lymphokine-acti vated killer LAK and activated natural killer NK cells having cytolytic effects on various tumor cells.
Uvádí se [Nagasawa a kol. Cell.Immunol. 133:317 (1991)], že lidské IL-5, IL-7 [Stotter a Lotze, Arch.Surgery 126:1525(1991)] a IL-12 [Gately a kol. J.Immunol. 147:874 (1991) ] podporují cytolytickou aktivitu v lidských PBMC. Zdá se, že interleukin-10 (IL-10), původně popsaný u myší jako syntetický cytokinový inhibiční faktor (cytokine synthesis inhibitory factor) vylučovaný specifickými pomocnými substrukturami T-buněk, moduluje diferenciaci myších cytotoxických T-buněk. [Chen a Zlotnik,J.Immunol . 147:528 (1991)]. Zjistilo se také, že lidské PBMC, inkubované se supernatanty, získanými z buněk COS transfektovaných lidským IL-10 cDNA, lyžují cíle nádorových buněk in vitro. T-buňky odpovídající IL-10 se zvýšeným cytolytickým potenciálem byly identifikovány jako CD56+ fenotyp, indikativní pro NK-buňky.It is reported [Nagasawa et al. Cell.Immunol. 133: 317 (1991)] that human IL-5, IL-7 [Stotter and Lotze, Arch.Surgery 126: 1525 (1991)] and IL-12 [Gately et al. J. Immunol. 147: 874 (1991)] promote cytolytic activity in human PBMCs. Interleukin-10 (IL-10), originally described in mice as a cytokine synthesis inhibitor factor secreted by specific T-cell helper substructures, appears to modulate the differentiation of murine cytotoxic T-cells. [Chen and Zlotnik, J. Immunol. 147: 528 (1991)]. Human PBMCs incubated with supernatants derived from COS cells transfected with human IL-10 cDNA were also found to lyse tumor cell targets in vitro. T cells corresponding to IL-10 with increased cytolytic potential were identified as a CD56 + phenotype indicative of NK cells.
Za jistých okolností může IL-4 nepříznivě ovlivňovat vytváření LAK aktivity IL-2 [Nagler a kol. J.Immunol. 141:2349 (1988)]. Kultivují-li se například lidské PBMC v přítomnosti jak IL-2, tak IL-4, je lyse LAK-oi11 ivých cílů silně snížena [Spits a kol. J.Immunol. 141=29 (1988)1. Jsou-li PBMC předběžně kultivovány v prostředí doplněném IL-2 po dobu 3 dnů před přidáním IL-4, je však výsledkem cytolytická aktivita [Spits a kol.1. Kromě toho může být blokáda cytotoxicity řízená IL-2 působením IL-4 snížena, je-li do původní inkubační směsi začleněn alfa-interferon (of-IFN) nebo alfa-faktor nádorového odumírání tkáně (tumor necrosis factor-alfa TNF-ae) [Svisher a kol. Cell. Immunol . 128: 450 (1990)1.In certain circumstances, IL-4 may adversely affect the formation of LAK activity by IL-2 [Nagler et al. J. Immunol. 141: 2349 (1988)]. For example, if human PBMCs are cultured in the presence of both IL-2 and IL-4, the lysis of LAK-1111 targets is greatly reduced [Spits et al. J. Immunol. 141 = 29 (1988). However, when PBMCs are pre-cultured in IL-2 supplemented media for 3 days prior to IL-4 addition, cytolytic activity results [Spits et al. In addition, IL-2-directed cytotoxicity blockade by IL-4 can be reduced by incorporating alpha-interferon (of-IFN) or tumor necrosis factor-alpha TNF-αe into the original incubation mixture [ Svisher et al. Cell. Immunol. 128: 450 (1990).
Kedar a kol. [Cancer Immunol.Immunother. 35=63 (1992)1 nedávno naznačil, že po sobě následující podávání IL-2 a oe-IFN je účinným imunoterapeutickým režimem k ošetřování sarkomů MCA-105 a karcinomů Ml09 na myších nádorových modelech. Primárním poznatkem z této studie bylo, že po sobě následující podávání cytokinů se jeví jako účinnější než současné podávání obou cytokinů.Kedar et al. [Cancer Immunol. Immunother. 35 = 63 (1992) 1 recently indicated that sequential administration of IL-2 and oe-IFN is an effective immunotherapeutic regimen for the treatment of MCA-105 sarcomas and M109 carcinomas in murine tumor models. The primary finding from this study was that sequential administration of cytokines appears to be more effective than concomitant administration of both cytokines.
Proveditelnost a účinnost adoptivní imunoterapíe jakožto způsobu léčeni různých chorob, zejména léčení novotvarových chorob (rakoviny) u lidí, je číslo 4 690915 (Rosenberg) popsána v americkém patentovém spise Jak už bylo uvedeno shora, chybějí způsoby provádění takového léčení, které nejsou tak toxické jako způsoby používající IL-2 samotného. Je také potřeba terapie, která je účinná při nízkých poměrech efektořových k cílovým buňkám.The feasibility and efficacy of adoptive immunotherapy as a method of treating various diseases, in particular the treatment of neoplastic diseases (cancer) in humans, is disclosed in U.S. Patent 4,690,915 (Rosenberg). As mentioned above, methods of performing such treatments that are not as toxic as methods using IL-2 alone. There is also a need for therapy that is effective at low effector to target cell ratios.
Vynález splňuje tyto požadavky tím, že poskytuje farmaceutický prostředek k léčení rakoviny obsahující IL-10 samotný nebo v kombinaci s IL-2 a/nebo oe-IFN ke zvýšení cytolytické aktivity PBMC, obzvláště buněk LAK a NK.The invention meets these requirements by providing a pharmaceutical composition for treating cancer comprising IL-10 alone or in combination with IL-2 and / or oe-IFN to enhance the cytolytic activity of PBMCs, particularly LAK and NK cells.
Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION
Farmaceutický prostředek k léčení rakoviny spočívá podle vynálezu v tom, že se že obsahuje PBMC aktivované IL-10 spolu s farmaceuticky vhodným nosičem.The pharmaceutical composition for the treatment of cancer is characterized in that it comprises an IL-10 activated PBMC together with a pharmaceutically acceptable carrier.
Při jednom provedení prostředek IL-10 v kombinaci zvýšení aktivace buněk LAK, techniky, které používají IL-2 buněk NK a LAK. Vynález silně vynálezu obsahuje farmaceutický s množstvím IL-2 postačujícím ke avšak nezpůsobujícím toxické vedlejší účinky přičítané používání IL-2 samotného.In one embodiment, the IL-10 composition in combination increases LAK cell activation, a technique that uses IL-2 NK and LAK cells. The invention strongly encompasses a pharmaceutical with an amount of IL-2 sufficient to, but not cause, toxic side effects attributed to the use of IL-2 alone.
Při jiném provedení vynálezu farmaceutický prostředek obsahuje IL-10 v kombinaci s množstvím ce-IFN, postačujícím ke zvýšení aktivace buněk LAK.In another embodiment of the invention, the pharmaceutical composition comprises IL-10 in combination with an amount of ce-IFN sufficient to increase activation of LAK cells.
Při ještě jiném provedení vynálezu farmaceutický prostředek obsahuje IL-10 v kombinaci s (a) množstvím IL-2 postačujícím ke zvýšení aktivace buněk LAK, avšak nezpůsobujícím toxické vedlejší účinky přičítané používání IL-2 samotného, (b) množstvím ořIFN postačujícím ke zvýšení aktivace buněk LAK.In yet another embodiment of the invention, the pharmaceutical composition comprises IL-10 in combination with (a) an amount of IL-2 sufficient to enhance LAK cell activation but not causing toxic side effects attributed to the use of IL-2 alone; PICKLE.
V uvedených prostředcích se používá s výhodou lidských IL-10, IL-2 a αί-IFN, nejvýhodněji rekombinantních IL-10, IL-2 a ot-IFN.Preferably, human IL-10, IL-2 and α-IFN are used in the compositions, most preferably recombinant IL-10, IL-2, and α-IFN.
Vynález znamená zlepšení oproti způsobům dosavadního stavu k vyvolání cytolytického působení redukuje toxické vedlejší účinky, které jsou typickým důsledkem používání IL-2 v takových způsobech léčení tím, že IL-2 vylučuje úplně, nebo silně snižuje množství IL-2, které musí být použito.The invention is an improvement over the prior art methods for inducing cytolytic action, reducing the toxic side effects that are typical of the use of IL-2 in such methods of treatment by eliminating IL-2 completely or severely reducing the amount of IL-2 that must be used.
Pokud nejsou definovány jinak, mají zde použité názvy stejný význam jak je jim rozumněno v oboru, na který je vynález zaměřen.Unless otherwise defined, the terms used herein have the same meaning as understood in the art to which the invention is directed.
Pokud jde o zde používaný název adoptivní imunologie, znamená to terapii zahrnující přenos aktivovaných funkčních imunních buněk do pacienta. Tyto buňky zahrnují s výhodou buňky LAK a NK pocházející z aktuálního pacienta prodělávajícího léčbu.As used herein, adoptive immunology refers to therapy involving the transfer of activated functional immune cells to a patient. These cells preferably comprise LAK and NK cells originating from the current patient undergoing treatment.
Zde použitý termín regrese je zde definován jako měřitelné zmenšení rozměru alespoň jednoho nádoru, jak se v oboru běžně měří.As used herein, the term regression is defined as a measurable reduction in dimension of at least one tumor, as commonly measured in the art.
Pokud jde o interleukin-10 nebo IL-10, je zde definován jako protein, který (a) má aminokyselinovou dokonalou sekvenci (to jest chybějící sekreční vůdčí sekvenci) IL-10, jak je uvedena v souboru americkém patentovém spise číslo (přihláška vynálezu číslo 07/917,806 z 20. července 1992, která odpovídá mezinárodní přihlášce vynálezu WO 91/003349 a (b) má biologickou aktivitu, která je společná s nativním IL-10. Pro účele vynálezu jsou glykosilované (to je vytvořené v eukariotických buňkách jako jsou buňky CHO) a neglykosilované (to je chemicky syntetizované v nebo vytvořené v E-. jcoli) IL-10 stejnocenné a lze jich používat zaměnitelně. Zahrnuty jsou také muteiny a jiné analogy, včetně proteinu BCRF1 (Epstein Barrův virus virální IL-10), který má biologickou aktivitu IL-10.With respect to interleukin-10 or IL-10, it is defined herein as a protein having (a) an amino acid perfect sequence (i.e., lack of a secretory leader sequence) of IL-10 as set forth in U.S. Patent Application Serial No. No. 07 / 917,806 of July 20, 1992, which corresponds to International Application WO 91/003349 and (b) has a biological activity that is common to native IL-10. For the purposes of the invention, they are glycosylated (i.e., produced in eukariotic cells such as cells And non-glycosylated (i.e., chemically synthesized in or generated in E. coli) IL-10 are equivalent and can be used interchangeably, including muteins and other analogs, including the BCRF1 (Epstein Barr virus viral IL-10) protein, which has the biological activity of IL-10.
IL-10, vhodný k použití podle vynálezu, lze získat z řady zdrojů. Může být například izolován z kultury aktivovaných buněk vylučujících protein. Dále může být IL-10, nebo jeho aktivní fragmenty připraven chemickou synthesou za použití standardních v oboru známých technik [Merrifield, Science 233:341 (1986) a Altherton a kol., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989, I.R.L. Press, Oxford],IL-10 suitable for use in the invention can be obtained from a variety of sources. For example, it may be isolated from a culture of activated protein secreting cells. Further, IL-10, or active fragments thereof, can be prepared by chemical synthesis using standard techniques known in the art [Merrifield, Science 233: 341 (1986) and Altherton et al., Solid Phase Peptide Synthesis: A Practical Approach, 1989, I.R.L. Press, Oxford]
S výhodou je protein nebo polypeptid získáván rekombinantními technikami za použití izolované nukleové kyseliny kódující polypeptid IL-10. Obecné způsoby molekulární biologie jsou popsány v literatuře [například Sambrook a kol. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 2. vydání 1989 a Ausubel a kol. (vydavatelé) Current Protocols in Molecular Biology, Green/Woley, New York (1987 a periodické doplňky)]. Příslušné sekvence je možno získat stadardními technikami z každé genomické nebo cDNA knihovny. Lze použít technik polymerazové řetězové reakce (PCR) [například PCR Protocols: A Guide to Methods and App7 lications, 1990, Innis a kol. (vydavatel) Academie Press, NewPreferably, the protein or polypeptide is obtained by recombinant techniques using an isolated nucleic acid encoding an IL-10 polypeptide. General methods of molecular biology are described in the literature [e.g., Sambrook et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, New York, 2nd Edition 1989, and Ausubel et al. (editors) Current Protocols in Molecular Biology, Green / Woley, New York (1987 and periodic supplements)]. Appropriate sequences can be obtained by standard techniques from each genomic or cDNA library. Polymerase chain reaction (PCR) techniques may be used [for example, PCR Protocols: A Guide to Methods and Approaches, 1990, Innis et al. (Publisher) Academie Press, New
York, New York.York, New York.
Knihovny jsou vytvořeny z nukleové kyseliny extrahované z příslušných buněk [například zveřejněná mezinárodní přihlášku vynálezu číslo W0 91/00349, kde jsou popsány rekombinantní metody přípravy IL-10]. Užitečné genové sekvence lze nalézt například v různých databázích sekvencí, například GenBank a BMPL nebo nukleové kyseliny a PIR a Swiss-Prot pro protein, c/i Intelligenetics Mountain View, California, nebo Genetic Computer Group, University of Wiconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin.Libraries are generated from nucleic acid extracted from the respective cells [e.g., International Publication No. WO 91/00349, where recombinant methods for preparing IL-10 are described]. Useful gene sequences can be found, for example, in various sequence databases, such as GenBank and BMPL or nucleic acids and PIR and Swiss-Prot for protein, c / i Intelligenetics Mountain View, California, or Genetic Computer Group, University of Wiconsin Biotechnology Center, Madison, Wisconsin .
Klony, obsahující sekvence jež kódují lidský IL-10, jsou deponovány ve sbírce American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryfand pod „čísly 68191 a 68192. Identifikace ostatních klonů, obsahujících sekvence kódující IL-10, se provádí buď hybridizací nukleové kyseliny nebo imunologickou detekcí zakódovaného proteinu, je-li použito expresního vektoru. Oligonukleidové vzorky, založené na deponovaných sekvencích uvedených v mezinárodní přihlášce vynálezu číslo W0 91/00349, jsou obzvlášť užitečné. Sekvence oligonukleotidových vzorků lze také připravit z konzervovaných oborů příbuzných genů v jiných druzích. Alternativně je možno použít degenerovaných vzorků založených na aminokyselinových sekvencích IL-10.Clones containing sequences encoding human IL-10 are deposited in the American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, Maryfand under " 68191 & 68192. The identification of other clones containing IL-10 coding sequences is accomplished by either nucleic acid hybridization. or by immunologically detecting the encoded protein when an expression vector is used. Oligonucleotide samples based on the deposited sequences disclosed in International Application No. WO 91/00349 are particularly useful. Sequences of oligonucleotide samples can also be prepared from conserved domains of related genes in other species. Alternatively, degenerate samples based on the amino acid sequences of IL-10 may be used.
Standardních metod je možno použít k produkci transformovaných savčích, kvasinkových nebo hmyzích buněčných linií, které expresují velká množství polypeptidu. Exemplární kmeny E. coli, vhodné jak k expresi tak ke klonování zahrnují W3110 /ATCC Bi , 27325, X1776 (TCC č. 31244), X2282, EE1 (ATCC Mp/31343). Exemplární savčí buněčné linie zahrnují buňky COS-7, myší buňky L a buňky CHP (Sambrook (1989) a Ausubel a kol., 1987 doplňky).Standard methods can be used to produce transformed mammalian, yeast, or insect cell lines that express large amounts of polypeptide. Exemplary E. coli strains suitable for both expression and cloning include W3110 / ATCC Bi, 27325, X1776 (TCC # 31244), X2282, EE1 (ATCC Mp / 31343). Exemplary mammalian cell lines include COS-7 cells, mouse L cells and CHP cells (Sambrook (1989) and Ausubel et al., 1987 Supplements).
K expresování DNA kódujících IL-10 je možno použít různých expresních vektorů. Použít lze konvenčních vektorů, používaných k expresi rekombinantních proteinů v prokaryotických nebo eukaryotických buňkách. Mezi vhodné vektory patří vektory pcD, které popsal Okayama a kol., Mol. Cell. Biol. 3:280 (183); a Takebe a kol., Mol. Cell. Biol. 8:466 (1988). K dalším savčím expresním vektorům, založeným na SV40, patří vektory objevené Kaufamanem a kol., [Mol. Cell. Biol.1:1304 (1982)] a vektory popsané v americkém patentovém spise číslo 4 675285. Tyto vektory, založené na SV40, jsou obzvlášť užitečné v opičích buňkách COS-7 (ATCC č. CRL 1651) stejně jako v jiných savčích buňkách, jako jsou myší buňky L [ Pouwels a kol. (1989 dodatky) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York].Various expression vectors can be used to express the DNA encoding IL-10. Conventional vectors used to express recombinant proteins in prokaryotic or eukaryotic cells may be used. Suitable vectors include the pcD vectors described by Okayama et al., Mol. Cell. Biol. 3: 280 (183); and Takebe et al., Mol. Cell. Biol. 8: 466 (1988). Other SV40-based mammalian expression vectors include those disclosed by Kaufaman et al., [Mol. Cell. Biol.1: 1304 (1982)] and the vectors disclosed in U.S. Patent 4,675,285. These SV40-based vectors are particularly useful in monkey COS-7 cells (ATCC No. CRL 1651) as well as other mammalian cells, such as mouse L cells [Pouwels et al. (1989 Appendices) Cloning Vectors: A Laboratory Manual, Elsevier, New York].
IL-10 je možno vyrábět v rozpustné formě jako vylučovaný produkt transformovaných nebo transfektovaných kvasinek nebo savčích buněk. Peptidy je pak možno čistit standardními postupy známými v oboru. Například mohou čisticí operace zahrnovat precipitaci síranem amonném, ionexovou chromatografií, gelovou filtraci, elektroforézu a afinitní chromatografií [Methods of Enzymology Purification Principles and Practices, nakladatelství Springer, New York, 1982 ] .IL-10 can be produced in soluble form as a secreted product of transformed or transfected yeast or mammalian cells. The peptides can then be purified by standard procedures known in the art. For example, purification operations may include ammonium sulfate precipitation, ion exchange chromatography, gel filtration, electrophoresis, and affinity chromatography [Methods of Enzymology Purification Principles and Practices, Springer, New York, 1982].
Alternativně lze IL-10 vyrábět v nerozpustné formě jako agregáty nebo inklusní tělesa. V takové formě se IL-10 čistí standardními postupy dobře známými v oboru. Příklady čisticích operací zahrnují separaci inklusních těles z narušených hostících buněk odstřeďováním a pak rozpouštění inklusních těles chaotropickým činidlem a redukčním činidlem takže peptid zaujme biologicky aktivní uspořádání. Podrobnosti k těmto postupům popisuje například Winkler a kol. [Biochemistry 25:4041 (1986], Winkler a kol., [Bio/Technology 3:9923 (1985]; Koths a kol., [americký patentový spis číslo 4 569790].Alternatively, IL-10 can be produced in insoluble form as aggregates or inclusion bodies. In such form, IL-10 is purified by standard procedures well known in the art. Examples of purification operations include separating inclusion bodies from disrupted host cells by centrifugation and then dissolving the inclusion bodies with a chaotropic agent and a reducing agent such that the peptide assumes a biologically active arrangement. Details of these procedures are described, for example, by Winkler et al. [Biochemistry 25: 4041 (1986), Winkler et al., [Bio / Technology 3: 9923 (1985); Koths et al., [U.S. Pat. No. 4,597,990].
Sekvence nukleotidů, použité k transfektování hostujících buněk, lze modifikovat podle standardních technik k vytváření IL-10 nebo jeho fragmentů s různými požadovanými vlastnostmi. Takové modifikované IL-10 se mohou lišit od sekvencí vyskytujících se v přírodě na úrovni primární struktury, to je aminokyselin, insertů, substitucí, vypuštění a fůzí. Modifikací lze použít v řadě kombinací k vytvoření konečného modifikovaného řetězce proteinů.The nucleotide sequences used to transfect the host cells can be modified according to standard techniques to generate IL-10 or fragments thereof with various desirable properties. Such modified IL-10 may differ from naturally occurring sequences at the level of the primary structure, i.e., amino acids, inserts, substitutions, deletions, and fusions. Modifications can be used in a variety of combinations to form the final modified protein chain.
Varianty sekvencí aminokyselin lze připravit k různým záměrům, včetně zvýšení poločasu životnosti sera, usnadnění čištění nebo přípravy, zlepšení terapeutické účinnosti a snížení závažnosti nebo výskytu vedlejších účinků při terapeutickém použití. Variantami sekvencí aminokyselin jsou obvykle předem určené, v přírodě se nevyskytující varianty, ačkoli jiné mohou být variantami po translaci, například glykosylované varianty nebo proteiny, které jsou konjugovány na polyethylenglykol (PEG). Takových variant je možno v provedeních podle vynálezu použít, pokud si zachovají biologickou aktivitu IL-10.Amino acid sequence variants can be prepared for a variety of purposes, including increasing serum half-life, facilitating purification or preparation, improving therapeutic efficacy, and reducing the severity or incidence of side effects in therapeutic use. The amino acid sequence variants are usually predetermined, non-naturally occurring variants, although others may be translational variants, for example glycosylated variants or proteins that are conjugated to polyethylene glycol (PEG). Such variants may be used in embodiments of the invention as long as they retain the biological activity of IL-10.
Modifikace sekvencí kódující polypeptidy lze snadno uskutečnit různými * technikajni, jako je mutagenese, zaměřená na určité místo [Gillman a kol. Gene 8:81 (1987)]. Většina modifikací se vyhodnocuje rutinním skrínováním ve vhodném testu pro požadované vlastnosti. Například mezinárodní zveřejněná přihláška vynálezu číslo WO 91/00349 popisuje řadu zkoušek in vitro, vhodných k měření aktivity IL-10.Modifications of polypeptide coding sequences can be readily accomplished by various techniques, such as site-directed mutagenesis [Gillman et al. Gene 8:81 (1987)]. Most modifications are evaluated by routine screening in a suitable assay for the desired properties. For example, WO 91/00349 discloses a number of in vitro assays suitable for measuring IL-10 activity.
Lidského IL-10 se s výhodou používá k ošetřování lidí, ačkoli je možno použít virálního IL0-10 nebo IL-10 z některých jiných druhů savců. Nejvýhodnějším používaným IL-10 je rekombinantní lidský IL-10. Příprava lidského a myšího IL-10 byla popsána v mezinárodním patentovém spise číslo WO 91/00349. Klonování a expresi virálního IL-10 (proteinu BCRF1) z Epstein Barrrova viru popsal Moore a kol. [Science 248:1230 (1990)]. Rekombinantní lidský IL-10 je také obchodním produktem například společnosti PreproTech,Inc., Rocky Hill, NJ.Human IL-10 is preferably used to treat humans, although viral IL-10 or IL-10 from some other mammalian species may be used. The most preferred IL-10 used is recombinant human IL-10. The preparation of human and murine IL-10 has been described in WO 91/00349. The cloning and expression of viral IL-10 (BCRF1 protein) from Epstein Barrr virus has been described by Moore et al. [Science 248: 1230 (1990)]. Recombinant human IL-10 is also a commercial product of, for example, PreproTech, Inc., Rocky Hill, NJ.
Mezi jedince, vhodné k léčení způsoby podle vynálezu, patří všichni jedinci s novotvarovým onemocněním, u kterých by mohla být blahodárná stimulace cytolytické aktivity PBMC, obzvláště buněk LAK a NK. Příklady pacientů s rakovinou uvádí například shora uvedený Rosenbergův patentový spis a článek v americkém vědeckém tisku. Vhodnými pacienty pro léčení způsoby podle vynálezu jsou jedinci s disposicí na zvýšení úrovně endogenního IL-4, kde IL-4 blokuje aktivaci cytolytické aktivity IL-2. U takových jedinců by vhodné léčení zahrnovalo předléčení IL-10 před podáváním IL-2.Subjects suitable for treatment by the methods of the invention include all individuals with neoplasm diseases in which the stimulation of the cytolytic activity of PBMCs, particularly LAK and NK cells, could be beneficial. Examples of cancer patients are given, for example, by the above Rosenberg patent and an article in the American scientific press. Suitable patients for treatment with the methods of the invention are individuals with an elevated endogenous IL-4 level, wherein IL-4 blocks activation of the cytolytic activity of IL-2. In such individuals, appropriate treatment would include pretreatment of IL-10 prior to administration of IL-2.
Standardních způsobů a technik, popsaných pro výrobu IL-10 k použití podle vynálezu, je možno použít také k výrobě IL-2 a α-IFN. IL-2 a α-IFN jsou také obchodně dostupné (například IL-2 je obchodním produktem společnosti Cetus Corporation, Emeryville, CA a α-IFN obchodním produktem společnosti Schering Corp., Kenilworth, NJ ) .The standard methods and techniques described for the production of IL-10 for use in the invention can also be used to produce IL-2 and α-IFN. IL-2 and α-IFN are also commercially available (for example, IL-2 is a commercial product of Cetus Corporation, Emeryville, CA and α-IFN a commercial product of Schering Corp., Kenilworth, NJ).
Mimotělní aktivace PBMC (s výhodou získaných standardními způsoby z ošetřovaného pacienta) a podávání takových buněk se provádí výhradně způsobem podle shora uvedených prací Rosenberga s tou výjimkou, že .IL/-10 spolu se sníženými úrovněmi IL-2 a/nebo α-IFN se používají jak je popsáno v tomto vynálezu. Počet podávaných aktivovaných PBMC je přibližně ÍO6 až přibližně 1012 buněk. S výhodou, nikoli však nutně, je podávání takových buněk doprovázeno a nebo následováno podáváním IL-10, jak zde popsáno.The extracorporeal activation of PBMCs (preferably obtained by standard methods from the treated patient) and the administration of such cells is carried out exclusively according to the Rosenberg work described above, except that IL / -10 along with reduced IL-2 and / or α-IFN levels used as described in this invention. The number of activated PBMCs administered is about 10 6 to about 10 12 cells. Preferably, but not necessarily, administration of such cells is accompanied or followed by administration of IL-10 as described herein.
Podle jednoho provedení jsou PBMC ativovány předzpracováním IL-10 [například přibližně třídenní inkubací při teplotě 37 ’C v přítomnosti 4 ng/ml (100 jednotek/ml) nebo 40 ng/ml lidského IL-10]. Pak se buňky promyjí k odstranění volného IL-10 a přidají se malá množství (zpravidla přibližně 2 jednotky/ml) IL-2.In one embodiment, PBMCs are activated by IL-10 pretreatment [e.g., about 3 days incubation at 37 ° C in the presence of 4 ng / ml (100 units / ml) or 40 ng / ml human IL-10]. The cells are then washed to remove free IL-10 and small amounts (typically about 2 units / ml) of IL-2 are added.
Podávání cytolytických buněk, aktivovaných IL-10, samotných nebo v kombinaci s ostatními zde používanými cytokiny, se uskutečňuje s výhodou intravenosní infusí. Lze to provádět například centrálním intravenosním katetrem do velké periferální cévy, nebo do hepatické tepny perkutánním katetrem.Administration of IL-10 activated cytolytic cells, alone or in combination with other cytokines used herein, is preferably accomplished by intravenous infusion. This can be done, for example, by a central intravenous catheter into a large peripheral vessel, or into a hepatic artery by a percutaneous catheter.
IL-10 se obecně podává jako farmaceutický prostředek obsahující farmaceutický nosič a účinné množství IL-10 samotného nebo v kombinaci s IL-2 a/nebo α-IFN. Farmaceutickým nosičem může být jakákoli netoxická látka vhodná k dodávání prostředku podle vynálezu pacientovi. Prostředky vhodné k parenterálnímu podávání takových drog jsou dobře známé [například Remington's Pharmaceuti 11 cal Science. 15. vydání, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980]. Alternativně mohou být prostředky podle vynálezu vpraveny do pacientova těla systémem implantování nebo injektování drogy [například Urquhart a kol., Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. 24:199 (1984); Lewis (vyd.) Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenům Press, NY.1981); americký patentový spis číslo 3 270960].IL-10 is generally administered as a pharmaceutical composition comprising a pharmaceutical carrier and an effective amount of IL-10 alone or in combination with IL-2 and / or α-IFN. The pharmaceutical carrier may be any non-toxic agent suitable for delivering the composition of the invention to a patient. Compositions suitable for parenteral administration of such drugs are well known [for example, Remington's Pharmaceutical Science. 15th Edition, Mack Publishing Company, Easton, PA, 1980]. Alternatively, the compositions of the invention may be incorporated into the patient's body by a drug implantation or injection system [e.g., Urquhart et al., Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol. 24: 199 (1984); Lewis (ed.) Controlled Release of Pesticides and Pharmaceuticals, Plenum Press, NY.1981); U.S. Patent No. 3,270,960].
Podávání cytokinů je možné dobře známými cestami včetně intravenosního, intraperitoneálního, a subkutánního. Výhodné je intravenosní podávání.Cytokine administration is possible by well known routes including intravenous, intraperitoneal, and subcutaneous. Intravenous administration is preferred.
Pokud jsou prostředky podávány parenterálně, jsou formulovány do injektovatelných jednotkových dávek (roztoků, suspensí, emulsí) spolu s farmaceutickým nosičem. Příklady takových nosičů jsou normální solanka, Ringerův roztok, dextrosový roztok a Hankův roztok. Použít je možno také nevodných nosičů jako fixovaných olejů a ethyloleátu. Výhodným nosičem je 5% směs dextrosy a solanky. Nosič může obsahovat malá množství aditivů, jako jsou látky usnadňující isotonicitu a chemickou stálost, například pufry a konzrervující látky. IL-10 je s výhodou formulován ve vyčištěné formě v podstatě prosté agregátů a jiných proteinů v koncentraci přibližně 5 až 20 gg/ml.When administered parenterally, the compositions are formulated in injectable unit doses (solutions, suspensions, emulsions) together with a pharmaceutical carrier. Examples of such carriers are normal saline, Ringer's solution, dextrose solution, and Hank's solution. Non-aqueous carriers such as fixed oils and ethyl oleate may also be used. A preferred carrier is a 5% dextrose / brine mixture. The carrier may contain small amounts of additives such as isotonicity and chemical stability aids, for example, buffers and preservatives. Preferably, IL-10 is formulated in purified form substantially free of aggregates and other proteins at a concentration of about 5 to 20 gg / ml.
Prostředky podle vynálezu je možno dodávat také technikami standardní genové terapie, včetně například přímého injektování DNA do tkání, použtí rekombinantních virálních vektorů a implantace transfektovaných buněk [například Rosenberg, J. Clin. Oncol. 10:180 (1992)].The compositions of the invention may also be delivered by standard gene therapy techniques, including, for example, direct injection of DNA into tissues, use of recombinant viral vectors, and implantation of transfected cells [e.g., Rosenberg, J. Clin. Oncol. 10: 180 (1992)].
Společné podávání jednoho nebo několika popsaných terapeutických činidel může být současné (spolu s podáváním IL-10), nebo postupné. S výhodou je například podáván IL-10 před podáním 11-2. Podávání α-IFN může být současné s IL-10 a/nebo IL—2 nebo postupné. Všechna podávaná činidla mají být v pacientově těle v úrovni postačující k terapeutickému účinku vyvolání ústupu nádoru .Co-administration of one or more of the disclosed therapeutic agents may be co-administered (along with IL-10 administration) or sequential. For example, preferably IL-10 is administered prior to administration of II-2. Administration of α-IFN may be concomitant with IL-10 and / or IL-2 or sequential. All agents administered should be in the patient's body at a level sufficient for the therapeutic effect of inducing tumor regression.
Účinným množstvím se zde míní množství IL-10 postačující ke snížení nebo prevenci vedlejších účinků v adoptivní imunoterapii a k současnému podpoření cytolytické aktivity buněk LAK a NK. Účinné množství cytokinů, potřebné pro jednotlivého pacienta, se může měnit v závislosti na takových činitelech, jakými jsou například stav a typ léčeného novotvarového onemocnění, celkový zdravotní stav pacientaa, způsob podávání, závažnost vedlejších účinků, množství a druh současně podávaných drog.By effective amount is meant herein an amount of IL-10 sufficient to reduce or prevent side effects in adoptive immunotherapy and at the same time promote the cytolytic activity of LAK and NK cells. The effective amount of cytokine required for a particular patient may vary depending upon such factors as the condition and type of neoplasm being treated, the general health of the patient, the mode of administration, the severity of side effects, the amount and type of drugs co-administered.
Množství cytokinů postačující ke zvýšení aktivace buněk LAK je zde definováno jako průměrné množství cytokinů, potřebě k vytvoření alespoň 25% nárůstu úrovně cytolytické aktivity vyvolané IL-10 samotným v cytolytickém testu, založeném na Daudiho buňkách. S výhodou je, nárůst nejméně asi 50% a nejvýhodněji nejméně asi 100%.The amount of cytokines sufficient to increase LAK cell activation is defined herein as the average amount of cytokines needed to generate at least a 25% increase in the level of cytolytic activity induced by IL-10 alone in a Daudi cell-based cytolytic assay. Preferably, the increase is at least about 50%, and most preferably at least about 100%.
S výhodou se IL-10 podává v maximální snesitelné dávce od přibližně 10 jednotek na kilogram hmotnosti (J/kg) za den až do přibližně 108 jednotek na kilogram hmotnosti (J/kg) za den. Podobně se mají podávat také IL-2 a α-IFN v maximální snesitelné dávce (například pro IL-2 je dávka : 105 J/kg tělesné hmotnosti podávaná intravenosně každých 8 hodin v 50 ml 0,9% solanky s 5% albuminu jako nosiči; pro (X-IFN je dávka: 106 J/kg tělesné hmotnosti podávaná intravenosně každých 8 hodin v 50 ml 0,9% solanky s 5% albuminu jako nosiči). Jak bylo shora uvedeno, stanoví dávkování lékař v mezích určených jako snesitelné pro každého pacienta individuálně.Preferably, IL-10 is administered at a maximum tolerable dose of from about 10 units per kilogram of weight (J / kg) per day to about 10 8 units per kilogram of weight (J / kg) per day. Similarly, IL-2 and α-IFN should also be administered at the maximum tolerable dose (for example, for IL-2 the dose is: 10 5 J / kg body weight administered intravenously every 8 hours in 50 ml of 0.9% brine with 5% albumin as for (X-IFN is the dose: 10 6 J / kg body weight administered intravenously every 8 hours in 50 ml of 0.9% saline with 5% albumin as the carrier). tolerable for each patient individually.
Způsobů podle vynálezu je možno také používat v souvislosti s tradičními postupy léčení rakoviny, jako je ozařování a chemoterapie, při použití tradičních chemoterapeutických činidel jako jsou alkaloidy Vinca, sloučeniny platiny a 5-fluorouraci 1.The methods of the invention may also be used in conjunction with traditional cancer treatments such as radiation and chemotherapy using traditional chemotherapeutic agents such as Vinca alkaloids, platinum compounds and 5-fluorouration 1.
Ošetřování lidských jednojaderných buněk periferní krve IL-10 samotným nebo v kombinaci s jinými cytokiny vyvolává nárůst cytolytické aktivity vůči lidským cílovým nádorovým. Jelikož je účinnost imunoterapie do velké míry závislá na nádorovém zatíže13 ní, bylo by obzvlášť blahodárné aplikovat zde popsané způsoby léčení po excisi většiny primární hmoty nádoru. Zánětlivé reakci, ke které typicky dochází v místě chirurgického zákroku, může být také s výhodou terapeuticky předcházeno.Treatment of human peripheral blood mononuclear cells with IL-10 alone or in combination with other cytokines induces an increase in cytolytic activity towards human target tumor cells. Since the efficacy of immunotherapy is largely dependent on tumor burden, it would be particularly beneficial to apply the treatment methods described herein after excision of most of the primary tumor mass. The inflammatory reaction typically occurring at the surgical site can also be advantageously therapeutically prevented.
Vynález blíže objasňují, bez záměru na jakémkoliv omezení, následující příklady praktického provádění.The invention is illustrated in more detail by the following non-limiting examples.
Příklady provedení vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
Účinek IL-10 na cytolytickou aktivitu lidských jednojaderných buněk periferní krveThe effect of IL-10 on the cytolytic activity of human peripheral blood mononuclear cells
Výsledky studfe účinku vytvoření cytolytické aktivity lidských jednojaderných buněk periferní krve působením IL-10 in vitro jsou shrnuty do následujících poznatků:The results of an in vitro study of the effect of the cytolytic activity of human peripheral blood mononuclear cells by IL-10 are summarized as follows:
1. IL-10 stimuluje aktivitu lymfokiny aktivovaného ničení (LAK) a přírodních zabijáckých buněk (NK) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve. Cytolytická aktivita řízená IL-10 může být neutralizována krysími monoklonálními protilátkami proti IL-10.IL-10 stimulates the activity of lymphokine activated killer (LAK) and natural killer cells (NK) in human peripheral blood mononuclear cells. IL-10-directed cytolytic activity can be neutralized by rat anti-IL-10 monoclonal antibodies.
2. IL-10 odvozené z expresních systémů CHO a E.coli vykazují podobné obrazce koncentrační odezvy ve stimulaci aktivit LAK a NK a jsou tudíž biologicky rovnocenné.2. IL-10 derived from CHO and E. coli expression systems exhibit similar concentration response patterns in stimulating LAK and NK activities and are therefore biologically equivalent.
3. PBMC zpracovaný IL-10 a nízkými koncentracemi IL-2 vykazuje aktivity LAK větší než jsou pozorovány s každým cytokinem samotným.3. PBMCs treated with IL-10 and low concentrations of IL-2 exhibit LAK activities greater than those observed with each cytokine alone.
4. PBMC předem ve dvou dnech zpracovávaný IL-10 vykazuje zvýšenou cytolytickou aktivitu po následné přísadě IL-2.4. PBMCs pre-treated with IL-10 at two days exhibit increased cytolytic activity following subsequent addition of IL-2.
5. IL-10 působí opačně na schopnost IL-4 zabraňovat aktivitě LAK vyvolané IL-2.IL-10 counteracts IL-4's ability to prevent IL-2-induced LAK activity.
6. IL-10 spolu s IL-2 vytvářejí zlepšenou cytolytickou aktivitu LAK při nízkém poměru efektorových buněk k cílovým buňkám.IL-10 together with IL-2 produce improved cytolytic activity of LAK at low effector cell to target cell ratios.
Vedle účinků pozorovaných na PBMC se zjistilo, že endothe14 liální buňky, kultivované v přítomnosti IL-10, vykazují neporovnatelnou odezvu na exogenní faktory (to je na gama-IFN a na TNFa), zatímco endotheliální buňky, inkubované v přítomnosti IL-2, byly bez odezvy vzhledem k toxicitě IL-2.In addition to the effects observed on PBMCs, endothelial cells cultured in the presence of IL-10 were found to exhibit an incomparable response to exogenous factors (i.e., gamma-IFN and TNFα), whereas endothelial cells incubated in the presence of IL-2 were no response to toxicity of IL-2.
Materiál a metodyMaterial and methods
Rekombinantní lidské cytokiny a protilátky Anti-IL-10Recombinant human cytokines and anti-IL-10 antibodies
Standardními metodami se připraví rekombinantní IL-10 (odvozený jak z E.coli, tak z CHO). Po vyčištění standardními metodami jsou získané aktivity 4,1 χ 107 (E.coli) a 2,1 χ 107 jednotek/mg(CHO)r , zjištěné testem proliferace buněk MC-9 [Thompson-Snipes a kol., J.Exp.Med. 173:507 (1991)]. Přibližně 4 ng v podstatě homogenního IL-10 má přibližně 100 jednotek takto definované biologické aktivity.Recombinant IL-10 (derived from both E.coli and CHO) was prepared by standard methods. After purification by standard methods, the activities obtained are 4.1 χ 10 7 (E.coli) and 2.1 χ 10 7 units / mg (CHO) r , as determined by the MC-9 cell proliferation assay [Thompson-Snipes et al., J. Exp.Med. 173: 507 (1991)]. Approximately 4 ng of substantially homogeneous IL-10 has about 100 units of biological activity thus defined.
Od doktora John Adamse z institutu DNAX molekulární biologie Palo Alto, CA, se získala krysí protilidská IL-10 monoklonální protilátka označená 19F1.A rat anti-human IL-10 monoclonal antibody designated 19F1 was obtained from Dr. John Adams of the DNAX Molecular Biology Institute of Palo Alto, CA.
Izolace lidských periferních jednojaderných krevních buněk (PBMC)Isolation of human peripheral mononuclear blood cells (PBMC)
Za použití heparinu nebo EDTA jako protisráž1 ivých látek se získá periferní krev od zdravých dospělých dárců. PBMC se separují dvouoperačním protokolem sestávajícím z dextranové sedimentace následované odstředěním na aparátu FICOL PAQUER při 1250 otáčkách za minutu. Mezifázové spoje, tvořené především lyrofocytyty a monocyty, se shromáždí a promyjí se nejméně dvakrát RPMI obsahujícím 10 % zárodečného telecího séra (complete medium) (JRH Biosc i ences ) .Using heparin or EDTA as anticoagulants, peripheral blood is obtained from healthy adult donors. PBMCs are separated by a two-operation protocol consisting of dextran sedimentation followed by centrifugation on a FICOL PAQUE R apparatus at 1250 rpm. The interphase junctions, mainly composed of lyrophocytes and monocytes, are collected and washed at least twice with RPMI containing 10% complete medium (JRH Biosceles ences).
Testy cytotoxicityCytotoxicity tests
Ze sbírky tkání American Type Tissue Collection se získají cílové buňky Daudi (citlivé na LAK) a K5762 (Citlivé na NK) s objednacím číslem CCL 213 a CCL 243. Buňky Daudi a K 562 se označí izotopem 51Cr jak je popsáno v literatuře Spits a kol. [J. Immunol. 141:29 (1998)]. Po kultivační periodě se PBMC shromáždí, promyjí se dvakrát a použijí se jako efektorové buňky v testu uvolňování izotopu 51Cr (Spits a kol.). 5xl03 buněk, značených izotopem 51Cr, se smísí s různým množstvím efektorových buněk (E/T = 20:1; 5:1 a 2:1) ve 100 μΐ 96 důlkových destiček se dnem tvaru V. Před 4-hodinovou inkubací při teplotě 37 'C v navlhčeném prostředí 5X oxidu uhličitého se destičky odstřeďují při 1000 otáčkách za minutu po dobu 5 minut. Po 4 hodinách se destičky odstřelují 5 minut při 500 x g. Supernatanty se shromáždí přístrojem SKATR0NR (Skatron Instruments) a v gama čítači (LKB-Pharamcia) se provede sečtení. Celková lyse se stanoví inkubováním izotopem 51Cr značených cílových buněk s IX SDS. Údaje jsou průměrem ze tří stanovení. Percentuelní lyse se vypočte následovně:From the American Type Tissue Collection, Daudi target cells (LAK sensitive) and K5762 (NK sensitive) were obtained with order numbers CCL 213 and CCL 243. The Daudi and K 562 cells were labeled with the 51 Cr isotope as described in the Spits literature and col. [J. Immunol. 141: 29 (1998)]. After the culture period, PBMCs are collected, washed twice and used as effector cells in the 51 Cr isotope release assay (Spits et al.). 5x10 3 cells, labeled with 51 Cr isotope, are mixed with different amounts of effector cells (E / T = 20: 1; 5: 1 and 2: 1) in 100 μΐ 96 V-bottom plated plates. At 37 ° C in a humidified 5X carbon dioxide medium, the plates are centrifuged at 1000 rpm for 5 minutes. After 4 hours, the plates were centrifuged for 5 minutes at 500 x g. The supernatants were collected by a SKATR0N R (Skatron Instruments) and counted in a gamma counter (LKB-Pharamcia). Total lysis is determined by incubating isotope 51 Cr labeled target cells with 1X SDS. Data are the average of three determinations. The percentage lysis is calculated as follows:
cpm uvolněných experimentálně - cpm spontánních X lyse = - x 100 cpm totální lyse - cpm spontánnícpm released experimentally - cpm spontaneous X lyse = - x 100 cpm total lyse - cpm spontaneous
Inkubace lidských PBMC s cytokinyIncubation of human PBMCs with cytokines
a. Inkubace se samotným IL-10Incubation with IL-10 alone
PBMC, izolované popsaným způsobem, se udržují v koncentraci lxlO6 buněk/ml v RPMI-1640, obsahujícím 10 X zárodečného telecího séra doplněného IL-10 nebo lidským IL-10 (CHO) při teplotě 37 *C po dobu tří dnů, pokud není uvedeno jinak. Cytolytická aktivita se stanoví, jak popsáno shora.PBMCs isolated as described are maintained at a concentration of 1x10 6 cells / ml in RPMI-1640 containing 10X germinal calf serum supplemented with IL-10 or human IL-10 (CHO) at 37 ° C for three days unless stated otherwise. Cytolytic activity is determined as described above.
b. Současná inkubace s IL-10 a IL-2b. Co-incubation with IL-10 and IL-2
PBMC se inkubují 3 dny se 4 ng/ml IL-10 s lidským IL-2 (Genzyme) (2 nebo 20 J/ml) nebo bez něho při teplotě 37 *C.PBMCs are incubated for 3 days with 4 ng / ml IL-10 with or without human IL-2 (Genzyme) (2 or 20 J / ml) at 37 ° C.
c. Postupná inkubace s IL-10 a IL-2c. Sequential incubation with IL-10 and IL-2
PBMC se inkubují 2 dny se 4 ng/ml IL-10 v úplném prostředí.PBMCs are incubated for 2 days with 4 ng / ml IL-10 in complete medium.
Lidský IL-2 se přidává do konečné koncentrace 3 nebo 20 J/ml. Po inkubaci přes noc se stanoví cytolytické aktivity LAK a NK.Human IL-2 is added to a final concentration of 3 or 20 J / ml. After overnight incubation, the cytolytic activities of LAK and NK are determined.
Účinek monoklonálnich protilátek anti-IL-10 na aktivaci IL-10 buněk LAK a NK.Effect of anti-IL-10 monoclonal antibodies on the activation of IL-10 by LAK and NK cells.
PBMC se inkubují tři dny se 4 ng/ml IL-10 v přítomnosti 2 μg/ml monoklonálni protilátky anti-IL-10 (19F1) nebo isotypické kontrolní (krysí IgG2a).PBMCs are incubated for three days with 4 ng / ml IL-10 in the presence of 2 µg / ml anti-IL-10 monoclonal antibody (19F1) or isotype control (rat IgG2a).
Účinek IL-10 na cytolytickou aktivitu lymfokiny aktivovaných zabijáckých'. buněk a přírodních zabijáckých buněk v lidských jednojaderných buňkách periferní krve.Effect of IL-10 on the cytolytic activity of activated killer lymphokines. cells and natural killer cells in human peripheral blood mononuclear cells.
Cytolytická aktivita buněk LAK a NK může být operativně rozlišena na základě použitých cílových nádorových buněk. Tradičními cíli pro cytolytickou aktivitu aktivovaných buněk LAK jsou buňky Daudi, odvozené z lidského Burkittova lymphomu. Jako specifických cílů pro cytolytickou aktivitu aktivovaných buněk NK se použije buněk z buněčné linie K562, lidské erytroleukemické linie buněk. Při těchto pokusech se lidské PMBC zpracovávají tři dny při různých koncentracích IL-10. Cytolytická aktivita se stanoví shora popsaným standardním testem uvolňování 51Cr.The cytolytic activity of LAK and NK cells can be operatively differentiated based on the target tumor cells used. Traditional targets for the cytolytic activity of activated LAK cells are Daudi cells derived from human Burkitt's lymphoma. As specific targets for the cytolytic activity of activated NK cells, cells from the K562 cell line, the human erythroleukemic cell line, are used. In these experiments, human PMBC was treated for three days at different concentrations of IL-10. Cytolytic activity is determined by the standard 51 Cr release assay described above.
Výsledky založené na aktivitě LAK jsou v tabulce I, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.Results based on LAK activity are shown in Table I, where the standard deviations are below the mean values.
Tabulka ITable I
a Percentuální lyse cílů Daudi 51Cr ve standardním testu uvolňování chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení. and Percent Lysis of Daudi 51 Cr targets in a standard chromium release assay at an effector to target cell ratio of 20: 1. Data are the means of three determinations.
b Lidské PMBC, připravené od normálních dárců, se zpracovávají tři dny IL-10 před-stanovením cytolytické aktivity. c Významný rozdíl mezi IL-10 zpracovaným a střední kontrolou při p 1 0,05 zjištěným Studentovým t-testem. b Human PMBC, prepared from normal donors, is treated for three days with IL-10 prior to cytolytic activity determination. c Significant difference between IL-10 treated and moderate control at p 1 0.05 determined by Student's t-test.
Údaje v tabulce I ukazují vliv IL-10 na aktivitu LAK v PBMC, získaných od šesti lidských dárců. Ačkoli je rozmanitost mezi dárci zřejmá, vyvolal IL-10 u všech dárců nárůst cytolitické aktivity v závislosti na koncentraci. Statisticky významná aktivita (p< 0,05) je pozorována při koncentracích IL-10 0,4 ng/ml nebo větší. Je také patrno, že PBMC dárce se základní úrovní cytolytické aktivity (to je v nepřítomnosti cytokinu) 5% nebo méně nejvíce vypovídají o IL-10 při všech zkoušených poměrech efektorových buněk k cílovým buňkám (údaje neuvedeny).The data in Table I show the effect of IL-10 on LAK activity in PBMCs obtained from six human donors. Although diversity among donors is evident, IL-10 induced a concentration-dependent increase in cytolytic activity in all donors. Statistically significant activity (p <0.05) is observed at IL-10 concentrations of 0.4 ng / ml or greater. It is also seen that donor PBMCs with a baseline cytolytic activity level (i.e., in the absence of a cytokine) of 5% or less most predict IL-10 at all effector to target cell ratios tested (data not shown).
Podobných výsledků bylo dosaženo vůči jiným cílovým buňkám, včetně buněčné linie lidské rakoviny ledvin, dvou různých lidských melanomových liniím a lidských linií rakoviny tlustého střeva. Buněčné linie rakoviny ledvin a melanomů použil také Rosenberg a pacienti s takovými nádory byli léčeni Rosenbergem in vivo pomocí adoptivní imunoloterapie IL-2. Ve všech případech byla percentní lyse cílových buněk závislá na koncentraci IL-10.Similar results were obtained against other target cells, including the human kidney cancer cell line, two different human melanoma lines, and human colon cancer lines. The kidney and melanoma cancer cell lines have also been used by Rosenberg, and patients with such tumors have been treated with Rosenberg in vivo using adoptive immunolotherapy of IL-2. In all cases, the percentage lysis of the target cells was dependent on IL-10 concentration.
Při dalších pokusech se zjistilo, že IL-10 samotný nebo v kombinaci s IL—2 vyvolává nárůst cytolytické aktivity vůči buň18 kám U937 (lidská histiocytoma), SW62O (lidská rakovina tlustého střeva) a SKBR3 (lidská rakovina prsu). V experimentech s použitím buněk HS294T (lidská melanoma) jako cílových se při zkoušených koncentacích neukázalo, že IL-10 vyvolává odezvu.In further experiments, IL-10 alone or in combination with IL-2 was found to induce an increase in cytolytic activity against U937 (human histiocytoma), SW62O (human colon cancer) and SKBR3 (human breast cancer) cells. In experiments using HS294T (human melanoma) cells as targets, IL-10 did not appear to elicit a response at the concentrations tested.
Základní cytolytická aktivita NK (to je lyse cílových buněk K562 v nepřítomnosti cytokinů) má sklon být vyšší než základní aktivita LAK. Aktivita NK může být dále zvýšena cytokiny, jako je IL-2 [Perussia uvedený shora, Phillips a Lanier, J. Exp. Med. 164:814 (1986)].The basal cytolytic activity of NK (i.e., lysis of K562 target cells in the absence of cytokines) tends to be higher than the basal activity of LAK. NK activity may be further enhanced by cytokines such as IL-2 [Perussia supra, Phillips and Lanier, J. Exp. Copper. 164: 814 (1986)].
Účinek IL-10 na aktivitu NK byl vyhodnocen u PBMC těchže šesti shora uvedených dárců v pokusech probíhajících paralelně s testy LAK. Výsledky jsou obsaženy v tabulce II, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.The effect of IL-10 on NK activity was evaluated in PBMCs of the same six donors listed above in experiments running in parallel to LAK assays. The results are shown in Table II, where the standard deviations are below the mean values.
Tabulka IITable II
Stimulace aktivity NK (vyjádřená jako % lyse3) v PBMC působením IL-10)Stimulation of NK activity (expressed as% lysis 3 ) in PBMC by IL-10)
Koncentrace IL-10 (ng/ml)b IL-10 concentration (ng / ml) b
vání chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení.chromium at a ratio of effector to target cells of 20: 1. Data are the means of three determinations.
b Lidské PMBC, připravené od normálních dárců, se zpracovávají tři dny IL-10 před stanovením cytolytické aktivity. b Human PMBC, prepared from normal donors, is treated three days before IL-10 is assayed for cytolytic activity.
c Významný rozdíl mezi IL-10 zpracovaným a střední kontrolou při p <. 0,05 zjištěným Studentovým t-testem. c Significant difference between IL-10 treated and mean control at p <. 0.05 determined by Student's t-test.
Jak z tabulky II vyplývá, vyvolává IL-10 významné, na dávce závislé zlepšení cytotoxicity zprostředkované buňkami NK v PBMC dárců. Došlo ke statisticky významnému nárůstu lytické aktivity při koncentracích IL-10 4 ng/ml nebo větší. Podobně jako u aktivity LAK, měnil se u různých dárců účinek IL-10 na NK.As shown in Table II, IL-10 induces a significant dose-dependent improvement in NK cell-mediated cytotoxicity in donor PBMCs. There was a statistically significant increase in lytic activity at IL-10 concentrations of 4 ng / ml or greater. Similar to LAK activity, the effect of IL-10 on NK was varied in various donors.
Porovnání účinků IL-2 s účinky IL-10 na endotheliální buňkyComparison of the effects of IL-2 with those of IL-10 on endothelial cells
Provedly se ^pojcusy k vyhodnoceni životnosti monovrstvy endotheliálních buněk po vystavení účinkům IL-10. Endotheliální buňky, kultivované v přítomnosti IL-10, vykazují neporovnatelnou odezvu na exogenní cytokiny (gama-IFN a TNF-α), zatímco paralelní kultury, vystavené působení jednotkových ekvivalentních dávek IL-2 po stejně dlouhou inkubační dobu, ztatily schopnost odezvy, způsobené toxicitou IL-2.Concepts were performed to assess endothelial cell monolayer viability after exposure to IL-10. Endothelial cells cultured in the presence of IL-10 show an incomparable response to exogenous cytokines (gamma-IFN and TNF-α), while parallel cultures exposed to unit equivalent doses of IL-2 for the same incubation period have lost the ability to respond due to toxicity IL-2.
Účinek monoklonálních protilátek anti-IL-10 na aktivaci buněk LAK a NK působením IL-10Effect of anti-IL-10 monoclonal antibodies on activation of LAK and NK cells by IL-10
Jak vyplývá z tabulek III a IV, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky s průměrnými hodnotami, stimulace cytolytické aktivity LAK a NK 40 ng/ml IL-10 je snížena trojásobně (pí. 0,05) v přítomnosti 2 μg/ml anti-IL-10 monoklonální protilátky 19F1. Výsledky vytvořené místo toho za použití 2 μδ/ιηΐ isotypických kontrolních protilátek krysího IgG2a, vedly k úrovni cytolytické aktivity statisticky neodlišitelné od výsledků získaných se 40 ng/ml IL-10 samotného.As shown in Tables III and IV, where standard deviations are presented with mean values, the stimulation of cytolytic activity of LAK and NK 40 ng / ml IL-10 is reduced 3-fold (p. 0.05) in the presence of 2 µg / ml anti-IL- 10 monoclonal antibodies 19F1. Instead, the results generated using the 2 μδ / ιηotyp isotype control rat IgG2a control antibodies resulted in a level of cytolytic activity statistically indistinguishable from the results obtained with 40 ng / ml IL-10 alone.
Tabulka IIITable III
Inhibice lymfokiny aktivované cytolytické aktivity zabijáckých buněk, vyvolaná IL-10 (vyjádřená jako procento lyse3) působením monoklonálních protilátek anti-IL-10Inhibition of IL-10 induced lymphokine-activated cytolytic activity of killer cells (expressed as percentage of lys 3 ) by anti-IL-10 monoclonal antibodies
Inkubační podmínky*3 Incubation conditions * 3
jsou středy ze tří stanovení.are the midpoints of the three determinations.
b Lidské jednojaderné buňky periferní krve, izolované od normálních dárců se zpracovávají tři dny 40 ng/ml IL-10 v přítomnosti 2 mg/ml 19F1 (anti-lidský IL-10) nebo krysím IgG2a (isotypická kontrola) před stanovením cytolytické aktivity. b Human peripheral blood mononuclear cells isolated from normal donors are treated for three days with 40 ng / ml IL-10 in the presence of 2 mg / ml 19F1 (anti-human IL-10) or rat IgG2a (isotypic control) before determining cytolytic activity.
c Významný rozdíl mezi zpracování IL-10 samotným a IL-10 v přítomnosti protilátek anti-IL-10 při p i 0,05 zjištěným Studentovým t-testem. c Significant difference between treatment of IL-10 alone and IL-10 in the presence of anti-IL-10 antibodies at pi 0.05 as determined by Student's t-test.
Tabulka IVTable IV
Neutralizace aktivity přírodních ničivých buněk vyvolaná IL-10 (vyjádřená v procentech lyse3) působením monoklonálních protilátek anti-IL-10Neutralization of IL-10 induced natural destructive cell activity (expressed as lys 3 percent) by anti-IL-10 monoclonal antibodies
Inkubační podmínky15 Incubation conditions 15
jsou středy ze tří stanovení.are the midpoints of the three determinations.
b Lidské jednojaderné buňky periferní krve izolované od normálních dárců se zpracovávají tři dny 40 ng/ml IL-10 v přítomnosti 2 mg/ml 19F1 (anti-lidský IL-10) nebo krysím IgG2a (isotypická kontrola) před stanovením cytolytické aktivity. b Human peripheral blood mononuclear cells isolated from normal donors are treated for three days with 40 ng / ml IL-10 in the presence of 2 mg / ml 19F1 (anti-human IL-10) or rat IgG2a (isotypic control) before determining cytolytic activity.
c Významný rozdíl mezi zpracování IL-10 samotným a IL-10 v přítomnosti protilátek anti-IL-10 při p £ 0,05 zjištěným Studentovým t-testem. c Significant difference between IL-10 processing alone and IL-10 in the presence of anti-IL-10 antibodies at p < 0.05 as determined by Student's t-test.
Cytolytická aktivita vyvolaná kombinací IL-10 a jiných cytokinůCytolytic activity induced by a combination of IL-10 and other cytokines
a. Současná inkubace IL-10 s IL-2a. Co-incubation of IL-10 with IL-2
Lidské PMBC se inkubují s podmaximálními stimulačními kon22 centracemi IL—2 (2 nebo 20 U/ml) v přítomnosti IL-10 při poměru efektorových buněk k cílovým buňkám 5:1 s výsledky uvedenými v tabulce V, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.Human PMBCs are incubated with sub-maximal stimulation con22 concentrations of IL-2 (2 or 20 U / ml) in the presence of IL-10 at an effector cell to target cell ratio of 5: 1 with the results shown in Table V showing the standard deviations below the mean values. .
Tabulka VTable V
Indukce cytolitické aktivity aktivované lymfokiny (vyjádřená jako procento lyse3) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve společnou inkubací IL-10 a IL-2Induction of cytolytic activity of activated lymphokines (expressed as percent lysis 3 ) in human peripheral blood mononuclear cells by co-incubation of IL-10 and IL-2
Inkubační podmínky13 Incubation conditions 13
vání chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení.chromium at a ratio of effector to target cells of 20: 1. Data are the means of three determinations.
b Lidské jednojaderné buňky periferní krve, izolované od normálních dárců, se zpracovávají tři dny před stanovením cytolytické aktivity 4 ng/ml IL-10 a 2 J/ml IL-2. b Human peripheral blood mononuclear cells isolated from normal donors are treated three days prior to the determination of cytolytic activity of 4 ng / ml IL-10 and 2 J / ml IL-2.
c Nebyl zjištěn významný rozdíl mezi cytolitickou aktivitou v PBMC dárců zpracovaných IL-10 a IL-2 ve srovnání s 20 J/ml IL-2 samotného při p i 0,05 zjištěným Studentovým t-testem. c There was no significant difference between the cytolytic activity in the PBMC of IL-10 and IL-2 treated donors compared to 20 J / ml IL-2 alone at 0.05 detected by Student's t-test.
Jak z tabulky V vyplývá, došlo k dodatečnému nárůstu akti23 vity LAK (poměr efektorových buněk k cílovým buňkám 5:1) po společné inkubaci 2 J/ml IL-2 a 4 ng/ml 1L-10. Tato úroveň aktivity, která je významně větší než aktivita s cytokinem samotným, se blíží úrovni produkované 10-násobně vyšší koncentrací IL-2. Tento výsledek je statisticky významný při p i 0,05 zjištěným Studentovým t-testem.As shown in Table V, there was an additional increase in LAK activity (effector cell to target cell ratio of 5: 1) after co-incubation with 2 J / ml IL-2 and 4 ng / ml IL-10. This level of activity, which is significantly greater than that with cytokine alone, approaches that produced by a 10-fold higher concentration of IL-2. This result is statistically significant at 0.05 determined by Student's t-test.
b. Současná inkubace IL-10 a a-IFNb. Co-incubation of IL-10 and α-IFN
PBMC inkubované společně s IL-10 a α-IFN vykazují podobný nárůst lytické aktivity oproti buňkám Daudi, nikoli však oproti cílovým buňkám NK. Je to patrno z tabulky VI, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.PBMCs incubated together with IL-10 and α-IFN show a similar increase in lytic activity over Daudi cells, but not over NK target cells. This can be seen in Table VI, where the standard deviations are below the mean values.
fifi
Tabulka VITable VI
Indukce aktivity zabijáckých buněk aktivovaných lymfokiny (vyjádřená jako procento lyse3) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve společnou inkubací IL-10 a a-IFNInduction of lymphokine-activated killer cell activity (expressed as percentage of lysis 3 ) in human peripheral blood mononuclear cells by co-incubation of IL-10 and α-IFN
Inkubační podmínkyb Incubation conditions b
3 Percentuální lyse cílů Daudi 51Cr ve standardním testu uvolňování chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení. 3 Percent lysis of Daudi 51 Cr targets in a standard chromium release assay at an effector to target cell ratio of 20: 1. Data are the means of three determinations.
b Lidské jednojaderné buňky periferní krve izolované od normálních dárců se zpracovávají tři dny před stanovením cytolytické aktivity 4 ng/ml IL-10 a 100 J/ml a-IFN. b Human peripheral blood mononuclear cells isolated from normal donors were treated three days prior to the determination of cytolytic activity of 4 ng / ml IL-10 and 100 J / ml α-IFN.
Pozorované rozdíly cytotoxické aktivity vyvolané v PBMC od dárců působením IL-10 a α-IFN v porovnání s aktivitami vyvolanými IL-10 a α-IFN samotnými jsou statisticky významné, při p < 0,05 zjištěným Studentovým t-testem.The observed differences in cytotoxic activity induced in PBMC from donors by IL-10 and α-IFN compared to those induced by IL-10 and α-IFN alone are statistically significant at p <0.05 as determined by the Student's t-test.
Na rozdíl od toho současné inkubace s IL-10 a IL-4, IL-5, GMCSF nebo gama-IFN nejsou tak účinné jako IL-10 samotného (údaje neuvedeny).In contrast, co-incubations with IL-10 and IL-4, IL-5, GMCSF or gamma-IFN are not as effective as IL-10 alone (data not shown).
Následná inkubace s IL-10 a IL—2Subsequent incubation with IL-10 and IL-2
Při použití popsaného způsobu se udržují PBMC v mediu samotném nebo v mediu doplněném IL-10. Po dvou dnech se přidá IL-2 na konečnou koncentraci 2 nebo 20 J/ml. Cytotoxická aktivita vůči buňkám Daudi se posuzuje po další inkubaci přes noc. Výsledky od pěti dárců jsou obsaženy v tabulce VII, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.Using the method described, PBMCs are maintained in media alone or in IL-10 supplemented media. After two days, IL-2 is added to a final concentration of 2 or 20 J / ml. Cytotoxic activity against Daudi cells is assessed after further overnight incubation. Results from five donors are shown in Table VII, where the standard deviations are below the mean values.
Tabulka VIITable VII
Indukce cytolytické aktivity aktivovaná lymfokiny (vyjádřená jako procento lyse3) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve společnou předběžnou inkubací IL-10 následovanou IL-2Induction of lymphokine-activated cytolytic activity (expressed as percentage of lysis 3 ) in human peripheral blood mononuclear cells by co-incubation with IL-10 followed by IL-2
Pre-inkubační podmínkyb Pre-incubation conditions b
testu uvolňování chrómu při poměru efektorových k cílovým buňkám 20:1. Údaje jsou středy ze tří stanovení.a chromium release assay at a 20: 1 effector to target cell ratio. Data are the means of three determinations.
b Lidské jednojaderné buňky periferní krve připravené od normálních dárců se udržují v mediu doplněném 4 ng/ml IL-10 po dobu dvou dnů před přísadou 2 U/ml IL-2. Cytolytická aktivita je zjištěna po dodatečné inkubaci přes noc. b Human peripheral blood mononuclear cells prepared from normal donors are maintained in medium supplemented with 4 ng / ml IL-10 for two days prior to the addition of 2 U / ml IL-2. Cytolytic activity is detected after additional overnight incubation.
c PBMC od dárců byly inkubovány tři dny s IL-10 d PBMC od dárců byly inkubovány v mediu samotném před přidáním IL-2 , e PBMC od dárců byly inkubovány 2 dny s IL-10 před přidáním 20 J IL-2. c Donor PBMCs were incubated for three days with IL-10 d Donor PBMCs were incubated in medium alone prior to IL-2 addition, e donor PBMCs were incubated for 2 days with IL-10 prior to addition of 20 µL IL-2.
Jak z tabulky VII vyplývá, ve skupinách, kde byly PBMC dárců předem zpracovány IL-10 před přidáním IL-2, je zřejmá 2-násobně vyšší cytolytická aktivita (78,8 ± 17,9%) ve srovnání s úrovní patrnou u kultur udržovaných v kompletním mediu pouze před přidáním IL-2 (41,7% ± 11,4). Pozorované rozdíly mezi vzorky předběžně zpracovanými IL-10 a vzorky nezpracovanými IL-2 jsou statisticky významné při pl 0,14.As shown in Table VII, in groups where donor PBMCs were pre-treated with IL-10 prior to IL-2 addition, a 2-fold higher cytolytic activity (78.8 ± 17.9%) is evident compared to the level seen in cultures maintained by IL-10. in complete medium only before addition of IL-2 (41.7% ± 11.4). The observed differences between IL-10 pretreated samples and IL-2 pretreated samples were statistically significant at pI 0.14.
« Podobný obraz zlepšené cytolytické aktivity je patrný u postupných inkubací s IL-10 následovaných inkubací α-IFN (údaje nejsou uvedeny).A similar pattern of improved cytolytic activity is seen in sequential incubations with IL-10 followed by α-IFN incubation (data not shown).
Blokáda cytotoxicity vyvolané IL-2 působením IL-10 a IL-4Blockade of IL-2 induced cytotoxicity by IL-10 and IL-4
V mediu obsahujícím 20 J/ml samotného IL-2, 20 J/ml IL-2 plus 1000 J/ml IL-4 nebo 20 J/ml IL plus 1000 J/ml 1L-4 plus 4 ng/ml IL-10 se kultivují PBMC od šesti lidských dárců. Výsledky obsahuje tabulka VIII, kde jsou uvedeny směrodatné odchylky pod průměrnými hodnotami.In a medium containing 20 J / ml IL-2 alone, 20 J / ml IL-2 plus 1000 J / ml IL-4 or 20 J / ml IL plus 1000 J / ml IL-4 plus 4 ng / ml IL-10, cultivate PBMCs from six human donors. The results are shown in Table VIII, where the standard deviations are below the mean values.
Tabulka VIIITable VIII
Antagonismus blokády IL-4 lymfokiny aktivované cytologické aktivity vyvolané IL-2 působením IL-10 (vyjádřená jako procento lyse3) v lidských jednojaderných buňkách periferní krve.Antagonism of IL-4 lymphokine blockade activated IL-2 induced cytological activity (expressed as percent lysis 3 ) in human peripheral blood mononuclear cells.
b Lidské jednojaderné buňky periferní krve izolované od normálních dárců se zpracovávají po dobu tří dnů 20 J/ml IL-2. c PBMC od dárců byly inkubovány po dobu tří dnů s 20 J/ml IL-2 a 100 J/ml lidského IL-4 d PBMC od dárců byly inkubovány spolu s J/ml IL-2, 1000 J/ml lidského IL-4 a 4 ng/ml IL-10. b Human peripheral blood mononuclear cells isolated from normal donors are treated for three days with 20 J / ml IL-2. c Donor PBMCs were incubated for three days with 20 J / ml IL-2 and 100 J / ml human IL-4 d Donor PBMCs were incubated together with J / ml IL-2, 1000 J / ml human IL-4 and 4 ng / ml IL-10.
Z údajů tabulka VIII vyplývá, že je patrná přibližně 34,2% lyse cílových buněk citlivých na LAK po zpracování 20 J/ml samotného IL-2. Je-li začleněno 1000 J/ml lidského IL-4 na začátku in27 kubační periody, je cytolytická aktivita potlačena přibližně dvojnásobně. Toto potlačení způsobené IL-4 však nebylo pozorováno, bylo-li v průběhu prvních 24 hodin inkubace přidáno 4 ng/mlThe data in Table VIII shows that approximately 34.2% of LAK-sensitive target cell lysis is seen after treatment with 20 J / ml IL-2 alone. When 1000 J / ml human IL-4 is incorporated at the beginning of the in27 cubic period, cytolytic activity is suppressed approximately twice. However, this suppression caused by IL-4 was not observed when 4 ng / ml was added during the first 24 hours of incubation
IL-10.IL-10.
Mezi výsledky vytvořenými IL-2 samotným a výsledky vytvořenými všemi třemi cytokiny dohromady není významný rozdíl (pl 0,05 zjištěným Studentovým t-testem), což znamená, že antagonismus blokády způsobené IL0-10 je v podstatě úplný.There is no significant difference between the results generated by IL-2 alone and those produced by all three cytokines taken together (p1 0.05 detected by Student's t-test), indicating that antagonism of IL0-10-induced blockade is essentially complete.
Aniž dojde k odchýlení od ducha a rozsahu vynálezu, jsou možné různé modifikace a varianty vynálezu, jak je pracopvníkům v oboru zřejmé. Specifická provedení jsou zde nabízena pouze jako příklady a vynález je vymezen pouze následujícími patentovými nároky.Without departing from the spirit and scope of the invention, various modifications and variations of the invention are possible, as will be apparent to those skilled in the art. Specific embodiments are offered herein by way of example only, and the invention is limited only by the following claims.
Průmyslová využitelnostIndustrial applicability
Použití interleukinu-10 (IL-10), formálně útlumového faktoru buněčné synthese pro výrobu farmaceutických prostředků k adoptivní imunoterapii při léčení novotvarových chorob (rakoviny) povzbuzováním cytolytické aktivity jednojaderných buněk periferní krve.The use of interleukin-10 (IL-10), a formally attenuated cell synthesis factor, for the manufacture of pharmaceutical compositions for adoptive immunotherapy in the treatment of neoplasm diseases (cancer) by stimulating the cytolytic activity of peripheral blood mononuclear cells.
Claims (5)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ962054A CZ205496A3 (en) | 1994-01-20 | 1994-01-20 | Pharmaceutical preparation for treating cancer, process of its preparation and the use of il-10 for preparing medicament for antagonizing cyctotoxicity blockade caused by il-2 endogenic il-4 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CZ962054A CZ205496A3 (en) | 1994-01-20 | 1994-01-20 | Pharmaceutical preparation for treating cancer, process of its preparation and the use of il-10 for preparing medicament for antagonizing cyctotoxicity blockade caused by il-2 endogenic il-4 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ205496A3 true CZ205496A3 (en) | 1997-03-12 |
Family
ID=5464282
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CZ962054A CZ205496A3 (en) | 1994-01-20 | 1994-01-20 | Pharmaceutical preparation for treating cancer, process of its preparation and the use of il-10 for preparing medicament for antagonizing cyctotoxicity blockade caused by il-2 endogenic il-4 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ205496A3 (en) |
-
1994
- 1994-01-20 CZ CZ962054A patent/CZ205496A3/en unknown
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4416839B2 (en) | Treatment of secondary immune deficiency | |
| KR101554056B1 (en) | Means for the treatment and/or prophylaxis of an autoimmune disease and for the formation of regulatory t-cells | |
| Owen-Schaub et al. | Synergy of tumor necrosis factor and interleukin 2 in the activation of human cytotoxic lymphocytes: effect of tumor necrosis factor α and interleukin 2 in the generation of human lymphokine-activated killer cell cytotoxicity | |
| CA2087525C (en) | Adoptive immunotherapy with interleukin-7 | |
| AU707019B2 (en) | Use of IL-10 to stimulate peripheral blood mononuclear cell cytolytic activity | |
| US7396681B1 (en) | Application of Hsp70 proteins | |
| NZ579795A (en) | Uses of mammalian cytokine; related reagents | |
| AU658588B2 (en) | TNF and IL-4 compositions | |
| US5871725A (en) | Use of IL-10 to stimulate peripheral blood mononuclear cell cytolytic activity | |
| EA015510B1 (en) | A METHOD OF INCREASING THE AMOUNT OF MONONUCLEAR CELLS IN A SUBJECT SUFFICIENT OF CANCER AND USED FOR THIS PHARMACEUTICAL COMBINATION | |
| IL107802A (en) | Pharmaceutical composition suppressing the cytotoxic activity of mammalian nk cells | |
| CZ205496A3 (en) | Pharmaceutical preparation for treating cancer, process of its preparation and the use of il-10 for preparing medicament for antagonizing cyctotoxicity blockade caused by il-2 endogenic il-4 | |
| Kuramitsu et al. | Transforming growth factor beta 1 (TGF-beta 1) produced in tumour tissue after chemotherapy acts as a lymphokine-activated killer attractant | |
| HUT78097A (en) | Use of il-10 to stimulate peripheral blood mononuclear cell cytolytic activity | |
| Tanida et al. | Marked reduction of subcutaneous tumor growth by intraperitoneal administration of recombinant human interleukin 2 with a cell accumulator, proteose-peptone, in mice | |
| NAGANUMA et al. | Analysis of Tumor Necrosis Factor and Lymphotoxin Secreted by Incubation of Lymph okine-activated Killer Cells with Tumor Cells | |
| CA2098509A1 (en) | Pharmaceutical compositions for the treatment of b-cell malignancies | |
| CN101074266A (en) | Transduced peptide-humanized granular leukocyte colony stimulating factor fusion protein and its medicinal composition | |
| NK | This suggestive evidence implicating NK cells in defense against leukemia initiated our studies on the NK cell cytotoxic profile of patients with leukemia. During these studies, we | |
| Owen-Schaub | Human Lymphokine-Activated Killer Cells Activated with Interleukin-2 and Tumor Necrosis Factor-α: Implications for Immunotherapy | |
| MXPA98001091A (en) | Combined use of interleukin-10 and cyclosporine for immunosupres therapy | |
| HK1131031A (en) | Method for treating secondary immunodeficiency |